JPH10311833A - Ldl−コレステロールの測定方法 - Google Patents
Ldl−コレステロールの測定方法Info
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- JPH10311833A JPH10311833A JP9137714A JP13771497A JPH10311833A JP H10311833 A JPH10311833 A JP H10311833A JP 9137714 A JP9137714 A JP 9137714A JP 13771497 A JP13771497 A JP 13771497A JP H10311833 A JPH10311833 A JP H10311833A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
- C12Y101/03006—Cholesterol oxidase (1.1.3.6)
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 低比重リポタンパク(LDL)中のコレステ
ロールを、従来法に於いて必要であった、LDLとLD
L以外の不要のリポタンパクとを分離するための煩雑な
前処理操作なしに直接自動分析装置等を用いて測定し得
る方法及びそれに用いられる試薬を提供。 【解決手段】 両性界面活性剤と、シクロデキストリン
又は/及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定
方法。
ロールを、従来法に於いて必要であった、LDLとLD
L以外の不要のリポタンパクとを分離するための煩雑な
前処理操作なしに直接自動分析装置等を用いて測定し得
る方法及びそれに用いられる試薬を提供。 【解決手段】 両性界面活性剤と、シクロデキストリン
又は/及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定
方法。
Description
【発明の属する技術分野】本発明は、血清、血漿などの
生体試料中に存在する低比重リポタンパク(以下、LD
Lと略記する。)中のコレステロールの測定方法及びこ
れに用いる試薬に関する。
生体試料中に存在する低比重リポタンパク(以下、LD
Lと略記する。)中のコレステロールの測定方法及びこ
れに用いる試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】血清中の脂質の主な成分はコレステロー
ル、トリグリセライド、リン脂質等であり、これら血清
脂質はアポタンパクと結合してリポタンパクを形成し血
中を循環する。該リポタンパクは比重の差により高比重
リポタンパク(HDL)、LDL、超低比重リポタンパ
ク(VLDL)カイロミクロン(CM)等に分類され
る。これらリポタンパクのうち、HDLは組織に沈着し
た過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、
抗動脈硬化作用を有し、一方、LDLは肝臓から各組織
へのコレステロールの主たる運搬体であり、LDLの増
加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられてい
る。従って、LDL中のコレステロール(以下、LDL
−コレステロールと略記する。)は、動脈硬化症、虚血
性心疾患(冠動脈疾患)の危険因子と考えられ、該LD
L−コレステロールの含有量は、これら疾患の診断・治
療および予防の重要な指標となる。
ル、トリグリセライド、リン脂質等であり、これら血清
脂質はアポタンパクと結合してリポタンパクを形成し血
中を循環する。該リポタンパクは比重の差により高比重
リポタンパク(HDL)、LDL、超低比重リポタンパ
ク(VLDL)カイロミクロン(CM)等に分類され
る。これらリポタンパクのうち、HDLは組織に沈着し
た過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、
抗動脈硬化作用を有し、一方、LDLは肝臓から各組織
へのコレステロールの主たる運搬体であり、LDLの増
加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられてい
る。従って、LDL中のコレステロール(以下、LDL
−コレステロールと略記する。)は、動脈硬化症、虚血
性心疾患(冠動脈疾患)の危険因子と考えられ、該LD
L−コレステロールの含有量は、これら疾患の診断・治
療および予防の重要な指標となる。
【0003】従来、LDL−コレステロールの測定法と
しては、沈澱法、超遠心法、電気泳動法、算出式による
算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈澱
法、超遠心法及び電気泳動法は、沈澱・遠心分離処理、
超遠心分離処理或いは電気泳動処理により、LDLとL
DL以外の不要のリポタンパクとを分離する前処理工程
が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査
の分野で広く普及している自動分析装置だけで直接測定
を実施することができないという問題点を有している。
また、フリーデワルド(Friedewald)の式で知られてい
る総コレステロール値、HDL−コレステロール値及び
トリグリセライド値から算出する算出法も、トリグリセ
ライドが500mg/dl以上含有する試料を用いた場合に
は、正確なLDL−コレステロール量を測定することが
できないという問題を有している。
しては、沈澱法、超遠心法、電気泳動法、算出式による
算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈澱
法、超遠心法及び電気泳動法は、沈澱・遠心分離処理、
超遠心分離処理或いは電気泳動処理により、LDLとL
DL以外の不要のリポタンパクとを分離する前処理工程
が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査
の分野で広く普及している自動分析装置だけで直接測定
を実施することができないという問題点を有している。
また、フリーデワルド(Friedewald)の式で知られてい
る総コレステロール値、HDL−コレステロール値及び
トリグリセライド値から算出する算出法も、トリグリセ
ライドが500mg/dl以上含有する試料を用いた場合に
は、正確なLDL−コレステロール量を測定することが
できないという問題を有している。
【0004】近年、従来法に於ける上記の如き問題点を
解消するために、種々の方法が開発されており、例えば
特開平7-280812号公報に開示された方法もその一つであ
る。即ち、LDLを凝集剤又は/及び抗体を使用して凝
集させた後に、LDL以外のリポタンパクに含まれるコ
レステロールを定量反応に関与しない別の反応系に導い
て消去(消費)させた後、界面活性剤又は/及び無機塩
類を使用して、凝集させたLDLを定量反応ができる程
度に溶解させ、LDL−コレステロールを定量反応に付
し該溶液の吸光度を測定するという方法がそれである。
解消するために、種々の方法が開発されており、例えば
特開平7-280812号公報に開示された方法もその一つであ
る。即ち、LDLを凝集剤又は/及び抗体を使用して凝
集させた後に、LDL以外のリポタンパクに含まれるコ
レステロールを定量反応に関与しない別の反応系に導い
て消去(消費)させた後、界面活性剤又は/及び無機塩
類を使用して、凝集させたLDLを定量反応ができる程
度に溶解させ、LDL−コレステロールを定量反応に付
し該溶液の吸光度を測定するという方法がそれである。
【0005】しかしながら、この方法は、測定時の試薬
の形態が3試薬系又は4試薬系となるため、このような
試薬形態での測定が可能なごく一部の自動分析装置にし
か適用できず、通常の臨床検査に於いて用いられている
2試薬系での測定にしか使用できない自動分析装置を用
いては測定を実施することができないという問題点があ
る。また、この方法では、測定に用いる試薬の数が多く
なるため、測定値の再現性が低下するという問題点もあ
った。
の形態が3試薬系又は4試薬系となるため、このような
試薬形態での測定が可能なごく一部の自動分析装置にし
か適用できず、通常の臨床検査に於いて用いられている
2試薬系での測定にしか使用できない自動分析装置を用
いては測定を実施することができないという問題点があ
る。また、この方法では、測定に用いる試薬の数が多く
なるため、測定値の再現性が低下するという問題点もあ
った。
【0006】更に、煩雑な前処理操作なしでLDL−コ
レステロールを測定する方法として特開昭58−165
800号公報に開示されている方法がある。しかしなが
ら、この方法は、試薬中の例えば界面活性剤やコレステ
ロールエステラーゼの使用濃度が限定されるため試薬の
調製が煩雑であり、更に測定時のpHや、測定時間間隔
等測定条件を厳密に設定しなくてはならず、しかもHD
L中のコレステロールもある程度反応することから、動
力学的測定、すなわち、レイト・アッセイでしかLDL
−コレステロールの測定を行うことができないため、実
用的な測定方法とは言い難い方法であった。
レステロールを測定する方法として特開昭58−165
800号公報に開示されている方法がある。しかしなが
ら、この方法は、試薬中の例えば界面活性剤やコレステ
ロールエステラーゼの使用濃度が限定されるため試薬の
調製が煩雑であり、更に測定時のpHや、測定時間間隔
等測定条件を厳密に設定しなくてはならず、しかもHD
L中のコレステロールもある程度反応することから、動
力学的測定、すなわち、レイト・アッセイでしかLDL
−コレステロールの測定を行うことができないため、実
用的な測定方法とは言い難い方法であった。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】上記した如き状況に鑑
み、本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のL
DL−コレステロールを、従来法に於いて必要であっ
た、LDLとLDL以外の不要のリポタンパクとを分離
するための煩雑な前処理操作なしに直接自動分析装置等
を用いて測定することを可能とする方法及びそれに用い
られる試薬の提供にある。
み、本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のL
DL−コレステロールを、従来法に於いて必要であっ
た、LDLとLDL以外の不要のリポタンパクとを分離
するための煩雑な前処理操作なしに直接自動分析装置等
を用いて測定することを可能とする方法及びそれに用い
られる試薬の提供にある。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明は、両性界面活性
剤と、シクロデキストリン(以下、CDと略記する。)
又は/及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、LDL−コレステロールの測定方法の発明であ
る。
剤と、シクロデキストリン(以下、CDと略記する。)
又は/及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、LDL−コレステロールの測定方法の発明であ
る。
【0009】また、本発明は、コレステロールオキシダ
ーゼ(以下、CODと略記する。)又はコレステロール
デヒドロゲナーゼ(以下、CHDと略記する。)を用い
るLDL−コレステロールの測定方法であって、試料を
予めCD又は/及びその誘導体を含んでなる試薬で処理
した後、CD又は/及びその誘導体と両性界面活性剤の
共存下でCOD又はCHDを反応させることを特徴とす
る、LDL−コレステロールの測定方法の発明である。
ーゼ(以下、CODと略記する。)又はコレステロール
デヒドロゲナーゼ(以下、CHDと略記する。)を用い
るLDL−コレステロールの測定方法であって、試料を
予めCD又は/及びその誘導体を含んでなる試薬で処理
した後、CD又は/及びその誘導体と両性界面活性剤の
共存下でCOD又はCHDを反応させることを特徴とす
る、LDL−コレステロールの測定方法の発明である。
【0010】更に、本発明は、両性界面活性剤と、CD
又は/及びその誘導体とを含有させてなることを特徴と
する、LDL−コレステロール測定用試薬の発明であ
る。
又は/及びその誘導体とを含有させてなることを特徴と
する、LDL−コレステロール測定用試薬の発明であ
る。
【0011】また、本発明は、CD又は/及びその誘導
体を含んでなる第一試薬と、CODを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、カップラー、デベロッパ
ー、ペルオキシダーゼ(以下、PODと略記する。)、
両性界面活性剤及びコレステロールエステラーゼ(以
下、CHEと略記する。)の夫々が少なくとも第一試薬
と第二試薬の何れかに含まれているLDL−コレステロ
ール測定用試薬の発明である。
体を含んでなる第一試薬と、CODを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、カップラー、デベロッパ
ー、ペルオキシダーゼ(以下、PODと略記する。)、
両性界面活性剤及びコレステロールエステラーゼ(以
下、CHEと略記する。)の夫々が少なくとも第一試薬
と第二試薬の何れかに含まれているLDL−コレステロ
ール測定用試薬の発明である。
【0012】更にまた、本発明は、CD又は/及びその
誘導体、両性界面活性剤及びCHEを含んでなる第一試
薬と、COD及びCHEを含んでなる第二試薬とからな
るものであって、カップラー、デベロッパー及びPOD
の夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含ま
れているLDL−コレステロール測定用試薬の発明であ
る。
誘導体、両性界面活性剤及びCHEを含んでなる第一試
薬と、COD及びCHEを含んでなる第二試薬とからな
るものであって、カップラー、デベロッパー及びPOD
の夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含ま
れているLDL−コレステロール測定用試薬の発明であ
る。
【0013】また、本発明は、CD又は/及びその誘導
体、両性界面活性剤、CHE、及びカップラー(又はデ
ベロッパー)を含んでなる第一試薬と、COD、CH
E、POD、及びデベロッパー(又はカップラー)を含
んでなる第二試薬とを組み合わせてなることを特徴とす
る、LDL−コレステロール測定用キットの発明であ
る。
体、両性界面活性剤、CHE、及びカップラー(又はデ
ベロッパー)を含んでなる第一試薬と、COD、CH
E、POD、及びデベロッパー(又はカップラー)を含
んでなる第二試薬とを組み合わせてなることを特徴とす
る、LDL−コレステロール測定用キットの発明であ
る。
【0014】即ち、本発明者等は、LDL−コレステロ
ールを、LDL以外の不要なリポタンパクを分離分別す
るための前処理操作なしに直接自動分析装置で測定し得
る方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、生体試料中
のLDL−コレステロールの測定を、両性界面活性剤
と、CD又は/及びその誘導体の共存下で行えば、LD
L以外の不要なリポタンパクを分離分別することなくL
DL中のコレステロールを特異的に測定することが可能
となることを見出し、本発明を完成するに至った。
ールを、LDL以外の不要なリポタンパクを分離分別す
るための前処理操作なしに直接自動分析装置で測定し得
る方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、生体試料中
のLDL−コレステロールの測定を、両性界面活性剤
と、CD又は/及びその誘導体の共存下で行えば、LD
L以外の不要なリポタンパクを分離分別することなくL
DL中のコレステロールを特異的に測定することが可能
となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】本発明に於いて用いられる、両性界面活性
剤としては、CDと共存させた場合に、LDL以外のリ
ポタンパクに含有されているコレステロールがコレステ
ロール測定反応に関与するのを抑制する作用を有するも
のであればよく、特に限定されない。このような両性界
面活性剤の具体例としては、例えばアルキルベタイン誘
導体(例えばラウリルベタイン、ステアリルベタイン、
ラウリルジメチルアンモニウムベタイン、ココナットベ
タイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリ
ン酸アミドプロピルベタイン等)、イミダゾリニウムベ
タイン誘導体(例えばラウリルカルボキシメチルヒドロ
キシエチルイミダゾリニウムベタイン、2−アルキル−
N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチルイミダゾ
リニウムベタイン、2−アルキル−N−カルボキシエチ
ル−N−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、
2−ウンデシル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキ
シエチルイミダゾリニウムベタイン等)、スルホベタイ
ン誘導体(例えばN−オクチル−N,N−ジメチル−3
−アンモニオ−1−プロパンスルホン酸、N−デシル−
N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスル
ホン酸、N−ドデシル−N,N−ジメチル−3−アンモ
ニオ−1−プロパンスルホン酸、N−テトラデシル−
N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスル
ホン酸、N−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−3−ア
ンモニオ−1−プロパンスルホン酸等)等のベタイン誘
導体、例えばアルキルグリシン、アルキルジ(アミノエ
チル)グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシ
ン、N−アルキルポリアミノエチルグリシン、β−アラ
ニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体、例えばビス
(2−ウンデシル,N−ヒドロキシエチルイミダゾリ
ン)クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導体等の
イミダゾリン誘導体、例えばラウリルジメチルアミンオ
キサイド等のアミンオキサイド誘導体等が挙げられる。
尚、これら両性界面活性剤は、市販のものを用いても良
いし、公知の方法に準じて合成したものを用いても良
い。これら両性界面活性剤の使用濃度としては、CDと
共存させた場合に、LDL以外のリポタンパクに含有さ
れるコレステロールがコレステロール測定反応に関与す
るのを抑制し得る濃度であればよく、特に限定されない
が、コレステロール測定時の反応液中の濃度、即ち最終
の反応液中の濃度が通常0.0001〜10%(W/V)、好まし
くは0.001〜1%(W/V)となるように添加される。ま
た、例えば、本発明の方法を2試薬系測定法により実施
する場合の各試薬中の両性界面活性剤の使用濃度として
は、試料、第一試薬及び第二試薬の液量比等により異な
るため一概には言えないが、第一試薬のみに両性界面活
性剤を含有させる場合の第一試薬中の両性界面活性剤濃
度としては、通常0.0002〜20%(W/V)、好ましくは0.
002〜2%(W/V)の範囲から適宜選択される。また、
第二試薬のみに両性界面活性剤を含有させる場合の第二
試薬中の両性界面活性剤濃度としては、通常0.0002〜20
%(W/V)、好ましくは0.002〜2%(W/V)の範囲か
ら適宜選択される。更に、第一試薬及び第二試薬の両方
に界面活性剤を含有させる場合の各試薬中の界面活性剤
濃度としては、第一試薬中の濃度が、通常0.0001〜20%
(W/V)、好ましくは0.001〜2%(W/V)、第二試薬
中の濃度が、通常0.0001〜20%(W/V)、好ましくは0.
001〜2%(W/V)となるように夫々添加される。尚、
これら両性界面活性剤は、単独で用いても、或いは二種
以上適宜組み合わせて用いても何れにてもよい。
剤としては、CDと共存させた場合に、LDL以外のリ
ポタンパクに含有されているコレステロールがコレステ
ロール測定反応に関与するのを抑制する作用を有するも
のであればよく、特に限定されない。このような両性界
面活性剤の具体例としては、例えばアルキルベタイン誘
導体(例えばラウリルベタイン、ステアリルベタイン、
ラウリルジメチルアンモニウムベタイン、ココナットベ
タイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリ
ン酸アミドプロピルベタイン等)、イミダゾリニウムベ
タイン誘導体(例えばラウリルカルボキシメチルヒドロ
キシエチルイミダゾリニウムベタイン、2−アルキル−
N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチルイミダゾ
リニウムベタイン、2−アルキル−N−カルボキシエチ
ル−N−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、
2−ウンデシル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキ
シエチルイミダゾリニウムベタイン等)、スルホベタイ
ン誘導体(例えばN−オクチル−N,N−ジメチル−3
−アンモニオ−1−プロパンスルホン酸、N−デシル−
N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスル
ホン酸、N−ドデシル−N,N−ジメチル−3−アンモ
ニオ−1−プロパンスルホン酸、N−テトラデシル−
N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスル
ホン酸、N−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−3−ア
ンモニオ−1−プロパンスルホン酸等)等のベタイン誘
導体、例えばアルキルグリシン、アルキルジ(アミノエ
チル)グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシ
ン、N−アルキルポリアミノエチルグリシン、β−アラ
ニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体、例えばビス
(2−ウンデシル,N−ヒドロキシエチルイミダゾリ
ン)クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導体等の
イミダゾリン誘導体、例えばラウリルジメチルアミンオ
キサイド等のアミンオキサイド誘導体等が挙げられる。
尚、これら両性界面活性剤は、市販のものを用いても良
いし、公知の方法に準じて合成したものを用いても良
い。これら両性界面活性剤の使用濃度としては、CDと
共存させた場合に、LDL以外のリポタンパクに含有さ
れるコレステロールがコレステロール測定反応に関与す
るのを抑制し得る濃度であればよく、特に限定されない
が、コレステロール測定時の反応液中の濃度、即ち最終
の反応液中の濃度が通常0.0001〜10%(W/V)、好まし
くは0.001〜1%(W/V)となるように添加される。ま
た、例えば、本発明の方法を2試薬系測定法により実施
する場合の各試薬中の両性界面活性剤の使用濃度として
は、試料、第一試薬及び第二試薬の液量比等により異な
るため一概には言えないが、第一試薬のみに両性界面活
性剤を含有させる場合の第一試薬中の両性界面活性剤濃
度としては、通常0.0002〜20%(W/V)、好ましくは0.
002〜2%(W/V)の範囲から適宜選択される。また、
第二試薬のみに両性界面活性剤を含有させる場合の第二
試薬中の両性界面活性剤濃度としては、通常0.0002〜20
%(W/V)、好ましくは0.002〜2%(W/V)の範囲か
ら適宜選択される。更に、第一試薬及び第二試薬の両方
に界面活性剤を含有させる場合の各試薬中の界面活性剤
濃度としては、第一試薬中の濃度が、通常0.0001〜20%
(W/V)、好ましくは0.001〜2%(W/V)、第二試薬
中の濃度が、通常0.0001〜20%(W/V)、好ましくは0.
001〜2%(W/V)となるように夫々添加される。尚、
これら両性界面活性剤は、単独で用いても、或いは二種
以上適宜組み合わせて用いても何れにてもよい。
【0016】本発明に於いて用いられる、CD又は/及
びその誘導体としては、両性界面活性剤と共存させた場
合に、LDL以外のリポタンパクに含有されているコレ
ステロールがコレステロール測定反応に関与するのを抑
制する作用を有するものであればよく、特に限定されな
いが、例えばα−CD、β−CD、γ−CD及びこれら
CDの誘導体のなかから適宜選択された、前述の如き性
質を有するものが挙げられる。このようなCD誘導体の
具体例としては、例えば2,6−ジ−O−メチル−α−
シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−メチル−
α−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−エチル−α
−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−エチル
−α−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチル−
β−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−メチ
ル−β−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−エチル
−β−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−エ
チル−β−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチ
ル−γ−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−
メチル−γ−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−エ
チル−γ−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O
−エチル−γ−シクロデキストリン等のアルキル化C
D、例えば2−ヒドロキシエチル−α−シクロデキスト
リン、2−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリ
ン、3−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリ
ン、2,3−ジヒドロキシプロピル−α−シクロデキス
トリン、2−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリ
ン、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン、3−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン、2,3−ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキス
トリン、2−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリ
ン、2−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリ
ン、3−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリ
ン、2,3−ジヒドロキシプロピル−γ−シクロデキス
トリン等のヒドロキシアルキル化CD、例えば2,3,
6−トリ−O−アセチル−α−シクロデキストリン、
2,3,6−トリ−O−アセチル−β−シクロデキスト
リン、2,3,6−トリ−O−アセチル−γ−シクロデ
キストリン等のアシル化CD、例えば6−O−α−D−
グルコシル−α−シクロデキストリン、6−O−α−マ
ルトシル−α−シクロデキストリン、6−O−α−D−
グルコシル−β−シクロデキストリン、6−O−α−マ
ルトシル−β−シクロデキストリン、6−O−α−D−
グルコシル−γ−シクロデキストリン、6−O−α−マ
ルトシル−γ−シクロデキストリン等の糖修飾CD、例
えばO−カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、
O−カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、O−
カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン等のカルボ
キシアルキル化CD、例えばポリ−α−シクロデキスト
リン、ポリ−β−シクロデキストリン、ポリ−γ−シク
ロデキストリン等のポリマー体等が挙げられる。尚、こ
れらCD及びCD誘導体は、市販のものを用いても良い
し、例えば米国特許第3453258号明細書、米国特許第345
3259号明細書、PolymerJournal, Vol.13, No.8, p.777-
781(1981)、特開昭61-266401号公報、特開昭63-122701
号公報、特開昭62-243602号公報等の自体公知の方法に
準じて合成したものを用いても良い。また、これらCD
又は/及びその誘導体の使用濃度としては、両性界面活
性剤と共存させた場合に、LDL以外のリポタンパクに
含まれているコレステロールがコレステロール測定反応
に関与するのを抑制し得る濃度であればよく、特に限定
されないが、コレステロール測定時の反応液中の濃度、
即ち最終の反応液中の濃度が通常0.0001〜10%(W/
V)、好ましくは0.001〜1%(W/V)となるように添加
される。また、例えば、本発明の方法を2試薬系測定法
により実施する場合の第一試薬中のCD又は/及びCD
誘導体の使用濃度としては、試料、第一試薬及び第二試
薬の液量比等により異なるため一概には言えないが、通
常0.0002〜20%(W/V)、好ましくは0.002〜2%(W/
V)となるように添加される。尚、これらCD又はその
誘導体は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせ
て用いても何れにてもよい。
びその誘導体としては、両性界面活性剤と共存させた場
合に、LDL以外のリポタンパクに含有されているコレ
ステロールがコレステロール測定反応に関与するのを抑
制する作用を有するものであればよく、特に限定されな
いが、例えばα−CD、β−CD、γ−CD及びこれら
CDの誘導体のなかから適宜選択された、前述の如き性
質を有するものが挙げられる。このようなCD誘導体の
具体例としては、例えば2,6−ジ−O−メチル−α−
シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−メチル−
α−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−エチル−α
−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−エチル
−α−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチル−
β−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−メチ
ル−β−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−エチル
−β−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−エ
チル−β−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−メチ
ル−γ−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O−
メチル−γ−シクロデキストリン、2,6−ジ−O−エ
チル−γ−シクロデキストリン、2,3,6−トリ−O
−エチル−γ−シクロデキストリン等のアルキル化C
D、例えば2−ヒドロキシエチル−α−シクロデキスト
リン、2−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリ
ン、3−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリ
ン、2,3−ジヒドロキシプロピル−α−シクロデキス
トリン、2−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリ
ン、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン、3−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン、2,3−ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキス
トリン、2−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリ
ン、2−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリ
ン、3−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリ
ン、2,3−ジヒドロキシプロピル−γ−シクロデキス
トリン等のヒドロキシアルキル化CD、例えば2,3,
6−トリ−O−アセチル−α−シクロデキストリン、
2,3,6−トリ−O−アセチル−β−シクロデキスト
リン、2,3,6−トリ−O−アセチル−γ−シクロデ
キストリン等のアシル化CD、例えば6−O−α−D−
グルコシル−α−シクロデキストリン、6−O−α−マ
ルトシル−α−シクロデキストリン、6−O−α−D−
グルコシル−β−シクロデキストリン、6−O−α−マ
ルトシル−β−シクロデキストリン、6−O−α−D−
グルコシル−γ−シクロデキストリン、6−O−α−マ
ルトシル−γ−シクロデキストリン等の糖修飾CD、例
えばO−カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、
O−カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、O−
カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン等のカルボ
キシアルキル化CD、例えばポリ−α−シクロデキスト
リン、ポリ−β−シクロデキストリン、ポリ−γ−シク
ロデキストリン等のポリマー体等が挙げられる。尚、こ
れらCD及びCD誘導体は、市販のものを用いても良い
し、例えば米国特許第3453258号明細書、米国特許第345
3259号明細書、PolymerJournal, Vol.13, No.8, p.777-
781(1981)、特開昭61-266401号公報、特開昭63-122701
号公報、特開昭62-243602号公報等の自体公知の方法に
準じて合成したものを用いても良い。また、これらCD
又は/及びその誘導体の使用濃度としては、両性界面活
性剤と共存させた場合に、LDL以外のリポタンパクに
含まれているコレステロールがコレステロール測定反応
に関与するのを抑制し得る濃度であればよく、特に限定
されないが、コレステロール測定時の反応液中の濃度、
即ち最終の反応液中の濃度が通常0.0001〜10%(W/
V)、好ましくは0.001〜1%(W/V)となるように添加
される。また、例えば、本発明の方法を2試薬系測定法
により実施する場合の第一試薬中のCD又は/及びCD
誘導体の使用濃度としては、試料、第一試薬及び第二試
薬の液量比等により異なるため一概には言えないが、通
常0.0002〜20%(W/V)、好ましくは0.002〜2%(W/
V)となるように添加される。尚、これらCD又はその
誘導体は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせ
て用いても何れにてもよい。
【0017】本発明の測定法は、上記した如き両性界面
活性剤と、CD又は/及びその誘導体とを共存させる以
外は、自体公知のコレステロール測定法に準じて、実施
すれば良く、使用される試薬類もこれら自体公知の方法
に準じて適宜選択すればよい。即ち、血清、血漿等の生
体試料中のLDL−コレステロールを、両性界面活性剤
と、CD又は/及びその誘導体の共存下、自体公知のコ
レステロール測定法に準じて測定することにより、生体
試料中のLDL−コレステロールを特異的に測定するこ
とができる。
活性剤と、CD又は/及びその誘導体とを共存させる以
外は、自体公知のコレステロール測定法に準じて、実施
すれば良く、使用される試薬類もこれら自体公知の方法
に準じて適宜選択すればよい。即ち、血清、血漿等の生
体試料中のLDL−コレステロールを、両性界面活性剤
と、CD又は/及びその誘導体の共存下、自体公知のコ
レステロール測定法に準じて測定することにより、生体
試料中のLDL−コレステロールを特異的に測定するこ
とができる。
【0018】これら自体公知のコレステロール測定法と
しては、生体試料中のコレステロールを測定し得る自体
公知のコレステロール測定法は全て挙げられるが、酵素
反応を利用する、例えば試料中のコレステロールエステ
ルをCHEによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解
し、初めから存在する遊離コレステロールと共に、CO
Dによって酸化して、コレステ−4−エン−3−オンと
過酸化水素にし、PODの存在下、生成した過酸化水素
で被酸化性呈色試薬を酸化発色させて、生じた酸化色素
を比色定量する酸化呈色法、例えば試料中のコレステロ
ールエステルをCHEによって遊離コレステロールと脂
肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと
共にCHDの存在下NAD(P)と反応させて、生成す
るNAD(P)Hを340nmで測定する紫外部測定法等が
好ましく挙げられる。
しては、生体試料中のコレステロールを測定し得る自体
公知のコレステロール測定法は全て挙げられるが、酵素
反応を利用する、例えば試料中のコレステロールエステ
ルをCHEによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解
し、初めから存在する遊離コレステロールと共に、CO
Dによって酸化して、コレステ−4−エン−3−オンと
過酸化水素にし、PODの存在下、生成した過酸化水素
で被酸化性呈色試薬を酸化発色させて、生じた酸化色素
を比色定量する酸化呈色法、例えば試料中のコレステロ
ールエステルをCHEによって遊離コレステロールと脂
肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと
共にCHDの存在下NAD(P)と反応させて、生成す
るNAD(P)Hを340nmで測定する紫外部測定法等が
好ましく挙げられる。
【0019】本発明の測定法に用いられるCODは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等
の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来する
もの等は全て使用可能である。CODの使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜10u/ml、好ましくは0.1〜2u/mlの範囲から
適宜選択される。
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等
の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来する
もの等は全て使用可能である。CODの使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜10u/ml、好ましくは0.1〜2u/mlの範囲から
適宜選択される。
【0020】本発明の測定法に用いられるCHEは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等
の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来する
もの等は全て使用可能である。CHEの使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜10u/ml、好ましくは0.1〜2u/mlの範囲から
適宜選択される。
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等
の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来する
もの等は全て使用可能である。CHEの使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜10u/ml、好ましくは0.1〜2u/mlの範囲から
適宜選択される。
【0021】本発明の測定法に用いられるPODは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物に由来する
もの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白
血球、甲状腺等に由来するもの等は全て使用可能であ
る。PODの使用量としては、コレステロール測定時の
反応液中の濃度として、通常0.01〜50u/ml、好ましく
は0.1〜5u/mlの範囲から適宜選択される。
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物に由来する
もの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白
血球、甲状腺等に由来するもの等は全て使用可能であ
る。PODの使用量としては、コレステロール測定時の
反応液中の濃度として、通常0.01〜50u/ml、好ましく
は0.1〜5u/mlの範囲から適宜選択される。
【0022】本発明の測定法に用いられる被酸化性呈色
試薬としては、PODの存在下、過酸化水素と反応して
呈色するものであれば何れにても良いが、4−アミノア
ンチピリン(4−AA)等のカップラー及び、該カップ
ラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合
せ、即ち、例えば4−AAとフェノール系化合物,ナフ
トール系化合物若しくはアニリン系化合物との組合せ、
3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニ
リン系化合物との組合せ等や、例えば2,2’−アジノ
ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン
酸)、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルア
ミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾー
ル誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、o−フェニレ
ンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する
発色剤等が挙げられる。デベロッパーとしてのフェノー
ル系化合物の具体例としては、例えばフェノール、p−
クロロフェノール、2,4−ジクロロフェノール等が挙
げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば
1−ナフトール、1−ナフトール−2−スルホン酸、1
−ナフトール−2−カルボン酸等が挙げられ、また、ア
ニリン系化合物の具体例としては、例えばN,N−ジエ
チルアニリン、N−エチル−N−(β−ヒドロキシエチ
ル)−m−トルイジン、N−エチル−N−(2−ヒドロ
キシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニ
リン(DAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ
−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシ−4−フ
ルオロアニリン(FDAOS)、N−(2−ヒドロキシ
−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン
(HDAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−
3−スルホプロピル)−m−トルイジン(TOOS)、
N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サク
シニル−エチレンジアミン(EMSE)等が挙げられ
る。カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場
合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの
種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なる
ため一概には言えないが、コレステロール測定時の反応
液中の濃度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜
10mMの範囲から適宜選択され、カップラーとして4−A
Aを使用する場合の使用量としては、コレステロール測
定時の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好まし
くは0.1〜5mMの範囲から適宜選択される。また、デベ
ロッパーの使用量としては、用いるデベロッパーの種類
や組み合わせるカップラーの種類等により異なるため一
概には言えないが、コレステロール測定時の反応液中の
濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜5mMの
範囲から適宜選択される。トリフェニルメタン系ロイコ
色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリー
ン、ビス(p−ジエチルアミノフェニル)−2−スルホ
フェニルメタン、ビス(p−ジエチルアミノフェニル)
−3,4−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナト
リウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体
例としては、例えばビス〔4−ジ(2−ブトキシエチ
ル)アミノ−2−メチルフェニル〕アミン、N,N−ビ
ス(4−ジエチルアミノ−2−メチルフェニル)−N’
−p−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロ
イコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば10
−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビ
ス(ジメチルアミノ)フェノチアジン・ナトリウム塩、
10−〔3−(メトキシカルボニルアミノメチル)フェニ
ルメチルアミノカルボニル〕−3,7−ビス(ジメチル
アミノ)フェノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジ
ジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、o−
トリジン、o−ジアニシジン、3,3’−ジアミノベン
ジジン、3,3’,5,5’−テトラアミノベンジジン
等が挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例
としては、例えば2−(4−カルボキシフェニル)−3
−N−メチルカルバモイル−4,5−ビス(4ージエチ
ルアミノフェニル)イミダゾール、2−(3−メトキシ
−4−ジエチルアミノフェニル)−3−N−メチルカル
バモイル−4,5−ビス(2−メチル−4−ジエチルア
ミノフェニル)イミダゾール等が挙げられる。これら発
色剤の使用量としては、通常この分野で用いられる濃度
範囲から適宜選択される。
試薬としては、PODの存在下、過酸化水素と反応して
呈色するものであれば何れにても良いが、4−アミノア
ンチピリン(4−AA)等のカップラー及び、該カップ
ラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合
せ、即ち、例えば4−AAとフェノール系化合物,ナフ
トール系化合物若しくはアニリン系化合物との組合せ、
3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニ
リン系化合物との組合せ等や、例えば2,2’−アジノ
ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン
酸)、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルア
ミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾー
ル誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、o−フェニレ
ンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する
発色剤等が挙げられる。デベロッパーとしてのフェノー
ル系化合物の具体例としては、例えばフェノール、p−
クロロフェノール、2,4−ジクロロフェノール等が挙
げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば
1−ナフトール、1−ナフトール−2−スルホン酸、1
−ナフトール−2−カルボン酸等が挙げられ、また、ア
ニリン系化合物の具体例としては、例えばN,N−ジエ
チルアニリン、N−エチル−N−(β−ヒドロキシエチ
ル)−m−トルイジン、N−エチル−N−(2−ヒドロ
キシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニ
リン(DAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ
−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシ−4−フ
ルオロアニリン(FDAOS)、N−(2−ヒドロキシ
−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン
(HDAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−
3−スルホプロピル)−m−トルイジン(TOOS)、
N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サク
シニル−エチレンジアミン(EMSE)等が挙げられ
る。カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場
合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの
種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なる
ため一概には言えないが、コレステロール測定時の反応
液中の濃度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜
10mMの範囲から適宜選択され、カップラーとして4−A
Aを使用する場合の使用量としては、コレステロール測
定時の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好まし
くは0.1〜5mMの範囲から適宜選択される。また、デベ
ロッパーの使用量としては、用いるデベロッパーの種類
や組み合わせるカップラーの種類等により異なるため一
概には言えないが、コレステロール測定時の反応液中の
濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜5mMの
範囲から適宜選択される。トリフェニルメタン系ロイコ
色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリー
ン、ビス(p−ジエチルアミノフェニル)−2−スルホ
フェニルメタン、ビス(p−ジエチルアミノフェニル)
−3,4−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナト
リウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体
例としては、例えばビス〔4−ジ(2−ブトキシエチ
ル)アミノ−2−メチルフェニル〕アミン、N,N−ビ
ス(4−ジエチルアミノ−2−メチルフェニル)−N’
−p−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロ
イコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば10
−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビ
ス(ジメチルアミノ)フェノチアジン・ナトリウム塩、
10−〔3−(メトキシカルボニルアミノメチル)フェニ
ルメチルアミノカルボニル〕−3,7−ビス(ジメチル
アミノ)フェノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジ
ジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、o−
トリジン、o−ジアニシジン、3,3’−ジアミノベン
ジジン、3,3’,5,5’−テトラアミノベンジジン
等が挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例
としては、例えば2−(4−カルボキシフェニル)−3
−N−メチルカルバモイル−4,5−ビス(4ージエチ
ルアミノフェニル)イミダゾール、2−(3−メトキシ
−4−ジエチルアミノフェニル)−3−N−メチルカル
バモイル−4,5−ビス(2−メチル−4−ジエチルア
ミノフェニル)イミダゾール等が挙げられる。これら発
色剤の使用量としては、通常この分野で用いられる濃度
範囲から適宜選択される。
【0023】本発明の測定法に用いられるCHDは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、ノカルディア属に由来するもの等が使
用可能である。CHDの使用量としては、コレステロー
ル測定時の反応液中の濃度として、通常0.1〜100u/m
l、好ましくは1〜50u/mlの範囲から適宜選択される。
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、ノカルディア属に由来するもの等が使
用可能である。CHDの使用量としては、コレステロー
ル測定時の反応液中の濃度として、通常0.1〜100u/m
l、好ましくは1〜50u/mlの範囲から適宜選択される。
【0024】本発明の測定法に用いられるNAD(P)
は、特に限定されず、通常この分野で使用されているも
のは全て使用可能である。NAD(P)の使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜50mM、好ましくは0.1〜10mMの範囲から適宜選
択される。
は、特に限定されず、通常この分野で使用されているも
のは全て使用可能である。NAD(P)の使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜50mM、好ましくは0.1〜10mMの範囲から適宜選
択される。
【0025】本発明のLDL−コレステロール測定用試
薬は、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のLDL−
コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、両
性界面活性剤と、CD又は/その誘導体とを使用する以
外は、上記した如き自体公知のコレステロール測定法に
使用される試薬類、例えば酸化呈色法に於いて使用され
るCOD、CHE、POD、被酸化性呈色試薬等の試薬
類、例えば紫外部測定法に於いて使用されるCHE、C
HD、NAD(P)等の試薬類を、この分野で使用され
る濃度範囲で含有するように調製されたものであり、構
成要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で述べた通り
である。
薬は、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のLDL−
コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、両
性界面活性剤と、CD又は/その誘導体とを使用する以
外は、上記した如き自体公知のコレステロール測定法に
使用される試薬類、例えば酸化呈色法に於いて使用され
るCOD、CHE、POD、被酸化性呈色試薬等の試薬
類、例えば紫外部測定法に於いて使用されるCHE、C
HD、NAD(P)等の試薬類を、この分野で使用され
る濃度範囲で含有するように調製されたものであり、構
成要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で述べた通り
である。
【0026】本発明のLDL−コレステロ−ル測定用試
薬は、1試薬系測定法用として調製されたものでも2試
薬系測定法用として調製されたものでも又それ以上に分
けたものでも何れにてもよく、特に限定されない。尚、
2試薬以上の試薬に分けた場合には、特異性、測定精度
等の点を考慮すると、以下のような組成としておくこと
が望ましい。即ち、先ず、酸化呈色法用の試薬の場合、
第一試薬にCD又は/及びその誘導体を、第二試薬にC
ODを含有させておくことが望ましく、これ以外の両性
界面活性剤、CHE、POD等の酵素類、カップラー及
びデベロッパー等は少なくとも何れかの試薬に含まれて
いればよい。また、紫外部測定法用の試薬の場合、第一
試薬にCD又は/及びその誘導体を、第二試薬にCHD
を含有させておくことが望ましく、これ以外のNAD
(P)等は少なくとも何れかの試薬に含まれていればよ
い。
薬は、1試薬系測定法用として調製されたものでも2試
薬系測定法用として調製されたものでも又それ以上に分
けたものでも何れにてもよく、特に限定されない。尚、
2試薬以上の試薬に分けた場合には、特異性、測定精度
等の点を考慮すると、以下のような組成としておくこと
が望ましい。即ち、先ず、酸化呈色法用の試薬の場合、
第一試薬にCD又は/及びその誘導体を、第二試薬にC
ODを含有させておくことが望ましく、これ以外の両性
界面活性剤、CHE、POD等の酵素類、カップラー及
びデベロッパー等は少なくとも何れかの試薬に含まれて
いればよい。また、紫外部測定法用の試薬の場合、第一
試薬にCD又は/及びその誘導体を、第二試薬にCHD
を含有させておくことが望ましく、これ以外のNAD
(P)等は少なくとも何れかの試薬に含まれていればよ
い。
【0027】本発明の方法を、2試薬系測定法により実
施する場合には、試料とCOD又はCHDを反応させる
前に、試料とCD又は/及びその誘導体を含んでなる第
一試薬とを混合する等して試料を第一試薬で処理した
後、該CD又は/及びその誘導体の存在下で、第二試薬
に含有させたCOD又はCHDを反応させる方が、特異
性、測定精度等の点から望ましい。
施する場合には、試料とCOD又はCHDを反応させる
前に、試料とCD又は/及びその誘導体を含んでなる第
一試薬とを混合する等して試料を第一試薬で処理した
後、該CD又は/及びその誘導体の存在下で、第二試薬
に含有させたCOD又はCHDを反応させる方が、特異
性、測定精度等の点から望ましい。
【0028】例えば酸化呈色法の場合、上記した如き試
薬の組合せとしては、例えば以下の如きものが挙げられ
る。 (i)CD又は/及びその誘導体、及び両性界面活性剤
を含んでなる第一試薬と、CODを含んでなる第二試薬
とからなるものであって、カップラー、デベロッパー、
POD及びCHEの夫々が少なくとも第一試薬と第二試
薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。 (ii)CD又は/及びその誘導体、及びCHEを含んで
なる第一試薬と、CODを含んでなる第二試薬とからな
るものであって、カップラー、デベロッパー、POD及
び両性界面活性剤の夫々が少なくとも第一試薬と第二試
薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。 (iii)CD又は/及びその誘導体、両性界面活性剤、
及びCHEを含んでなる第一試薬と、CODを含んでな
る第二試薬とからなるものであって、カップラー、デベ
ロッパー及びPODの夫々が少なくとも第一試薬と第二
試薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。また、
例えば紫外部測定法の場合、上記した如き試薬の組合せ
としては、例えば以下の如きものが挙げられる。 (i')CD又は/及びその誘導体、及び両性界面活性
剤を含んでなる第一試薬と、CHDを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、NAD(P)及びCHEの
夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれ
ている試薬からなるもの。 (ii')CD又は/及びその誘導体、及びCHEを含ん
でなる第一試薬と、CHDを含んでなる第二試薬とから
なるものであって、NAD(P)及び両性界面活性剤の
夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれ
ている試薬からなるもの。 (iii')CD又は/及びその誘導体、両性界面活性剤、
及びCHEを含んでなる第一試薬と、CHDを含んでな
る第二試薬とからなるものであって、NAD(P)が少
なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている試
薬からなるもの。尚、本発明のLDL−コレステロール
測定用試薬を2液法用として調製する場合には、両性界
面活性剤又は/及びCHEを、CD又は/及びその誘導
体と共に第一試薬に含有させて用いる方が、LDL−コ
レステロールへの特異性及びLDL−コレステロールの
測定精度を向上させる上で望ましい。また、上記の如き
本発明の試薬の組合せのうち、両性界面活性剤とCHE
とを共存させる場合には、両性界面活性剤によりCHE
活性の安定性が低下する可能性があるので、試薬の保存
安定性等の点から、第一試薬及び第二試薬の両方にCH
Eを含有させたもの、即ち、酸化呈色法用試薬の場合に
は、CD又は/及びその誘導体、両性界面活性剤、及び
CHEを含んでなる第一試薬と、COD及びCHEを含
んでなる第二試薬とからなるものであって、カップラ
ー、デベロッパー及びPODの夫々が少なくとも第一試
薬と第二試薬の何れかに含まれている試薬からなるもの
が、また、紫外部測定法用試薬の場合には、CD又は/
及びその誘導体、両性界面活性剤、及びCHEを含んで
なる第一試薬と、CHD及びCHEを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、NAD(P)が少なくとも
第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている試薬からな
るものが、夫々望ましい。また、上記した如き本発明の
酸化呈色法用試薬の組合せに於いては、試薬の安定性
(試薬盲検の安定性)を考慮すると、カップラーとデベ
ロッパーの一方を第一試薬に含有させ、他方を第二試薬
に含有させることが望ましい。
薬の組合せとしては、例えば以下の如きものが挙げられ
る。 (i)CD又は/及びその誘導体、及び両性界面活性剤
を含んでなる第一試薬と、CODを含んでなる第二試薬
とからなるものであって、カップラー、デベロッパー、
POD及びCHEの夫々が少なくとも第一試薬と第二試
薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。 (ii)CD又は/及びその誘導体、及びCHEを含んで
なる第一試薬と、CODを含んでなる第二試薬とからな
るものであって、カップラー、デベロッパー、POD及
び両性界面活性剤の夫々が少なくとも第一試薬と第二試
薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。 (iii)CD又は/及びその誘導体、両性界面活性剤、
及びCHEを含んでなる第一試薬と、CODを含んでな
る第二試薬とからなるものであって、カップラー、デベ
ロッパー及びPODの夫々が少なくとも第一試薬と第二
試薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。また、
例えば紫外部測定法の場合、上記した如き試薬の組合せ
としては、例えば以下の如きものが挙げられる。 (i')CD又は/及びその誘導体、及び両性界面活性
剤を含んでなる第一試薬と、CHDを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、NAD(P)及びCHEの
夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれ
ている試薬からなるもの。 (ii')CD又は/及びその誘導体、及びCHEを含ん
でなる第一試薬と、CHDを含んでなる第二試薬とから
なるものであって、NAD(P)及び両性界面活性剤の
夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれ
ている試薬からなるもの。 (iii')CD又は/及びその誘導体、両性界面活性剤、
及びCHEを含んでなる第一試薬と、CHDを含んでな
る第二試薬とからなるものであって、NAD(P)が少
なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている試
薬からなるもの。尚、本発明のLDL−コレステロール
測定用試薬を2液法用として調製する場合には、両性界
面活性剤又は/及びCHEを、CD又は/及びその誘導
体と共に第一試薬に含有させて用いる方が、LDL−コ
レステロールへの特異性及びLDL−コレステロールの
測定精度を向上させる上で望ましい。また、上記の如き
本発明の試薬の組合せのうち、両性界面活性剤とCHE
とを共存させる場合には、両性界面活性剤によりCHE
活性の安定性が低下する可能性があるので、試薬の保存
安定性等の点から、第一試薬及び第二試薬の両方にCH
Eを含有させたもの、即ち、酸化呈色法用試薬の場合に
は、CD又は/及びその誘導体、両性界面活性剤、及び
CHEを含んでなる第一試薬と、COD及びCHEを含
んでなる第二試薬とからなるものであって、カップラ
ー、デベロッパー及びPODの夫々が少なくとも第一試
薬と第二試薬の何れかに含まれている試薬からなるもの
が、また、紫外部測定法用試薬の場合には、CD又は/
及びその誘導体、両性界面活性剤、及びCHEを含んで
なる第一試薬と、CHD及びCHEを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、NAD(P)が少なくとも
第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている試薬からな
るものが、夫々望ましい。また、上記した如き本発明の
酸化呈色法用試薬の組合せに於いては、試薬の安定性
(試薬盲検の安定性)を考慮すると、カップラーとデベ
ロッパーの一方を第一試薬に含有させ、他方を第二試薬
に含有させることが望ましい。
【0029】本発明のLDL−コレステロール測定用試
薬中には、緩衝剤が含まれていても良い。本発明に於い
て使用される緩衝剤としては、用いられる各種酵素類及
び被酸化性呈色試薬等の組合せ等により異なるが、この
分野に於いて通常用いられるものであればよく、pH5〜
11の範囲で緩衝作用を有するものが使用される。また、
これら緩衝剤の使用濃度としては、通常1mM〜5M、好
ましくは5mM〜1Mの範囲から適宜選択される。これら
緩衝剤のうち、特にLDL−コレステロールへの特異性
の点から、例えばN−(2−アセトアミド)−2−アミ
ノエタンスルホン酸(ACES)、N,N−ビス(2−
ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(B
ES)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホ
ン酸(CHES)、2−〔4−(2−ヒドロキシエチ
ル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPE
S)、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ピ
ペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(P
IPES)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−
2−アミノエタンスルホン酸(TES)等のアミノエタ
ンスルホン酸誘導体、例えばN−シクロヘキシル−3−
アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、N−シクロヘ
キシル−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン
酸(CAPSO)、3−〔N,N−ビス(2−ヒドロキ
シエチル)アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン
酸(DIPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチ
ル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸(EPP
S)、2−ヒドロキシ−3−〔4−(2−ヒドロキシエ
チル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸(HE
PPSO)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MO
PS)、2−ヒドロキシ−3−モルホリノプロパンスル
ホン酸(MOPSO)、ピペラジン−1,4−ビス(2
−ヒドロキシ−3−プロパンスルホン酸)(POPS
O)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−ア
ミノプロパンスルホン酸(TAPS)、2−ヒドロキシ
−N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノ
プロパンスルホン酸(TAPSO)等のアミノプロパン
スルホン酸誘導体、例えばN−(2−アセトアミド)イ
ミノ二酢酸(ADA)、N,N−ビス(2−ヒドロキシ
エチル)グリシン(Bicine)、N−〔トリス(ヒ
ドロキシメチル)メチル〕グリシン(Tricine)
等のグリシン誘導体等のカルボキシル基又はスルホン酸
基を有する脂肪族アミン類を緩衝剤として用いることが
望ましい。
薬中には、緩衝剤が含まれていても良い。本発明に於い
て使用される緩衝剤としては、用いられる各種酵素類及
び被酸化性呈色試薬等の組合せ等により異なるが、この
分野に於いて通常用いられるものであればよく、pH5〜
11の範囲で緩衝作用を有するものが使用される。また、
これら緩衝剤の使用濃度としては、通常1mM〜5M、好
ましくは5mM〜1Mの範囲から適宜選択される。これら
緩衝剤のうち、特にLDL−コレステロールへの特異性
の点から、例えばN−(2−アセトアミド)−2−アミ
ノエタンスルホン酸(ACES)、N,N−ビス(2−
ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(B
ES)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホ
ン酸(CHES)、2−〔4−(2−ヒドロキシエチ
ル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPE
S)、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ピ
ペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(P
IPES)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−
2−アミノエタンスルホン酸(TES)等のアミノエタ
ンスルホン酸誘導体、例えばN−シクロヘキシル−3−
アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、N−シクロヘ
キシル−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン
酸(CAPSO)、3−〔N,N−ビス(2−ヒドロキ
シエチル)アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン
酸(DIPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチ
ル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸(EPP
S)、2−ヒドロキシ−3−〔4−(2−ヒドロキシエ
チル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸(HE
PPSO)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MO
PS)、2−ヒドロキシ−3−モルホリノプロパンスル
ホン酸(MOPSO)、ピペラジン−1,4−ビス(2
−ヒドロキシ−3−プロパンスルホン酸)(POPS
O)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−ア
ミノプロパンスルホン酸(TAPS)、2−ヒドロキシ
−N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノ
プロパンスルホン酸(TAPSO)等のアミノプロパン
スルホン酸誘導体、例えばN−(2−アセトアミド)イ
ミノ二酢酸(ADA)、N,N−ビス(2−ヒドロキシ
エチル)グリシン(Bicine)、N−〔トリス(ヒ
ドロキシメチル)メチル〕グリシン(Tricine)
等のグリシン誘導体等のカルボキシル基又はスルホン酸
基を有する脂肪族アミン類を緩衝剤として用いることが
望ましい。
【0030】また、本発明のLDL−コレステロ−ル測
定用試薬中には、イオン性化合物、例えばデキストラン
硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等
のポリアニオン等が含まれていても良い。これらは単独
または混合して使用することができる。更に、イオン性
化合物と、Mg2+、Mn2+、Ca2+等の2価のカチオン
(或いはこれら2価のカチオンを生じさせ得る金属塩)
とを組み合わせて使用してもよい。これらの使用濃度と
しては特に限定されないが、イオン性化合物等の使用濃
度としては、反応液中の濃度が、通常0.01〜10%(w/
v)の範囲で使用され、また、2価カチオンの使用濃度
としては、反応液中の濃度が、通常0.1〜200mMの範囲で
使用される。また、本発明のLDL−コレステロ−ル測
定用試薬中にはLDL以外のリポタンパク中のコレステ
ロールがコレステロール測定反応に関与することを防止
するために、ポリクロ−ナル抗体またはモノクロ−ナル
抗体の1種または2種以上を共存させてもよい。このよ
うな目的で使用可能な抗体としては、例えば抗アポリポ
タンパクA抗体、抗アポリポタンパクC抗体、抗アポリ
ポタンパクE抗体、抗αリポタンパク抗体等が挙げられ
る。これら抗体の使用濃度としては、LDL以外のリポ
タンパク中に含まれるコレステロールがコレステロール
測定反応に関与するのを防止し得る濃度以上であればよ
く、特に限定されないが、最終の反応液中の濃度が通常
0.001〜10mgAb/ml、好ましくは0.01〜1mgAb/mlとなる
ように反応液中に添加される。また、本発明のLDL−
コレステロール測定用試薬中には、この分野に於いて通
常用いられる界面活性剤、例えばポリオキシエチレンイ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポ
リオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリ
コールモノラウレート、ポリエチレンラウリルエーテル
等の非イオン性界面活性剤、例えば塩化ステアリルトリ
メチルアンモニウム、塩化アルキルベンジルジメチルア
ンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、例えばコール
酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性
剤等、両性界面活性剤以外の界面活性剤が含まれていて
も良い。これらは単独又は二種以上適宜組み合わせて用
いることができ、その使用濃度としては、特に限定され
ないが、反応液中の濃度が、通常0.0001〜10%(w/
v)、好ましくは0.001〜1%(w/v)の範囲から適宜選
択される。
定用試薬中には、イオン性化合物、例えばデキストラン
硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等
のポリアニオン等が含まれていても良い。これらは単独
または混合して使用することができる。更に、イオン性
化合物と、Mg2+、Mn2+、Ca2+等の2価のカチオン
(或いはこれら2価のカチオンを生じさせ得る金属塩)
とを組み合わせて使用してもよい。これらの使用濃度と
しては特に限定されないが、イオン性化合物等の使用濃
度としては、反応液中の濃度が、通常0.01〜10%(w/
v)の範囲で使用され、また、2価カチオンの使用濃度
としては、反応液中の濃度が、通常0.1〜200mMの範囲で
使用される。また、本発明のLDL−コレステロ−ル測
定用試薬中にはLDL以外のリポタンパク中のコレステ
ロールがコレステロール測定反応に関与することを防止
するために、ポリクロ−ナル抗体またはモノクロ−ナル
抗体の1種または2種以上を共存させてもよい。このよ
うな目的で使用可能な抗体としては、例えば抗アポリポ
タンパクA抗体、抗アポリポタンパクC抗体、抗アポリ
ポタンパクE抗体、抗αリポタンパク抗体等が挙げられ
る。これら抗体の使用濃度としては、LDL以外のリポ
タンパク中に含まれるコレステロールがコレステロール
測定反応に関与するのを防止し得る濃度以上であればよ
く、特に限定されないが、最終の反応液中の濃度が通常
0.001〜10mgAb/ml、好ましくは0.01〜1mgAb/mlとなる
ように反応液中に添加される。また、本発明のLDL−
コレステロール測定用試薬中には、この分野に於いて通
常用いられる界面活性剤、例えばポリオキシエチレンイ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポ
リオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリ
コールモノラウレート、ポリエチレンラウリルエーテル
等の非イオン性界面活性剤、例えば塩化ステアリルトリ
メチルアンモニウム、塩化アルキルベンジルジメチルア
ンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、例えばコール
酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性
剤等、両性界面活性剤以外の界面活性剤が含まれていて
も良い。これらは単独又は二種以上適宜組み合わせて用
いることができ、その使用濃度としては、特に限定され
ないが、反応液中の濃度が、通常0.0001〜10%(w/
v)、好ましくは0.001〜1%(w/v)の範囲から適宜選
択される。
【0031】本発明のLDL−コレステロ−ルの測定法
を、2試薬系測定法により実施するには、例えば以下の
如く行えばよい。即ち、酸化呈色法の場合、例えば血
清、血漿等の生体試料と、例えば両性界面活性剤、CD
又は/及びその誘導体、CHE及びカップラー(又はデ
ベロッパー)、要すれば緩衝剤、抗体、イオン性化合
物、2価のカチオン等を含有する第一試薬とを混合して
生体試料を処理し、2〜40℃で1〜30分間反応させた後
に吸光度(OD1)を測定する。次いで、該反応液と、
例えばCOD、CHE、POD及びデベロッパー(又は
カップラー)、要すれば緩衝剤等を含有する第二試薬と
を混合し、2〜40℃で1〜60分反応させた後に吸光度
(OD2)を測定する。上記のOD2からOD1に由来す
る値(例えばOD1に補正係数を掛けて求めた値)を差
し引いた吸光度(OD3)を求め、得られたOD3を、例
えば予めLDL−コレステロール濃度既知の標準液等を
試料として上記と同様にして求めた、LDL−コレステ
ロール濃度とOD3との関係を示す検量線に当てはめる
ことにより、生体試料中のLDL−コレステロールの値
が求められる。また、紫外部測定法の場合、例えば血
清、血漿等の生体試料と、例えば両性界面活性剤、CD
又は/及びその誘導体及びCHE、要すれば緩衝剤、抗
体、イオン性化合物、2価のカチオン等を含有する第一
試薬とを混合して生体試料を処理し、2〜40℃で1〜30
分間反応させた後に340nmに於ける吸光度(OD1')を
測定する。次いで、該反応液と、例えばCHD、CHE
及びNAD(P)、要すれば緩衝剤等を含有する第二試
薬とを混合し、2〜40℃で1〜60分反応させた後に340n
mに於ける吸光度(OD2')を測定する。上記のOD2'
からOD1'に由来する値(例えばOD1'に補正係数を掛
けて求めた値)を差し引いた吸光度(OD3')を求め、
得られたOD3'を、例えば予めLDL−コレステロール
濃度既知の標準液等を試料として上記と同様にして求め
た、LDL−コレステロール濃度とOD3との関係を示
す検量線に当てはめることにより、生体試料中のLDL
−コレステロールの値が求められる。
を、2試薬系測定法により実施するには、例えば以下の
如く行えばよい。即ち、酸化呈色法の場合、例えば血
清、血漿等の生体試料と、例えば両性界面活性剤、CD
又は/及びその誘導体、CHE及びカップラー(又はデ
ベロッパー)、要すれば緩衝剤、抗体、イオン性化合
物、2価のカチオン等を含有する第一試薬とを混合して
生体試料を処理し、2〜40℃で1〜30分間反応させた後
に吸光度(OD1)を測定する。次いで、該反応液と、
例えばCOD、CHE、POD及びデベロッパー(又は
カップラー)、要すれば緩衝剤等を含有する第二試薬と
を混合し、2〜40℃で1〜60分反応させた後に吸光度
(OD2)を測定する。上記のOD2からOD1に由来す
る値(例えばOD1に補正係数を掛けて求めた値)を差
し引いた吸光度(OD3)を求め、得られたOD3を、例
えば予めLDL−コレステロール濃度既知の標準液等を
試料として上記と同様にして求めた、LDL−コレステ
ロール濃度とOD3との関係を示す検量線に当てはめる
ことにより、生体試料中のLDL−コレステロールの値
が求められる。また、紫外部測定法の場合、例えば血
清、血漿等の生体試料と、例えば両性界面活性剤、CD
又は/及びその誘導体及びCHE、要すれば緩衝剤、抗
体、イオン性化合物、2価のカチオン等を含有する第一
試薬とを混合して生体試料を処理し、2〜40℃で1〜30
分間反応させた後に340nmに於ける吸光度(OD1')を
測定する。次いで、該反応液と、例えばCHD、CHE
及びNAD(P)、要すれば緩衝剤等を含有する第二試
薬とを混合し、2〜40℃で1〜60分反応させた後に340n
mに於ける吸光度(OD2')を測定する。上記のOD2'
からOD1'に由来する値(例えばOD1'に補正係数を掛
けて求めた値)を差し引いた吸光度(OD3')を求め、
得られたOD3'を、例えば予めLDL−コレステロール
濃度既知の標準液等を試料として上記と同様にして求め
た、LDL−コレステロール濃度とOD3との関係を示
す検量線に当てはめることにより、生体試料中のLDL
−コレステロールの値が求められる。
【0032】また、本発明のLDL−コレステロ−ルの
測定法は、1試薬系測定法により実施しても良く、この
場合は、例えば以下の如く行えばよい。即ち、酸化呈色
法の場合、例えば血清, 血漿等の生体試料と、例えばC
HE、COD、POD、被酸化性呈色試薬、両性界面活
性剤及び、CD又は/及びその誘導体、要すれば緩衝
剤、抗体、イオン性化合物、2価のカチオン等を含有す
る試液とを混合し、2〜40℃で1〜30分間反応させた後
に吸光度(ODS)を測定する。また、生体試料の代わ
りに生理食塩水等を使用し、上記と同じ試薬を用い上記
と同様の操作を行って盲検値(ODBl)を求める。次い
で、ODSからODB lを差し引いた吸光度(ODR)を求
め、これを、例えば予めLDL−コレステロール濃度既
知の標準液等を試料として上記と同様にして求めた、L
DL−コレステロール濃度とODRとの関係を示す検量
線に当てはめることにより、生体試料中のLDL−コレ
ステロールの値が求められる。また、紫外部測定法の場
合、例えば血清, 血漿等の生体試料と、例えばCHE、
CHD、NAD(P)、両性界面活性剤及び、CD又は
/及びその誘導体、要すれば緩衝剤、抗体、イオン性化
合物、2価のカチオン等を含有する試液とを混合し、2
〜40℃で1〜30分間反応させた後に340nmに於ける吸光
度(ODS')を測定する。また、生体試料の代わりに生
理食塩水等を使用し、上記と同じ試薬を用い上記と同様
の操作を行って盲検値(ODBl')を求める。次いで、
ODS'からODBl'を差し引いた吸光度(ODR')を求
め、これを、例えば予めLDL−コレステロール濃度既
知の標準液等を試料として上記と同様にして求めた、L
DL−コレステロール濃度とODR'との関係を示す検量
線に当てはめることにより、生体試料中のLDL−コレ
ステロールの値が求められる。
測定法は、1試薬系測定法により実施しても良く、この
場合は、例えば以下の如く行えばよい。即ち、酸化呈色
法の場合、例えば血清, 血漿等の生体試料と、例えばC
HE、COD、POD、被酸化性呈色試薬、両性界面活
性剤及び、CD又は/及びその誘導体、要すれば緩衝
剤、抗体、イオン性化合物、2価のカチオン等を含有す
る試液とを混合し、2〜40℃で1〜30分間反応させた後
に吸光度(ODS)を測定する。また、生体試料の代わ
りに生理食塩水等を使用し、上記と同じ試薬を用い上記
と同様の操作を行って盲検値(ODBl)を求める。次い
で、ODSからODB lを差し引いた吸光度(ODR)を求
め、これを、例えば予めLDL−コレステロール濃度既
知の標準液等を試料として上記と同様にして求めた、L
DL−コレステロール濃度とODRとの関係を示す検量
線に当てはめることにより、生体試料中のLDL−コレ
ステロールの値が求められる。また、紫外部測定法の場
合、例えば血清, 血漿等の生体試料と、例えばCHE、
CHD、NAD(P)、両性界面活性剤及び、CD又は
/及びその誘導体、要すれば緩衝剤、抗体、イオン性化
合物、2価のカチオン等を含有する試液とを混合し、2
〜40℃で1〜30分間反応させた後に340nmに於ける吸光
度(ODS')を測定する。また、生体試料の代わりに生
理食塩水等を使用し、上記と同じ試薬を用い上記と同様
の操作を行って盲検値(ODBl')を求める。次いで、
ODS'からODBl'を差し引いた吸光度(ODR')を求
め、これを、例えば予めLDL−コレステロール濃度既
知の標準液等を試料として上記と同様にして求めた、L
DL−コレステロール濃度とODR'との関係を示す検量
線に当てはめることにより、生体試料中のLDL−コレ
ステロールの値が求められる。
【0033】本発明のLDL−コレステロール測定用キ
ットは、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のLDL
−コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、
このようなキットとしては以下の如きものが望ましい。
即ち、酸化呈色法用の場合、CD又は/及びその誘導
体、両性界面活性剤、CHE、及びカップラー(又はデ
ベロッパー)を含んでなる第一試薬と、COD、CH
E、POD、及びデベロッパー(カップラー)を含んで
なる第二試薬とを含んでなるものが挙げられる。また、
紫外部測定法用の場合、CD又は/及びその誘導体、両
性界面活性剤、及びCHEを含んでなる第一試薬と、C
HD、NAD(P)、及びCHEを含んでなる第二試薬
とを含んでなるものが挙げられる。尚、夫々の構成要素
の好ましい態様、具体例については上で述べた通りであ
る。また、当該キットには、必要に応じて、LDL−コ
レステロール標準品等が組み合わされていても良いこと
は言うまでもない。
ットは、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のLDL
−コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、
このようなキットとしては以下の如きものが望ましい。
即ち、酸化呈色法用の場合、CD又は/及びその誘導
体、両性界面活性剤、CHE、及びカップラー(又はデ
ベロッパー)を含んでなる第一試薬と、COD、CH
E、POD、及びデベロッパー(カップラー)を含んで
なる第二試薬とを含んでなるものが挙げられる。また、
紫外部測定法用の場合、CD又は/及びその誘導体、両
性界面活性剤、及びCHEを含んでなる第一試薬と、C
HD、NAD(P)、及びCHEを含んでなる第二試薬
とを含んでなるものが挙げられる。尚、夫々の構成要素
の好ましい態様、具体例については上で述べた通りであ
る。また、当該キットには、必要に応じて、LDL−コ
レステロール標準品等が組み合わされていても良いこと
は言うまでもない。
【0034】本発明のLDL−コレステロールの測定法
は、両性界面活性剤、及びCD又は/及びその誘導体の
共存下で、コレステロールの測定を行わせるために、H
DLのみならずVLDL、カイロミクロン等のLDL以
外のリポタンパク中のコレステロールとも実質的に反応
せず、LDL−コレステロールのみと特異的に反応する
ので、従来法では困難であったエンドポイント・アッセ
イでのLDL−コレステロール測定を可能ならしめるも
のである。また、標準品についてもLDL−コレステロ
ールの純品を用いる必要はなく、コレステロールを含
む、標準液あるいは粘度、比重等が正常血清と同様の物
性を持つ標準血清を使用することができる。
は、両性界面活性剤、及びCD又は/及びその誘導体の
共存下で、コレステロールの測定を行わせるために、H
DLのみならずVLDL、カイロミクロン等のLDL以
外のリポタンパク中のコレステロールとも実質的に反応
せず、LDL−コレステロールのみと特異的に反応する
ので、従来法では困難であったエンドポイント・アッセ
イでのLDL−コレステロール測定を可能ならしめるも
のである。また、標準品についてもLDL−コレステロ
ールの純品を用いる必要はなく、コレステロールを含
む、標準液あるいは粘度、比重等が正常血清と同様の物
性を持つ標準血清を使用することができる。
【0035】以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。
【0036】
実施例1 日立7170形自動分析装置〔(株)日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、超遠心法で分画した
各種リポタンパク中のコレステロールを測定し、その反
応性を検討した。 〔試料〕自体公知の超遠心法で血清より分画して得たL
DL画分、HDL画分、VLDL画分及びCM画分を試
料とした。尚、各試料中のコレステロールを、予め、市
販の総コレステロール測定用試薬キット Lタイプワコ
ーCHO・H(和光純薬工業(株)製)を用いて、同キッ
トの現品説明書の標準操作法に従い測定した。 〔試薬〕 (試薬1) R−1;2,6−ジ−O−メチル−α−シクロデキスト
リン(和光純薬工業(株)製。:以下、DM−α−CDと
略記する。) 0.06%(w/v)、N-(2-ヒドロキシ-3-
スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン Na塩
(HDAOS:(株)同仁化学研究所製。) 0.6mM、及
びNaSO4 0.4Mを含有する50mM ピペラジン-1,4-ビ
ス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)−NaOH緩衝液
(pH7.0)をR−1とした。 R−2;COD(天野製薬(株)製。) 4U/ml、CH
E(旭化成工業(株)製)4U/ml、POD(東洋紡(株)
製。) 6U/ml、4−AA 3mM及び所定の両性界面
活性剤 0.01%(w/v)を含有する50mM PIPES−
NaOH緩衝液(pH7.0)をR−2とした。 (両性界面活性剤) 以下に挙げる両性界面活性剤を夫々使用した。 ・リポミンLA(ライオン(株)、商品名);アミノカル
ボン酸誘導体 ・ソフタゾリンLPB−R(川研ファインケミカル
(株)、商品名);ラウリン酸アミドプロピルベタイン ・ソフタゾリンCL(川研ファインケミカル(株)、商品
名);2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒド
ロキシエチルイミダゾリニウムベタイン ・アンヒトール24B(花王(株)、商品名);ラウリル
ベタイン ・エナジコールL−30AN(ライオン(株)、商品
名);N−ラウロイル−N−メチル−β−アラニンナト
リウム ・Zwittergent3−08(和光純薬工業
(株)、商品名);N−オクチル−N,N−ジメチル−3
−アンモニオ−1−プロパンスルホン酸 (試薬2) R−1;試薬1と同じ。 R−2;両性界面活性剤の代わりに、下記の界面活性剤
を使用した以外は、試薬1と同じ。 (界面活性剤) ・エマルゲンA−90(花王(株)、商品名);ポリオキ
シエチレン誘導体 ・エマルゲン709(花王(株)、商品名);ポリオキシ
エチレン高級アルコールエーテル ・トリトンX−100(ローム アンド ハース社、商
品名);ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル (試薬3) R−1;HDAOS 0.6mM、及びNaSO4 0.4Mを含
有する50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH7.0)を
R−1とした。 R−2;COD(天野製薬(株)製。) 4U/ml、CH
E(旭化成工業(株)製)4U/ml、POD(東洋紡(株)
製。) 6U/ml及び4−AA 3mMを含有する50mM
PIPES−NaOH緩衝液(pH7.0)をR−2とし
た。 〔測定条件〕測定パラメータを以下のように設定して、
各試料中のコレステロールを測定した。 測定方法 ;2ポイント エンド[16]−[34] 試料量 ;3μl R−1 ;270μl R−2 ; 90μl 測定波長 ;700/600nm 測定温度 ;37℃ 標準品濃度;100mg/dl 〔結果〕各種試料について得られたコレステロール値
と、市販のキットを用いて測定した各種試料中のコレス
テロール値とを、下記式に当てはめて、各リポタンパク
の反応率を求めた。 その結果を表1に示す。
使用して、本発明の測定法により、超遠心法で分画した
各種リポタンパク中のコレステロールを測定し、その反
応性を検討した。 〔試料〕自体公知の超遠心法で血清より分画して得たL
DL画分、HDL画分、VLDL画分及びCM画分を試
料とした。尚、各試料中のコレステロールを、予め、市
販の総コレステロール測定用試薬キット Lタイプワコ
ーCHO・H(和光純薬工業(株)製)を用いて、同キッ
トの現品説明書の標準操作法に従い測定した。 〔試薬〕 (試薬1) R−1;2,6−ジ−O−メチル−α−シクロデキスト
リン(和光純薬工業(株)製。:以下、DM−α−CDと
略記する。) 0.06%(w/v)、N-(2-ヒドロキシ-3-
スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン Na塩
(HDAOS:(株)同仁化学研究所製。) 0.6mM、及
びNaSO4 0.4Mを含有する50mM ピペラジン-1,4-ビ
ス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)−NaOH緩衝液
(pH7.0)をR−1とした。 R−2;COD(天野製薬(株)製。) 4U/ml、CH
E(旭化成工業(株)製)4U/ml、POD(東洋紡(株)
製。) 6U/ml、4−AA 3mM及び所定の両性界面
活性剤 0.01%(w/v)を含有する50mM PIPES−
NaOH緩衝液(pH7.0)をR−2とした。 (両性界面活性剤) 以下に挙げる両性界面活性剤を夫々使用した。 ・リポミンLA(ライオン(株)、商品名);アミノカル
ボン酸誘導体 ・ソフタゾリンLPB−R(川研ファインケミカル
(株)、商品名);ラウリン酸アミドプロピルベタイン ・ソフタゾリンCL(川研ファインケミカル(株)、商品
名);2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒド
ロキシエチルイミダゾリニウムベタイン ・アンヒトール24B(花王(株)、商品名);ラウリル
ベタイン ・エナジコールL−30AN(ライオン(株)、商品
名);N−ラウロイル−N−メチル−β−アラニンナト
リウム ・Zwittergent3−08(和光純薬工業
(株)、商品名);N−オクチル−N,N−ジメチル−3
−アンモニオ−1−プロパンスルホン酸 (試薬2) R−1;試薬1と同じ。 R−2;両性界面活性剤の代わりに、下記の界面活性剤
を使用した以外は、試薬1と同じ。 (界面活性剤) ・エマルゲンA−90(花王(株)、商品名);ポリオキ
シエチレン誘導体 ・エマルゲン709(花王(株)、商品名);ポリオキシ
エチレン高級アルコールエーテル ・トリトンX−100(ローム アンド ハース社、商
品名);ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル (試薬3) R−1;HDAOS 0.6mM、及びNaSO4 0.4Mを含
有する50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH7.0)を
R−1とした。 R−2;COD(天野製薬(株)製。) 4U/ml、CH
E(旭化成工業(株)製)4U/ml、POD(東洋紡(株)
製。) 6U/ml及び4−AA 3mMを含有する50mM
PIPES−NaOH緩衝液(pH7.0)をR−2とし
た。 〔測定条件〕測定パラメータを以下のように設定して、
各試料中のコレステロールを測定した。 測定方法 ;2ポイント エンド[16]−[34] 試料量 ;3μl R−1 ;270μl R−2 ; 90μl 測定波長 ;700/600nm 測定温度 ;37℃ 標準品濃度;100mg/dl 〔結果〕各種試料について得られたコレステロール値
と、市販のキットを用いて測定した各種試料中のコレス
テロール値とを、下記式に当てはめて、各リポタンパク
の反応率を求めた。 その結果を表1に示す。
【0037】
【表1】
【0038】
【0039】表1の測定結果から明らかな如く、試薬1
を用いた場合、即ち、両性界面活性剤とDM−α−CD
との共存下でコレステロールの測定を行った場合には、
LDL以外のリポタンパクは殆ど反応せず、LDL中の
コレステロールを特異的に測定し得ることが判る。これ
に対して、非イオン性界面活性剤とDM−α−CDとの
共存下で測定を行った場合(試薬2)、及び界面活性剤
とDM−α−CDの何れも非共存下で測定を行った場合
(試薬3)には、LDL以外のリポタンパクとも反応し
てしまい、LDL−コレステロールを特異的に測定する
ことは不可能であることが判る。以上のことから、LD
L中のコレステロールを特異的に測定するためには、両
性界面活性剤と、CD又は/及びその誘導体との共存下
でリポタンパク中のコレステロールの測定を行う必要が
あることが判る。
を用いた場合、即ち、両性界面活性剤とDM−α−CD
との共存下でコレステロールの測定を行った場合には、
LDL以外のリポタンパクは殆ど反応せず、LDL中の
コレステロールを特異的に測定し得ることが判る。これ
に対して、非イオン性界面活性剤とDM−α−CDとの
共存下で測定を行った場合(試薬2)、及び界面活性剤
とDM−α−CDの何れも非共存下で測定を行った場合
(試薬3)には、LDL以外のリポタンパクとも反応し
てしまい、LDL−コレステロールを特異的に測定する
ことは不可能であることが判る。以上のことから、LD
L中のコレステロールを特異的に測定するためには、両
性界面活性剤と、CD又は/及びその誘導体との共存下
でリポタンパク中のコレステロールの測定を行う必要が
あることが判る。
【0040】実施例2 血清、血漿等生体試料中のLDL−コレステロールの測
定を実施するために使用される、測定用キットの代表的
な例としては、以下のようなものが挙げられる。 (1)第一試薬(pH6〜8):CD又は/及びその誘導
体、両性界面活性剤、CHE、カップラー(又はデベロ
ッパー)。 (2)第二試薬(pH6〜8):COD、CHE、PO
D、デベロッパー(又はカップラー)。
定を実施するために使用される、測定用キットの代表的
な例としては、以下のようなものが挙げられる。 (1)第一試薬(pH6〜8):CD又は/及びその誘導
体、両性界面活性剤、CHE、カップラー(又はデベロ
ッパー)。 (2)第二試薬(pH6〜8):COD、CHE、PO
D、デベロッパー(又はカップラー)。
【0041】
【発明の効果】以上述べた如く、本発明は試料中のLD
L−コレステロ−ルを特異的に且つ精度良く測定し得る
方法並びにそれに用いられる試薬を提供するものであ
り、本発明を利用することにより、従来の方法では不可
能であったLDL−コレステロ−ルを直接、しかも汎用
の自動分析装置を用いて測定し得るという効果を奏する
ものであるので、斯業に貢献するところ大なる発明であ
る。
L−コレステロ−ルを特異的に且つ精度良く測定し得る
方法並びにそれに用いられる試薬を提供するものであ
り、本発明を利用することにより、従来の方法では不可
能であったLDL−コレステロ−ルを直接、しかも汎用
の自動分析装置を用いて測定し得るという効果を奏する
ものであるので、斯業に貢献するところ大なる発明であ
る。
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【手続補正書】
【提出日】平成9年7月30日
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0030
【補正方法】変更
【補正内容】
【0030】また、本発明のLDL−コレステロール測
定用試薬中には、イオン性化合物、例えばデキストラン
硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等
のポリアニオン等が含まれていても良い。これらは単独
または混合して使用することができる。更に、イオン性
化合物と、Mg2+、Mn2+、Ca2+等の2価のカ
チオン(或いはこれら2価のカチオンを生じさせ得る金
属塩)とを組み合わせて使用してもよい。これらの使用
濃度としては特に限定されないが、イオン性化合物等の
使用濃度としては、反応液中の濃度が、通常0.01〜
10%(w/v)の範囲で使用され、また、2価カチオ
ンの使用濃度としては、反応液中の濃度が、通常0.1
〜200mMの範囲で使用される。また、本発明のLD
L−コレステロール測定用試薬中にはLDL以外のリポ
タンパク中のコレステロールがコレステロール測定反応
に関与することを防止するために、ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体の1種または2種以上を共存
させてもよい。このような目的で使用可能な抗体として
は、例えば抗アポリポタンパクA抗体、抗アポリポタン
パクC抗体、抗アポリポタンパクE抗体、抗αリポタン
パク抗体等が挙げられる。これら抗体の使用濃度として
は、LDL以外のリポタンパク中に含まれるコレステロ
ールがコレステロール測定反応に関与するのを防止し得
る濃度以上であればよく、特に限定されないが、最終の
反応液中の濃度が通常0.001〜10mgAb/m
l、好ましくは0.01〜1mgAb/mlとなるよう
に反応液中に添加される。また、本発明のLDL−コレ
ステロール測定用試薬中には、この分野に於いて通常用
いられる界面活性剤、例えばポリオキシエチレンイソオ
クチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、ポリオキソエチレンノニルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオ
キシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコー
ルモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル等の非イオン性界面活性剤、例えば塩化ステアリルト
リメチルアンモニウム、塩化アルキルベンジルジメチル
アンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、例えばコール
酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性
剤等、両性界面活性剤以外の界面活性剤が含まれていて
も良い。これらは単独又は二種以上適宜組み合わせて用
いることができ、その使用濃度としては、特に限定され
ないが、反応液中の濃度が、通常0.0001〜10%
(w/v)、好ましくは0.001〜1%(w/v)の
範囲から適宜選択される。
定用試薬中には、イオン性化合物、例えばデキストラン
硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等
のポリアニオン等が含まれていても良い。これらは単独
または混合して使用することができる。更に、イオン性
化合物と、Mg2+、Mn2+、Ca2+等の2価のカ
チオン(或いはこれら2価のカチオンを生じさせ得る金
属塩)とを組み合わせて使用してもよい。これらの使用
濃度としては特に限定されないが、イオン性化合物等の
使用濃度としては、反応液中の濃度が、通常0.01〜
10%(w/v)の範囲で使用され、また、2価カチオ
ンの使用濃度としては、反応液中の濃度が、通常0.1
〜200mMの範囲で使用される。また、本発明のLD
L−コレステロール測定用試薬中にはLDL以外のリポ
タンパク中のコレステロールがコレステロール測定反応
に関与することを防止するために、ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体の1種または2種以上を共存
させてもよい。このような目的で使用可能な抗体として
は、例えば抗アポリポタンパクA抗体、抗アポリポタン
パクC抗体、抗アポリポタンパクE抗体、抗αリポタン
パク抗体等が挙げられる。これら抗体の使用濃度として
は、LDL以外のリポタンパク中に含まれるコレステロ
ールがコレステロール測定反応に関与するのを防止し得
る濃度以上であればよく、特に限定されないが、最終の
反応液中の濃度が通常0.001〜10mgAb/m
l、好ましくは0.01〜1mgAb/mlとなるよう
に反応液中に添加される。また、本発明のLDL−コレ
ステロール測定用試薬中には、この分野に於いて通常用
いられる界面活性剤、例えばポリオキシエチレンイソオ
クチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、ポリオキソエチレンノニルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオ
キシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコー
ルモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル等の非イオン性界面活性剤、例えば塩化ステアリルト
リメチルアンモニウム、塩化アルキルベンジルジメチル
アンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、例えばコール
酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性
剤等、両性界面活性剤以外の界面活性剤が含まれていて
も良い。これらは単独又は二種以上適宜組み合わせて用
いることができ、その使用濃度としては、特に限定され
ないが、反応液中の濃度が、通常0.0001〜10%
(w/v)、好ましくは0.001〜1%(w/v)の
範囲から適宜選択される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 花田 寿郎 兵庫県尼崎市高田町6番1号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内
Claims (14)
- 【請求項1】 両性界面活性剤と、シクロデキストリン
又は/及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定
方法。 - 【請求項2】 コレステロールオキシダーゼ又はコレス
テロールデヒドロゲナーゼを用いる低比重リポタンパク
中のコレステロールの測定方法であって、試料を予めシ
クロデキストリン又は/及びその誘導体を含んでなる試
薬で処理した後、シクロデキストリン又は/及びその誘
導体と両性界面活性剤の共存下でコレステロールオキシ
ダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを反応させ
ることを特徴とする、低比重リポタンパク中のコレステ
ロールの測定方法。 - 【請求項3】 シクロデキストリン又は/及びその誘導
体のコレステロール測定時の反応液中の濃度が、0.0001
〜10%(W/V)である、請求項1又は2に記載の低比重
リポタンパク中のコレステロールの測定方法。 - 【請求項4】 コレステロール測定時の反応液中の両性
界面活性剤濃度が、0.0001〜10%(W/V)である、請求
項1〜3に記載の低比重リポタンパク中のコレステロー
ルの測定方法。 - 【請求項5】 両性界面活性剤と、シクロデキストリン
又は/及びその誘導体とを含有させてなることを特徴と
する、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用試
薬。 - 【請求項6】 シクロデキストリン又は/及びその誘導
体を含んでなる第一試薬と、コレステロールオキシダー
ゼを含んでなる第二試薬とからなるものであって、カッ
プラー、デベロッパー、ペルオキシダーゼ、両性界面活
性剤及びコレステロールエステラーゼの夫々が少なくと
も第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている低比重リ
ポタンパク中のコレステロール測定用試薬。 - 【請求項7】 両性界面活性剤が第一試薬に含まれてい
る、請求項6に記載の低比重リポタンパク中のコレステ
ロール測定用試薬。 - 【請求項8】 両性界面活性剤が第二試薬に含まれてい
る、請求項6に記載の低比重リポタンパク中のコレステ
ロール測定用試薬。 - 【請求項9】 コレステロールエステラーゼが第一試薬
に含まれている、請求項6〜8に記載の低比重リポタン
パク中のコレステロール測定用試薬。 - 【請求項10】 コレステロールエステラーゼが第二試
薬に含まれている、請求項6〜8に記載の低比重リポタ
ンパク中のコレステロール測定用試薬。 - 【請求項11】 コレステロールエステラーゼが第一試
薬及び第二試薬の両方に含まれている、請求項6〜8に
記載の低比重リポタンパク中のコレステロール測定用試
薬。 - 【請求項12】 シクロデキストリン又は/及びその誘
導体、両性界面活性剤及びコレステロールエステラーゼ
を含んでなる第一試薬と、コレステロールオキシダーゼ
及びコレステロールエステラーゼを含んでなる第二試薬
とからなるものであって、カップラー、デベロッパー及
びペルオキシダーゼの夫々が少なくとも第一試薬と第二
試薬の何れかに含まれている低比重リポタンパク中のコ
レステロール測定用試薬。 - 【請求項13】 カップラーとデベロッパーの一方が第
一試薬に含まれ、他方が第二試薬に含まれている、請求
項6〜12に記載の低比重リポタンパク中のコレステロ
ール測定用試薬。 - 【請求項14】 シクロデキストリン又は/及びその誘
導体、両性界面活性剤、コレステロールエステラーゼ、
及びカップラー(又はデベロッパー)を含んでなる第一
試薬と、コレステロールオキシダーゼ、コレステロール
エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びデベロッパー
(又はカップラー)を含んでなる第二試薬とを組み合わ
せてなることを特徴とする、低比重リポタンパク中のコ
レステロール測定用キット。 【0001】
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9137714A JPH10311833A (ja) | 1997-05-13 | 1997-05-13 | Ldl−コレステロールの測定方法 |
US08/943,008 US5814472A (en) | 1997-05-13 | 1997-10-02 | Measurement of LDL-cholesterol |
DE69815207T DE69815207T2 (de) | 1997-05-13 | 1998-03-30 | Messung von LDL-Cholesterin |
EP98302436A EP0878716B1 (en) | 1997-05-13 | 1998-03-30 | Measurement of LDL-cholesterol |
ES98302436T ES2195276T3 (es) | 1997-05-13 | 1998-03-30 | Medicion de ldl-colesterol. |
KR1019980011872A KR19980086568A (ko) | 1997-05-13 | 1998-04-03 | Ldl -콜레스테롤의 측정 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9137714A JPH10311833A (ja) | 1997-05-13 | 1997-05-13 | Ldl−コレステロールの測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10311833A true JPH10311833A (ja) | 1998-11-24 |
Family
ID=15205114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9137714A Pending JPH10311833A (ja) | 1997-05-13 | 1997-05-13 | Ldl−コレステロールの測定方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10311833A (ja) |
KR (1) | KR19980086568A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000052480A1 (fr) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | International Reagents Corporation | Dosage de composant d'un echantillon biologique |
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