JPH10500024A

JPH10500024A - 無毒、非毒素原性、非病原性の発現系、並びにその中で利用するためのプロモーター及びターミネーター

Info

Publication number: JPH10500024A
Application number: JP8503267A
Authority: JP
Inventors: シー．ローヤー，ジョン; エル．モーヤー，ドナ; ヨダー，ウェンディー; アール．シュスター，ジェフリー
Original assignee: ノボノルディスクバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 1995-06-15
Publication date: 1998-01-06
Anticipated expiration: 2016-05-21
Also published as: FI119437B; FI965220A0; AU2705895A; JP3511005B2; EP0777737B1; US5837847A; EP1559776A3; FI965220A; DE69534185T2; JP3167729B2; EP1559776A2; CN101659926A; CN1151762A; ATE294871T1; JP2001169791A; DE69534185D1; WO1996000787A1; EP0777737A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プロモーターに作用可能式に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る無毒、非毒素原性、非病原性組換フサリウム、例えばフサリウム・グラミネアルム宿主細胞に関する。本発明は更にかかるフサリウム宿主細胞を利用する組換タンパク質の製造のための方法に関する。本発明は更にかかる細胞において使用し得るプロモーター及びターミネーター配列に関する。

Description

【発明の詳細な説明】無毒、非毒素原性、非病原性の発現系、並びにその中で利用するためのプロモーター及びターミネーター１．発明の分野本発明は組換タンパク質の製造において有用な宿主細胞に関する。特に、本発明は高レベルでの組換タンパク質、特に酵素の発現において利用できうる無毒、非毒素原性及び非病原性のフサリウム（Fusarium）の菌類宿主細胞に関する。２．発明の背景異種タンパク質の発現における組換宿主細胞の利用は近年大量の商業的に有用なタンパク質の製造を簡略化した。その利用がなければ、それらのタンパク質はその天然起源からの精製によってのみ得られる。現在、任意の所定のタンパク質の製造のために選択される原核系及び真核系宿主を含む発現系の様々な選別がある。適当な発現系の選別は往々にして、活性状態のタンパク質の適正な収量をもたらす宿主細胞の能力に依存するのみならず、タンパク質の意図される最終用途によってもかなり支配されうる。哺乳動物及び酵母の細胞が最も一般的に利用されている真核系宿主であるが、組換タンパク質の製造のための宿主細胞として糸状菌類が非常に有用であることが認識され始めている。現在かかるプロセスに利用されている又は利用が提案されている糸状菌類の例はニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）、トリポケラジウム・ゲオデス（Tolypocladium geodes）、ムコール・サーシネロイデス（ Mucor circinelloides）及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（A．niger）及びアスペルギルス・オリザ（A．oryzae）である。フサリウム属の所定の種、例えばフサリウム・オキシスポルム（F．oxysporum ）（Diolezら、1993，Gene 131：61-67；Langinら、1990，Curr．Genet．17：31 3-319；Malardierら、1989，Gene 78：147-156及びKistler and Benny，1988，C urr．Genet．13：145-149）、フサリウム・ソラニ（F．solani）(Crowhurstら、 1992，Curr．Genet．21：463-469)及びフサリウム・カルモルム（F. culmorum）（Curraghら、1992，Mycol．Res．97：313-317）が植物病原及び遺伝子調節の研究のためのモデル系として利用されている。これらのフサリウム種は異種タンパク質の製造にとっては商業的に適当でなく、その理由は植物病原体であるが如きのその所望されない特徴又はそれらが安全でないレベルでマイトマイシンを産生することにある。Dickman and Leslie（1992，Mol．Gen．Genet．235：458-462 ）はニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のnit−２を含むプラスミドによるジッベレラ・ジー(Gibberella zeae)の形質転換を開示する。Dickman a nd Leslieに開示されているジッベレラ・ジーの株は植物病原体であり、そしてエストロゲン様ミコトキシンであるゼアラレノン(zearalenone)を産生する。San chez-Fernandezら（1991，Mol．Gen．Genet．225：231-233）はアスペルギルス・ニガーの niaＤ遺伝子を含むプラスミドによるniaＤ突然変異を担持するジッベレラ・フジコロイ（G．fujikoroi）の形質転換を開示する。理想的な発現系は、プロテアーゼ及びミコトキシン産生力を実質的に有さず、またその他の大量の内生産生された分泌タンパク質を実質的にもたず、そして既知の宿主細胞よりも高いレベルの発現が可能なものである。本発明はこのような要件を満たす新規のフサリウム発現系をこの度提供する。３．発明の概要本発明は、プロモーターに作用可能式に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る無毒、非毒素原性及び非病原性組換フサリウム宿主細胞を提供する。本明細書において規定する「無毒」とは、その宿主細胞が植物又は動物に対して毒素として作用しないことを意味する。例えば、フサリウム宿主細胞は、約20mlの用量の（１：１希釈した）３日目のフサリウム培養培地／体重kg ／マウスで約５匹のマウスに注射を施してから約14日後にどのマウスもフサリウム処置の結果として死亡しなかったとき、無毒であると考えられるであろう。本明細書において規定する「非毒素原性」とは、その宿主細胞がHPLC分析の如き標準の分析方法による決定に従い本質的にミコトキシンを有さないことを意味する。例えば、固体栄養培地を有する２枚の９cmのペトリ皿上で増殖した所定量のフサリウムを有機溶媒で抽出し、そして0.5％の抽出物を分析のためにHPLCにインジェクトしてよい。既知のミコトキシンの無さは、ミコトキシン標準に関してわかっている位置での検出可能なHPLCピークの無さにより推定されるであろう。本明細書において規定する「非病原性」とは、その宿主細胞が健康な植物又は健康な動物において有意義な病気を及ぼさないことを意味する。例えば、植物に対して病原性であるフサリウム種は植物の木質組織の菌類侵入を示し得、そして一般にしおれ症状を特徴とする疾病状態をもたらす。本明細書において規定する「異種タンパク質」とは、宿主細胞にとって天然でないタンパク質、又は天然タンパク質であってその天然配列が変わるように修飾の施されたもの、又は天然タンパク質であってその発現がその天然タンパク質の発現にとって必須の天然調節配列、例えばプロモーター、リポソーム結合性部位等の操作の結果としてもしくは組換DNA 技術による宿主細胞のその他の操作の結果として量的に改変されたものをいう。核酸配列は適当なプロモーター配列に作用可能式に連結されており、そのプロモーター配列は選定の宿主細胞におけるその核酸配列の転写を指令することができる。本発明は更に組換タンパク質の製造のための方法に関連し、この方法は異種タンパク質をコードする核酸配列を含む上記の種のいづれかの宿主細胞をタンパク質の発現が誘導される条件下で培養し、そしてこのタンパク質をその培養物から回収することを含んで成る。好適な態様において、本発明は菌類タンパク質、最も好ましくは菌類酵素である。本発明の方法を利用して、少なくとも約0.5ｇの異種タンパク質／１１の宿主細胞が産生される。本発明の宿主細胞は、以降の第６．１章に記載のカゼイン清浄アッセイによる決定に従い、驚くべきほどに少量のみのプロテアーゼを分泌する。特にほんの小さな加水分解ゾーンしか検出されないか、又はそのゾーンは全く検出されない。本発明の宿主細胞及び方法は、その他の既知の菌類種、例えばアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザ又はフサリウム・オキシスポルムよりも驚くべきほどに効率的に所定の菌類酵素を組換生産せしめる。本発明は更にフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター配列又はその配列と実質的に同じプロモーター活性を有するそのフラグメントに関する。このプロモーターの配列をSEQ ID NO：５に示す。更に、本発明はフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するターミネーター配列又はその配列と実質的に同じターミネーター活性を有するそのフラグメントに関する。このターミネーターの配列をSEQ ID NO：６に示す。４．図面の簡単な説明図１はフサリウム・グラミネアルム(F．graminearum)(レーン１)；アスペルギルス・ニガー（レーン２）：及びアスペルギルス・オリザ（レーン３）の分泌タンパク質のSDSゲルを示す。レーン４は分子量マーカーを示す。図２は以下のサンプルに基づくプロテアーゼアッセイの結果を示す：アスペルギルス・オリザ（ウェル１）：アスペルギルス・ニガー（ウェル２）；フサリウム・グラミネアルム（ウェル３）；空のウェルコントロール（ウェル４−６）。図３はプラスミドpJRoy６の構築を示す。図４はＦ．グラミネアルム 20334の形質転換体におけるトリプシン様プロテアーゼ(SP387)の分泌のSDS−PAGE分析を示す。レーン１：分子サイズマーカー；レーン２：ブランク：レーン３：精製トリプシン様プロテアーゼタンパク質標準品；レーン４：ブランク；レーン５：未形質転換のＦ．グラミネアルム株20334 ；レーン６：ブランク；レーン７：ブラスミドpJRoy６により形質転換されたＦ．グラミネアルム株20334；レーン８：ブランク；レーン９：分子サイズマーカー。図５はpJRoy20の制限地図を示す。図６はpDM151の制限地図を示す。図７はpDM155の制限地図を示す。図８Ａ及び８ＢはDSM151−４をフサリウム・グラミネアルムにおいて20から16 0hr発酵した場合のフサリウム・グラミネアルムのCarezyme（登録商標）の発現レベルを示す。図８Ｂは前記フサリウム・グラミネアルムにおけるCarezyme（登録商標）の産生のSDS−PAGE分析を示す。レーン１：分子サイズマーカー；レーン２：20hr；レーン３：50hr；レーン４：70hr；レーン５：90hr；レーン６；120hr；レーン７：140hr；レーン８：160h r。図９Ａ及び９ＢはDSMI55−10をフサリウム・グラミネアルムの中で20から160h r発酵した場合のLipolase（登録商標）の発現レベルを示す。図９ＡはLipolase （登録商標）のアッセイの結果を示す。図９Ｂは前記フサリウム・グラミネアルムにおけるLipolase（登録商標）の産生のSDS−PAGE分析を示す。レーン１：分子サイズマーカー；レーン２：20hr；レーン３：50hr；レーン４：60hr；レーン 5：90hr；レーン６：120hr；レーン７：140hr ；レーン８：160hr。図10はpCaHj418の制限地図を示す。図11はpDM148の制限地図を示す。図12はpDM149の制限地図を示す。図13はpMHan37の制限地図を示す。図14はpDM154の制限地図を示す。５．発明の詳細な説明フサリウムは培養中での菌糸体過剰及び綿様状を特徴とし、往々にして固体培地上の菌糸体における若干のピンク、紫又は黄色の色合いを有する。分生子柄は変則的に細く、そして単純であるか、又は太い、短い、不規則的に分岐している、もしくは小梗の輪生体を抱え、単独であるか又は分生子褥へとまとまっている。分生子は主に２通りあり、往々にして小さな湿った頭部の中に保持されている。即ち、大分生子は多区画となっており、若干曲屈しているか、又は先端で曲がっており、一般にカヌー型であり、そして小分生子は一区画となっており、卵形又は長だ円形であり、単独で又は鎖状で保持されている。一部の分生子は中間型であり、２又は３区画となっており、長だ円形又は若干屈曲している。特定の態様において、本発明の宿主細胞は以下の特徴を有するフサリウム・グラミネアルム種である。分生子：小分生子がない。大分生子ははっきりと隔壁で仕切られ、厚壁であり、まっすぐからやや鎌状であり、不規則的に屈曲し、腹部の面はほぼまっすぐであり、そしてなめらかに弓なりとなった背面を有する。基底細胞は明瞭に足型となっている。頂点の細胞は円錐形又は鼻(snout)のようにくびれている。分生子柄：分岐していない又は分岐した単分生子柄。厚壁胞子は一般に培養物を非常にゆっくりと形成する；そのようなとき、それらは往々にして大分生子の形態であるが、しかし菌糸の形態でもありうる。コロニー形態：PD A上で、増殖は迅速であり、密な気生菌糸体はチューブをほぼ滴林にし得、そして往々にして黄色から黄かっ色であり、白色から深紅色のふち取りをもつ。赤茶色から橙色の分生子褥は存在しているならまばらであり、往々にしてその培養物が30日目より古いときに見れる。下層は通常深紅色である。この菌類は変色の章の全ての種のうちで最もシリンダー状（背面と側面とが平行）の大分生子を産生する。最も特別な態様において、フサリウム・グラミネアルムはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そして番号ATCC 20334の付けられたフサリウム・グラミネアルム・シュワベ（Schwabe）IMI 145425(米国特許第4,091, 189号)、並びに同様に無毒、非毒素原性及び非病原性である誘導体及び突然変異体、例えば米国特許第 4,041,189号に教示のものである。本明細書及び請求の範囲全体を通じて、「フサリウム・グラミネアルム」なる語の利用はこの種に包括される生物のみならず、別の分類系列において別の種に従来又は現在割り当てられているが、しかしなから上記と同じ形態学及び培養特性をもつ種であって、Ｆ．グラミネアルムの異名でありうるものをも含む。これらには、限定することなく、フサリウム・ロゼウム(F ．roseum)、Ｆ．ロゼウム．var.グラミネアルム、ジッベレラ・ジー、又はジッベレラ・ロゼウム(G．roseum)、ジッベレラ・ロゼウムf．sp.セレアリス(G．ｒo seum f．sp．cerealis)が含まれる。当業者は本明細書に記載の宿主種の有効な形質転換が特異的に例示しているベクター、プロモーター及び選択マーカーの利用に限定されないことをも認識するであろう。一般に、Ｆ．オキシスポルム、Ｆ．ソラン及びＦ．カルモルム(F．cu lmorum)の形質転換において有用な技術は本発明の宿主細胞にも有用である。例えば、amdＳ選択マーカーが好適であるが、その他の有用な選択マーカーにはarg Ｂ（Ａ．ニドゥランス又はＡ．ニガー）、trpＣ（Ａ．ニガー又はＡ．ニドゥランス）、pyrＧ（Ａ．ニガー、Ａ．オリザ又はＡ．ニドゥランス、niaＤ（Ａ．ニドゥランス、Ａ．ニガー又はＦ．オキシスポルム）及びhygＢ（Ｅ．コリ(E．col i)）マーカーが含まれる。プロモーターはこれらの種において強力な転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、そして細胞外及び細胞内タンパク質の双方、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及び解糖酵素をコードする遺伝子に由来しうる。かかるプロモーターの例には、限定することなく、Ａ．ニドゥランスamdSプロモーター、又は解糖酵素、例えばTP I，ADH，GAPDH及びPGKについての遺伝子由来のプロモーターが含まれる。プロモーターは同族プロモーター、即ち、使用する宿主株にとって天然の遺伝子のためのプロモーターであってもよい。このプロモーター配列には、プロモーター配列と選定の遺伝子又は選定のシグナルペプチドもしくはプレ領域とのライケーションを助長する特定の制限部位を導入する目的でリンカーが施されていてもよい。プロモーター配列はフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子又はこの配列と実質的に同じプロモーター活性を有するそのフラグメントに由来しうる。プロモーターの配列をSEQ ID NO：５に示す。本発明は更に以下の条件下でSEQ ID NO：５に示すプロモーター配列とハイブリダイズする核酸配列を包括する：〔５×のSSCの中での予備浸漬及び20％のホルムアミド、５×のDenhardt溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8及び50μｇの変性音波処理仔牛胸腺DNAの溶液中での約40℃で１ｈにわたるプレハイブリダイゼーション、それに続く100μＭのATPの添加された同一の溶液中での約40℃で18hrにわたるハイブリダイゼーション、それに続く0.4×のSSCの中での約45℃の温度での洗浄〕。又は、本発明は更に、SEQ ID NO：５に対して約90％以上の相同性、そして好ましくは約95％以上の相同性を有するが、しかしこの配列と実質的に同じプロモーター活性を有する核酸配列を包括する。別の態様において、プロモーターは窒素制限の際に発現される遺伝子の陽性レギュレーターであるAreAの大量の結合性部位を含んで成る配列であってよい；これらの部位はニューロスポラ・クラッサにおいてnit−２と呼ばれている（Fu and Marzlus，1990，Proc．Natl ．Acad．Sci．U．S．A．87：5331-5335）。プロモーター配列はかかるAreA部位の付加又は置換により修飾され得る。ターミネーター及びポリアデニル化配列はプロモーターと同じ起源に由来してもよい。特定の態様において、このターミネーター配列はフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するものであるか、又はこの配列と実質的に同じターミネーター活性を有するそのフラグメントである。このターミネーターの配列をSEQ ID NO：６に示す。本発明は更に以下の条件下でSEQ I D NO：６に示すターミネーター配列とハイブリダイズする核酸配列を包括する：〔５×のSSCの中での予備浸漬及び20％のホルムアミド、５×のDenhardt溶液、5 0mMのリン酸ナトリウム、pH6.8及び50μｇの変性音波処理仔牛胸腺DNAの溶液中での約40℃で１hrにわたるプレハイブリダイゼーション、それに続く 100μＭのATPの添加された同一の溶液中での約40℃で18hrにわたるハイブリダイゼーション、それに続く0.4×のSSCの中での約45℃の温度での洗浄〕。又は、本発明は更に、SEQ ID NO：６に対して約90％以上の相同性、そして好ましくは約95％以上の相同性を有するが、しかしこの配列と実質的に同じターミネーター活性を有する核酸配列を包括する。エンハンサーもこの構築体に挿入してよい。発現生成物を得るための細胞の破壊の必要性を回避するため、及ひ細胞内の発現生成物の考えられる分解の程度を最小限とするため、その生成物は細胞外に分泌されることが好ましい。このため、好適な態様において、注目の遺伝子を、発現生成物を細胞の分泌経路に導き得るシグナル又はリーダーペプチドの如きプレ領域に連結する。このプレ領域は任意の生物からの任意の分泌タンパク質にとっての遺伝子に由来しうるか、又は天然プレ領域であってよい。かかるプレ領域にとってのとりわけ有用な起源はアスペルギル種由来のグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バチルス種由来のアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミーヘイ由来のリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のα因子についての遺伝子、又は仔牛プロキモシン遺伝子である。プレ領域はＡ．オリザTAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー中性 α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ｂ．リシェニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ、バチルス NCIB 11837由来のマルトジェニックアミラーゼ、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ B．stearothermophilus）・α−アミラーゼ又はＢ．リシェニホルミス・スブチリシンについての遺伝子に由来しうる。有効なシグナル配列はＡ．オリザTAKAアミラーゼシグナル、リゾムコール・ミーヘイ・アスパラギン酸プロテイナーゼシグナル及びリゾムコール・ミーヘイ・リパーゼシグナルである。他に、発現すべき遺伝子にとって天然の遺伝子、例えばSEQ ID NO：４のアミノ酸−24と−５との間の遺伝子も利用できうる。プロモーター及びターミネーター配列に機能的に連結された所望の生成物に関する遺伝子を選択マーカーを含むベクターの中に組込むか、又は宿主株のゲノムの中に組込まれることのできる独立のベクターもしくはプラスミドの上に載せてよい。他方、使用するベクターは宿主細胞中の線形又は環状染色体外因子として複製可能でありうる。これらのタイプのベクターには、例えばプラスミド及びミニ染色体が含まれる。このベクター系は単一のベクターもしくはプラスミド、又は２以上のベクターもしくはプラスミドであってゲノムの中に組込まれるべき全 DNAを共に含むものであってよい。宿主細胞は当業界において公知の手順、例えば形質転換及びエレクトロポレーションを利用して異種タンパク質をコードする核酸により形質転換されうる（例えば、Fincham，1989，Microbial Rev．53：148-170を参照のこと）。本発明の組換宿主細胞は当業界公知の手順を利用して培養されうる。簡単には、宿主細胞を標準の増殖培地、例えば無機塩、ビタミン、適当な有機炭素源、例えばグルコースもしくはデンプン、任意の様々な複合栄養源（酵母抽出物、加水分解カゼイン、ダイズマメミール等）の組合せを含むものの上で培養する。一例はFP−１培地（５％のダイズマメミール、５％のグルコース、２％のK₂HPO₄，0.2％のCaCl₂， 0.2％のMgSO₄・7H₂O及び0.1％のプルロニン酸（BASF））である。発酵は約4.5〜 8.0のpH及び約20〜37℃の温度で約２〜７日間行う。当該宿主細胞種は注目の任意の原核又は真核異種タンパク質を発現させるために使用でき、そして好ましくは真核系タンパク質を発現させるために使用する。これらの種にとって特に注目されるのは異種タンパク質、特に菌類酵素の発現におけるその使用である。この新規の発現系は酵素、例えばカタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、キュチナーゼ、プロテアーゼ及びその他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ及びその他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシターゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、ムタナーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼを発現させるために使用できる。特定の態様において、この酵素はアルカリ性プロテアーゼ、例えばフサリウム・オキシスポルム・プレープロ−トリプシン遺伝子である。最も特別な態様において、ゲノム配列をSEQ ID NO：３において示し、そしてタンパク質配列をSEQ I D NO：４に示す。別の特定の態様において、この酵素はアルカリ性エンドグルカナーゼであり、これはヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）DSM 1800由来の高純度の〜43kDエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫学的に反応性であるか、又はセルラーゼ活性を示す〜43kDのエンドグルカナーゼの誘導体である（WO 91/17243を参照のこと）。以降に「Careyme（登録商標）」と称するエンドグルカナーゼはSEQ ID NO：７に示す遺伝子によりコードされ得、そしてSEQ ID NO：８に示すタンパク質配列を有しうる。この酵素はCarezyme（登録商標）変異体でもありうる。更なる別の特定の態様において、この酵素は１，３特異性リパーゼあり、以降にLipolase（登録商標）と呼ぷ。この酵素はSEQ ID NO：９に示すDNA配列によりコードされ得、そしてSEQ ID NO：10に示すアミノ酸配列を有しうる。この酵素はLipolase（登録商標）変異体、例えばD96L，E210K，E210Lであってもよい（WO 92/05249を参照のこと）。当業者は、「菌類酵素」なる語が天然菌類酵素のみならず、活性、熱安定性、 pH寛容性等を高めるために施されうるアミノ酸置換、欠失、付加又はその他の修飾により修飾されている菌類酵素も含むことを理解するであろう。当該宿主細胞種はホルモン、成長因子、レセプター等の如き薬理学的に注目される異種タンパク質の発現のためにも利用できうる。本発明を以下の非限定例により更に説明する。６．実施例６．１．フサリウム・グラミネアルム20334は低レベルでのみタンパク質を分泌する。フサリウム・グラミネアルム株20334，Ａ．オリザ及びＡ．ニガーの分生胞子懸濁物を125mlの振盪フラスコの中の25mlのYPD培地（１％の酵母抽出物(Difco) 、２％のバクトペプトン(Difco)、２％のグルコース）に接種し、そして30℃，3 00rpmで５日間インキュベートする。培養物由来の上清液を遠心により回収する。総量10μ ｌづつのサンプルを10μｌの0.1Ｍのジチオスレイトール（Slgma）及び10μｌの装填バッファー（40mMのトリスベース、６％のドデシル硫酸ナトリウム、2.5mM のEDTA，15％のグリセロール、２mg／mlのブロモクレゾール・パープル）と混合する。これらのサンプルを５分間煮沸し、そして４−12％のポリアクリルアミドゲル（Novex）で泳動させる。タンパク質をクマジーブルーによる染色により識別化させる。その結果（図１）は、フサリウム・グラミネアルム株20334がごくわずかな分泌タンパク質しか生成しないことを示した。６．２．フサリウム・グラミネアルム20334は低レベルでのみプロテアーゼを分泌する。フサリウム・グラミネアルム株20334，Ａ．オリザ及びＡ．ニガー由来の全量4 0μｌの培養液（上記の６．１章を参照のこと）をカゼインアガープレート（２％の脱脂粉乳(Lucerne)、50mMのトリス−HCl pH＝7.5 ，１％のノブルアガー(Di fco)）へと切ったウェルの中にそれぞれ分注する。これらのプレートを37℃で５時間インキュベートし、そしてタンパク質加水分解ゾーンを観察する。その結果（図２）は、フサリウム・グラミネアルム株20334培養液が非常にわずかなタンパク質分解活性しかもたないことを示した。６．３．フサリウム・オキシスポルム・ゲノム・プレプロ−トリプシン遺伝子のクローニングラムダファージ中のゲノムDNAライブラリーをSambrookら、1989，Molecular C loning，ＡLaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NYにおいて記載されている如き方法を利用してＦ．オキシスポルムゲノムDNAから調製する。全部で50μ ｇのゲノムDNAを10mMのトリス(pH＝7.5)、50mMのNaCl，７mMのMgCl₂，７mMの２ −メルカプトエタノール及び４ユニットの制限酵素Sau ３Ａを含む200μｌの容量において37℃で１分消化させる。分子サイズ10−20kbの部分消化DNAをアガロースゲル電気泳動により単離し、次いで透析膜に電気溶離させ、そしてElutip−Ｄカラム（Schleicher and Schuell）を利用して濃縮する。制限酵素BamHＩで切り、そしてホスファターゼ（Clonetech）で処理したEMBL４のファージの１μｇのラムダアームを標準条件下（Sambrookら、1989，Molecular Cl oning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY）で25μｌ容量において 300〜400μｇのSau ３Ａ切断ゲノムDNAとライゲーションさせる。ラムダファージを、商業的に有用なキット（Gigapack Gold II，Stratagene）を利用し、その製造者の仕様に従い、このライゲーション混合物から調製する。約15,000個の組換ラムダファージのブレーティング及びフィルターリフトの製造（Hybond Ｎ⁺フィルター、Amershamに対する）は標準の方法を利用して行う（Sambrookら、1989，Molecu1ar Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY）。これらのフィルターをハイブリダイゼーションのために非放射能核酸検出(Boehringer Mannheim)用のGenius Kitにより、標準の方法（Sambrook ら、1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Sprinｇ Harbor，N Y）を利用して処理する。プローブとして使用するDNAはプラスミドpSX 233の中に存在するＦ．オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼ（以降SP387と称す）遺伝子の全コード領域の0.75kbのジゴキシゲニン(DIG)ラベル化PCRフラグメントとする。このプラスミドはNRRLに受託番号NRRLＢ−21241で寄託されている。P CR反応のためのプライマーは５’−tgcggatccATGGTCAAGTTCGCTTCCGTC（フォワードプライマー；SEQ ID NO：１）及び５’−gacctcgagTTAAGCATAGGTGTCAATGAA（リバースプライマー；SEQ ID NO：２）とする。双方のプライマーにおいて、小文字はリンカー配列を表わし、そして大文字はSP387遺伝子のコード領域に相当する。 PCRを実施するため、プラスミドpSX233由来のSP387遺伝子を含む907bpのBamHI/X baI DNAフラグメント25ngを68pmoleづつのフォワード及びリバースプライマーと混合する。 DNAフラグメント及びプライマーの混合物を１ＸのTaqバッファー／１ＸのDIG ラベル用ミックス／５ユニットのTaq（Boehringer Mannbeim）中で80μｌの容量にする。反応条件は95℃で３分、次いで35サイクルの95℃で30秒、50℃で１分、 72℃で１分、とする。Ｆ．オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼ由来のPC Rにより誘導されたDNA配列をSEQ ID NO：３に示す。ファージプラークをGenius キット(Boehringer Mannheim)の改良(Engler and Blum，1993，Anal．Blochem． 210：235-244)を利用し、DIGラベル化プローブによりスクリーニングする。陽性クローンを単離し、そして第２ラウンドのプレーティング及びハイブリダイゼーションにより精製する。Ｆ．オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼ遺伝子を含む組換ラムダファージを調製し、そしてDNAをQuiagen lamda midi調製用キット(Quiagen)を利用してファージから単離する。６．４．発現プラスミドpJRoy６の構築制限地図、サザンブロッティング及びハイブリダイゼーション技術（Sambrook ら、1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY ）を、Ｆ．オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼコード遺伝子及び隣接DN A配列を含む組換ファージの１つから5.5kbのPStＩ制限酵素フラグメントを同定するために用いる。この5.5kbのPstＩフラグメントをPstＩ消化したpUC118にサブクローニングし、そしてこのプラスミドをpJRoy４と命名する（図３参照）。プラスミドpJRoy４を制限酵素EcoRＩで消化し、そしてSP387遺伝子を含む3.5kb のEcoRＩフラグメントとpUC118ポリリンカーの43bpのEcoRＩ/PstＩ領域を単離し、そしてベクターpT oC90にサブクローニングしてプラスミドpJRoy６を作り上げる（図３）。６．５．SP387発現カセットの構築 pUC118中のBamHＩ部位により連結されたSP387プロモーター及びターミネーターを含む発現カセット(pJRoy20)を構築する。pJRoy20を含むＥ．コリ株はNRRLに寄託してある。プロモーターフラグメントを、SP387ベクターpJRoy６をEcoRＩ（これは−1200を切る）及びNcoＩ（これは翻訳開始部位を切る：図５参照）で消化することにより作る。ターミネーター配列（図５のbp2056−3107）は以下のオリゴヌクレオチドを利用するPCR増幅により作る：フォワードリバース大文字はSP387ターミネーターDNAに対応し、一方小文字は操作された制限部位を含むテールである。 NcoＩ及びSphＩによる消化後、５’末端上でNcoＩ及びBamHＩ部位の隣接する並びに３’末端上でEcoRＩ，PmeＩ，KpnＩ及びSphＩ部位の隣接するターミネーターを含む得られる増幅生成物を単離する。プロモーターフラグメント、ターミネーターフラグメント及びKpnＩ/SphＩ切断pUC118の三段ライゲーションを行ってpJRoy20を作る（図５参照）。６．６．Carezyme（登録商標）構築体 SP387プロモーターにおける−15位のEcoRＶ部位及びCarezyme（登録商標）コード領域の＋243位にあるNcoＩ部位をSP387プロモーターとCarezyme（登録商標）遺伝子との正確な融合体を作り上げるために利用する。SP387プロモーターの−18〜−１、それに直接続くCarezyme（登録商標）遺伝子の−１〜＋294を含むPCRフラグメントを以下のプライマーを利用してCare zyme（登録商標）ベクターpCaHj418（図10参照）から作る：フォワードリバースフォワードプライマーの小文字はSP387プロモーターのbp−24〜−１であり、一方大文字はCarezyme（登録商標）のbpＩ〜20である。利用するPCR条件は、95℃で５分、それに続く30サイクルの95℃で30秒、50℃ で１分、72℃で１分とする。得られる0.32KbのフラグメントをInvitrogenのTAクローニングキットを利用してベクターpCRIIにクローニングし、pDM148を得る（図11参照）。0.26kbのEcoRＶ/NcoＩフラグメントをpDM148から単離し、そしてpC aHj418由来の0.69kbのNcoＩ/BglIIフラグメントにライゲーションし、そしてEco RＶ／BamHＩ消化したpJRoy20にクローニングし、pDM149を作り上げる（図12参照）。3.2kbのEcoRＩ Carezyme（登録商標）発現カセット（SP387プロモーター／ Carezyme（登録商標）／SP387ターミネーター）をpDM149から単離し、そしてpTo C90のEcoRＩ部位にクローニングしてpDM151を作り上げる（図６参照）。発現構築体pDM151は発現カセット及びamdS選択マーカーの双方を含む。pDM151を含むＥ．コリ株はNRRLに寄託してある。６．７．Lipolase（登録商標）構築体 SP387プロモーターの−15位のEcoRＶ及びLipolase（登録商標）コード領域の＋６位のSacＩ部位をSP387プロモーターとLipolase（登録商標）遺伝子との正確な融合体を作るために用いる。SP387プロモーターの最後の15bp、それに続くLip olase（登録商標）コード領域の最初の６bpを含むアダプターを構築し、それを以下に示す。 Lipolase（登録商標）cDNA遺伝子の0.9kbのSacＩ／BamHＩフラグメントをＡ．オリザ発現構築体pMHan37(図13参照)から単離する。EcoRＶ/SacＩアダプター及びSacＩ／BamHＩ Lipolase（登録商標）フラグメントをライゲーションし、そしてEcoRＶ／BamHＩ消化したpJRoy20にクローニングしてプラスミドpDM154を作り上げる（図14参照）。3.2kbのKpnＩ Lipolase（登録商標）発現カセット（SP 387プロモーター／Lipolase（登録商標）／SP387ターミネーター）をpDM154から単離し、そしてpToC90のKpnＩ部位にクローニングしてプラスミドpDM155を作り上げる（図７参照）。発現構築体pDM155はLipolase（登録商標）発現カセット及びamdＳ選択マーカーの双方を含む。pDM151を含むＥ．コリ株はNRRLに寄託してある。６．８．Ｆ．グラミネアルムの形質転換フサリウム・グラミネアルム株ATCC 20334培養物をVogels培地（Vogel，1964 ，Am．Nature 98：435-446）と1.5％のグルコース及び1.5％のアガーの100枚の1 5mmのペトリ皿の上で25℃で３週間増殖させる。分生子（約１０⁸／プレート）をトランスファーループを用いて10mlの無菌水に入れ、そして４層のチーズクロスそして最後に一層のミラクロスで濾過することにより精製する。分生子懸濁物を遠心により濃縮する。50mlのYPG（１％の酵母抽出物(Dlfco)、２％のバクトペプト(Difco) 、２％のグルコース）に10⁸の分生子を接種し、そして20℃，150rpmで14ｈインキュベートする。得られる菌糸を0.4μｍの滅菌フィルター上で捕捉し、そして無菌蒸留水及び1.0ＭのMgS0₄で順に洗う。その菌糸を10mlのNovozym（登録商標）234（Novo Nordisk)溶液(1.0ＭのMgSO₄中２〜10mg／ml)に再懸濁し、そして34 ℃で15〜30分、80rpmで撹拌しなから消化する。未消化の菌糸材料を得られるプロトプラスト懸濁物から４層のチーズクロス及びミラクロスでの順々の濾過により除去する。20mlの１Ｍのソルビトールをこのチーズクロス及びミラクロスに通し、そしてプロトプラスト溶液と合わせる。混合後、プロトプラスト（約５×10⁸ ）を遠心によりペレットにし、そして20mlの１Ｍのソルビトール及び20mlのSTC (0.8Ｍのソルビトール、50mMのトリス−HCl，pH＝8.0，50mMのCaCl₂)中での再懸濁及び遠心により順々に洗う。この洗浄プロトプラストを４部のSTC及び１部のS PTC(0.8Ｍのソルビトール、40％のポリエチレングリコール4000(BDH)，50mMのトリス−HCl pH＝8.0 ，50mMのCaCl₂)の中に１〜２×10⁸／mlの濃度で再懸濁する。100μｌのプロトプラスト懸濁物をポリプロピレンチューブ(17×100mm)の中の５μｇのpJRoy６及び５μｌのヘパリン(STC中５mg／ml)に加え、そして氷の上で 30分インキュベーションする。１mlのSPTCを静かにこのプロトプラスト懸濁物に混合し、そしてインキュベーシヨンを室温で20分続ける。プロトプラストをCove 塩（Cove，D．J.，1966，Biochem．Biophys．Acta 113：51-56）と10mMのアセトアミド、15mMのCsCl₂，2.5％のノブルアガー(Difco)及び1.0Ｍのスクロースとより成る選択培地の上に0.6Ｍのスクロースと1.0％の低融点アガロース(Sigma)とを有する同じ培地の上層を利用してプレーティングする。プレートを25℃でインキュベートし、そして形質転換体は６〜21日目に出現する。６．９．フサリウム・グラミネアルムにおけるトリプシン様プロテアーゼの発現形質転換体をCOVE２培地（上記のCOVE培地と同じであるが、塩化セシウムがなく、その代わりに30ｇ／ｌの濃度の1.0Ｍのスクロースが入ってる）のプレートに移し、そして25℃で３日以上増殖させる。150mlのフラスコの中の25mlのアリコートのFP−１培地（５％のダイズマメミール、５％のグルコース、２％のK₂HP 0₄，0.2％のCaCl₂，0.2％のMgSO₄・7H₂O及び0.1％のプルロニン酸（BASF））にC OVE２プレート培養物由来の約１cmのアガープラグを接種し、そして30℃で６日撹拌しなから（150rpm）インキュベートする。上清培養液サンプルを遠心を経て回収し、そして以下の通りのSDS−PAGE分析にかける。30μｌづつの培養液を10 μｌのSDS−PAGEサンプルバッファー（１mlの 0.5ＭのトリスpH＝6.8，0.8mlのグリセロール、1.6mlの10％のSDS，0.4mlの0.8Ｍのジチオスレイトール、0.2ml の１％のブロモフェノールブルー）、イソプロパノール中の２μｌの２％のPMSF (Sigma)及び２μｌのグリセロールと混合する。これらのサンプルを沸騰湯浴の中に４分入れ、そして40μｌづつを10−27％のポリアクリルアミドゲル(Novex) 上で泳動させる。そのゲルを標準的な方法を利用してクマージ染料で染色及び脱色する。トリプシン様プロテアーゼの発現レベルは≧0.5ｇ／ｌのと決定される。６．10．酵素アッセイ６．10．１．Carezyme（登録商標）バッファー：リン酸ナトリウム（50mM，pH7.0）基質：AZCL−HEセルロース（Megazyme）：２mg／mlのバッファー酵素標準品：100mgのCarezyme（登録商標）標準品（10,070 ECU／ｇ）を１ml のバッファーに溶かし、そして−20℃で保持する。このストックを酵素アッセイに利用する直前にバッファーの中に１：100で希釈する。アッセイレンジは0.5− 5.OECU／mlである。650,000ECU／ｇのCarezyme（登録商標）の換算係数を使用する。基質溶液(990ml)を24穴マイクロタイタープレートのサンプルウェルに加える。10μｌのCarezyme（登録商標）サンプル（バッファーに希釈して0.5〜10 ECU ／mlの活性にしてある）を基質に加える。反応体を45℃で30分インキュベートし、上清液を96穴マイクロタイタプレートに移し、そして650nmの吸収を測定する。６．10．２．Lipolase（登録商標）アッセイバッファー：４mMのCaCl₂を含む0.1ＭのMOPS，pH7.5 基質：１mlのDMSO中の10mlのｐ−ニトロフェニルブチレート（pNB）； DMSO中の基質に４mlのバッファーを添加 ^*ストック濃度＝20％のDMSO中11.5mM 酵素標準品：Lipolase（登録商標）（23,100LU／ｇ）を1000LU／ mlにて50％のグリセロールに溶かし、そして−20℃ で保存する。このストックをアッセイ直前にバッファーに１：10 0に希釈する。アッセイレンジは0.125〜3.0LU／ mlである。 100μｌのpNBストック溶液を100μｌの適宜希釈した酵素サンプルに加える。活性(mOD／min)を405nmにて、25℃で５分測定する。６．10．３．SP387アッセイＬ−BAPNA基質は、ジメチルスルホキシド中のＬ−BAPNAの0.2 Ｍのストック溶液（Sigma B3133）（凍結保存）を使用直前にバッファー（0.01 Ｍのジメチルグルタル酸(Sigma)、0.2Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウム、p HはNaOHにより6.5に調整）に0.004Ｍにまで希釈することにより調製する。１μ ｌの培養物を遠心する(145,000ｇ，10min)。100μｌの希釈培養液のアリコートを96穴マイクロタイタープレート中の100μｌの基質に加える。405nmでの吸収変化をELISAリーダーを用い、25℃で５分間にわたり30秒間隔でアッセイする。結果を精製SP387標準品に対して計算する。６．11．Carezyme（登録商標）の発現 pDM151の23の形質転換体を精製し、振盪フラスコの中でダイズ／グルコース培地上で培養し、そして９日後にCarezyme（登録商標）活性についてアッセイする（以下の表１参照）。４つの形質転換体が約50−100 mg／ｌのレベルでCarezyme （登録商標）を発現する。形質転換体pDM151−４をSP387製造に関して開発された条件を利用して小スケール発酵槽の中で培養する（章６．９参照）。約6.0ｇ／ｌのCarezyme（登録商標）が７日後に示される（図８Ａ）。Carezyme（登録商標）は７日目に基づき分泌タンパク質の90％以上を占める（図８Ａ）。Carezyme （登録商標）はSDSゲル電気泳動に基づく分泌タンパク質の90％以上を占める。６．12．Lipolase（登録商標）の発現 pDM155の15の形質転換体を精製し、振盪フラスコの中でダイズ／グルコース培地上で培養し、そして９日後にLipolase（登録商標）活性についてアッセイする（表参照）。４つの形質転換体がLipolase（登録商標）を約100〜200mg／ｌのレベル(pNBアッセイに基づく)で発現する。形質転換体pDM155−10をSP387製造に関して開発された条件を利用して小スケール発酵槽の中で培養する（章６．９参照）。約2.0 ｇ／ｌのLipolaseが７日後に示される（図８Ａ）。Lipolase（登録商標）はSDS ゲル電気泳動に基づき分泌タンパク質の90％以上を占める（図８）。７．微生物の寄託以下の生物材料をブダペスト条約のもとで、Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Nothern Regional Research Center，1815 Univer sity Street，Peoria，Illinois，61604に寄託してある。これらの株は、本特許出願の係属中での特許及び商標庁により認められた者の、37 C.F.R．§１．14及びU.S.C.§122並びにブダペスト条約の条件のもとで規定に従うその培養物に対するアクセスが保障されるように寄託してある。この寄託物は各寄託株の生物学的に純粋な培養物である。この寄託物は本願又はその関連出願の提出された図の特許法の要求に従い入手できる。しかしながら、寄託物の入手性は政府活動により認定される特許権の減縮の点において本発明の実施の許可を構成するものではない。本明細書及び請求の範囲に記載の発明は開示の特定の態様に限定されない。その理由は、これらの態様は本発明のいくつかの見解の例示を意図するからである。任意の均等な態様は本発明の範囲に属する。事実、示しているもの他に本発明の様々な改良ができることが当業者にとって明らかであろう。かかる改良は請求の範囲の発明に属する。様々な参考文献が本明細書において例示され、その開示内容は引用することで本明細書に組入れる。

【手続補正書】【提出日】１９９７年３月６日【補正内容】請求の範囲１．プロモーターに作用可能式に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る無毒、非毒素原性、非病原性組換フサリウム宿主細胞。２．前記フサリウムがフサリウム・グラミネアルムである、請求項１記載の宿主細胞。３．前記フサリウム・グラミネアルムがATCC 20334の認定表示を有する請求項１記載の宿主細胞。４．前記異種タンパク質が菌類タンパク質である、請求項１記載の宿主細胞。５．前記異種タンパク質が分泌タンパク質である、請求項１記載の宿主細胞。６．前記異種タンパク質が菌類酵素である、請求項１記載の宿主細胞。７．前記菌類酵素が、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、キュチナーゼ、タンパク分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β− ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼより成る群から選ばれる、請求項６記載の宿主細胞。８．前記菌類酵素がプロテアーゼである、請求項６記載の宿主細胞。９．前記菌類酵素がアルカリ性プロテアーゼである、請求項６記載の宿主細胞。 10．前記アルカリ性プロテアーゼがフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼである、請求項９記載の宿主細胞。 11．前記フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼがSEQ ID N O：４に示すアミノ酸配列を有する、請求項10記載の宿主細胞。 12．前記菌類酵素がエンドグルカナーゼ又はその変異体である、請求項６記載の宿主細胞。 13．前記エンドグルカナーゼがSEQ ID NO：８に示すアミノ酸配列を有する、請求項12記載の宿主細胞。 14．前記菌類酵素が１，３リパーゼ又はその変異体である、請求項６記載の宿主細胞。 15．前記１，３リパーゼがSEQ ID NO：10に示すアミノ酸配列を有する、請求項12記載の宿主細胞。 16．前記異種タンパク質がホルモン、成長因子及びレセプターより成る群から選ばれる、請求項１記載の宿主細胞。 17．前記プロモーターが菌類プロモーターである、請求項１記載の宿主細胞。 18．前記プロモーターがＡ．ニドゥランスamdＳ由来のプロモーターより成る群から選ばれる、請求項17記載の宿主細胞。 19．前記菌類プロモーターがフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するものであるか又はこの配列と実質的に同じプロモーター活性を有するそのフラグメントである、請求項17記載の宿主細胞。 20．前記プロモーター配列がSEQ ID NO：５に示すものである、請求項19記載の宿主細胞。 21．選択マーカーも含んで成る、請求項１記載の宿主細胞。 22．前記マーカーがargＢ，trpＣ，pyrＧ，amdＳ，niaD及びhygＢより成る群から選ばれる、請求項13記載の宿主細胞。 23．ターミネーターも含んで成る、請求項１記載の宿主細胞。 24．前記ターミネーターがフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するものであるか又はこの配列と実質的に同じターミネーター活性を有するそのフラグメントである、請求項23記載の宿主細胞。 25．前記ターミネーター配列がSEQ ID NO：６に示すものである、請求項24記載の宿主細胞。 26．注目のタンパク質を製造するための方法であって、プロモーターに作用可能式に連結された前記タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る無毒、非毒素原性、非病原性組換宿主細胞を培養し、そしてそのタンパク質を単離することを含んで成る方法。 27．フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター配列又はその配列と実質的に同じプロモーター活性を有するそのフラグメントであって、ここで前記プロモーターがSEQ ID NO：５に示す配列を有するものである、前記配列。 28．フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するターミネーター配列又はその配列と実質的に同じターミネーター活性を有するそのフラグメントであって、ここで前記ターミネーターがSEQ ID N O：６に示す配列を有するものである、前記配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:77） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヨダー，ウェンディーアメリカ合衆国，カリフォルニア 95694, ウインターズ，プレザントバレーロード 8503 (72)発明者シュスター，ジェフリーアール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，レガッタレーン 2619

Claims

【特許請求の範囲】１．プロモーターに作用可能式に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る無毒、非毒素原性、非病原性組換フサリウム宿主細胞。２．前記フサリウムがフサリウム・グラミネアルムである、請求項１記載の宿主細胞。３．前記フサリウム・グラミネアルムがATCC 20334の認定表示を有する請求項１記載の宿主細胞。４．前記異種タンパク質が菌類タンパク質である、請求項１記載の宿主細胞。５．前記異種タンパク質が分泌タンパク質である、請求項１記載の宿主細胞。６．前記異種タンパク質が菌類酵素である、請求項１記載の宿主細胞。７．前記菌類酵素が、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、キュチナーゼ、タンパク分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β− ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼより成る群から選ばれる、請求項６記載の宿主細胞。８．前記菌類酵素がプロテアーゼである、請求項６記載の宿主細胞。９．前記菌類酵素がアルカリ性プロテアーゼである、請求項６記載の宿主細胞。 10．前記アルカリ性プロテアーゼがフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼである、請求項９記載の宿主細胞。 11．前記フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼがSEQ ID N O：４に示すアミノ酸配列を有する、請求項10記載の宿主細胞。 12．前記菌類酵素がエンドグルカナーゼ又はその変異体である、請求項６記載の宿主細胞。 13．前記エンドグルカナーゼがSEQ ID NO：８に示すアミノ酸配列を有する、請求項14記載の宿主細胞。 14．前記菌類酵素が１，３リパーゼ又はその変異体である、請求項６記載の宿主細胞。 15．前記１，３リパーゼがSEQ ID NO：１に示すアミノ酸配列を有する、請求項12記載の宿主細胞。 16．前記異種タンパク質がホルモン、成長因子及びレセプターより成る群から選ばれる、請求項１記載の宿主細胞。 17．前記プロモーターが菌類プロモーターである、請求項１記載の宿主細胞。 18．前記プロモーターがＡ．ニドゥランス amdＳ由来のプロモーターより成る群から選ばれる、請求項17記載の宿主細胞。 19．前記菌類プロモーターがフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するものであるか又はこの配列と実質的に同じプロモーター活性を有するそのフラグメントである、請求項17記載の宿主細胞。 20．前記プロモーター配列がSEQ ID NO：５に示すものである、請求項19記載の宿主細胞。 21．選択マーカーも含んで成る、請求項１記載の宿主細胞。 22．前記マーカーがargＢ，trpＣ，pyrＧ，amdＳ，niaＤ及びhygＢより成る群から選ばれる、請求項13記載の宿主細胞。 23．ターミネーターも含んで成る、請求項１記載の宿主細胞。 24．前記ターミネーターがフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するものであるか又はこの配列と実質的に同じターミネーター活性を有するそのフラグメントである、請求項23記載の宿主細胞。 25．前記ターミネーター配列がSEQ ID NO：６に示すものである、請求項24記載の宿主細胞。 26．注目のタンパク質を製造するための方法であって、プロモーターに作用可能式に連結された前記タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る無毒、非毒素原性、非病原性組換宿主細胞を培養し、そしてそのタンパク質を単離することを含んで成る方法。 27．フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター配列又はその配列と実質的に同じプロモーター活性を有するそのフラグメントであって、ここで前記プロモーターがSEQ ID NO：５に示す配列を有するものである、前記配列。 28．フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由来するターミネーター配列又はその配列と実質的に同じターミネーター活性を有するそのフラグメントであって、ここで前記ターミネーターがSEQ ID N O：６に示す配列を有するものである、前記配列。