JPH08116996A

JPH08116996A - 血清または血漿中のｈｄｌ−コレステロールを測定する方法

Info

Publication number: JPH08116996A
Application number: JP26267994A
Authority: JP
Inventors: Hatsuichi Majima; 肇一馬島; Shigeki Asano; 茂樹浅野; Toshiro Kikuchi; 俊郎菊地; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1994-10-26
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 1996-05-14

Abstract

(57)【要約】【目的】血清や血漿中のＨＤＬ−コレステロールを簡
便かつ正確に測定する方法を提供する。【構成】血清または血漿から得た試料をリポ蛋白分画
剤を含む溶液で処理し、次いで得られた混合液を固体及
び液体の分離処理をすることなく、アニオン界面活性
剤、コレステロールエステラーゼおよびコレステロール
オキシダーゼを含む試薬とともに恒温保持し、生成した
過酸化水素を測定する血清または血漿中のＨＤＬ−コレ
ステロールを測定する方法およびそのための試薬。【効果】アニオン界面活性剤を含有させることによ
り、コレステロール測定試薬が、ＨＤＬ−コレステロー
ルに有効に働く。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血清または血漿中のＨ
ＤＬ−コレステロール測定法およびその試薬に関する。
血清や血漿に含有されるＨＤＬ−コレステロールは、冠
状動脈硬化症における危険予防因子として注目されてお
り、その測定が臨床上有用になってきている。

【０００２】

【従来の技術】脂質はエネルギー源として、また生体膜
や血漿リポ蛋白などの構成成分として生体内で重要な役
割を果たす。脂質は主にコレステロール、リン脂質、ト
リグルセライド（中性脂肪）、遊離脂肪酸からなる。体
内で脂質は運搬体としてアポ蛋白と結合してリポ蛋白と
なり転送される。リポ蛋白にはカイロマイクロン、超低
比重リポ蛋白（ＨＬＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）、高比重リポ蛋白（ＨＬＤ）などがあり、それぞれ
が役目を持って脂質の転送に働いている。コレステロー
ルの運搬体としては、中でもＬＤＬとＨＤＬが注目され
ている。ＬＤＬは血中コレステロールの主たる運搬体で
あり、これはＬＤＬ経由によって動脈壁細胞を含む諸臓
器の実質細胞に取り込まれ、同時に細胞内のコレステロ
ール生合成を抑制する。また、この取り込みに関与する
ＬＤＬ受容体数の増減によって細胞内へのコレステロー
ルの過剰蓄積を防いでおり、受容体機構の障害などによ
る高コレステロール血症は動脈効果の促進因子とされて
いる。ＨＤＬは動脈壁を含めた各組織からコレステロー
ルを受け取り、ＬＣＡＴの作用でエステル化して内部に
取り込み、肝臓へ輸送して異化させる機能をもち、細胞
内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、また
ＨＤＬの一部はＬＤＬ受容体と競合的に結合してＬＤＬ
の取り込みを抑制している。これらのリポ蛋白の代謝に
異常をきたすと、脳梗塞、動脈硬化、虚血性の心臓病な
どが起こる。

【０００３】ＨＤＬ−コレステロールは、これらのリポ
蛋白中の１成分であり、その測定のためには、リポ蛋白
の分画とコレステロールの定量の２段階に分けて考える
必要があった。ＨＤＬ−コレステロールの測定法として
は、従来、超遠心分離法・電気泳動法・沈澱法などがあ
げられるが、これらはいずれも超遠心分離・電気泳動・
分画剤による沈澱生成などの手段により予めリポ蛋白を
分画してＨＤＬ画分を分離したのちに、公知の総コレス
テロール測定法によりコレステロールを測定する方法で
ある。

【０００４】超遠心分離法は、超遠心分離により比重
１．０６３〜１．２１０の間に分画されるＨＤＬを分取
し、そのコレステロールを測定する方法であるが、高価
な超遠心分離機を必要とし、操作が煩雑で定量性に問題
がある。

【０００５】電気泳動法は、セルロースアセテート膜や
アガロースゲルなどを支持体として電気泳動を行い、リ
ポ蛋白を分離した後、酵素法によりコレステロールを発
色させ、デンシトメトリーで百分率を算出し、総コレス
テロール値を掛けて各画分を定量する方法であり、ＨＤ
Ｌはα1-グロブリンの位置に泳動される。しかしこの方
法も操作が煩雑で時間を要するという問題がある。

【０００６】沈澱法は、マグネシウム・カルシウム・マ
ンガンなどの２価陽イオンと、デキストラン硫酸・ヘパ
リンなどのポリアニオンを組み合わせて、ＨＤＬ以外の
リポ蛋白を沈澱させ、上清のＨＤＬ−コレステロールを
測定する方法であるが、前処理として遠心分離操作を行
う必要があり、自動分析機には直接適用できず操作が煩
雑で時間を要する。

【０００７】遠心分離操作を必要としない沈澱法もいく
つか開発されている。たとえば、特開平6-102276号公報
には、公知の沈澱剤と寒天粉末・ケイソウ土・酸化アル
ミニウム粉末などの沈澱助剤からなる分離剤による分画
の後、コレステロールを測定する方法が開示されてい
る。この方法は検体と分離剤を混合する操作が必要であ
り、多数の検体を測定するには適していない方法であ
る。

【０００８】また、日本臨床検査自動化学会会誌19巻 4
号(1994) 634頁には、デキストラン硫酸と塩化マグネシ
ウムの結合した磁性体粒子を分離剤として用い、磁石に
よってＨＤＬ分画以外のリポ蛋白分画を沈澱させた後、
コレステロールを測定する方法が開示されている。しか
し、この方法も検体と分離剤を混合する操作が必要であ
り、多数の検体を測定するには適していない方法であ
る。

【０００９】そこで近年になって、分離剤の使用や遠心
分離操作を必要とせず、検体を直接自動分析機に適用す
ることが可能なＨＤＬ−コレステロール測定法がいくつ
か開発された。たとえば特開昭63-126498 号公報には、
特定の試薬組成・測定条件のもとではコレステロールエ
ステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの反応は
２相で経過する、すなわち、ある条件下ではＬＤＬ−コ
レステロールが先に反応し、ＨＤＬ−コレステロールと
の反応が時間的に遅れて開始することを利用する方法が
開示されている。この方法では、ＬＤＬ−コレステロー
ルが十分反応した時点以降の時間域での吸光度変化をと
ることによりＨＤＬ−コレステロールを測定する。しか
しこの方法は、沈澱法（実施例ではリンタングステン
法）に対する相関係数の傾きが条件によって一定せず、
相関係数も0.679 〜0.973 と良好でない。さらに、この
方法は酵素や界面活性剤などの試薬組成や温度や測定時
間域など測定条件の微妙なバランスの上に成り立つ方法
であるため、試薬の安定性や測定条件のばらつきの影響
を受けやすいと考えられる。

【００１０】また、特公平6 -16720号公報には、胆汁酸
などのある種の界面活性剤の存在下では、ＨＤＬ以外の
コレステロールのみがコレステロールエステラーゼおよ
びコレステロールオキシダーゼとの反応に関与すること
を利用した方法が開示されている。この方法は、第１反
応でまず胆汁酸等の存在下でＨＤＬ以外に含まれるコレ
ステロールを反応させ、ついで第２反応で非イオン系ポ
リエチレンオキシド基含有界面活性剤または第２アルカ
ンスルホネートを添加して、残りのＨＤＬコレステロー
ルとの反応を行うものである。しかし、この方法は沈澱
法に対する相関係数の傾きが１でなく、相関係数も0.81
4 と良好でない。

【００１１】さらに、日本臨床検査自動化学会会誌19巻
4号(1994) 629,630頁には、ポリエチレングリコールお
よび抗アポＢ抗体、抗アポＣIII 抗体により、ＨＤＬ以
外のリポ蛋白を凝集させ、この時、凝集しないＨＤＬに
酵素法によるコレステロール測定試薬を作用させ、発色
させた後、グアニジンにより反応を停止させ、かつ凝集
を透明化させて比色定量する方法が開示されている。し
かし、この方法は４段階の反応を必要とするため、現在
普及している大部分の自動分析機には適用できない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に示し
た操作の煩雑さや測定の正確性に関与する問題点を解消
しようとするものであり、その目的とするところは、血
清や血漿中のＨＤＬ−コレステロールを簡便かつ正確に
測定する方法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、鋭意検討したところ、血清または血
漿から得た試料をリポ蛋白分画剤を含む液で処理し、つ
いで、得られた混合液を固体及び液体の分離処理をする
ことなく、コレステロールエステラーゼおよびコレステ
ロールオキシダーゼを含む系とともに恒温保持し、生成
した過酸化水素を測定することにより、前処理なしで直
接自動分析機に適用でき、かつ正確性の高い、ＨＤＬ−
コレステロール測定法の発明に至った。

【００１４】すなわち本発明は、血清または血漿から得
た試料をリポ蛋白分画剤を含む溶液で処理し、次いで得
られた混合液を固体及び液体の分離処理をすることな
く、アニオン界面活性剤の存在下にコレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを作用さ
せ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血
清または血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定する方
法である。

【００１５】本発明に使用するリポ蛋白分画剤の種類
は、特に限定されない。たとえば公知のものとしてデキ
ストラン硫酸・ヘパリン・リンタングステン酸ナトリウ
ム・アミロペクチン硫酸などのポリアニオンと、マグネ
シウム・カルシウム・マンガン・コバルト・ニッケルな
どの２価陽イオンの組み合わせが挙げられる。本発明に
使用するリポ蛋白分画剤を含む溶液としては、上記リポ
蛋白分画剤の他に、ポリエチレングリコールなどがあ
る。

【００１６】本発明では、コレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼを作用させて、過酸
化水素を生成させる。これらの酵素を含む試薬は、アニ
オン界面活性剤および緩衝液を含む。コレステロールエ
ステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含むコ
レステロール検出試薬は、アニオン系界面活性剤を含有
させることにより、リポ蛋白分画剤で処理された混合液
中のＨＤＬ−コレステロールに有効に働く。

【００１７】本発明に使用するアニオン界面活性剤の種
類は、特に限定されないが、１−ペンタンスルホン酸
塩、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−ヘプタンスルホン
酸塩、１−オクタンスルホン酸塩などのアルキルスルホ
ン酸塩や、コール酸塩やデヒドロコール酸塩などの胆汁
酸またはその誘導体が好適である。上記のうちでは特
に、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−ヘプタンスルホン
酸塩が好適である。なお、非イオン界面活性剤だけの使
用は、ＨＤＬ−コレステロールのみならずＬＤＬ−コレ
ステロールをも反応させてしまうので、本発明にとって
は好ましくない。

【００１８】本発明に使用するコレステロールオキシダ
ーゼは化学修飾していない酵素、化学修飾した酵素など
があり、その起源は、特に限定されない。たとえばスト
レプトマイセス(Streptomyces)属の属する細菌由来の酵
素が利用できる。また、化学修飾した酵素の例として
は、グルコースの重合度が１０以下の直鎖オリゴ糖また
は環状オリゴ糖またはそれらの誘導体で化学修飾したコ
レステロールオキシダーゼなどがある。

【００１９】本発明に使用するコレステロールエステラ
ーゼは化学修飾していない酵素、化学修飾した酵素など
があり、その起源は、特に限定されない。たとえばシュ
ードモナス (Pseudomonas)属やシゾフィラム(Schizophy
llum) 属に属する細菌などが利用できる。また、化学修
飾した酵素の例としては、グルコースの重合度が１０以
下の直鎖オリゴ糖または環状オリゴ糖またはそれらの誘
導体で化学修飾したコレステロールエステラーゼなどが
ある。これらの中では、シュードモナス (Pseudomonas)
属に属する細菌由来のコレステロールエステラーゼをオ
リゴ糖または環状オリゴ糖またはその誘導体で化学修飾
したものが好適である。

【００２０】化学修飾酵素は、オリゴ糖の糖鎖にスペー
サーを結合させた蛋白質修飾剤と酵素を結合させて得る
ことができる。蛋白質修飾剤はオリゴ糖の水酸基もしく
は還元末端のアルデヒド基に各種スペーサーを導入し、
オリゴ糖を活性化することにより得られる。結合させる
オリゴ糖鎖としては、マルトトリオース、マルトテトラ
オース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなど
のオリゴ糖鎖が挙げられる。スペーサーとしては、トリ
アジン環を有するもの、例えば塩化シアヌル、フッ化シ
アヌルなどが挙げられる。またスペーサーを結合させる
方法としては、塩化シアヌル等のトリアジン環を有する
化合物をアセトン、ＤＭＦ等の水可溶性有機溶媒に溶解
し、これとオリゴ糖を水溶液中で反応させ、トリアジン
誘導体に導き、活性化し酵素表面のアミノ基を修飾する
方法などがある。蛋白質修飾剤と酵素との反応は、例え
ば炭酸緩衝液中でｐＨ８〜１０、好ましくはｐＨ８．５
〜９．５のもとに、０〜４０℃の温度にて約２〜４８時
間で行なうことにより酵素へ修飾剤を導入することがで
きる。

【００２１】コレステロール検出試薬は、さらに必要に
より過酸化水素検出試薬、例えばペルオキシダーゼ、４
−アミノアンチピリン、色原体および緩衝液を含む。過
酸化水素を発色定量する試薬である４−アミノアンチピ
リン、色原体および緩衝液は、通常使用されるものを使
用する。４−アミノアンチピリンに代えて、水系受容体
としては、３−メチル−２−ベンゾチアゾリン誘導体な
どを使用してもよい。ペルオキシダーゼとしては、植物
由来のもの、微生物由来のものなどがあり、例えば西洋
ワサビ（Horse radish) 由来のものが挙げられる。色原
体としては、フェノール誘導体、例えばｐ−キシレノー
ル、ｐ−クロロフェノール、２，５−ジクロロフェノー
ル、スルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨ
ード安息香酸などがある。アニリン誘導体、例えばＮ−
エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−3-スルホプロピル）−ｍ−トル
イジンなどがある。緩衝液としては、ピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、
Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸、２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸などのいわゆるグッド緩衝
液やリン酸緩衝液などがある。

【００２２】本発明のＨＤＬ−コレステロールを測定す
るための試薬は、リポ蛋白分画剤、緩衝液、アニオン界
面活性剤、コレステロールエステラーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼおよび過酸化水素検出試薬を含む。該試
薬はリポ分画剤を含む試薬とアニオン系界面活性剤を含
むコレステロール測定試薬の２試薬系からなることが望
ましい。本発明のＨＤＬ−コレステロールを測定するた
めの試薬は、具体例のひとつとして、第１試薬がリポ蛋
白分画剤、緩衝液、コレステロールエステラーゼ、ペル
オキシダーゼおよびアニオン界面活性剤を含み、第２試
薬がリポ蛋白分画剤、緩衝液、コレステロールオキシダ
ーゼおよびアニオン界面活性剤を含むものがある。４−
アミノアンチピリン、フェノール誘導体またはアニリン
誘導体は第２試薬に存在させることが好ましい。

【００２３】本発明によるＨＤＬ−コレステロール測定
は例えば次のようにして行われる。すなわち、まず第１
ステップとして、血清または血漿から得た試料をリポ蛋
白分画剤を含む液で処理して、ＨＤＬ−コレステロール
以外のリポ蛋白が凝集した混合液の状態とする。この得
られた混合液の固体及び液体の分離処理は行わずに、次
に第２ステップとして、混合液を、アニオン界面活性剤
の存在下で、コレステロールエステラーゼおよびコレス
テロールオキシダーゼを含む系とともに恒温保持し、Ｈ
ＤＬ−コレステロールのみを反応させて、生成した過酸
化水素を測定することにより、ＨＤＬ−コレステロール
を測定する。

【００２４】本発明を実施する際には、第２ステップに
おいては、第１ステップで凝集した固体が再溶解しない
ように、第１ステップと同濃度のリポ蛋白分画剤を存在
させることが望ましい。また、アニオン界面活性剤やコ
レステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダー
ゼなど第２ステップに必要な組成の一部は、第１ステッ
プから存在させても差し支えない。

【００２５】第２ステップにおいてコレステロールより
過酸化水素を生成させる手段は、次式の通りである。

【００２６】

【化１】

【００２７】

【化２】

【００２８】さらに、生成した過酸化水素を測定する手
段は、種々の公知の方法により行われる。たとえば、次
式のような方法がある。

【００２９】

【化３】

【００３０】本発明によるＨＤＬ−コレステロール測定
の典型的な反応タイムコースを図１に示す。本図の横軸
は時間、縦軸は、上記のようにペルオキシダーゼを用い
る過酸化水素測定の際に生じるキノン色素の、吸収極大
波長における吸光度を示す。反応の第１ステップは、血
清または血漿から得た試料をリポ蛋白分画剤を含む液
（図１においては試薬１）で処理して、ＨＤＬ−コレス
テロール以外のリポ蛋白が凝集した混合液の状態であ
り、図中の吸光度の増大は濁りによるものである。次に
第２ステップとして、この濁った液に、アニオン界面活
性剤、コレステロールエステラーゼおよびコレステロー
ルオキシダーゼを含む試薬２を添加すると、濁りが希釈
され一時的に吸光度が下がるが、すぐに試薬とＨＤＬ−
コレステロールの反応が始まり、吸光度が増大する。こ
のとき、リポ蛋白分画剤の濃度は第１ステップ・第２ス
テップを通して変わらないように設定されていれば、濁
りは消去されることはない。そこで、第１ステップ終了
時の吸光度をａ、第２ステップ終了時の吸光度をｂとす
ると、その差ｂ−ａが、正味のキノン色素の生成、すな
わちＨＤＬ−コレステロールの量を反映することにな
る。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、前処理なしで直接自動
分析機に適用でき、かつ、正確性の高いＨＤＬ−コレス
テロールの測定が可能である。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。実施例１本発明の試薬による測定値の正確性・直線性１．試薬下記組成のものを調製した。試薬Ａ１００ｍＭグッド緩衝液（ＰＩＰＥＳ）ｐＨ７．０デキストラン硫酸ナトリウム１５ｍｇ／ｍｌＭｇＣｌ₂ ２００ｍＭ１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム５０ｍｇ／ｍｌペルオキシダーゼ１Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ０．５Ｕ／ｍｌＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン０．２ｍｇ／ｍｌ

【００３３】試薬Ｂ１００ｍＭグッド緩衝液（ＰＩＰＥＳ）ｐＨ７．０デキストラン硫酸ナトリウム１５ｍｇ／ｍｌＭｇＣｌ₂ ２００ｍＭ１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム５０ｍｇ／ｍｌ４−アミノアンチピリン０．２ｍｇ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ６Ｕ／ｍｌ

【００３４】２．サンプル（財）化学品検査協会の総コレステロール／ＨＤＬ−コ
レステロール標準血清ＷＣＨＬ９４１Ｍを、生理食塩
水で希釈して、ＨＤＬ−コレステロール濃度０ｍｇ／ｄ
ｌ〜５８．４ｍｇ／ｄｌの１０水準（０は含まない）の
希釈系列を作成した。

【００３５】３．検討方法上記試薬Ａ０．２６ｍｌにサンプル０．００３ｍｌを添
加し、３７℃において５分間放置した後、５４６ｎｍに
おける吸光度を測定した（吸光度ａ）。ついで、その直
後に試薬Ｂ０．１３ｍｌを加え、３７℃において５分間
放置後の５４６ｎｍにおける吸光度を測定した（吸光度
ｂ）。ここで（吸光度ｂ−吸光度ａ）を計算し吸光度差
とした。同様に、サンプルのかわりにブランクならびに
５０ｍｇ／ｄｌの標準液０．００３ｍｌを用いて同様の
操作を行って吸光度差を求め、次式でＨＤＬ−コレステ
ロール値の計算を行った。

【００３６】

【数１】

【００３７】測定結果を表１に、サンプル中のＨＤＬ−
コレステロール値と測定値の関係を図２に示す。

【００３８】実施例１の結果より、ＨＤＬ−コレステロ
ール値が高くなるにつれて吸光度差が比例的に上昇し、
試験範囲内において良好な直線性を示していることがわ
かる。さらに、サンプル中のＨＤＬ−コレステロール値
と測定値はよく一致し、良好な正確性を示していること
がわかる。

【００３９】

【表１】

【００４０】実施例２、比較例１本発明の試薬による測定値と従来の沈澱法による測定値
の相関１．試薬ａ. 本発明の試薬実施例１の試薬Ａ・試薬Ｂに同じ。ｂ. 従来の沈澱法の試薬分画剤：デキストラン硫酸ナトリウムとＭｇＣｌ₂ (コレスカラー・ＨＤＬ (東洋紡績製) を使用) コレステロール測定試薬：コレスカラー・リキッド (東
洋紡績製) ２．サンプル血清３０検体。

【００４１】３．検討方法ａ. 本発明の方法試薬Ａ０．２６ｍｌにサンプル０．００３ｍｌを添加
し、３７℃において５分間放置した後、５４６ｎｍにお
ける吸光度を測定した（吸光度ａ）。ついで、その直後
に試薬Ｂ０．１３ｍｌを加え、３７℃において５分間放
置後の５４６ｎｍにおける吸光度を測定した（吸光度
ｂ）。ここで、（吸光度ｂ−吸光度ａ）を計算し吸光度
差とした。同様に、サンプルの代わりにブランクならび
に５０ｍｇ／ｄｌの標準液をそれぞれ０．００３ｍｌ用
いて同様の操作を行って吸光度差を求め、実施例１と同
様にして、ＨＤＬ−コレステロール値の計算を行った。

【００４２】ｂ．従来の沈澱法分画剤：デキストラン硫酸ナトリウムとＭｇＣｌ₂、
(コレスカラー・ＨＤＬ (東洋紡績製) を使用) とコレ
ステロール測定試薬：コレスカラー・リキッド(東洋紡
績製) を用法・用量に従って使用した。ｃ．測定値の相関図と相関式の計算通常の統計的手法に従って計算した。結果の相関図と相
関式を図３に示す。

【００４３】実施例２の結果より、本発明の方法（実施
例１の方法）と沈澱法の間に良好な相関関係があること
がわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるＨＤＬ−コレステロール測定の典
型的な反応タイムコースを示す。

【図２】サンプル中のＨＤＬ−コレステロール濃度と本
発明の試薬による測定値の関係を示す。

【図３】本発明の試薬による測定値と従来の沈澱法によ
る測定値の相関を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者川村良久福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血清または血漿から得た試料をリポ蛋白
分画剤を含む溶液で処理し、次いで得られた混合液を固
体及び液体の分離処理をすることなく、アニオン界面活
性剤の存在下に、コレステロールエステラーゼおよびコ
レステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化
水素を測定することを特徴とする血清または血漿中のＨ
ＤＬ−コレステロールを測定する方法。
【請求項２】アニオン界面活性剤がアルキルスルホン
酸塩または胆汁酸あるいはその誘導体であることを特徴
とする請求項１記載の血清または血漿中のＨＤＬ−コレ
ステロールを測定する方法。
【請求項３】コレステロールオキシダーゼが、グルコ
ースの重合度１０以下の直鎖オリゴ糖または環状オリゴ
糖またそれらの誘導体で化学修飾したコレステロールオ
キシダーゼであることを特徴とする請求項１記載の血清
または血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定する方
法。
【請求項４】コレステロールエステラーゼが、グルコ
ースの重合度１０以下の直鎖オリゴ糖または環状オリゴ
糖またはそれらの誘導体で化学修飾したコレステロール
エステラーゼであることを特徴とする請求項１記載の血
清または血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定する方
法。
【請求項５】リポ蛋白分画剤が、デキストラン硫酸、
ヘパリン、リンタングステン酸ナトリウムおよびアミロ
ペクチン硫酸よりなる群から選ばれる１種または２種以
上のポリアニオンおよびマグネシウム、カルシウム、マ
ンガン、コバルトおよびニッケルよりなる群から選ばれ
る１種または２種以上の２価陽イオンの組み合わせであ
ることを特徴とする請求項１記載の血清または血漿中の
ＨＤＬ−コレステロールを測定する方法。
【請求項６】血清または血漿から得た試料をデキスト
ラン硫酸、ヘパリン、リンタングステン酸ナトリウムお
よびアミロペクチン硫酸よりなる群から選ばれる１種ま
たは２種以上のポリアニオンおよびマグネシウム、カル
シウム、マンガン、コバルトおよびニッケルよりなる群
から選ばれる１種または２種以上の２価陽イオンの組み
合わせであるリポ蛋白分画剤を含む溶液で処理し、次い
で得られた混合液を固体及び液体の分離処理をすること
なく、アルキルスルホン酸塩または胆汁酸あるいはその
誘導体であるアニオン界面活性剤、コレステロールエス
テラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、４−アミノア
ンチピリン、色原体および緩衝液を含む試薬と反応さ
せ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血
清または血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定する方
法。
【請求項７】リポ蛋白分画剤、コレステロールエステ
ラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ、アニオン界
面活性剤、緩衝液および必要によりペルオキシダーゼ、
４−アミノアンチピリンおよび色原体を含むことを特徴
とする血清または血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測
定するための試薬。
【請求項８】第１試薬がリポ蛋白分画剤、緩衝液、コ
レステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼおよびア
ニオン界面活性剤を含み、第２試薬がリポ蛋白分画剤、
緩衝液、コレステロールオキシダーゼおよびアニオン界
面活性剤を含むことを特徴とする請求項７記載の血清ま
たは血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定するための
試薬。
【請求項９】アニオン界面活性剤がアルキルスルホン
酸塩または胆汁酸あるいはその誘導体であることを特徴
とする請求項７記載の血清または血漿中のＨＤＬ−コレ
ステロールを測定するための試薬。
【請求項１０】コレステロールオキシダーゼが、グル
コースの重合度１０以下の直鎖オリゴ糖または環状オリ
ゴ糖またそれらの誘導体で化学修飾したコレステロール
オキシダーゼであることを特徴とする請求項７記載の血
清または血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定するた
めの試薬。
【請求項１１】コレステロールエステラーゼが、グル
コースの重合度１０以下の直鎖オリゴ糖または環状オリ
ゴ糖またはそれらの誘導体で化学修飾したコレステロー
ルエステラーゼであることを特徴とする請求項７記載の
血清または血漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定する
ための試薬。
【請求項１２】リポ蛋白分画剤が、デキストラン硫
酸、ヘパリン、リンタングステン酸ナトリウムおよびア
ミロペクチン硫酸よりなる群から選ばれる１種または２
種以上のポリアニオンおよびマグネシウム、カルシウ
ム、マンガン、コバルトおよびニッケルよりなる群から
選ばれる１種または２種以上の２価陽イオンの組み合わ
せであることを特徴とする請求項７記載の血清または血
漿中のＨＤＬ−コレステロールを測定するための試薬。
【請求項１３】デキストラン硫酸、ヘパリン、リンタ
ングステン酸ナトリウムおよびアミロペクチン硫酸より
なる群から選ばれる１種または２種以上のポリアニオン
およびマグネシウム、カルシウム、マンガン、コバルト
およびニッケルよりなる群から選ばれる１種または２種
以上の２価陽イオンの組み合わせであるリポ蛋白分画
剤、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ、アルキルスルホン酸塩または胆汁酸あるいは
その誘導体であるアニオン界面活性剤、緩衝液および必
要によりペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンお
よび色原体を含むことを特徴とする血清または血漿中の
ＨＤＬ−コレステロールを測定するための試薬。