JPH10505484A - 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補的細胞系を提供する。また、多重欠損アデノウイルスベクターおよび該組換え体を用いる治療方法、特に遺伝子治療、予防接種などの治療方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系 関連出願 本願は、１９９４年６月１０日に出願された同時係属中の米国特許出願第０８ ／２５８，４１６号の一部継続出願である。 発明の技術分野 本発明は、組換え多重欠損アデノウイルスベクターおよび当該ベクターの培養 に有用な相補的細胞系に関する。さらに、本発明は、該ベクターの医療的用途に 関する。 発明の背景 １９５２〜１９５３年の冬から春にかけて、国立衛生研究所（ＮＩＨ）のロウ とその共同研究者らは、ワシントン特別区に住む幼児から外科的に切除されたア デノイド（腺様増殖組織）を取得し、組織培養を行った（Roweら，Proc．Soc．E xp．Biol．Med.，84，570-573(1953)）。数週間後、該培養の多くが上皮細胞の 破壊を特徴とする進行性の変性を示し始めた。この細胞変性効果は培養濾液によ って、樹立されたヒト細胞系の組織培養物に連続的に伝達することができた。該 細胞変性剤は「アデノイド変性」（Ａｄ）剤と呼ばれた。「アデノウイルス」の 名前は、最終的に、これらの薬剤に一般的に使われる名称になった。アデノウイ ルスの多くの原型株−その中の幾つかは呼吸疾患を引き起こす−の発見がこれら 最初の発見に続いた［Roweら，上述；Dingleら，Am．Rev．Respir．Dis.，97, 1 -65(1968)；Horwitz，「アデノウイルス科とそれらの複製」(Adenoviridae and Their Replication),ウイルス学（Virology）（Fieldsら編，レイヴン出版社， ニューヨーク，第２版，1990年），1679-1721 頁に総説］。 ヒトから４０を越すアデノウイルスサブタイプが単離されており、さらに加え て５０を越すサブタイプが他の哺乳類又は鳥類から単離されている （Ishibashi ら，「動物のアデノウイルス」(Adenoviruses of animals)，アデ ノウイルス (The Adenoviruses)，Ginsberg 編，プレナム出版，ニューヨーク， ニューヨーク州，497-562 頁，（1984年）；Strauss，「ヒトにおけるアデノウ イルス感染」（Adenovirus infections in humans），アデノウイルス(The Aden oviruses)，Ginsberg編，プレナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州，451-5 96 頁，（1984年））。これらのサブタイプは全てアデノウイルス科に属し、現 在のところ２つの属、すなわちマストアデノウイルス属とアビアデノウイルス属 とに分けられている。 全てのアデノウイルスは形態的および構造的に類似している。しかしながら、 ヒトにおいては、アデノウイルスは互いに異なる免疫学的特性を有するがために 、血清型に分けられている。２つのヒトアデノウイルス血清型、すなわち、Ａｄ ２とＡｄ５は徹底的に研究されてきた。これらの研究によりアデノウイルス一般 についての情報の大部分が提供された。 アデノウイルスはエンベロープを有さず、正二十面体で直径が６５〜８０ｎｍ 、外部キャプシドと内部コアから成る。キャプシドは、２０の三角形の表面すな わち切子面と１２の頂点から成る（Horne ら，J．Mol．Biol.，1，84-86(1959) ）。切子面はヘキソンで、頂点はペントンで構成されている。各頂点からファイ バーが突出している。ヘキソン、ペントンおよびファイバーに加えて、８つの微 量の構造ポリペプチドがあるが、それらの大多数の正確な位置は不明である。あ る微量ポリペプチド成分、すなわち、ポリペプチドIXは、各切子面の９群中心（ the group-of-nine center）といわれる場所において、ヘキソン−ヘキソンの接 点を安定化させ得る位置で結合している（Furcinittiら，EMBO，8，3563-3570（ 1989））。微量ポリペプチドVIおよびVIIIは、隣接する切子面間のヘキソン−ヘ キソンの接点を安定化させると信じられている。微量ポリペプチドIIIAは、頂点 の領域に位置することが知られているが、キャプシドとコアとを繋いでいること がStewart ら（Cell，67，145-154(1991)）によって示唆されている。 ウイルスコアは、単離物によっては長さが１０３塩基対〜１６３塩基対と変化 することが観察されている逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）を有する直鎖状の二本 鎖ＤＮＡ分子を含有すると言われている（Garon ら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，69，2391-2394（1972）；Wolfson ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，69，3 054-3057（1972）；Arrandら，J．Mol．Biol.，128，577-594（1973）；Steenbe rg ら，Nucleic Acids Res.，4， 4371-4389（1977）；およびTooze，ＤＮＡ腫 瘍ウイルス （DNA Tumor Viruses ），第２版，コールドスプリングハーバー，ニ ューヨーク：コールドスプリングハーバー研究所，943-1054頁，（1981年））。 ＩＴＲはＤＮＡの複製起点を担持する（Garon ら，上述；Wolfson ら，上述；Ar randら，上述；Steenberg ら，上述）。 ウイルスＤＮＡは４つのポリペプチド、すなわち、V，VII，μおよび末端ポリ ペプチド（ＴＰ）と結合している。５５ｋｄのＴＰはｄＣＭＰを介してＤＮＡの ５’末端に共有結合している（Rekoshら，Cell，11，283-295（1977）；Robinso nら，Virology，56，54-69(1973)）。他の３つのポリペプチドはＤＮＡに非共有 結合的に結合してキャプシドの小さな容量に合うようにＤＮＡを折り畳んでいる 。ＤＮＡはヌクレアーゼ消化パターンからわかるように細胞のヌクレオソームに 類似した構造にパッケージングされているらしい（Cordenら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，73，401-404（1976）；Tateら，Nucleic Acids Res.，6，2769-278 5（1979）；Mirza ら，Biochim．Biophys．Acta，696，76-86（1982））。 アデノウイルスゲノムの全体的な構造は血清型を通して保たれており、特定の 機能は同様な位置に置かれている。Ａｄ２およびＡｄ５のゲノムは完全に配列決 定されており、他の血清型由来のゲノムの選択された領域の配列も入手可能であ る。 アデノウイルスは、細胞膜上の特定の受容体にファイバーを付着させることに より細胞感染を始める［Londberg-Holm ら，J．Virol.，4，323-338（1969）；M organら，J．Virol.，4，777-796（1969)；Pastanら，「アデノウイルスの細胞 への侵入：古い問題に関するいくつかの新しい観察」(Adenovirus entry into c ells: some new observations on an old problem)，ウイルス病原の概念 （Concepts in Viral Pathogenesis），Notkins ら編，シュプリンガー−フェア ラーク，ニューヨーク，ニューヨーク州，141-146 頁，（1987年）］。次いで、 ペントンベースがアデノウイルスインテグリン受容体に結合する。それから、受 容体と結合したウイルスは原形質膜から、エンドサイトーシス小胞又はレセプト ソームを形成する、クラスリンで被覆された窪みに移動し、そこでＰｈが５．５ に落ちる［Pastanら，ウイルス病原の概念（Concepts in Viral Pathogenesis） ,Notkins and Oldstone編，シュプリンガー−フェアラーグ，ニューヨーク，141 -146 頁，（1987年）］。Ｐｈの降下がウイルス表面の外形を変化させ、その結 果レセプトソームが破裂してウイルスが細胞の細胞質中に放出されると信じられ ている。ウイルスＤＮＡは、核に輸送される間、細胞質中では部分的に被覆され ていない、すなわち、部分的に結合タンパク質が外れている。 ウイルスが核孔に達すると、ウイルスＤＮＡは、残りのタンパク質のほとんど を細胞質に残して核に入る（Philipson ら，J．Virol.，2，1064-1075(1968)） 。しかしながら、ウイルスＤＮＡは完全にタンパク質を持たないわけではなく、 少なくともウイルスＤＮＡの一部は少なくとも４つのウイルスポリペプチド、す なわち、V，VII，TPおよびμと結合しており、ウイルスＤＮＡ−細胞ヒストン複 合体に転化される（Tateら，Nucleic Acids Res.，6，2769-2785（1979））。 細胞感染からウイルス粒子産生へのサイクルは１〜２日続き、結果として細胞 あたり１万に達する感染性粒子が産生される（Green ら，Virology，13，169-17 6(1961)）。アデノウイルスの感染過程はウイルスＤＮＡの複製によって分けら れる、初期（Ｅ）および後期（Ｌ）の相に区分される。もっとも、初期相の間に 起こる事のいくつかは後期相の間にも起こり、その逆もある。ウイルス遺伝子の 一時的な発現を十分に記述するためにさらに下位区分がなされている。 初期相の間に、細胞内に存在する全ＲＮＡのうちの小さな割合を占めているウ イルスｍＲＮＡが、細胞核に存在するアデノウイルスＤＮＡの両方の鎖から合成 される。少なくとも、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４およびＭＬＰ−Ｌ１と命名された ５つの領域が転写される［Lewis ら，Cell，7，141-151（1976）；Sharp ら， Virology，75，442-456（1976）；Sharp，「アデノウイルスの転写」（Adenovir us transcription），アデノウイルス（The Adenoviruses），Ginsberg編，プレ ナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州，173-204 頁，1984年）］。それぞれ の領域は少なくとも１つの明瞭なプロモーターを有し、プロセスされて複数のＭ ＲＮＡ種を生じる。 初期（Ｅ）領域の産物は、（１）他のウイルス成分の発現に制御的な役割を果 たし、（２）細胞のＤＮＡ複製およびタンパク質合成の一般的な停止に関与し、 および（３）ウイルスＤＮＡの複製に必要である。初期ｍＲＮＡの転写を調節す る複雑な一連の出来事は、Ｅ１Ａ、Ｌ１および１３．５ｋｄ遺伝子を含むある特 定の、すぐの初期領域の発現で始まる［Sharp(1984)，上述，に総説されている ；Horwitz(1990)，上述］。遅延初期領域であるＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３ およびＥ４の発現はＥ１Ａ遺伝子産物に依存する。３つのプロモーター、７２マ ップ単位（ｍｕ）にあるＥ２プロモーター、タンパク質ＩＸプロモーターおよび ＩＶａプロモーターは、ＤＮＡ複製の開始によりエンハンスされるがそれに依存 しない（Wilsonら、Virology，94，175-184(1979)）。それらの発現はウイルス の遺伝子発現の移行期を特徴づける。初期遺伝子発現のカスケードの結果、ウイ ルスＤＮＡの複製が開始される。 アデノウイルスＤＮＡの複製は、ゲノムのどちらかの末端にある複製起点から 、５’から３’方向への連続的合成によって親の一本鎖を置換する［Kelly ら， 「ウイルスのＤＮＡ複製の開始」（Initiation of Viral DNA replication），ウイルス研究の進歩 （Advances in Virus Research），Maramorosch ら編，アカ デミック出版社，サンディエゴ，カリフォルニア州，34，1-42 1988年）；Horwi tz(1990)，上述；Van der Vliet，「生体外におけるアデノウイルスＤＮＡの複 製」（Adenovirus DNA replication in vitro），真核細胞の核（The Eukaryoti c Nucleus），Strauss ら編，テルフォード出版，カルドウェル，ニュージャー ジー州，1，1-29，（1990年），に総説されている］。Ｅ２由来のコードされて いる３つのウイルスタンパク質：（１）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質 （ＤＢＰ）、（２）アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ（Ａｄ ｐｏｌ）、およ び（３）プレ末端タンパク質（ｐＴＰ）はアデノウイルスＤＮＡ合成に必須であ る。これら必須のタンパク質に加えて生体外の実験によって多くの宿主細胞因子 がＤＮＡの合成に必要であることが確認されている。 ＤＮＡ合成はｄＣＭＰ分子のｐＴＰのセリン残基への共有結合的接着によって 開始する。それからｐＴＰ−ＤＣＭＰ複合体はＡｄ ｐｏｌが伸長するためのプ ライマーとして機能する。置換された親の一本鎖は逆位末端反復配列の塩基の対 合によってフライパンの柄のような構造を形成することができる。この末端の２ 重の構造は親ゲノムの末端と同一であり、相補鎖合成の開始の起点として機能で きる。 ウイルスＤＮＡの複製の開始が後期相に入るのに必須のように思われる。ウイ ルス感染の後期相はウイルス構造ポリペプチドおよびキャプシドの構築に関わる 非構造タンパク質の大量産生によって特徴付けられる。主要後期プロモーター（ ＭＬＰ）が十分に活性となり、１６．５ｍｕで始まりゲノムの末端付近で終結す る転写産物を産生する。この長い転写産物の転写後のプロセッシングは後期ｍＲ ＮＡの５つの系統をもたらし、それぞれＬ１からＬ５と命名される（Shawら，Ce ll，22，905-916(1980)）。初期相から後期相への変遷を制御し、又結果として そのような転写産物の利用における劇的な変遷を生じる機構は明らかでない。 一次感染ウイルスの後期の転写が活性である時は、後期転写は重感染ウイルスか らは起こらないので、ＤＮＡ複製の条件はＤＮＡ鋳型がシス特性であるかもしれ ない（Thomasら，Cell，22，523-533(1980)）。 ウイルス粒子の構築は、個々のポリペプチド鎖から主要な構造単位を組み立て る最初のステップから複雑なプロセスである［Philipson，「アデノウイルスの 構築」（Adenovirus Assembly），アデノウイルス（The Adenoviruses），Ginsb erg編，プレナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州，309-337 頁，（1984年 ），に総説されている; Horwitz(1990)，上述］。ヘキソン、ペントンベースお よびファイバーは細胞質内での合成後、三量体のホモポリマー形態を構築す る。１００ｋｄタンパク質はヘキソンの３量体化の為の骨格タンパク質として機 能するようであり、得られたヘキソン三量体はヘキソンカプソマーと呼ばれる。 ヘキソンカプソマーは自己構築して空のキャプシドの殼を形成することができ、 ペントンベースとファイバーの三量体は、構成成分が核内に存在するときは、結 合してペントンを形成することができる。正二十面体の切子面は３つのヘキソン カプソマーで構成され、そのことはキャプシドが分離することでわかるが、９群 中心ヘキソン形成の途中のステップは観察されていない。幾つかの構築中間体が 温度感受性変異株を用いた実験により示されている。キャプシド構築の進行は５ ０ｋｄおよび３０ｋｄの骨格タンパク質に依存していると考えられる。裸のＤＮ Ａはおそらく、頂点の一つの開口部を通って完成状態に近いキャプシドに入り込 む。該プロセスの最後の段階は、前駆ポリペプチドpVI、pVII、pVIIIおよびpTP のタンパク分解的なトリミングを含んでおり、それはキャプシド構造を安定化さ せ、該ＤＮＡをヌクレアーゼ処理に非感受性とし、成熟したウイルス粒子を産生 する。 ある種の組換えアデノウイルスベクターが遺伝子治療に用いられている。１つ あるいはそれ以上の組換え遺伝子を運搬するための組換えアデノウイルスベクタ ーの使用は、治療を必要とする器官、組織あるいは細胞への１またはそれ以上の 遺伝子の目的とする送達を可能にし、それにより体細胞の遺伝子治療のほとんど の場合に遭遇する送達に関する問題が克服される。さらに、組換えアデノウイル スベクターはアデノウイルスタンパク質の発現に宿主細胞の増殖を必要としない ［Horwitz ら，ウイルス学（Virology），レイヴン出版，ニューヨーク，2，167 9-1721，（1990年）；Berkner，BioTechniques，6，616(1988)］。さらにもし治 療が必要な疾病器官が肺であれば、遺伝子情報の運びやとしてのアデノウイルス の使用は、アデノウイルスが通常気道上皮栄養性であるという点でさらに有利で ある［Straus，アデノウイルス（Adenoviruses），プレナム出版，ニューヨーク ，451-496 頁，（1984年）］。 ヒトの遺伝子治療に使用可能なベクターとしてのアデノウイルスの他の長所は 以下の通りである：（ｉ）組換えが稀であり；（ii）ヒトがアデノウイルスに感 染することが頻繁にあるにもかかわらず、アデノウイルス感染からヒトへの悪影 響に関連するものが今のところなく；（iii）現在、アデノウイルスゲノム（直 鎖状で二本鎖ＤＮＡ）は、長さにして７．０〜７．５ｋｂまでの範囲の外来遺伝 子を収容するように操作でき；（iv）アデノウイルスベクターはそれ自身のＤＮ Ａを細胞の染色体には挿入せず、そのためその効果は一時的で細胞の正常な機能 を妨害することはありそうにもなく；（ｖ）アデノウイルスは脳や肺の細胞の様 な、***せず、つまり最終分化を遂げた細胞に感染することができ；（vi）生ア デノウイルス−必須な特徴として複製する能力を有している−がヒトワクチンと して安全に利用されている（Horwitz ら，上述；Berkner ら，J．Virol.，61，1 213-1220（1987）；Straus，上述；Chanock ら，JAMA，195，151（1966）；Haj- Ahmad ら，J．Virol.，57，267（1986）；およびBallayら，EMBO，4，3861(1985 )）。 発現ベクターとして使うために、外来遺伝子をアデノウイルスゲノムの２つの 主要な領域、すなわちＥ１およびＥ３領域に挿入して、単欠損アデノウイルスお よびそれ由来のベクターを得ている。Ｅ１領域への挿入は、相補細胞内での増殖 あるいは完全なヘルパーウイルスの存在を必要とする欠損のある子孫を生み出す 。それらは、損傷を受けたあるいは消失したＥ１領域の機能を代替する（Berkne r ら，上述；Davidsonら，J．Virol.，61，1226-1239（1987）；およびMansour ら，Mol．Cell Biol.，6，2684-2694(1986)）。ゲノムのこの領域は外来遺伝子 の発現に最も頻繁に利用されている。 Ｅ１領域に挿入された遺伝子は種々のプロモーターの制御下におかれ、多くは 発現カセットによっては大量に外来遺伝子産物を産生する。しかしながらこれら のアデノウイルスベクターは非相補的細胞系中では増殖しない。現在のところ、 単欠損アデノウイルスに欠けている必須機能を相補する細胞系は２、３存在する のみである。それらの細胞系の例としては、ＨＥＫ−２９３（Grahamら，Cold S pring Harbor Sym．Quant．Biol.，39，637-650（1975））やＷ１６２ （Weinbergら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80，5383-5386(1983)）およびgＭ ＤＢＰ（Klessig ら,Mol．Cell Biol.，4，1354-1362（1984）；Broughら，Viro logy，190，624-634（1992））が含められる。 外来遺伝子の挿入に有効であるとして上述したもう１つの領域、Ｅ３領域は組 織培養中でのウイルスの増殖には非必須なので、この領域を外来遺伝子発現カセ ットで置換すると非相補的細胞系においても生産的に増殖できるウイルスが得ら れる。例えば、Ｅ３領域内へのＢ型肝炎表面抗原の挿入および発現、それに続く ハムスターへの接種および抗体の形成が報告されている（Morinら，Proc．Natl. Acad．Sci．USA，84，4626-4630(1987)）。 単欠損アデノウイルスベクターの問題点は、外来遺伝子の挿入や発現に利用で きるアデノウイルス内のスペース量を制限してしまうことである。現在存在して いる単欠損アデノウイルスベクターと相補的細胞系とに含まれているウイルス配 列に類似性あるいは重複がある為に、組換え現象（上述の様に通常は極めて稀で ある）が起こり得、そしてベクター保存株中において、そのように繁殖した複製 可能なウイルスを生み出すことがありうる。この現象が実際問題として、ベクタ ーの保存株を遺伝子治療の目的で利用できないようにしている。 したがって、本発明の目的は外来ＤＮＡの、より大きな断片の挿入および発現 に適応可能な多重欠損アデノウイルスベクターを提供することである。本発明の 別の目的は該本発明の多重欠損アデノウイルスベクターを相補する細胞系を提供 することである。さらに本発明の目的は又、多重欠損アデノウイルスベクターの 組換え体およびそのような組換え体を用いる治療方法、特に遺伝子治療、予防接 種などに関する治療方法を提供することである。本発明のこれらの、又他の目的 および利点、又発明の他の特色は、以下の詳細な説明から明確になるであろう。 発明の簡単な要約 本発明は多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補的細胞系を提供する。該 多重欠損アデノウイルスベクターは、現在入手可能な単欠損アデノウイルスベク ターで可能とされる以上の、より大きな外来ＤＮＡの断片の挿入および発現に適 応可能である。該多重欠損アデノウイルスベクターは又、複製に欠陥を有し、相 補的細胞系中で繁殖あるいは増殖させた時の組換えに耐性であり、その特性が遺 伝子治療および他の治療目的に特に望ましい。従って、本発明はさらに、組換え 多重欠損アデノウイルスベクターおよびそのような組換え体の利用を含む治療方 法、例えば遺伝子治療、予防接種などに関する治療方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｒウイルスベクタ ーの一連の概略図である。 図２はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１１ウイルスベクターの一連の概略図である。 図３はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２ウイルスベクターの概略図である。 図４はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１３ウイルスベクターの概略図である。 図５はＥ２Ａ発現ベクターの概略図である。 図６はあるクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系における誘導されたＤＢＰ発現の 程度をスクリーニングする為に用いられたイムノブロット像である。 図７はあるクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系による、誘導の最初の２４時間の 間にわたるＤＢＰの蓄積を解析する為に用いられたイムノブロット像である。 図８はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２Ｂウイルスベクタ ーの一連の概略図である。 図９は臭化エチジウムで染色したＤＮＡゲルの逆コントラスト写真であり、継 代したトランスフェクション溶解物からのＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２Ｂウイルスベク ターのＰＣＲ検出に関するデータを示す。 図１０はＡｄ_GVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳウイルスベクターの概略図である。 図１１はＥ４−ＯＲＦ６発現ベクターの概略図である。 図１２は臭化エチジウムで染色したＤＮＡゲルの逆コントラスト写真であり、 継代したＡｄ_GVβｇａｌ．１２の溶解物におけるＥ４欠失領域のＰＣＲ検出に関 するデータを示す。 図１３はトランスフェクション後のある細胞系（ｘ軸）ごとのＰＦＵ／細胞（ ｙ軸）の程度を示す棒グラフである。 図１４はＡｄ_GVβｇａｌ．１２ウイルスベクターの概略図である。 発明の詳細な説明 本発明は特に、遺伝子クローニングおよび発現のための多重欠損アデノウイル スベクターを提供する。本発明の多重欠損アデノウイルスベクターは、現在、入 手可能な単欠損アデノウイルスベクターとは、アデノウイルスゲノムの少なくと も２つの領域に欠損があるという点で、又外来ＤＮＡのより大きな断片を受入れ 、発現できるという点で異なっている。ここで用いられる「外来ＤＮＡ」という 用語は、アデノウイルスゲノムにとって外来の、本発明のベクターに挿入された いかなるＤＮＡ配列をも意味する。そのような外来ＤＮＡは遺伝子、遺伝子の部 分あるいはその他のいかなるＤＮＡ配列を構成しても良く、ＲＮＡ、アンチセン スＲＮＡ、および／又はポリペプチドをコードする配列が含むがそれらに限定さ れない。 アデノウイルスゲノムの領域は１つあるいはそれ以上の遺伝子からなる。Horw itz（1990）、上述。そのような遺伝子は接着、浸透、脱外皮、複製、コアタン パク質、ヘキソン、ファイバー、ヘキソン関連タンパク質などのアデノウイルス の種々の構成成分や活性を仲介、促進、引き起こし、あるいはそのものである遺 伝子産物をコードしている。例えば、前述の構成成分や活性のいくつかに、ある いは全てに関与するかもしれない欠損領域による一つの影響はアデノウイルスの 繁殖が不能であることである。ここでは前述の構成成分や活性を遺伝子の機能と 呼ぶこととする。 ここで用いられる、遺伝子あるいは遺伝子機能における欠損、すなわち、欠損 した遺伝子、遺伝子領域もしくは領域とは、ウイルスゲノムの遺伝的な材料の欠 失として定義され、ＤＮＡ配列が全体にもしくは部分的に欠失した遺伝子の機能 を減ずるもしくは抹消するように、又ウイルスゲノムにとって外来のＤＮＡを挿 入するためにウイルスゲノム内に余地もしくは容量を与える。そのような欠損は 、非相補的な細胞宿主の組織培養中におけるアデノウイルスベクターの繁殖に必 須な遺伝子内にあっても、又、必須でない遺伝子内にあっても良いが、該発明の ウイルスベクターの欠損した遺伝子の、好ましくは少なくとも１つ、より好まし くは少なくとも２つが繁殖に必須な遺伝子の欠損である。 いかなるサブタイプ、サブタイプの混合物又はキメラアデノウイルスを多重欠 損アデノウイルスベクターの作製のためのＤＮＡの原料として用いてもよい。し かしながら、Ａｄ５ゲノムは完全に配列が決定されているので、本発明ではＡｄ ５血清型について記載する。 本発明のアデノウイルスベクターはアデノウイルスゲノムの初期領域１（Ｅ１ ）、初期領域２Ａ（Ｅ２Ａ）および／又は初期領域２Ｂ（Ｅ２Ｂ）を含む初期領 域２（Ｅ２）、初期領域３（Ｅ３）および初期領域４（Ｅ４）を含む初期領域の １つあるいはそれ以上によって与えられる機能を少なくとも欠損しているのが好 ましい。Ｅ１領域における欠損は領域Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢあるいはＥ１ＡとＥ１Ｂの 両方に存在する。本発明のアデノウイルスベクターは領域Ｅ２（すなわちＥ２Ａ 、Ｅ２ＢあるいはＥ２ＡとＥ２Ｂの両方）、および／又はＥ３、および／又はＥ ４における欠損と共に領域Ｅ１によって与えられる機能を少なくとも欠損してい るのがさらに好ましい。 欠失した領域のいかなる１つもアデノウイルスにとって外来である外来遺伝子 産物を生み出すためにプロモーター可変性発現カセットで置換してもよい。例え ば、外来遺伝子のＥ２Ａ領域への挿入は、特異な制限部位の導入によって容易に なされ、外来遺伝子産物はＥ２Ａプロモーターから発現され得る。 しかしながら本発明はゲノムの初期領域においてのみ遺伝子機能を欠損したア デノウイルスベクターに限定されない。ゲノムの後期領域に欠損のあるアデノウ イルスベクター、ゲノムの初期および後期領域に欠損のあるアデノウイルスベク ター、本質的に全てのゲノムが除かれているベクターも又包含される。この場合 少なくともウイルスの逆位末端反復配列およびいくらかのプロモーターあるいは ウイルスの逆位末端反復配列およびパッケージングシグナルのいずれかが完全に 残されていることが好ましい。当業者であれば排除されるアデノウイルスゲノム の領域が大きいほど、より大きな外来性のＤＮＡの断片がゲノムに挿入できると いうことが認識できるであろう。例えば、３６ｋｂのアデノウイルスゲノムであ れば、ウイルスの逆位末端反復配列といくらかのプロモーターを完全な形で残す と、アデノウイルスの許容量はおよそ３５ｋｂである。あるいは、ＩＴＲとパッ ケージングシグナルのみを有する多重欠損アデノウイルスベクターを作製するこ ともできる。これにより、このベクターから３７−３８ｋｂの外来ＤＮＡの発現 が効果的に予測されよう。 一般的に、ウイルスベクターは細胞内でのアデノウイルスＤＮＡ断片間での高 レベルの組換えを期待して構築される。断片間で類似（あるいは重複）している 領域を有しゲノムの完全長を構成しているアデノウイルスベクターの２つ又は３ つの断片を細胞にトランスフェクションする。宿主細胞の組換え機構は前述の断 片を組変えることによって完全長のウイルスベクターゲノムを構成する。種々の 単一領域における改変を含む、ウイルスを構築するための他の好適な手法が以前 に報告されており（Berkner ら，Nucleic Acids Res.，12，925-941（1984）；B erkner ら，Nucleic Acids Res.，11，6003-6020（1983）；Broughら，Virol.,1 90，624-634(1992)）、これらは多重欠損ウイルスの構築のために用いることが できる。さらに他の好適な手法は、例えば生体外での組換えや連結も含む。 ウイルスベクター構築の最初の段階は標準的な分子生物学的な技術を用いて、 プラスミドカセット内でアデノウイルスゲノムの特定の領域の欠失あるいは改変 を構築することである。示量解析の後、この変化させたＤＮＡ（欠失あるいは改 変を含む）はそれからアデノウイルスゲノムの１／２までを含むより大きなプラ スミドに移される。次の段階は該プラスミドＤＮＡ（欠失あるいは改変を含む） およびアデノウイルスゲノムの大きな断片を受容細胞にトランスフェクトするこ とである。これら２つのＤＮＡ断片は合わせると、アデノウイルスゲノムと類似 領域の全てを包含する。この類似領域内で組換え現象が起こり、欠失又は改変を 含んでいる組換えウイルスゲノムが造られる。多重欠損ベクターの場合、受容細 胞は組換え機能だけではなく、トランスフェクトされたウイルスゲノムには含ま れていない失われたウイルス機能の全てを提供、すなわち組換えウイルスゲノム の全ての欠損を相補する。多重欠損ベクターは、例えばＩＴＲおよび／又はパッ ケージングシグナルの改造によってもさらに改変され、そのような多重欠損ベク ターのみ、相補的細胞系において機能し、又増殖する。 加えて、本発明は、本発明の多重欠損アデノウイルスベクターの繁殖あるいは 増殖のための相補的細胞系をも提供する。本発明の好ましい細胞系はアデノウイ ルスゲノムのＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４領域を含む遺伝子機能の内の少なくと も１つの遺伝子機能を相補することで特徴付けられる。他の細胞系としては後期 領域を含む遺伝子機能由来の少なくとも１つの遺伝子機能において欠損があるア デノウイルスベクターを相補するもの、初期および後期の遺伝子機能の組合わせ を相補するもの、および全てのアデノウイルス機能を相補するものが含まれる。 当業者であれば選択する細胞系は、関心のある組換え多重欠損アデノウイルスベ クターから欠失し、それらの機能を特異的に相補するものであり、標準的な分子 生物学的技術を用いて製せられるものであることがわかるであろう。該細胞系は さらに相補的遺伝子を重複しないように含んでおり、それがベクターゲノムが細 胞ＤＮＡと組変えする可能性を最小限に、実質的に排除するということによって さらに特徴付けられる。従って、複製可能なアデノウイルスはベクター保存株か らは排除され、従って特定の治療目的、特に遺伝子治療の目的に好適である。こ れは又非相補的細胞におけるアデノウイルスの複製をも排除する。 相補的細胞系は、組換えアデノウイルスベクターの高力価保存株を製する為に は、２以上の欠損アデノウイルス遺伝子機能の産物を、それらの産物にとって適 切なレベルで発現することが可能なものでなければならない。例えば、Ｅ２Ａ産 物であるＤＢＰは、アデノウイルスＤＮＡの複製のためには、化学量論的なレベ ル、すなわちかなり高レベルで発現する必要があるが、Ｅ２Ｂ産物であるＡｄｐ ｏｌはアデノウイルスＤＮＡの複製のためには、触媒レベル、すなわち比較的低 レベルでのみ発現する必要がある。組換えアデノウイルスベクターの高力価保存 株を確実にするためには、産物のレベルを適切にしなければならないだけでなく 、産物の時間的な発現を細胞の通常のウイルス感染において見られるものと矛盾 がないようにしなければならない。例えば、ウイルスのＤＮＡ複製に必要な構成 成分はウイルス粒子の構築に必要な構成成分よりも前に発現されなければならな い。ウイルス産物の高レベルの発現にしばしば伴う細胞毒性を回避するために、 又産物の時間的発現を調節するために、誘導プロモーター系が使用される。例え ば、ヒツジのメタロチオネイン誘導プロモーター系が、完全なＥ４領域、Ｅ４領 域の転写解読枠６、およびＥ２Ａ領域を発現するのに使用できる。他の好適な誘 導プロモーター系の例には細菌のｌａｃオペロン、テトラサイクリンオペロン、 Ｔ７ポリメラーゼ系、および真核生物と原核生物の転写因子、抑制因子やその他 の構成成分を組み合わせたものやキメラ構築物があるが、これらのものに限定さ れない。発現されるべきウイルス産物に高い毒性があるときは、２つに分かれた 誘導系を用いることが好ましく、ここでインデューサーはウイルスベクター内に 保持され、誘導産物は相補的細胞系の染色質内に保持される。テトラサイクリン 発現系やｌａｃ発現系の様な、抑制性／誘導性発現系も又使用してよい。 トランスフェクトされた細胞の小さな部分に入り込むＤＮＡは、より小さな分 画内でさえも安定に維持されるようになる。１つあるいはそれ以上のトランスフ ェクトされた遺伝子を発現している細胞系の単離は、例えば抗生物質、薬物ある いはその他の化合物に対する耐性を与える第２の遺伝子（マーカー遺伝子）を同 じ細胞に導入することによって達成される。この選別は、抗生物質、薬物あるい はその他の化合物の存在下では、移入された遺伝子を有さない細胞は死に、一方 で移入された遺伝子を含む細胞は生き残るという事実に基づいている。そして生 き残った細胞はクローン単離され個々の細胞系として拡大される。これらの細胞 系ではマーカー遺伝子と関心ある１またはそれ以上の遺伝子の両方を発現するも のが含まれる。細胞の繁殖は親の細胞系およびその選別の方法に依存している。 細胞のトランスフェクションも又細胞のタイプに依存している。トランスフェク ションに使用される最も一般的な技術は、リン酸カルシウム沈澱、リポソーム、 ＤＥＡＥデキストランにより仲介されるDNA 伝達である。 ここで具体的に説明されるＤＮＡ配列およびプラスミドの多くの改変や変異が 可能である。例えば、遺伝暗号の縮重により、コードされたポリペプチドコーデ ィング配列の変更なしに、ポリペプチドのコーディング全領域にわたる、又、翻 訳停止シグナル中での、ヌクレオチドの置換が見込まれる。そのような置換可能 な配列は、特定の遺伝子の既知のアミノ酸あるいはＤＮＡ配列から演繹すること ができ、常套の合成あるいは部位特異的変異導入法によって構築され得る。合成 ＤＮＡ法はItakura らの方法，Science，198，1056（1977）およびCreaらの方法 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，5765 （1987）に実質的に一致して行われ 得る。部位特異的変異導入法はManiatisら，モレキュラークローニング：ア ラ ボラトリー マニュアル (Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，コールド スプリングハーバー，ニューヨーク（第２版 1989 年）に記載されている。従っ て、本発明はここで特に例示されたＤＮＡ配列およびプラスミドに決して限定さ れない。例示されたベクターは嚢胞性繊維症の遺伝子治療の為のものであるので 、嚢胞性繊維症膜貫通型制御因子（cystic fibrosis transmembrane regulator: ＣＦＴＲ）遺伝子を有し、発現するが、しかしながら記載されたベクターは他の 疾病−気腫、喘息、成人呼吸促進症候群および慢性気管支炎のような慢性の肺疾 患、癌や冠状動脈性心臓病や遺伝子治療や予防接種などによって好適に治療ある いは予防されるその他の疾患が含められるがそれらに限定されない−を治療する ために容易に改造される。従って、いかなる遺伝子あるいはＤＮＡ配列も多重欠 損アデノウイルスベクターに挿入され得る。遺伝子あるいはＤＮＡ配列の選択は 、例えば遺伝子治療、予防接種などの状況において治療および／又は予防効果を なし遂げるものである。 当業者であれば本発明の多重欠損アデノウイルスベクターを治療や予防、すな わち遺伝子治療、予防接種など（例えばRosenfeld ら，Science，252，431-434( 1991),Jaffe ら，Clin．Res.，39(2)，302A(1991)，Rosenfeld ら、Clin．Res. ，39(2)，311A (1991)， Berkner，BioTechniques，6，616-629（1988）参照 ）の目的で動物に投与する好適な方法があることが理解できよう。又ベクターの 投与には複数の経路を用いることができるが、特別な経路が別の経路に比べてよ り迅速、且つより効果的な反応を可能にするということがわかるだろう。医薬上 許容しうる賦形剤も又当業者に良く知られているものであり容易に入手できるも のである。賦形剤の選択は組成物を投与するのに用いられる個々の方法によって 幾分決定される。従って、本発明の医薬組成物の好適な製剤は広く多様である。 以下の製剤および方法は単なる例示であって何らこれに限定されるものではない 。しかしながら経口、注射およびエアロゾル製剤が好ましい。 経口投与に好適な製剤は（ａ）水、生理食塩水あるいはオレンジジュースのよ うな希釈液に有効量の化合物を溶解させた液状溶液剤；（ｂ）各々、特定量の活 性成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤あるいは錠剤；（ ｃ）適当な液体での懸濁液剤および（ｄ）好適な乳剤からなる。錠剤にはラクト ース、マンニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微晶性セル ロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化シリコン、クロスカルメロース ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびその他の 賦形剤、着色剤、希釈液、緩衝剤、給湿剤、防腐剤、芳香剤および医薬上適合し 得る賦形剤を１つあるいはそれ以上含めることができる。ロゼンジ剤は、活性成 分を通常シュクロースやアカシアあるいはトラガカントといった香味料に含める ことができ、又、ゼラチンやグリセリン、あるいはシュクロースやアカシアのよ うな不活性な基剤に活性成分を含めている香錠剤や、乳剤、ゲル剤などは活性成 分に加え、この分野で公知の賦形剤が含められる。 本発明のベクターは、単独であるいは他の好適な成分と組み合わせて、吸入に よって投与されエアロゾル製剤に製せられる。これらのエアロゾル製剤はジクロ ロジフロロメタン、プロパン、窒素などのような圧縮された許容しうる抛射薬内 に入れることができる。それらは又ネブライザーやアトマイザーのような非圧縮 性製剤用医薬品して製剤化してもよい。 非経口的な投与に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射 液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤および予定された被投与者の血 液と製剤を等張にするための溶質が含まれていても良く、又水性および非水性の 無菌の懸濁液剤があり、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤および防 腐剤が含まれていてもよい。製剤はアンプルやバイアルのように単位投与量ある いは多投与量で容器に封入され、フリーズドライ（凍結乾燥）され、注射するた めには使用直前に例えば水のような注射用の無菌の液体の希釈液を添加するだけ でよい状態で保存され得る。即席の注射液剤や懸濁液剤は前述の種類の無菌の粉 末、顆粒および錠剤から調製される。 さらに、本発明において用いられるベクターは乳化基剤や水溶性基剤のような 種々の基剤と混合することにより座剤に製することができる。 膣内投与に好適な製剤にはペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、パスタ、 泡あるいはスプレー形態が挙げられ、それらには活性成分に加え、当分野で適当 であることが知られている担体が含められる。 本発明において、動物、とくにヒトに投与される量は重要な遺伝子又は他の配 列、用いた組成、投与の方法および治療される特定の部位および生物によって変 化する。投与量は好ましい応答、例えば、治療あるいは予防応答を好ましい時間 枠内でもたらすに十分であるべきである。 本発明の多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補的細胞系は又、生体外で も利用可能性がある。例えば、アデノウイルスの遺伝子機能および構築、あるい は好適な標的細胞における外来ＤＮＡの発現を研究するのに用いることができる 。当業者であれば、本発明のアデノウイルスベクターでトランスフェクトされ得 る、および／又はアデノウイルス粒子に感染させて、結果として挿入されたアデ ノウイルスＤＮＡ補充成分の発現を生じる細胞を選択することによって、好適な 標的細胞を同定することができる。好ましくは、好適な標的細胞はアデノウイル スの 細胞への接着および侵入のための受容体を有するものが選択される。そのような 細胞は全ての哺乳類からはじめに単離されたものをも含むが、それらに限定され るものではない。一旦好適な標的細胞を選抜すれば、該標的細胞を、本発明の外 来のＤＮＡを有する組換え多重欠損アデノウイルスベクターあるいはアデノウイ ルス粒子に接触させて、それぞれトランスフェクションあるいは感染させる。発 現、毒性および標的細胞での外来ＤＮＡの挿入および活性に関連する他のパラメ ーターは当分野で良く知られている通常の方法を用いて測定する。その際研究者 らは、種々の生物から外殖され組織培養で研究されている種々の細胞種における 該発明のベクターによって導入された外来ＤＮＡの種々の配列の発現の効能や効 果と同様に、アデノウイルス感染に関する現象論について学び、解明にすること ができる。 さらに遺伝子治療において好適に治療される疾患を有する患者からの外殖ある いは除去された細胞が、本発明において有用に生体外で操作される。例えば、生 体外で培養されたそのような個体由来の細胞を本発明のアデノウイルスベクター と、トランスフェクションするのに好適な条件下で接触させるが、その条件は当 業者であれば容易に決定できるものであり、該ベクターは、好適な外来ＤＮＡを 含む。そのような接触は好適には培養細胞へのベクターのトランスフェクション をもたらし、トランスフェクトされた細胞は好適なマーカーおよび選択的な培養 条件によって選択される。その際、標準的な方法を用いて細胞の生存性を調べ、 すなわち毒性を測定し、関心のベクターの１またはそれ以上の外来遺伝子の遺伝 子産物の存在を調べる、すなわち発現を測定し、個々の細胞について、関心ある 外来遺伝子を有するベクターとの適合性、その発現およびその毒性について調べ る。それによってそのようにして調べたベクター／外来ＤＮＡ系をを用いて、個 体の治療の妥当性や効能についての情報が得られる。そのような外殖およびトラ ンスフェクトされた細胞、用いた遺伝子治療法の可能な効能／毒性を調べるのに 役立つのに加えて、又その個体内の生体内の位置に戻すことが出来る。そのよう な個体に戻される細胞は、それについての生体外トランスフェクションあるいは 個体体内の他の組織や細胞と隔てるマトリックスによって包まれあるいは埋め込 まれて場合を除いては、改変せず、装飾せずに戻されるかもしれない。そのよう な基質としてはコラーゲンやセルロースなどの生体適合性物質であってもよい。 勿論それとは別に、あるいはそれに加えて、生体外の試験で一旦陽性の反応を観 察したら、上に詳細に記載した投与方法によって生体内のそのままの位置でトラ ンスフェクションを実行することができる。 以下の実施例にさらに本発明を説明するが、勿論、どのような場合にもその範 囲を限定するものと解釈すべきではない。本実施例で言及される酵素類は特に指 定し示さない限りベセスダリサーチラボラトリーズ（ＢＲＬ），ガイザースバー グ(Gaithersburg)，メリーランド州２０８７７，ニューイングランドバイオラブ ス社（ＮＭＢ），ベバリー，マサチューセッツ州０１９１５あるいはベーリンガ ーマンハイムバイオケミカルズ（ＢＭＢ），７９４１ キャッスルウェイドライ ブ，インディアナポリス，インディアナ州 ４６２５０ より入手可能であり、 製造元の推奨に実質的に従って用いる。ここで用いる技術の多くは当業者に良く 知られたものである。分子生物学的な技術は、Maniatisら，モレキュラークロー ニング：ア ラボラトリー マニュアル (Molecular Cloning: A Laboratory Man ual)，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（第２版，1989年）およびカ レント プロトコール イン モレキュラー バイオロジー （Current Protocol s in Molecular Biology)，（Ausubel ら編，1987年）のような好適な実験マニ ュアルに詳細に記載されている。当業者であれば以下に示した種々に代えて別の 方法をそれに代わる別の方法に置換えができることを認識するであろう。実施例 および図は、嚢胞性繊維症膜貫通型制御因子遺伝子（ＣＦＴＲ）を有するＡｄ_GV ．１０、Ａｄ_GV．１１、Ａｄ_GV．１２およびＡｄ_GV．１３、すなわちＡｄ_GVＣＦ ＴＲ．１０、Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１１、Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１２およびＡｄ_GVＣＦＴ Ｒ．１３に関するものであるが、これらのベクターはＣＦＴＲ遺伝子の発現に限 定されるものではなく、他の遺伝子およびＤＮＡ配列の発現にも利用できる。従 って、例えば本発明は外来遺伝子、その断片である好適なＤＮＡ配列ある いはその他のＤＮＡ配列からなるようなベクターをも包含する。そのような好適 なＤＮＡ配列は遺伝子治療によって好適に治療される疾患を治療するための遺伝 子治療において効果を有するであろう。あるいは好適なＤＮＡ配列は又、ＤＮＡ 配列が哺乳類中で発現され、結果として例えばポリペプチド−該ポリペプチドに 対する免疫反応を引き起こすことができる−を生じ、予防接種に用いるような時 など予防効果も有するであろう。さらに哺乳類で発現しうる好適なＤＮＡ配列の さらに別の使途は、アンチセンス分子、特にＭＲＮＡおよび合成オリゴヌクレオ チドからなる群より選択されるアンチセンス分子のような、何か他の好適な治療 および／又は予防剤を提供することである。 実施例１ この実施例においてＥ１およびＥ３領域に欠損のあるＡＤ_GV．１０を含む１つ の実施態様、すなわちＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０の作製について述べる。 Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１０はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター からＣＦＴＲ遺伝子を発現する。このベクターの２つの作製例を構築し、図１− Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｒの一連の概略図である− に示されるようにベクターゲノムのＥ１領域にＣＦＴＲ発現カセットが置かれる 方向によってＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｒと命名した 。 ＣＦＴＲ発現カセットは以下のようにして構築した。ｐＲＫ５（ジェネンテッ ク社，サウスサンフランシスコ，カリフォルニア州）をKpn Ｉ（ニューイングラ ンドバイオラブズ（ＮＥＢ），ベバリー，マンハッタン州）で消化し、マングビ ーンヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で平滑末端化し、Xho Ｉリンカー（ＮＥＢ）をKpn Ｉサイトの位置で連結させた。得られたベクターをｐＲＫ５−Xho Ｉと命名した 。そしてｐＲＫ５−Xho ＩをSma Ｉ（ＮＥＢ）とHin dIII（ＮＥＢ）で消化し、 マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。ＣＦＴＲ遺伝子を含むプラスミド 、ｐＢＱ４．７（Lap-Chee Tsui 博士，Hospital for Sick Children，トロント ，カナダ）を有するプラスミドはAva Ｉ（ＮＥＢ）およびSac Ｉ（ＮＥＢ）で消 化し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。これら２つの断片を単離し 相互に連結させてＣＦＴＲ発現カセットであるｐＲＫ５−ＣＦＴＲ１を作成した 。 ｐＲＫ５−ＣＦＴＲ１をSpe Ｉ（ＮＥＢ）およびXho Ｉで消化し、クレノウ（ ＮＥＢ）で平滑末端化した。１−４５４／３３２５−５７８８由来のＡｄ５配列 を含むｐＡｄ６０．４５４（L.E．Babiss 博士，ロックフェラー大学，ニューヨ ーク，ニューヨーク州）をBgl II（ＮＥＢ）で消化し、クレノウで平滑末端化し た。これら２つの断片は低融点アガロース技術（Maniatisら，モレキュラークロ ーニング：ア ラボラトリー マニュアル （Motecular Cloning: alaboratory m anual），コールドスプリングハーバー研究所，コールドスプリングハーバー， ニューヨーク州（第２版 1989年））によってベクター配列から精製し、相互に 連結させてｐＧＶＣＦＴＲ．１０ＬおよびｐＧＶＣＦＴＲ．１０Ｒの左アームプ ラスミドを作成した。 ｐＧＶＣＦＴＲ．１０ＬあるいはｐＧＶＣＦＴＲ．１０Ｒ由来の左アームプラ スミドをNhe Ｉ（ＮＥＢ）で消化した。ウイルスの右アームはＡｄ５ｄ１３２４ （Thomas E．Shenk 博士，プリンストン大学，プリンストン，ニュージャージー 州）をCla Ｉ（ＮＥＢ）で消化することによって作成した。２つの断片−小さ い９１８塩基対断片および大きい、およそ３２，８００塩基対断片−をショ糖密 度勾配遠心（マニアティスら，上述）によって分離した。大きい方の断片を左ア ームプラスミド断片と混合し、常套のリン酸カルシウム法（Grahamら，Virology ,52，456(1973)）によって２９３細胞にトランスフェクトした。得られた組換え ウイルスを２９３細胞上でプラーク精製し、常套のウイルス技術（例えばBerkne rら，(1983)および(1984)，上述）を用いてウイルスの保存株を樹立した。 実施例２ この実施例においてＥ１、Ｅ３およびＥ４領域に欠損のあるＡｄ_GVＣＦＴＲ． １１の作製について述べる。 Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１１はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０の１−２７０８２、即ち左アー ムとBam HI（ＮＥＢ）およびSal Ｉ（ＮＥＢ）で線状化されたＡｄ５の２１５６ ２−３５９３５、即ち右アームを含むプラスミド（ｐＧＶ１１Ａ，ｐＧＶ１１Ｂ ，ｐＧＶ１１ＣあるいはｐＧＶ１１Ｄ；後で詳細に述べる）との間での単一の生 体内組換えによって構築され、それに後述の種々のＥ３およびＥ４の改変体を導 入した。 完全なＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０をSpe Ｉ（ＮＥＢ）およびSrf Ｉ（ストラタジー ン社，ラ ジョラ，カリフォルニア州）で消化して１−２７０８２塩基対の断片 を得た後、Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１０由来の左アームを全溶液の１／４が４０％であ る凹型１０−４０％ショ糖密度勾配で単離した。 右アームを改変ｐＧＥＭベクター（ｐＧＢＳ）のBam HI-Sal Ｉ消化によって 得られた。ｐＧＢＳは以下のようにして作製した。ｐＧｅｍＩ（プロメガ社，マ ディソン，ウイスコンシン州）をEco RIで消化しクレノウで平滑末端化し、そし てSal Ｉリンカーを該ベクターに連結させた。そして、得られたＤＮＡをSal Ｉ で消化し再び連結させ、それによってEco RIサイトをSal Ｉサイトで置換し２つ のSal Ｉサイト間の配列を欠如させ、Hin DIIIで消化されクレノウで平滑末端化 したｐＧＥＭＨ／Ｐ／Ｓを作製し、Bam HIリンカーを該ベクターに連結させてｐ ＧＥＭＳ／Ｂを作製した。ｐＧＥＭＳ／ＢをBam HIおよびSal Ｉで消化し、ｐ５ ０−１００（Paul Freimuth 博士，コロンビア大学，ニューヨーク州）と呼ばれ るｐＢＲプラスミド由来の約１４ｋｂのBam HI-Sal Ｉ断片（Ａｄ５由来の２１ ５６２−３５９３５）と連結させ、ｐＧＢＳを作製した。 抗免疫性および抗炎症性の特性を有する２つのＡｄ Ｅ３遺伝子産物をアデノ ウイルスベクターに導入するために３つの異なった様式の右アームプラスミドを 構築した。ｐＧＶ１１（０）（実施例７）と命名されたｐＧＢＳ△Ｅ３ＯＲＦ６ での大きなＥ３欠失を、５’末端にＡｄ２ Ｅ３ １９ｋＤａの抗免疫性遺伝子 産物を、および３’末端にＡｄ５ Ｅ３ １４．７ＫＤａの抗炎症性遺伝子産物 を有する２シストロン性のｍＲＮＡの発現を駆動するラウス肉腫ウイルスの長い 末端反復配列（ロングターミナルリピート）（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを 有する発現カセットの３つの異った様式のものに必須的に置換した。Bst BI（Ｎ ＥＢ）断片の欠失によって１９ｋＤａのｃＤＮＡ断片を欠失させることによりさ らに１つのウイルスを構築した。Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１１（Ｄ）と命名されたこの ウイルスはＥ３ １４．７ｋＤａの抗炎症性遺伝子産物のみを有する単シストロ ン性のｍＲＮＡの発現を駆動するＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターを有する。 まず、Eco RI（２７３３１）−Nde Ｉ（３１０８９）断片をＰＵＣ１９ポリリ ンカーの同一サイトにクローニングすることによりｐＧＢＳ△Ｅ３（実施例５） 由来のSpe Ｉ（２７０８２）−Nde Ｉ（３１０８９）断片をｐＵＣ１９にサブク ローニングした。ｐＧＢＳから生成されたHin dIII（２６３２８）− Eco RI（ ２７３３１）断片をこのクローンの Eco RI サイトにクローニングして、ｐＨ Ｎ△Ｅ３を作製した。適切なプライマーを用いて、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター 、Ａｄ２ Ｅ３ １９ｋＤａの遺伝子産物およびＡｄ５ Ｅ３ １４．７ｋＤａ の遺伝子産物を有する、フランキングXba Ｉサイトを持つＰＣＲ断片を作製した 。増幅した断片をXba Ｉで消化しｐＵＣ１９にサブクローニングしてｐＸＡを作 製した。Xba Ｉ断片の解析後、該断片をｐＨＮ△Ｅ３に連結させｐＨＮＲＡを作 製した。 適当なプライマーを用いて、それらを含むｍＲＮＡの翻訳を増強させることが 知られている（Jobling ら，Nature，325，622-625(1987)；Jangら，Genes and Development，4，1560-1572(1990)）内部リボーゾーム導入サイト（ＩＲＥＳ） をコードしているフランキングBst BIサイトを持つ２つのＰＣＲ断片を作製した 。１つの断片（様式Ｂ）にはアルファルファモザイクウイルスの外皮タンパク質 ｍＲＮＡの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４ リーダー）（Joblingら，上 述）由来の３４塩基対のＩＲＥＳが含まれる。もう１つの断片（様式Ｃ）には脳 心筋炎ウイルス（エンセファロマイオカルディティスウイルス）（ＥＭＣＶ）ｍ ＲＮＡ（Jangら，上述）の５’非翻訳領域由来の５７０塩基対のＩＲＥＳが含ま れる。様式ＢあるいはＣ由来の各々のBst BI断片をｐＸＡにおいてBst BI断片の 代わりにクローニングした。得られたプラスミド−それぞれｐＸＢ、ｐＸＣと命 名される−をXba Ｉ断片の配列解析の後、それぞれｐＨＮ△Ｅ３に移し、ｐＨＮ ＲＢおよびｐＨＮＲＣを作製した。 ｐＧＢＳ△Ｅ３ＯＲＦ６由来のSpe Ｉ（２７０８２）−Nde Ｉ（３１０８９） 断片を、ｐＨＮＲＡ、ｐＨＮＲＢ、ｐＨＮＲＣおよびｐＨＮＲＤ由来のSpe Ｉ− Nde Ｉ断片で置換し、それぞれｐＧＶ１１Ａ、ｐＧＶ１１Ｂ、、ｐＧＶ１１Ｃお よびｐＧＶ１１Ｄを作製した。 ｐＧＢＶプラスミドＤＮＡをBam HIおよびSal Ｉで線状化し、精製した左アー ムＤＮＡ断片と２０μｇ全ＤＮＡまでで種々に濃度を変えて混合し、必要に応じ てサケ***あるいはウシ胸腺ＤＮＡ（ライフテクノロジー社，ガイザースバーグ (Gaithersburg)，マサチューセッツ州）でＤＮＡ量を約２０μｇになるように用 いた。混合した断片を常法のリン酸カルシウム技術（Grahamら，上述）を用いて ２９３細胞にトランスフェクトした。 トランスフェクトして５日後、細胞単層を３回の凍結融解により回収した。得 られたハイブリッドウイルスは２９３細胞上で力価検定し、単離されたプラーク を選び取った。最初のプラーク保存株中に単一の組換えウイルスが存在するのを 確実にするためにプラーク単離の工程を２回以上繰り返した。単離プラーク保存 株をBurlseson ら、ヴィロロジー：ラボラトリー マニュアル（Virology: a La boratory Manual ）、アカデミック出版社、（1992年）に記載されている常套の ウイルス技術に従って大容量のウイルス保存株に増幅した。 図２は種々のＡＤ_GVＣＦＴＲ．１１ウイルスベクターの一連の概略図である。 図は比較の為ＡＤ_GVＣＦＴＲ．１０Ｌの図と一列に並べた。 実施例３ この実施例においてＥ１、Ｅ３およびＥ４領域に欠損のあるＡｄ_GVＣＦＴＲ． １２の作製について述べる。 Ａｄ_GV．１２はＥ４領域の完全な排除により特徴付けられる。この大きな欠失 によりおよそ１０ｋｂまでの外来のＤＮＡを挿入することができる。さらに重要 なことに、ゲノムの他の領域はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２ベクターを用いた外来ＤＮ Ａ発現カセットの導入に利用しやすい。いまやこの欠失が他の産物のためのより 大きな発現カセットの取り込みを可能にするのである。例えば、膜貫通型のドメ インを有さず、それゆえ膜に結合していないＴＮＦあるいはＩＬ−６などの可溶 性の受容体、および例えばｃｄｃ２、ｃｄｋキナーゼ、サイクリンＥあるいはサ イクリンＤといったサイクリン類のような細胞周期制御産物に対するもののよう なアンチセンス分子、および炎症や免疫応答を排除するための転写因子、すなわ ちＥ２Ｆあるいはｃ−ｍｙｃなどである。 ｐＧＶ１１（０）を改造し全Ｅ４領域が欠失している右アームプラスミドを作 製する。得られたプラスミドは全Ｅ３およびＥ４領域を欠失し、ｐＧＶ１２（０ ） と命名される。これは３２８１１のAfl IIIサイトおよび３５６４０のBsq Ｉサ イトでPac Ｉ制限部位を導入することによりなされる。これら２つのサイト間で のPac Ｉ断片の欠失がＥ４プロモーターおよびＥ４ポリＡサイト内にあるＥ４ ＴＡＴＡ要素を含む全てのＥ４配列を効果的に排除する。 ウイルスの構築は２９３／Ｅ４細胞系あるいは２９３／ＯＲＦ６細胞系を使用 する以外は先に述べたようにして行う。Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｌ由来の左アーム 右アームｐＧＶ１２（０）プラスミド、および全ての他の一般的な技術は実施、 例２で述べたものである。Ｅ４はウイルスの増殖に必要な必須遺伝子産物を有し ているので、得られたＥ４欠失変異ウイルスは外因的に発現されたＥ４の非存在 下では増殖できない。従って、全てのウイルス構築の操作は新しい２９３／Ｅ４ 細胞系あるいは２９３／ＯＲＦ６細胞系で行われる（各々実施例８および実施例 ９に述べられている）。得られたウイルスがＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２であり比較と してＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｌのみ用いて図３に図式的に示してある。 実施例４ この実施例においてＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４領域に欠損のあるＡｄ_GVＣ ＦＴＲ．１３の作製について述べる。 Ａｄ_GV．１３はＥ１およびＥ４領域の完全な排除（ＡＤ_GV．１２の如く）だけ でなくＥ２Ａの完全な排除によっても特徴付けられる。Ｅ２Ａの完全なコード領 域は、転写解読枠（Vos ら，Virology，172，634-642（1989）；Broughら，Viro logy，190，624-634（1992））の両末端でのCla Ｉ制限部位の挿入を有するＨ５ ｉｎ８００およびＨ５ｉｎ８０４という２つのＥ２Ａ変異ウイルス由来のＤＮＡ を相互に融合させることによって欠失させる。Ｈ５ｉｎ８００のCla Ｉサイトは 遺伝子のコドン２および３の間にあり、Ｈ５ｉｎ８０４のCla ＩサイトはＥ２Ａ 遺伝子の停止コドン内にある。結果として生ずるウイルスはＥ２Ａ読み枠と類似 点を持たない２３アミノ酸からなる転写解読枠を含む。さらに重要なことに、こ のカセットはウイルスゲノムの他の領域に特徴的な遺伝子を導入することがで きる。これは関心ある遺伝子を小ＯＲＦが存在する適切な読み枠に挿入すること により、あるいは関心ある遺伝子に加えてそれ自身のプロモーター配列、ポリア デニレーションシグナルおよび停止コドンを有する他の発現カセットを導入する ことによって成し得る。 アデノウイルスＤＮＡをＨ５ｉｎ８００およびＨ５ｉｎ８０４から調製した。 制限酵素Hin dIII（ＮＥＢ）で消化した後、両Ｈ５ｉｎ８００およびＨ５ｉｎ８ ０４由来のHin dIIIA断片をｐＫＳ+（ストラタジーン社）にクローニングする。 得られたプラスミドをｐＫＳ+ Ｈ５ｉｎ８００Hin dIIIAおよびｐＫＳ+ Ｈ５ｉ ｎ８０４Hin dIIIAとそれぞれ命名した。そしてｐＫＳ+ Ｈ５ｉｎ８００Hin dII IA由来のCla Ｉ（ＮＥＢ）断片を単離し、ｐＫＳ+ Ｈ５ｉｎ８０４Hin dIIIA由 来の同一のCla Ｉ断片の代わりにクローニングする。このキメラプラスミド、ｐ Hin dIIIA△Ｅ２Ａは上に述べたように全てのＥ２Ａ読み枠を効果的に排除して いる。この点で、Ｅ２Ａの欠失をBamH Ｉ（ＮＥＢ）および Spe Ｉ（ＮＥＢ）制 限部位に移し、ｐＧＶ１２（０）中の野性型の配列を置換してｐＧＶ１３（０） を構築した。 Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１３ウイルス（図４参照）をＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０左アーム ＤＮＡおよびｐＧＶ１３（０）右アームプラスミドＤＮＡを用いることによって 既に述べた様にして構築する。しかしながら、このウイルス構築物の宿主細胞系 は３重の相補的細胞系２９３／Ｅ４／Ｅ２Ａである。図４はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１ ３ウイルスベクターの概略図である。図は比較の為にＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｌの 図と一列に並べてある。 実施例５ この実施例においてｐＧＢＳΔＥ３の作製について述べる。 このプラスミドは、Ｅ３プロモーターおよび現存するＥ３遺伝子を含めた、ｐ ＧＢＳ内のＥ３領域の大部分を除去するため、他の構築物のために場所を空ける ため、そしてＥ３発現カセットの導入を容易にするために製せられる。このプラ スミドは２８３３１から３０４６９までの欠失を含んでいる。 ＰＣＲ断片はＡｄ５ｓ（２７３２４）およびＡ５ａ（２８３３０）Ｘをプライ マーとして、そしてｐＧＢＳを鋳型として用いて製せられる。得られた断片をEc o RI（２７３３１）およびXba Ｉ（２８３３０）で消化し、ゲル精製した。そし てこの断片をEco RIサイト（２７３３１）およびXba Ｉ（３０４７０）サイトで ｐＧＢＳに導入した。 実施例６ この実施例においてｐＧＢＳΔＥ３ΔＥ４の作製について述べる。 さらなる外来性の配列をアデノウイルスゲノム内に移すのを容易にするために Ａｄ５ Ｅ４領域の大きな欠失をｐＧＢＳΔＥ３に導入した。３２８３０−３５ ５６６Ｅ４コーディング配列を欠失させた。 ｐＧＢＳをMun Ｉで消化したＤＮＡ断片をクレノウで処理して該断片を平滑末 端化し、これにPac Ｉリンカーを連結させることによって３２８３０の位置でMu n Ｉサイトの代わりにPac Ｉサイトを製した。その改変したＤＮＡをNde Ｉで消 化し、得られた１７３６塩基対断片（Nde Ｉ３１０８９−Pac Ｉ３２８３０）を ゲル精製した。ＰＣＲ断片を、Ａ５（３５５６４）Ｐ（ＩＤＴ、コーラルビレー 、アイオワ州）およびＴ７プライマー（ＩＤＴ、コーラルビレー、アイオワ州） 、並びに鋳型としてｐＧＢＳを用いて調製した。得られた断片をPac ＩおよびSa l Ｉで消化しPac Ｉ３５５６６−Sal Ｉ３５９３５を作製した。ｐＵＣ１９のポ リリンカー領域内のSma ＩサイトをPac Ｉリンカーに連結させることによってPa c Ｉサイトに改変した。Pac Ｉ３５５６６−Sal Ｉ３５９３５断片を改変させた ｐＵＣ１９ベクターにポリリンカー領域内のPac ＩおよびSal Ｉサイトの位置で それぞれ移した。改変したNde Ｉ３１０８９−Pac Ｉ３２８３０断片を、Pac Ｉ ３５５６６-Sal Ｉ３５９３５断片が既に挿入されているｐＵＣ１９に、Nde Ｉ およびPac Ｉサイトの位置でそれぞれ移した。ｐＵＣ１９プラスミド由来のNde Ｉ３１０８９−Sal Ｉ３５９３５断片をゲル精製によって精製し、ｐＧＢＳΔＥ ３ 内の各Nde ＩおよびSal Ｉサイトに置き換えてクローニングしてｐＧＢＳΔＥ３ ΔＥ４を得た。 実施例７ この実施例においてｐＧＢＳΔＥ３ＯＲＦ６の作製について述べる。 Ａｄ５の８９４塩基対のＥ４ ＯＲＦ−６遺伝子をｐＧＢＳΔＥ３ΔＥ４中の Ｅ４プロモーターの３’に置いた。ＯＲＦ−６は非Ｅ４相補的細胞系においては ウイルスの増殖に唯一絶対的に必要なＥ４産物である。それゆえに、Ａｄ_GVＣＦ ＴＲ．１１ウイルスを２９３細胞で繁殖させ得る為に、この産物をそれ独自のプ ロモーター制御下で右アームプラスミド（実施例２）に再導入した。 ＰＣＲ断片をＡ５ｓ（３３１９０）Ｐ（３２塩基対；5'CACTTAATTAAACGCCTACA TGGGGGTAGAGT3'）（配列表配列番号１）およびＡ５ａ（３４０８４）Ｐ（３４塩 基対；5'CACTTAATTAAGGAAATATGACTACGTCCGGCGT）（配列表配列番号２）をプライ マー（ＩＤＴ、コーラルビレー、アイオワ州）として、ｐＧＢＳを鋳型として用 いて製した。この断片をPac Ｉで消化しゲル精製した。その産物をｐＧＢＳΔＥ ３ΔＥ４中の１つのPac Ｉサイトに導入し、１９ｋＤａおよび１４．７ｋＤａＡ ｄ Ｅ３産物の発現のためにＥ３が改変されているプラスミドｐＧＶ１１（０） を製した。 実施例８ この実施例において２９３／Ｅ４細胞系の作製について述べる。 ｐＳＭＴ／Ｅ４は以下の様にして作製した。２７５２塩基対のMun Ｉ（Ａｄ２ のサイト３２８２５）−Sph Ｉ（ポリリンカー）断片を、Ａｄ２由来の領域３２ ２６４−３５５７７がサブクローニングされたｐＵＣ１９プラスミドであるｐＥ ４（８９−９９）から単離、クレノウで平滑末端化し、ホスファターゼ（ＮＥＢ ）で処理した。発現カセットプラスミドｐＳＭＴ／Ｅ４を作製するために、２７ ５２塩基対のMun Ｉ−Sph Ｉ断片を、Bam HIで線状化しクレノウで平滑末端化し ホスファターゼで処理したｐＭＴ０１０／Ａ⁺（McNeall ら，Gene，76，81-89(1 989)）に連結させた。 細胞系２９３は（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；アメリカンタイプカルチャー コレクション，ロックヴィル，メリーランド州）は１０％ウシ胎児血清ダルベッ コの改変イーグル培地（ライフテクノロージ社，ガイザースバーグ(Gaithersbur g)，メリーランド州）で培養した。ついで２９３細胞をEco RIで線状化したｐＳ ＭＴ／Ｅ４にリン酸カルシウム法（Sambrookら，モレキュラークローニング：ア ラボラトリー マニュアル ( Molecular Cloning: a laboratory manual ),コ ールドスプリングハーバー研究所出版（1989年））によりトランスフェクトした 。トランスフェクション後、約２４−４８時間で１００μＭメトトレキサートお よびアメソプテリン（シグマ化学社，セントルイス，ミズーリ州）を含有する培 地（上記）を添加した。培地中のメトトレキサートの存在はｐＳＭＴ／Ｅ４プラ スミドにおける選択マーカーであるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子の 発現を選択する。 正常の細胞のＤＨＦＲ遺伝子は与えるメトトレキサートの濃度によって阻害さ れ（細胞種特異的）、細胞死を引き起こす。ｐＳＭＴ／Ｅ４を有するトランスフ ェクトされた細胞におけるさらなるＤＨＦＲ遺伝子の発現はメトトレキサートに 対する耐性を与える。従って、新しい遺伝子を有するトランスフェクトされた細 胞のみがこれらの条件下で生育する細胞である（Sambrookら参照，上述，に総説 されている）。 選択マーカーを保持している最初の１つの細胞から細胞の小コロニーが形成さ れると、それらをクローンごとに単離し回収した（サムブルークら参照，上述， で概観されている）。これらのクローンは細胞系を生成するまで拡大した。これ らの細胞系はその産物−−この場合Ｅ４−−の発現でスクリーニングされる、ま た欠損のあるウイルス−−この場合Ｅ１およびＥ４の両方を欠損したウイルス− −を相補する機能性でスクリーニングされる。 この工程の結果、がＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２のようなＥ１およびＥ４の機能の両 方を欠損しているアデノウイルスベクターを相補することが可能な最初の２９３ ／Ｅ４細胞系が産生された。 実施例９ この実施例において２９３／ＯＲＦ−６細胞系の作製について述べる。 プライマーＡ５ｓ（３３１９０）ＰおよびＡ５ａ（３４０８４）Ｐをポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［ＰＣＲプロトコール，ア ガイド トウ メソッド アンド アプリケーション （PCR Protocols，A guide to Methods and Applicat ions），Innis ら編，アデミックプレス社、1990年］に用いてクローニングのた めのＡｄ５ Ｅ４のＯＲＦ−６遺伝子を増幅し、又、末端にPac Ｉサイトをつく った。増幅した断片をクレノウで平滑末端化しｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ(+)（ ストラタジーン社，ラ ジョラ，カリフォルニア州）にクローニングした。得ら れたプラスミド、ｐＣＲ／ＯＲＦ−６の配列を決定し、そのＯＲＦ−６挿入断片 を、ＳＭＴプロモータを含んでいる平滑末端化されたEco RI− Hin dIII断片を ｐＲＣｐｕｒｏの平滑末端化Mlu Ｉ−Hin dIIIサイトに連結させることによって 作製したｐＳＭＴ／ｐｕｒｏ発現ベクターに移し、ｐＳＭＴ／ＯＲＦ−６を作製 した。 トランスフェクトされた細胞がピューロマイシン耐性遺伝子［それを発現する 細胞がピューロマイシンの存在下で生育し得る］の選択下に置かれているという ことを除けば、実施例８に記載したように２９３細胞系を培養しｐＳＭＴ／ＯＲ Ｆ−６でトランスフェクトした。形質転換された細胞のコロニーをサブクローニ ングして、回収し、実施例８に記載したようにスクリーニングした。 この細胞系はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２ベクターシリーズのようなＥ１およびＥ４ 領域を欠損しているベクターを相補するのに好適である。 実施例１０ この実施例では２９３／Ｅ４／Ｅ２Ａ細胞系の作製について述べる。該２９３ ／Ｅ４／Ｅ２Ａ細胞系によりＥ１、Ｅ４およびＥ２Ａを欠損したウイルスベクタ ーが増殖できる。 ２９３／Ｅ４細胞に導入するためのＥ２Ａ発現カセット（図５参照）は以下の ように製する。最初の段階はＥ２Ａの効率的な発現のためにＥ２ＡのＡＴＧのま わりの塩基を完全なコザックのコンセンサス（コザックら，J．Molec．Biol.，1 96，947-950(1987)）を形成するように改造することである。Ｅ２Ａ遺伝子の５ ’末端を改造するために２つのプライマーを設計した。１８塩基対のオリゴヌク レオチド（5'gCCgCCTCATCCgCTTTT3'）（配列表配列番号３）であるＡｄ５ｓ（２ ３８８４）をＥ２Ａ遺伝子のSma Ｉサイトの隣にある内部領域を始点とするよに 設計した。３２塩基対のオリゴヌクレオチド（5'CCggAATTCCACCATggCgAgtcgggAA gAgg3'）（配列表配列番号４）であるＤＢＰ（ＡＴＧ）Ｒ１を、クローニングを 容易にするために、これを改造しているＥ２Ａ遺伝子のＡＴＧのまわりの翻訳コ ンセンサス配列を完全なコザック拡張コンセンサス配列を導入するように、およ び丁度５’のEco RIサイトを導入するように設計した。上記のプライマーを用い て得られたＰＣＲ産物をEco RIおよびSma Ｉ（ＮＥＢ）で消化し、ｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ IIＫＳ+（ストラタジーン社，ラ ジョラ，カリフォルニア州）の 同一のポリリンカー部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＫＳ／Ｅ ＳＤＢＰと命名した。 Sma Ｉ- Xba Ｉ断片をｐＨＲカウフマン（Morin ら，Mol．Cell Biol.，9，43 72-4380(1989)）から単離し、Ｅ２Ａの読み枠を補うためにｐＫＳ／ＥＳＤＢＰ の対応するSma ＩおよびXba Ｉサイトにクローニングした。得られたプラスミド はｐＫＳＤＢＰと命名した。発現カセット内に含まれるベクター由来のすべての 相同配列を排除するために、ポリリンカー内のEco RIサイトが破壊されている（ ジェンベク，ロックヴィル，メリーランド州）ＰＮＥＢ１９３（ＮＥＢ）の対応 するKpn Ｉおよび Pme Iサイトに、ｐＫＳＤＢＰ由来のKpn Ｉ−Dra Ｉ断片を移 した。得られたクローンｐＥ２Ａは実施例４のＥ２Ａを欠失したベクターに相同 するどんな余分な配列も有さずＥ２Ａの読み枠の全てを含んでいる。 適切にｍＲＮＡが核でプロセッシングされるように、又、Ｅ２Ａの発現がさら にエンハンスされるように５’スプライスカセットをｐＥ２Ａに移した。このこ とを行うために、実施例１に記載したｐＲＫ５をSac II（ＮＥＢ）で消化し、マ ングビーンヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で平滑末端化し、そしてEco RI（ＮＥＢ）で 消化した。得られた、スプライシングシグナルを含む、およそ２４０塩基対の重 要な断片をｐＥ２ＡのCla Ｉ（クレノウにより平滑末端化された）−Eco RIサイ トにクローニングし、ｐ５’Ｅ２Ａを製する。Ｅ２Ａ配列を有するｐ５’Ｅ２Ａ 由来の平滑末端化された（クレノウ）Sal Ｉ− Hin dIII断片をｐＳＭＴ／ｐｕ ｒｏおよびｐＳＭＴ／ｎｅｏの平滑末端化された（クレノウ）Xba Ｉサイトに移 す。 全てのＥ２Ａ遺伝子を含んだｐＫＳＥ２Ａ由来のXba Ｉ断片をｐＳＭＴ／ｐｕ ｒｏおよびｐＳＭＴ／ｎｅｏのXba Ｉサイトに移す。得られたＥ２Ａ発現プラス ミド、ｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｐｕｒｏおよびｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｎｅｏをそれぞれ ２９３／Ｅ４および２０３／ＯＲＦ−６細胞にトランスフェクトした。ｐＳＭＴ ／Ｅ２Ａ／ｐｕｒｏでトランスフェクトされた細胞は標準培地＋ピューロマイシ ン中の生育で選択され、ｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｎｅｏでトランスフェクトされた細 胞は標準培地＋ゲネチシン（Ｇ４１８；ライフテクノロジー社、ガイザースバー グ(Gaithersburg)、メリーランド州）中の生育で選択される。単離したコロニー のクローンの拡大は実施例８に記載のとおりである。得られた細胞系はそのＥ１ 、Ｅ４およびＥ２Ａ欠損ウイルスベクターを相補する能力により選別される。 これらの細胞系は、ウイルスベクターのＡｄ_GVＣＦＴＲ．１３シリーズに記載 されたものの様にウイルスのＥ１、Ｅ４およびＥ２Ａ領域を欠損しているウイル スベクターを相補するのに好適である。 実施例１１ この実施例では細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ）を親株として用いた相補的細胞系 の作製について述べる。 Ａｄ２ウイルスＤＮＡは前述の技術によって調製される。ゲノムＤＮＡはSsp ＩおよびXho Ｉで消化し、５４３８塩基対の断片を精製しｐＫＳ+（ストラタジ ーン）のEco RV/ Xho ＩサイトにクローニングしｐＫＳ３４１−５７７８を作製 した。クローンの特徴測定の後、Xho Ｉ（クレノウを用いて平滑末端化された） −Eco RI断片をｐＲＣ／ＣＭＶｎｅｏのNru Ｉ（平滑）− Eco RI サイトに移し ｐＥ１ｎｅｏを製した。このクローンを用いてＡ５４９細胞を形質転換して相補 的細胞系（２９３同様）を製する。該細胞では、２９３細胞の際に記載したのと 同じ方法で、さらなる発現カセットが導入され、優れたプラーク形成能をもつ多 相補的細胞系を製する。 実施例１２ この実施例では２９３／Ｅ２Ａ細胞系の作製の方法およびＥ２およびＥ４の両 領域を欠損しているアデノウイルスベクターの構築のためのその利用について述 べる。 実施例１０に記載および図５に描写されるように、Ｅ２Ａ発現カセットベクタ ーが得られた。Ｅ２Ａ発現カセットベクターはトランスフェクトされた細胞のマ ーカーとしてネオマイシン耐性を与える遺伝子を含んでいる。 又、実施例１０に記載したように、２９３細胞はｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｎｅｏで トランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は標準培地＋Ｇ４１８中で の増殖で選別された。選別された細胞のクローン拡大は実施例８に記載されたよ うにして行われた。得られた細胞系は誘導時のそのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢ Ｐ；Ｅ２Ａ遺伝子産物）を発現するそれらの能力およびＥ１およびＥ２Ａ欠損ウ イルスベクターを相補するそれらの能力でスクリーニングした。 ＤＢＰ発現能力に対する、２９３／Ｅ２Ａ細胞系のネオマイシン陽性（ｎｅｏ⁺ ；すなわち、ネオマイシン耐性）の単離クローンの能力を調べるために、細胞 をＧ４１８存在下で生育させて選別を続けた。独立した単離クローンからの樹立 した単層を１００μＭのＺｎＣｌ₂で２４時間誘導させ、ＤＢＰ遺伝子 の発現を常法を用いてイムノブロッティングで検出した。調べた６２株の内、４ ２％のｎｅｏ⁺細胞系がＤＰＢ発現に陽性（ＤＰＢ⁺）であり、ＤＰＢ⁺細胞系の 全ては誘導性のＤＢＰ発現を示した。以下の表１にはＤＢＰ発現によるスクリー ニングからのデータを表す： 続いてブラウらの方法、上述、を用いたイムノブロッティングによって誘導さ れたＤＢＰの発現の程度でクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系をスクリーニングし 、標識されたオートラジオグラフィー図で描写された結果を図６および７に示す 。ＨｅＬａに基づくｇｍＤＢＰ２細胞のそれと同様程度にＤＢＰを蓄積した細胞 をさらに解析した。図６に示す様に、誘導された細胞の溶解物によると、誘導さ れたＤＢＰの発現の程度は単離クローンによって大きく異なっている。例えば上 述 のように、細胞系１０４、１１２および２１６は誘導するとかなりの量のＤＢＰ を産生する、その一方で細胞系１９および６１はｇｍＤＢＰ２細胞によって産生 されるほども産生しない。 誘導して最初の２４時間にわたってＤＢＰを蓄積する能力を、又再び、ブラウ らの方法、上述、を用いてクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系について解析した。 図７に示す様に、誘導後、０、２、１６および２４時間で回収した細胞の溶解物 によると、いくつかの株にインキュベーション時間にわたる累進的なＤＢＰの蓄 積がウイルスの増殖と矛盾無く見られた。 得られた２９３／Ｅ２Ａ細胞系による相補性を調べるために、常套の手法を用 いてこれらの細胞系における増殖についてＥ２Ａ欠失ウイルスを調べた。当業者 にはよく知られているように、ウイルス増殖は宿主細胞の単層におけるプラーク 形成の単純な観察によって半定量的に測定でき、ここでもそれを行った。同じ株 についてＥ２Ａ遺伝子の相対的な発現、すなわちＤＢＰの相対的な発現をブラウ ら，Virology，190，624-634（1992）、に従ってイムノブロットにより測定した 。各々の細胞系の前述のパラメーター（最も低い＋／−〜最も高い＋＋＋＋＋） に関して、発現あるいは増殖の相対的な程度を表２に述べる： 表２に反映されるように、この研究の結果は２つの２９３／Ｅ２Ａ細胞系（す なわち５４および１１２）はＥ２Ａ欠失ウイルスのプラーク形成および、従って 増殖を補助することを示した。 選別された細胞系はまた当分野には慣例の細胞培養法を用いてウイルスのＥ１ およびＥ２Ａ領域を欠損しているベクターを相補することも示された。そのよう な２重に欠損を有するベクターは実施例１および３に開示された方法を用いて製 することができる。図８はＥ１およびＥ２Ａ領域を欠損しているアデノウイルス ベクターであるＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２Ｂの構造を示している。細胞継代後の、ト ランスフェクトされた細胞の３つの異なる溶解物におけるＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２ Ｂベクターの存在は常套のＰＣＲアッセイによって、ベクターに関連したＤＮＡ 配列を検出することにより示された。ＣＦＴＲ配列（図９において“Ａ”と標記 したカラム）の存在、Ｅ２Ａ配列の不在、すなわち欠失の根拠（“Ｂ”と標記し たカラム）および野性型のＥ２Ａ配列（“Ｃ”と標記したカラム）の存在につい て３つの異なった溶解物を別々に調べた。その実験は常套の方法を用いて成され た、図９に示された臭化エチジウムで染色された、ゲル分離されたＤＮＡ断片の 逆コントラスト写真から解析され得る。 結果は、３つの溶解物全てがＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２Ｂベクターの構造に一致し たＣＦＴＲおよびＥ２Ａ欠失配列を含んでいることを示している。これらの溶解 物には野性型のＥ２Ａ配列は検出されなかった。図９において“Ｍ”は産物のサ イズを確かめるためのＤＮＡマーカーを表し、“＋”は与えられたプライマーセ ットに正の鋳型を用いた場合のサンプルの印であり、“−”は与えられたプライ マーセットに負の鋳型を用いた場合のサンプルの印であり、そして上述のＡ、Ｂ およびＣは試した３つのウイルス溶解物を表す。 それによって、Ｅ１およびＥ２領域に欠失を有するアデノウイルスベクターが 作製され、２重の欠損ベクターを相補する能力を有する細胞系を確認した。 実施例１３ この実施例では外来ＤＮＡの発現へのＥ２Ａ欠失プラスミドの使用を説明する 。 実施例４に述べたように、Ｅ２Ａ欠失プラスミドｐＧＶ１３（０）をｐＧＶ１ ２Ｂベクターシリーズの構築に用いた。ｐＧＶ１３（０）の改変には、特有のSc eI制限サイトをClaIサイトと置換し、Ｅ２Ａ遺伝子のＡＴＧのまわりの領域を能 率的なコザックのコンセンサス配列に変更することが含められる。フランキング なSceI制限サイトを有するマーカー遺伝子（β−グルクロニダーゼ）をＥ２Ａ遺 伝子に挿入し、そのマーカー遺伝子は最も豊富な初期遺伝子、すなわちＤＢＰの 発現に用いられるシグナルの全てに応答して発現する。トランスフェクションお よび続いてβ−グルクロニダーゼ活性を評価することによって機能性について得 られたプラスミド（ｐＧＢＳＥ２ＧＵＳ）を調べた；調べた全てのトランスフェ クトした細胞系は、高いβ−グルクロニダーゼの発現レベルを示し、これはβ− グルクロニダーゼが基質Ｘ−ｇｌｕとの反応を触媒するときに青色を産生するこ とによって検出される。 図１０で描写される様な他のウイルスベクター（Ａｄ_GVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳ） は、例えば遺伝子治療目的の為の外来ＤＮＡの配置への欠失したＥ２領域の利用 を説明するために構築される。Ａｄ_GVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳベクターはＥ１領域に ＣＭＶルシフェラーゼマーカーを含み、Ｅ２Ａ領域にβ−グルクロニダーゼを含 む。前ベクター（Ａｄ_GVＬＵＣ．１０）は２９３／Ｅ２Ａ細胞をトランスフェク トするのに用いられ、得られたウイルスプラークのその後のＸ−ｇｌｕを用いた β−グルクロニダーゼについての染色では実際、青色は示されなかった、すなわ ちβ−グルクロニダーゼ活性は検出されなかった。Ａｄ_GVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳベ クターでトランスフェクトされた２９３／Ｅ２Ａ細胞から形成されたプラークは 、Ｘ−ｇａｌの添加によって、かなりの量の青色を産生した。 従って、アデノウイルスベクターのＥ２Ａ領域で置換された外来ＤＮＡは機能 できる。 実施例１４ この実施例では２９３／ＯＲＦ６細胞系の作製方法およびＥ１およびＥ４領域 の両方を欠損しているアデノウイルスベクターを構築するためのその利用につい て説明する。 図１１に描写されるＥ４−ＯＲＦ６発現カセットは上記の実施例９に開示され た方法を用いて構築される。２９３細胞のトランスフェクションはｐＳＭＴ／Ｏ ＲＦ６／ｐｕｒｏでなされ、トランスフェクトされた細胞は標準の培地＋ピュー ロマイシン中での生育によって選別された。クローンの拡大は実施例８に記載さ れたようにして行った。得られた細胞系は誘導の際のそれらのＥ４−ＯＲＦ６の 発現能力およびＥ１およびＥ４を欠損したウイルスベクターを補う能力で選別し た。 ２９３／ＯＲＦ６細胞系のピューロマイシン陽性（ｐｕｒｏ⁺、すなわちピュ ーロマイシン耐性）の単離クローンはそれらのＯＲＦ６の発現能力で選別した。 選別を維持するためにピューロマイシン存在下で細胞を生育させた。個々の単離 クローンからの確立した単層を１００μＭのＺｎＣｌ₂で２４時間かけて誘導し た。ＯＲＦ６遺伝子の発現はノザンブロッティング、それによるＲＮＡ転写を確 認することによって検出した。試した各々の細胞系の発現の相対的な程度（最も 低い（＋）〜最も高い ＋＋＋＋＋）を表３に示す。 ＯＲＦ６遺伝子の発現を調べた結果はピューロマイシン耐性細胞系の５３％は ＯＲＦ６転写陽性であり、ＯＲＦ６が陽性なような細胞系は全てＯＲＦ６発現を 誘発しやすいことを示した。 またＰＣＲはアデノウイルスベクターのＥ４欠失領域での遺伝子の挿入を検出 するために用いられ、その結果は図１２に描写される。Ａｄ_GVβgal ．１２でト ランスフェクトされた継代された細胞の溶解物を野性型Ｅ４に関連したある遺伝 子配列、すなわち３０８７塩基対および３６７塩基対の断片を増幅するＰＣＲに 付した。モック感染させた２９３／ＯＲＦ６細胞（レーン１）、Ａｄ_GVβgal ． １０で感染させた細胞（レーン２）およびＡｄ_GVβgal ．１２で感染させた細胞 （レーン３）をゲル電気泳動および臭化エチジウム染色に付した。図１２に示さ れる得られた染色されたゲルの逆コントラスト写真は、Ａｄ_GVβgal ．１０ベク ターが３６７塩基対の配列を含むＥ４領域の部分を欠いていること、Ａｄ_GVβga l ．１２ベクターが３０８７塩基対配列を含むＥ４領域の部分を欠いていること を示している。 ２９３／ＯＲＦ６細胞系においてＥ４を欠失したベクターの増殖を観察した。 細胞を１０感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、生育５日後でかなりの量のウイル スの増殖が相補性プラーク解析によって観察された。結果を細胞あたりのプラー ク形成単位（ＰＦＵ）をｙ軸に、および調べた細胞系をｘ軸に示した棒グラフで ある図１３に描写する。陽性コントロール生育としては、Ｅ４の機能を補うこと が知られている細胞系Ｗ１６２を用いた。陰性コントロールとしては、Ｅ１機能 のみを補うことが知られている２９３細胞系を用いた。細胞系Ａ２、Ｂ８、２１ ６および４０６はＥ４欠失ウイルス（ｄ１３６６）の定量的に異なる相補性を示 す２９３／ＯＲＦ６細胞系の独立した単離体である。 従って細胞系がＥ４機能を相補する−それによってＥ４欠失ウイルスの増殖を 可能にし、機能を有する外来ＤＮＡを担持することが可能であることが示される −と確認された。これらの細胞系はウイルスのＥ１およびＥ４領域を２重に欠損 した、上記のＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２シリーズに記載された様な、あるいはＡｄ_GV β- gal ．１２ベクターの図説である図１４に示されたようなベクターを相補す るに好適である。Ａｄ_GVβ- gal ．１２ベクターはＥ１領域に挿入されたβ−ガ ラクトシダーゼ遺伝子と欠失のあるＥ４領域を有している。 実施例１５ この実施例ではＥ１およびＥ４欠失を有するアデノウイルスベクターの利用を 説明する。 Ｅ４欠失プラスミドであるｐＧＢＳ△Ｅ４はいくつかの特徴的な制限部位を含 むように改変されている。これらのサイトは、この領域に好適な外来ＤＮＡをク ローン化するために用いられ、発現のためには、アデノウイルスＥ４プロモータ ーが用いられる。上述のように、この領域でのβ−グルクロニダーゼのクローニ ングによって、完全に機能的であり、外来ＤＮＡを発現しているウイルスベクタ ーが得られた。従って、Ｅ１領域に配置された好適な外来ＤＮＡおよびＥ４領域 での他の好適な外来ＤＮＡ、これらはともに同一ウイルスベクター上にあり、そ れぞれの外来ＤＮＡをＥ１およびＥ４プロモーターあるいは必要とされる他のプ ロモーターの制御を利用して発現することができる。 Ｅ４領域の２番目の改変は種々の異種の制御要素由来の好適な外来ＤＮＡの発 現を許す。プラスミド構築物は多数の交換が都合よくなされ得るようにして造ら れる。マルチプラスミドは都合よく交換され得る次のような特徴を有する： １．相同組換えに使用されるアデノウイルス部分−ベクターのＥ１末端および Ｅ４末端に外来ＤＮＡを配置するために結合している−； ２．プロモーター部分； ３．スプライスシグナル部分； ４．外来ＤＮＡ部分； ５．ポリアデニレーション部位； ６．アデノウイルスパッケージング配列； ７．アデノウイルスＩＴＲ；および ８．哺乳類の組織培養と同様に細菌においてもプラスミドを選択および生育す るために必要な全てのプラスミドＤＮＡ配列。 ここで述べられた刊行物および特許を含めた全ての引例は、ここに言及したこ とで、引用により組み込まれるべく、個々に、詳細に示され、ここにその全てが 明示されたと同程度に、明細書中に組み込まれるものである。 本発明は好適な具体例を強調して記載したものであるが、好適な具体例は変更 させて良いことは当業者には明白である。ここで詳細に記載された以外の方法で 該発明を実行してもよい。従って、本発明は添付の請求項の精神および範囲内に 包含される全ての変更を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年６月１９日 【補正内容】 実施例１ この実施例においてＥ１およびＥ３領域に欠損のあるＡｄ_GV．１０を含む１つ の実施態様、すなわちＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０の作製について述べる。 Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１０はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター からＣＦＴＲ遺伝子を発現する。このベクターの２つの作製例を構築し、図１− Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｒの一連の概略図である− に示されるようにベクターゲノムのＥ１領域にＣＦＴＲ発現カセットが置かれる 方向によってＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０Ｒと命名した 。 ＣＦＴＲ発現カセットは以下のようにして構築した。ｐＲＫ５（ジェネンテッ ク社，サウスサンフランシスコ，カリフォルニア州）をKpn Ｉ（ニューイングラ ンドバイオラブズ（ＮＥＢ），ベバリー，マンハッタン州）で消化し、マングビ ーンヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で平滑末端化し、Xho Ｉリンカー（ＮＥＢ）をKpn Ｉサイトの位置で連結させた。得られたベクターをｐＲＫ５−Xho Ｉと命名した 。そしてｐＲＫ５−Xho ＩをSma Ｉ（ＮＥＢ）とHin dIII（ＮＥＢ）で消化し、 マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。ＣＦＴＲ遺伝子を含むプラスミド 、ｐＢＱ４．７（Lap-Chee Tsui 博士，Hospital for Sick Children，トロント ，カナダ）を有するプラスミドはAva Ｉ（ＮＥＢ）およびSac Ｉ（ＮＥＢ）で消 化し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。これら２つの断片を単離し 相互に連結させてＣＦＴＲ発現カセットであるｐＲＫ５−ＣＦＴＲ１を作成した 。 ｐＲＫ５−ＣＦＴＲ１をSpe Ｉ（ＮＥＢ）およびXho Ｉで消化し、クレノウ（ ＮＥＢ）で平滑末端化した。１−４５４／３３２５−５７８８由来のＡｄ５配列 を含むｐＡｄ６０．４５４（L.E．Babiss 博士，ロックフェラー大学，ニューヨ ーク，ニューヨーク州）をBgl II（ＮＥＢ）で消化し、クレノウで平滑末端化し た。これら２つの断片は低融点アガロース技術（Maniatisら，モレキュラークロ ーニング：ア ラボラトリー マニュアル （Molecular Cloning: a laboratory manual），コールドスプリングハーバー研究所，コールドスプリングハーバー， ニューヨーク州（第２版 1989年））によってベクター配列から精製し、相互に 得られた。ｐＧＢＳは以下のようにして作製した。ｐＧｅｍＩ（プロメガ社，マ ディソン，ウイスコンシン州）をEco RIで消化しクレノウで平滑末端化し、そし てSal Ｉリンカーを該ベクターに連結させた。そして、得られたＤＮＡをSal Ｉ で消化し再び連結させ、それによってEco RIサイトをSal Ｉサイトで置換し２つ のSal Ｉサイト間の配列を欠如させ、Hin dIIIで消化されクレノウで平滑末端化 したｐＧＥＭＨ／Ｐ／Ｓを作製し、Bam HIリンカーを該ベクターに連結させてｐ ＧＥＭＳ／Ｂを作製した。ｐＧＥＭＳ／ＢをBam HIおよびSal Ｉで消化し、ｐ５ ０−１００（Paul Freimuth 博士，コロンビア大学，ニューヨーク州）と呼ばれ るｐＢＲプラスミド由来の約１４ｋｂのBam HI−Sal Ｉ断片（Ａｄ５由来の２１ ５６２−３５９３５）と連結させ、ｐＧＢＳを作製した。 抗免疫性および抗炎症性の特性を有する２つのＡｄ Ｅ３遺伝子産物をアデノ ウイルスベクターに導入するために３つの異なった様式の右アームプラスミドを 構築した。ｐＧＶ１１（０）（実施例７）と命名されたｐＧＢＳ△Ｅ３ＯＲＦ６ での大きなＥ３欠失を、５’末端にＡｄ２ Ｅ３ １９ｋＤａの抗免疫性遺伝子 産物を、および３’末端にＡｄ５ Ｅ３ １４．７ＫＤａの抗炎症性遺伝子産物 を有する２シストロン性のｍＲＮＡの発現を駆動するラウス肉腫ウイルスの長い 末端反復配列（ロングターミナルリピート）（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを 有する発現カセットの３つの異った様式のものに必須的に置換した。Bst BI（Ｎ ＥＢ）断片の欠失によって１９ｋＤａのｃＤＮＡ断片を欠失させることによりさ らに１つのウイルスを構築した。Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１１（Ｄ）と命名されたこの ウイルスはＥ３ １４．７ｋＤａの抗炎症性遺伝子産物のみを有する単シストロ ン性のｍＲＮＡの発現を駆動するＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターを有する。 まず、Eco RI（２７３３１）−Nde Ｉ（３１０８９）断片をＰＵＣ１９ポリリ ンカーの同一サイトにクローニングすることによりｐＧＢＳ△Ｅ３（実施例５） 由来のSpe Ｉ（２７０８２）−Nde Ｉ（３１０８９）断片をｐＵＣ１９にサブク ローニングした。ｐＧＢＳから生成されたHin dIII（２６３２８）− Eco RI（ ２７３３１）断片をこのクローンの Eco RI サイトにクローニングして、ｐＨ いた。混合した断片を常法のリン酸カルシウム技術（Grahamら，上述）を用いて ２９３細胞にトランスフェクトした。 トランスフェクトして５日後、細胞単層を３回の凍結融解により回収した。得 られたハイブリッドウイルスは２９３細胞上で力価検定し、単離されたプラーク を選び取った。最初のプラーク保存株中に単一の組換えウイルスが存在するのを 確実にするためにプラーク単離の工程を２回以上繰り返した。単離プラーク保存 株をBurlseson ら、ヴィロロジー：ラボラトリー マニュアル（Virology: a La boratory Manual ）、アカデミック出版社、（1992年）に記載されている常套の ウイルス技術に従って大容量のウイルス保存株に増幅した。 図２は種々のＡｄ_GVＣＦＴＲ．１１ウイルスベクターの一連の概略図である。 図は比較の為ＡＤ_GVＣＦＴＲ．１０Ｌの図と一列に並べた。 実施例３ この実施例においてＥ１、Ｅ３およびＥ４領域に欠損のあるＡｄ_GVＣＦＴＲ． １２の作製について述べる。 Ａｄ_GV．１２はＥ４領域の完全な排除により特徴付けられる。この大きな欠失 によりおよそ１０ｋｂまでの外来のＤＮＡを挿入することができる。さらに重要 なことに、ゲノムの他の領域はＡｄ_GVＣＦＴＲ．１２ベクターを用いた外来ＤＮ Ａ発現カセットの導入に利用しやすい。いまやこの欠失が他の産物のためのより 大きな発現カセットの取り込みを可能にするのである。例えば、膜貫通型のドメ インを有さず、それゆえ膜に結合していないＴＮＦあるいはＩＬ−６などの可溶 性の受容体、および例えばｃｄｃ２、ｃｄｋキナーゼ、サイクリンＥあるいはサ イクリンＤといったサイクリン類のような細胞周期制御産物に対するもののよう なアンチセンス分子、および炎症や免疫応答を排除するための転写因子、すなわ ちＥ２Ｆあるいはｃ−ｍｙｃなどである。 ｐＧＶ１１（０）を改造し全Ｅ４領域が欠失している右アームプラスミドを作 製する。得られたプラスミドは全Ｅ３およびＥ４領域を欠失し、ｐＧＶ１２（０ ） ／Ｅ４／Ｅ２Ａ細胞系によりＥ１、Ｅ４およびＥ２Ａを欠損したウイルスベクタ ーが増殖できる。 ２９３／Ｅ４細胞に導入するためのＥ２Ａ発現カセット（図５参照）は以下の ように製する。最初の段階はＥ２Ａの効率的な発現のためにＥ２ＡのＡＴＧのま わりの塩基を完全なコザックのコンセンサス（コザックら，J．Molec．Biol.，1 96，947-950(1987)）を形成するように改造することである。Ｅ２Ａ遺伝子の５ ’末端を改造するために２つのプライマーを設計した。１８塩基対のオリゴヌク レオチド（5'GCCGCCTCATCCGCTTTT3'）（配列表配列番号３）であるＡｄ５ｓ（２ ３８８４）をＥ２Ａ遺伝子のSma Ｉサイトの隣にある内部領域を始点とするよに 設計した。３２塩基対のオリゴヌクレオチド（5'CCGGAATTCCACCATGGCGAGTCGGGAA GAGG3'）（配列表配列番号４）であるＤＢＰ（ＡＴＧ）Ｒ１を、クローニングを 容易にするために、これを改造しているＥ２Ａ遺伝子のＡＴＧのまわりの翻訳コ ンセンサス配列を完全なコザック拡張コンセンサス配列を導入するように、およ び丁度５’のEco RIサイトを導入するように設計した。上記のプライマーを用い て得られたＰＣＲ産物をEco RIおよびSma Ｉ（ＮＥＢ）で消化し、ｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ IIＫＳ+（ストラタジーン社，ラ ジョラ，カリフォルニア州）の 同一のポリリンカー部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＫＳ／Ｅ ＳＤＢＰと命名した。 Sma Ｉ‐Xba Ｉ断片をｐＨＲカウフマン（Morinら，Mol．Cell Biol.，9，437 2-4380(1989)）から単離し、Ｅ２Ａの読み枠を補うためにｐＫＳ／ＥＳＤＢＰの 対応するSma ＩおよびXba Ｉサイトにクローニングした。得られたプラスミドは ｐＫＳＤＢＰと命名した。発現カセット内に含まれるベクター由来のすべての相 同配列を排除するために、ポリリンカー内のEco RIサイトが破壊されている（ジ ェンベク，ロックヴィル，メリーランド州）ＰＮＥＢ１９３（ＮＥＢ）の対応す るKpn Ｉおよび Pme Iサイトに、ｐＫＳＤＢＰ由来のKpn Ｉ−Dra Ｉ断片を移し た。得られたクローンｐＥ２Ａは実施例４のＥ２Ａを欠失したベクターに相同す るどんな余分な配列も有さずＥ２Ａの読み枠の全てを含んでいる。 実施例４に述べたように、Ｅ２Ａ欠失プラスミドｐＧＶ１３（０）をｐＧＶ１ ２Ｂベクターシリーズの構築に用いた。ｐＧＶ１３（０）の改変には、特有のSc e Ｉ制限サイトをCla Ｉサイトと置換し、Ｅ２Ａ遺伝子のＡＴＧのまわりの領域 を能率的なコザックのコンセンサス配列に変更することが含められる。フランキ ングなSce Ｉ制限サイトを有するマーカー遺伝子（β−グルクロニダーゼ）をＥ ２Ａ遺伝子に挿入し、そのマーカー遺伝子は最も豊富な初期遺伝子、すなわちＤ ＢＰの発現に用いられるシグナルの全てに応答して発現する。トランスフェクシ ョンおよび続いてβ−グルクロニダーゼ活性を評価することによって機能性につ いて得られたプラスミド（ｐＧＢＳＥ２ＧＵＳ）を調べた；調べた全てのトラン スフェクトした細胞系は、高いβ−グルクロニダーゼの発現レベルを示し、これ はβ−グルクロニダーゼが基質Ｘ−ｇｌｕとの反応を触媒するときに青色を産生 することによって検出される。 図１０で描写される様な他のウイルスベクター（Ａｄ_GVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳ） は、例えば遺伝子治療目的の為の外来ＤＮＡの配置への欠失したＥ２領域の利用 を説明するために構築される。Ａｄ_GVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳベクターはＥ１領域に ＣＭＶルシフェラーゼマーカーを含み、Ｅ２Ａ領域にβ−グルクロニダーゼを含 む。前ベクター（Ａｄ_GVＬｕｃ．１０）は２９３／Ｅ２Ａ細胞をトランスフェク トするのに用いられ、得られたウイルスプラークのその後のＸ−ｇｌｕを用いた β−グルクロニダーゼについての染色では実際、青色は示されなかった、すなわ ちβ−グルクロニダーゼ活性は検出されなかった。Ａｄ_GVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳベ クターでトランスフェクトされた２９３／Ｅ２Ａ細胞から形成されたプラークは 、Ｘ−ｇｌｕの添加によって、かなりの量の青色を産生した。 従って、アデノウイルスベクターのＥ２Ａ領域で置換された外来ＤＮＡは機能 できる。 実施例１４ この実施例では２９３／ＯＲＦ６細胞系の作製方法およびＥ１およびＥ４領域特許請求の範囲 ： １．アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ及びＥ４領域からなる群より選ばれる ２以上のアデノウイルス初期領域のそれぞれにおいて１以上の必須の遺伝子機能 に欠損のあるアデノウイルスベクターであって、１以上の機能的な初期又は後期 領域遺伝子を含む該ベクター。 ２．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲１のアデノウイルスベクター。 ３．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ４領域におい て１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１のアデノ ウイルスベクター。 ４．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲３のアデノウイルスベクター。 ５．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ２Ａ領域にお いて１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１のアデ ノウイルスベクター。 ６．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲５のアデノウイルスベクター。 ７．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ２Ａ及びＥ４領域にお いて１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１のアデ ノウイルスベクター。 ８．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲７のアデノウイルスベクター。 ９．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ及びＥ４領 域において１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１ のアデノウイルスベクター。 １０．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもの である特許請求の範囲９のアデノウイルスベクター。 １１．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１領域から全ての必 須の遺伝子機能が欠損し且つアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ及び／又はＥ４領域 から１以上の必須の遺伝子機能が欠損したものである特許請求の範囲１のアデノ ウイルスベクター。 １２．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもの である特許請求の範囲１１のアデノウイルスベクター。 １３．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ及びＥ４ 領域から全ての必須の遺伝子機能が欠損したものである特許請求の範囲１のアデ ノウイルスベクター。 １４．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもの である特許請求の範囲１３のアデノウイルスベクター。 １５．アデノウイルスゲノムのＥ４領域の全ての転写解読枠が欠失した特許請求 の範囲１のアデノウイルスベクター。 １６．アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ３及びＥ４領域の全てが欠失し た特許請求の範囲１のアデノウイルスベクター。 １７．アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ及びＥ４領域からなる群より選ばれ る２以上のアデノウイルス初期領域のそれぞれにおいて１以上の必須の遺伝子機 能に欠損のあるアデノウイルスベクターをトランスに相補し得る細胞系。 １８．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ４領域の１ 以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７の細胞系。 １９．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲１８の細胞系。 ２０．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲１９の細胞系。 ２１．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の全ての必須の遺伝子機 能に欠損のあるものである特許請求の範囲１８の細胞系。 ２２．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ２Ａ領域の １以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７の細胞系 。 ２３．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の全ての必須の遺伝子機 能に欠損のあるものである特許請求の範囲２２の細胞系。 ２４．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ２Ａ及びＥ４領域の １以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７の細胞系 。 ２５．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲２４の細胞系。 ２６．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲２５の細胞系。 ２７．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ ４領域の１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７ の細胞系。 ２８．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲２７の細胞系。 ２９．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲２８の細胞系。 ３０．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ ４領域の全ての必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲２７の 細胞系。 ３１．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲３０の細胞系。 ３２．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲３１の細胞系。 ３３．特許請求の範囲１７の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ３４．特許請求の範囲１８の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ３５．特許請求の範囲１９の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ３６．特許請求の範囲２０の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ３７．特許請求の範囲２１の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ３８．特許請求の範囲２２の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ３９．特許請求の範囲２３の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４０．特許請求の範囲２４の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４１．特許請求の範囲２５の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４２．特許請求の範囲２６の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４３．特許請求の範囲２７の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４４．特許請求の範囲２８の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４５．特許請求の範囲２９の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４６．特許請求の範囲３０の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４７．特許請求の範囲３１の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４８．特許請求の範囲３２の細胞系を用いて調製されたものであるアデノウイル スベクター。 ４９．２９３／Ｅ４、２９３／ＯＲＦ−６、２９３／Ｅ２Ａ、及び２９３／Ｅ４ ／Ｅ２Ａと命名される細胞系からなる群より選ばれる細胞系。 ５０．外来遺伝子を含む特許請求の範囲３３の組換えアデノウイルスベクター。 ５１．該外来遺伝子が嚢胞性繊維症膜貫通調節因子遺伝子(cystic fibrosis tra nsmembrane regulator gene)である特許請求の範囲５０の組換えアデノウイルス ベクター。 ５２．該組換えアデノウイルスベクターが、Ａｄ_GV．１２及びＡｄ_GV．１３から なる群より選ばれるものである特許請求の範囲５０の組換えベクター。 ５３．該組換えアデノウイルスベクターが、Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１２及びＡｄ_GVＣ ＦＴＲ．１３からなる群より選ばれるものである特許請求の範囲５２の組換えベ クター。 ５４．哺乳類中で治療又は予防剤を発現するＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲３ ３の組換えアデノウイルスベクター。 ５５．該治療剤がｍＲＮＡ及びオリゴクレオチドからなる群より選ばれるアンチ センス分子である特許請求の範囲５４の組換えアデノウイルスベクター。 ５６．該予防剤が哺乳類中でポリペプチドとして発現するＤＮＡ配列であって、 該ポリペプチドが該ポリペプトに対する免疫応答を誘導するものである特許請求 の範囲３３の組換えアデノウイルスベクター。 ５７．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲５０の組換えアデノウイルスベクターを投与し、その結果該ベクターを含有す る細胞を生じせしめることを含む遺伝子治療方法。 ５８．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲５１の組換えアデノウイルスベクターを投与し、その結果該ベクターを含有す る細胞を生じせしめることを含む遺伝子治療方法。 ５９．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲５２の組換えアデノウイルスベクターを投与し、その結果該ベクターを含有す る細胞を生じせしめることを含む遺伝子治療方法。 ６０．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲５３の組換えアデノウイルスベクターを投与し、その結果該ベクターを含有す る細胞を生じせしめることを含む遺伝子治療方法。 ６１．該組換えアデノウイルスベクターを該患者の肺に投与する特許請求の範囲 ５８の方法。 ６２．該組換えアデノウイルスベクターを該患者の肺に投与する特許請求の範囲 ６０の方法。 ６３．治療を必要とする患者由来の細胞に、治療剤として発現するＤＮＡ配列を 含む特許請求の範囲３３の組換えアデノウイルスベクターを治療上有効な量投与 し、その結果、該ベクターを含有する細胞を生じせしめることを含む治療方法。 ６４．該治療剤がｍＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるアン チセンス分子である特許請求の範囲６３の方法。 ６５．予防接種を必要とする患者に、ポリペプチドとして発現し該ポリペプチド が該ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するものであるＤＮＡ配列を含む特許 請求の範囲３３の組換えアデノウイルスベクターを、免疫誘導に有効な量投与す ることを含む予防接種方法。 ６６．遺伝子治療を必要とする患者の細胞における特許請求の範囲５０の外来Ｄ ＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターの発現又は毒性の試験方法であって、 （１）該患者から標的細胞のアリコートを分離して培養に付し、（２）該細胞を 該ベクターに接触させその結果、該ベクターを含有する細胞を生じせしめ、（３ ）該細胞を培養し、そして（４）該外来ＤＮＡの発現及び／又は該培養細胞の生 存力(vitality)を検出又は測定することを含む方法。 ６７．標的細胞へのトランスフェクションにおける外来ＤＮＡ発現の試験方法で あって（１）標的細胞を選抜し、（２）該標的細胞を特許請求の範囲５０の外来 ＤＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターに接触させ、その結果、該ベクター を含有する細胞を生じせしめ、そして（３）該標的細胞における該外来ＤＮＡの 発現を検出又は測定することを含む方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年９月６日 【補正内容】特許請求の範囲 ： １．アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４領域からなる群より選ばれ る２以上のアデノウイルス初期領域のそれぞれにおいて１以上の必須の遺伝子機 能に欠損のあるアデノウイルスベクターであって、１以上の機能的な初期又は後 期領域遺伝子を含む該ベクター。 ２．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲１のアデノウイルスベクター。 ３．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ４領域におい て１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１のアデノ ウイルスベクター。 ４．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲３のアデノウイルスベクター。 ５．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ２Ａ領域にお いて１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１のアデ ノウイルスベクター。 ６．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲５のアデノウイルスベクター。 ７．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ２Ａ及びＥ４領域にお いて１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１のアデ ノウイルスベクター。 ８．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもので ある特許請求の範囲７のアデノウイルスベクター。 ９．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４ 領域において１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲 １のアデノウイルスベクター。 １０．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもの である特許請求の範囲９のアデノウイルスベクター。 １１．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１領域から全ての必 須の遺伝子機能が欠損し、且つアデノウイスゲノムのＥ２Ａ及び／又はＥ４領域 から１以上の必須の遺伝子機能が欠損したものである特許請求の範囲１のアデノ ウイルスベクター。 １２．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもの である特許請求の範囲１１のアデノウイルスベクター。 １３．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ ４領域から全ての必須の遺伝子機能が欠損したものである特許請求の範囲１のア デノウイルスベクター。 １４．該ベクターが、さらにアデノウイルスゲノムのＥ３領域に欠損のあるもの である特許請求の範囲１３のアデノウイルスベクター。 １５．アデノウイルスゲノムのＥ４領域の全ての転写解読枠が欠失した特許請求 の範囲１のアデノウイルスベクター。 １６．アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ３、及びＥ４領域の全てが欠失 した特許請求の範囲１のアデノウイルスベクター。 １７．アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４領域からなる群より選ば れる２以上のアデノウイルス初期領域のそれぞれにおいて１以上の必須の遺伝子 機能に欠損のあるアデノウイルスベクターをトランスに相補し得る細胞系。 １８．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ４領域の１ 以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７の細胞系。 １９．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲１８の細胞系。 ２０．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲１９の細胞系。 ２１．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の全ての必須の遺伝子機 能に欠損のあるものである特許請求の範囲１８の細胞系。 ２２．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１及びＥ２Ａ領域の １以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７の細胞系 。 ２３．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の全ての必須の遺伝子機 能に欠損のあるものである特許請求の範囲２２の細胞系。 ２４．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ２Ａ及びＥ４領域の １以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７の細胞系 。 ２５．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲２４の細胞系。 ２６．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲２５の細胞系。 ２７．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ ４領域の１以上の必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲１７ の細胞系。 ２８．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲２７の細胞系。 ２９．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲２８の細胞系。 ３０．該ベクターが、アデノウイルスゲノムの少なくともＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ ４領域の全ての必須の遺伝子機能に欠損のあるものである特許請求の範囲２７の 細胞系。 ３１．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含 むものである特許請求の範囲３０の細胞系。 ３２．該細胞系が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含み、他のＯ ＲＦを含まないものである特許請求の範囲３１の細胞系。 ３３．２９３／Ｅ４、２９３／ＯＲＦ−６、２９３／Ｅ２Ａ、及び２９３／Ｅ４ ／Ｅ２Ａと命名される細胞系からなる群より選ばれる細胞系。 ３４．複製のために、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４領域から なる群より選ばれる２以上のアデノウイルス初期領域のそれぞれにおいて１以上 の必須の遺伝子機能がトランスに相補されることを必要とするアデノウイルスベ クターであって、特許請求の範囲１７〜３３のいずれかの細胞系を用いて調製さ れた該ベクター。 ３５．外来遺伝子を含む特許請求の範囲１〜１６及び３４のいずれかの組換えア デノウイルスベクター。 ３６．該外来遺伝子が嚢胞性繊維症膜貫通調節因子遺伝子(cystic fibrosis tra nsmembrane regulator gene)である特許請求の範囲３５の組換えアデノウイルス ベクター。 ３７．該組換えアデノウイルスベクターが、Ａｄ_GV．１２及びＡｄ_GV．１３から なる群より選ばれるものである特許請求の範囲３５の組換えベクター。 ３８．該組換えアデノウイルスベクターが、Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１２及びＡｄ_GVＣ ＦＴＲ．１３からなる群より選ばれるものである特許請求の範囲３７の組換えベ クター。 ３９．哺乳類中で治療又は予防剤を発現するＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲１ 〜１６及び３４のいずれかの組換えアデノウイルスベクター。 ４０．該治療剤がｍＲＮＡ及びオリゴクレオチドからなる群より選ばれるアンチ センス分子である特許請求の範囲３９の組換えアデノウイルスベクター。 ４１．該予防剤が哺乳類中でポリペプチドとして発現するＤＮＡ配列であって、 該ポリペプチドが該ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するものである特許請 求の範囲３９の組換えアデノウイルスベクター。 ４２．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲３５〜４１のいずれかの組換えアデノウイルスベクターを投与し、その結果該 ベクターを含有する細胞を生じせしめることを含む遺伝子治療方法。 ４３．該組換えアデノウイルスベクターを該患者の肺に投与する特許請求の範囲 ４２の方法。 ４４．治療を必要とする患者由来の細胞に、治療剤として発現するＤＮＡ配列を 含む特許請求の範囲１〜１６及び３４のいずれかの組換えアデノウイルスベクタ ーを治療上有効な量投与し、その結果、該ベクターを含有する細胞を生じせしめ ることを含む治療方法。 ４５．該治療剤がｍＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるアン チセンス分子である特許請求の範囲４４の方法。 ４６．予防接種を必要とする患者に、ポリペプチドとして発現し該ポリペプチド が該ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するものであるＤＮＡ配列を含む特許 請求の範囲１〜１６及び３４のいずれかの組換えアデノウイルスベクターを、免 疫誘導に有効な量投与することを含む予防接種方法。 ４７．遺伝子治療を必要とする患者の細胞における特許請求の範囲３５の外来Ｄ ＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターの発現又は毒性の試験方法であって、 （１）該患者から標的細胞のアリコートを分離して培養に付し、（２）該細胞を 該ベクターに接触させその結果、該ベクターを含有する細胞を生じせしめ、（３ ）該細胞を培養し、そして（４）該外来ＤＮＡの発現及び／又は該培養細胞の生 存力(vitality)を検出又は測定することを含む方法。 ４８．標的細胞へのトランスフェクションにおける外来ＤＮＡ発現の試験方法で あって、（１）標的細胞を選抜し、（２）該標的細胞を特許請求の範囲３５の外 来ＤＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターに接触させ、その結果、該ベクタ ーを含有する細胞を生じせしめ、そして（３）該標的細胞における該外来ＤＮＡ の発現を検出又は測定することを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 マクヴェイ、ダンカン エル. アメリカ合衆国、メリーランド州 20855、 ダーウッド、アイアンフォージ コート、 7727 (72)発明者 ブルーダー、ジョゼフ ティー. アメリカ合衆国、メリーランド州 21774、 ニュー マーケット、ビーチ ドライブ、 6644 (72)発明者 リゾノワ、アレナ アメリカ合衆国、メリーランド州 20852、 ロックヴィル、ランドルフ ロード、5329

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．２以上のアデノウイルス領域に欠損のあるアデノウイルスベクター。 ２．該２以上の領域の少なくとも１つが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域を含 む領域、Ｅ２領域を含む領域、Ｅ３領域を含む領域、及びＥ４領域を含む領域の グループより選ばれる特許請求の範囲１のアデノウイルスベクター。 ３．該２以上の領域の少なくとも１つが、その各々がアデノウイルスゲノムの後 期領域を含む領域のグループより選ばれる特許請求の範囲１のアデノウイルスベ クター。 ４．該２以上の領域の少なくとも１つが、その各々がアデノウイルスゲノムの後 期領域を含む領域のグループより選ばれる特許請求の範囲２のアデノウイルスベ クター。 ５．該２以上のアデノウイルス領域が、全てのアデノウイルス遺伝子を含む特許 請求の範囲１のアデノウイルスベクター。 ６．該アデノウイルスベクターが、アデノウイルス逆位末端反復配列及び１以上 のアデノウイルスプロモーターを含む特許請求の範囲５のアデノウイルスベクタ ー。 ７．該アデノウイルスベクターが、アデノウイルス逆位末端反復配列及びパッケ ージングシグナルを含む特許請求の範囲５のアデノウイルスベクター。 ８．該アデノウイルスベクターが、相補的な細胞系においてのみ増殖する特許請 求の範囲１のアデノウイルスベクター。 ９．該アデノウイルスベクターが、アデノウイルス逆位末端反復配列又はパッケ ージングシグナルの改変の結果として、相補的な細胞系においてのみ増殖する特 許請求の範囲８のアデノウイルスベクター。 １０．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲１のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １１．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲２のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １２．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲３のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １３．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲４のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １４．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲５のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １５．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲６のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １６．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲７のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １７．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲８のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １８．該領域の少なくとも２つが増殖に必須である特許請求の範囲９のアデノウ イルスベクターを相補する細胞系。 １９．２９３／Ｅ４、２９３／ＯＲＦ−６、２９３／Ｅ２Ａ、及び２９３／Ｅ４ ／Ｅ２Ａと命名される細胞系からなる群より選ばれる細胞系。 ２０．外来ＤＮＡを含む特許請求の範囲１の組換え多重欠損アデノウイルスベク ター。 ２１．該外来ＤＮＡが嚢胞性繊維症膜貫通調節因子遺伝子(cystic fibrosis tra nsmembrane regulator gene)である特許請求の範囲２０の組換えベクター。 ２２．該組換えベクターがＡｄ_GV．１０、Ａｄ_GV．１１、Ａｄ_GV．１２、及びＡ ｄ_GV．１３からなる群より選ばれる特許請求の範囲２０の組換えベクター。 ２３．該組換えベクターがＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０、Ａｄ_GVＣＦＴＲ．１１、Ａｄ_GV ＣＦＴＲ．１２、及びＡｄ_GVＣＦＴＲ．１３からなる群より選ばれる特許請求 の範囲２２の組換えベクター。 ２４．哺乳類中で治療又は予防剤を発現するＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲１ の組換え多重欠損アデノウイルスベクター。 ２５．該治療剤がｍＲＮＡ及び合成オリゴクレオチドからなる群より選ばれるア ンチセンス分子である特許請求の範囲２４の組換え多重欠損アデノウイルスベク ター。 ２６．該予防剤が哺乳類中でポリペプチドとして発現するＤＮＡ配列であって、 該ポリペプチドが該ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するものである特許請 求の範囲２４の組換え多重欠損アデノウイルスベクター。 ２７．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲２０の組換え多重欠損アデノウイルスベクターを投与することを含む遺伝子治 療方法。 ２８．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲２１の組換え多重欠損アデノウイルスベクターを投与することを含む遺伝子治 療方法。 ２９．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲２２の組換え多重欠損アデノウイルスベクターを投与することを含む遺伝子治 療方法。 ３０．遺伝子治療を必要とする患者由来の細胞に治療上有効な量の特許請求の範 囲２３の組換え多重欠損アデノウイルスベクターを投与することを含む遺伝子治 療方法。 ３１．組換え多重欠損アデノウイルスベクターを該患者の肺に投与する特許請求 の範囲２８の方法。 ３２．組換え多重欠損アデノウイルスベクターを該患者の肺に投与する特許請求 の範囲３０の方法。 ３３．治療を必要とする患者由来の細胞に、治療剤として発現するＤＮＡ配列を 含む特許請求の範囲１の組換え多重欠損アデノウイルスベクターを治療上有効な 量投与することを含む治療方法。 ３４．該治療剤がｍＲＮＡ及び合成オリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる アンチセンス分子である特許請求の範囲３３の方法。 ３５．予防接種を必要とする患者に、ポリペプチドとして発現し該ポリペプチド が該ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するものであるＤＮＡ配列を含む特許 請求の範囲１の組換え多重欠損アデノウイルスベクターを、免疫誘導に有効な量 投与することを含む予防接種方法。 ３６．遺伝子治療を必要とする患者の細胞における特許請求の範囲２０の外来Ｄ ＮＡを含む組換え多重欠損アデノウイルスベクターの発現又は毒性の試験方法で あって、（１）該患者から標的細胞のアリコートを分離して培養に付し、（２） 該標的細胞を該ベクターに接触させ、そして（３）該培養した標的細胞の該外来 ＤＮＡの発現及び生存力(vitality)を測定することを含む方法。 ３７．標的細胞へのトランスフェクションにおける外来ＤＮＡ発現の試験方法で あって、（１）標的細胞を選抜し、（２）該標的細胞を特許請求の範囲２０の外 来ＤＮＡを含む組換え多重欠損アデノウイルスベクターに接触させ、そして（３ ）該標的細胞における該外来ＤＮＡの発現を測定することを含む方法。