JP5191236B2 - 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット - Google Patents
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Description
各リポ蛋白質は、脂質組成及びアポ蛋白の種類が異なっており、それ故生体中での働きが大きく異なる。また、VLDLからLDLへ代謝される過程において生成するリポ蛋白として、VLDLとLDLの密度の中間に相当する中間密度リポ蛋白(以下、IDLと略記する)が存在するが、広義にはLDLとして分類されている。
分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、第一工程でLDL以外の全てのリポ蛋白中のトリグリセリドを除去した後、第二工程で残ったLDL中のトリグリセリドを測定する方法(特許文献1及び特許文献2)が知られているが、VLDL中のトリグリセリドやCM中のトリグリセリドが高い検体においては第一工程で除去しきれず第二工程に反応が持ち越され正の影響を受けるといった問題がある。
また、分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマー、特に、ポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンのトリブロックコポリマー存在下での酵素反応を特徴とする、LDL中のトリグリセリドの測定方法(特許文献4)が知られている。
[1] 下記工程(i)〜(iv)を順次行うことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの測定方法。
(i)検体及びポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びHLB値が13.2以上14以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する水性媒体中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程;
(ii)前記工程(i)の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程;
(iii)前記工程(ii)で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩、及びHLB値が11以上12.8以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程;
(iv)前記工程(iii)で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。
[3] 工程(ii)の遊離型グリセロールの除去が、遊離型グリセロールを工程(iv)の遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することである[1]又は[2]記載の方法。
[5] 過酸化水素の除去が、過酸化水素にカタラーゼを作用させるか、又は、酸化カップリング色原体の片方の存在下に、過酸化水素に過酸化活性物質を作用させることにより行われる[4]に記載の測定方法。
[7] 遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロール3−リン酸オキシダーゼとを含有する試薬又はグリセロールオキシダーゼを含有する試薬である[4]〜[6]のいずれかに記載の測定方法。
[9] 胆汁酸誘導体の存在下に、工程(iii)のリポプロテインリパーゼを作用させる[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[14] 遊離グリセロール除去試薬が、グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素除去試薬を含有する試薬である、[11]〜[12]記載のキット。
[16] 遊離型グリセロール測定試薬が、遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する試薬である、[11]〜[15]のいずれかに記載のキット。
[18] 過酸化水素測定試薬が、過酸化活性化物質と酸化発色型色原体とを含有する試薬である[16]又は[17]に記載のキット。
[20] 胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩、一般式(I)
本発明の好ましいLDL中のトリグリセリドの測定は、いずれの反応工程においても、検体中のVLDL中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制した状態、もしくは促進しない状態で行うことを特徴とする。これにより、トリグリセリドを豊富に含むVLDLに由来するトリグリセリドの測定値への影響を実質的に回避することができる。
本発明に用いられるリポプロテインリパーゼとしては、リポタンパク中トリグリセリドを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のリポプロテインリパーゼ、遺伝子工学的な手法により製造されるリポプロテインリパーゼ等が挙げられる。また、リポ蛋白中トリグリセリドを加水分解する能力を有するコレステロールエステル加水分解酵素等も本発明のリポプロテインリパーゼに包含される。
市販されているリポプロテインリパーゼとしては、コレステロールエステラーゼ“Amano”3(CHE3;天野エンザイム社製)、コレステロールエステラーゼ(CEBP−M;旭化成社製)、リポプロテインリパーゼ(LPL311;東洋紡績製社製)、リポプロテインリパーゼ“Amano”6(LPL6;天野エンザイム社製)、リポプロテインリパーゼ“Amano”3(LPL3;天野エンザイム社製)、EST“Amano”2(天野エンザイム社製)、リポプロテインリパーゼ(LPBP;旭化成社製)、コレステロールエステラーゼ[COE313(化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ);東洋紡績社製]等が挙げられる。
本発明に用いられるPOP−POA多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
本発明において用いられるPOP−POAアルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
本発明に用いられるPOE−POAアルキルフェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の、例えばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
POE−POAアルキルフェニルエーテル及びPOP−POAアルキルフェニルエーテルそれぞれにおけるポリオキシエチレンのオキシエチレン及びポリオキシプロピレンのオキシプロピレンの重合度としては、好ましくは2〜60であり、より好ましくは4〜30であり、ポリオキシアルキレンのオキシアルキレンの重合度としては、好ましくは1〜40であり、より好ましくは1〜20である。
POE多環フェニルエーテル縮合物の具体例(製品)としては、ニューカルゲンE150(竹本油脂社製)等が挙げられる。
POEアルキルフェニルエーテル硫酸塩におけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数6〜30の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。
本発明に用いられるPOE多環フェニルエーテル硫酸塩中のポリオキシエチレンにおけるオキシエチレンの重合度としては、好ましくは1〜60であり、より好ましくは2〜30である。
POE多環フェニルエーテル硫酸塩の具体的例(製品)としては、ニューコール707SF(日本乳化剤社製)等が挙げられる。
HLB値が9.0以上13.0未満のPOE多環フェニルエーテルの具体的例(製品)としては、エマルゲンA60(HLB値12.8 花王社製)、BLAUNON DSP12.5(HLB値12.7 青木油脂社製)、BLAUNON TSP20(HLB値12.7 青木油脂社製)、BLAUNON DSP−9(HLB値11.4 青木油脂社製)、BLAUNON DSP−7.5(HLB値9.2 青木油脂社製)、BLAUNON TSP−16(HLB値12.7 青木油脂社製)等が挙げられる。
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えばコール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩等が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式(II)
化合物(II)のうち、R3及びR4が共に、
本発明に用いられる胆汁酸誘導体の濃度としては、LDL中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が0.001〜10%であることが好ましく、0.01〜1%がより好ましい。本発明においては、胆汁酸誘導体を2種類以上用いても良い。
(i)検体及びPOE−POA多環フェニルエーテル、POP−POA多環フェニルエーテル、POEアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物、及びHLB値が13.0以上17.0以下のPOE多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する反応液中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程、
(ii)前記工程(i)の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程、
(iii)前記工程(ii)で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、POE−POAアルキルエーテル、POP−POAアルキルエーテル、POE−POAアルキルフェニルエーテル、POP−POAアルキルフェニルエーテル、POE多環フェニルエーテル縮合物、POEアルキルフェニルエーテル硫酸塩、POE多環フェニルエーテル硫酸塩、及びHLB値が9.0以上13.0未満のPOE多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロール生成させる工程、
(iv)前記工程(iii)で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。
工程(ii)における、反応液中に存在する遊離型グリセロールの除去は、遊離型グリセロールを工程(iv)で生成する遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することにより行うことができる。なお、工程(iv)における遊離型グリセロールの測定方法との組み合わせで工程(ii)の遊離型グリセロールの除去方法は、当業者が適宜選択できる。
本発明におけるグリセロールキナーゼとしては、グリセロールをATPの存在下グリセロール3−リン酸に変換する活性を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のグリセロールキナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるグリセロールキナーゼ等も用いることができ、グリセロールキナーゼ(GYK−301;東洋紡績社製)、グリセロールキナーゼ(GYK−311;東洋紡績社製)、グリセロールキナーゼ(GKZ;旭化成社製)等の市販品を使用することもできる。
本発明の方法に用いられるグリセロールキナーゼの濃度としては、LDL中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.1〜20U/mLの濃度であることが好ましく、0.2〜10U/mLの濃度であることがより好ましい。また、本発明においては、2種類以上のグリセロールキナーゼを組み合わせて用いることもできる。
本発明の方法に用いられるグリセロール3−リン酸オキシダーゼの濃度としては、LDL中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で1〜60U/mLの濃度であることが好ましく、2〜30U/mLの濃度であることがより好ましい。また、本発明においては、2種類以上のグリセロール3−リン酸オキシダーゼを組み合わせて用いることもできる。
過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方との組み合わせを使用する場合、過酸化活性物質の濃度としては、該過酸化活性物質とHDL中のトリグリセリド及び遊離のグリセロール由来の過酸化水素との反応により、無色の物質が生成し得る濃度であれば特に制限はない。過酸化活性物質として、パーオキシダーゼを用いる場合、パーオキシダーゼの濃度としては、反応液中で1〜100U/mLの濃度であることが好ましく、2〜50U/mLの濃度であることがより好ましい。
フェノール系水素供与体化合物としては、フェノール、4−クロロフェノール、3−メチルフェノール、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
本発明の工程(ii)において、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程(iv)においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、アジ化ナトリウム、H2S、HCN、NH2OH、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程(iv)で生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない濃度であればとくに限定はされないが、好ましくは0.5〜60mmol/L、より好ましくは1〜30mmol/Lである。
ロイコ型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(CCAP)、10−N−メチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(MCDP)、N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA−64)、4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン、ビス〔3−ビス(4−クロロフェニル)メチル−4−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
例えば、工程(ii)で、生成する遊離型グリセロールにグリセロールキナーゼを作用させて、該遊離型グリセロールをグリセロール3−リン酸に変換し、工程(iv)で、グリセロールキナーゼ不活性化剤等の存在下、グリセロールオキシダーゼを作用させて、生成する過酸化水素を測定する方法等を例示することができる。
POE−POA多環フェニルエーテル、POP−POA多環フェニルエーテル、POEアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びHLB値が13.0以上17.0以下のPOE多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、リポプロテインリパーゼ及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する試薬。
POE−POAアルキルエーテル、POP−POAアルキルエーテル、POE−POAアルキルフェニルエーテル、POP−POAアルキルフェニルエーテル、POE多環フェニルエーテル縮合物、POEアルキルフェニルエーテル硫酸塩、POE多環フェニルエーテル硫酸塩、及びHLB値が9.0以上13.0未満のPOE多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤及び遊離型グリセロール測定試薬を含有する試薬。
過酸化水素除去試薬は、第一試薬に含有される。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合は、第二試薬はカタラーゼ活性阻害剤を含有するのが好ましい。該カタラーゼ活性阻害剤としては、前述のカタラーゼ活性阻害剤が挙げられる。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップリング型色原体の片方とを含有する試薬を使用する場合、該過酸化活性物質と該片方の酸化カップリング型色原体は、過酸化水素測定試薬の構成成分も兼ねているので、特に過酸化水素除試薬を除去又は不活性化する必要はなく、第二試薬に、発色に必要な別の片方の酸化カップリング型色原体を含有させればよい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合においても、過酸化水素測定試薬中の一部の構成成分、特に、酸化カップリング型色原体の片方は第一試薬に含有されてもよい。胆汁酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されても良いが、第二試薬に含有されることが好ましい。
本発明のLDL中トリグリセリド測定用キットにおけるリポプロテインリパーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜1200U/mLとなる含量が好ましく、0.02〜600U/mLとなる含量がより好ましい。本発明のLDL中トリグリセリド測定用キットにおけるグリセロールキナーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.1〜60U/mLとなる含量が好ましく、0.2〜30U/mLとなる含量がより好ましい。本発明のLDL中トリグリセリド測定用キットにおけるグリセロール3−リン酸オキシダーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が1〜180U/mLとなる含量が好ましく、2〜90U/mLとなる含量がより好ましい。
過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のLDL中トリグリセリド測定用キットにおけるカタラーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.05〜1.2kU/mLとなる含量が好ましく、0.1〜6.0kU/mLとなる含量がより好ましい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のLDL中トリグリセリド測定用キットにおけるカタラーゼ活性阻害剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.5〜180mmol/Lとなる含量が好ましく、1〜90mmol/Lとなる含量がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬a)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
第一試薬(試薬B)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
ニューコール610 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬a)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
第一試薬(試薬C)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
ニューコール2608F 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬a)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
第一試薬(試薬D)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
ニッコールR1020 2 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬a)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
第一試薬(試薬E)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
ニューカルゲンGP120 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬a)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬b)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
BLUNON DSP12.5 10 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬c)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンL40 5 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬d)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
ハイテノールN08 6 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬e)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
ニューコール707SF 5 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬f)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
ワンダサーフS1400 6 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬g)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
ニューカルゲンE150 6 g/L
比較例1
第一試薬(試薬F)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬a)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
比較例2
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬h)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
比較例3
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬i)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲン909 10 g/L
比較例4
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬j)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルミンNL70 6 g/L
(1)各リポ蛋白分画中トリグリセリドとそれぞれ実施例1〜11並びに比較例1〜4のキットとの反応による各リポ蛋白分画における「反応吸光度」の算出
日立7170S形自動分析装置を用いて、以下の操作により「反応吸光度」を算出した。
日立7170S形自動分析装置を用いて、色原体としてEMSEを使用したトリグリセリド測定用キットであるデタミナーC TG(協和メデックス社製)を実施例1のキットの代わりに用いる以外は(1)の場合と同様の方法で、「反応吸光度」を算出し、以下の計算式にて、それぞれ実施例1〜11並びに比較例1〜4のキットにおける各リポ蛋白分画中トリグリセリドとの反応率(%)を算出した。尚、デタミナーC TGを用いた測定において算出した「反応吸光度」は、対象とするリポ蛋白中のトリグリセリドが全て反応した際の「反応吸光度」を意味する。
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬k)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
コール酸ナトリウム 6 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬l)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
ハイテノールN08 6 g/L
コール酸ナトリウム 6 g/L
第一試薬(試薬A)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
エマルゲンB66 5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GYK−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬(試薬m)
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
アジ化ナトリウム 0.5 g/L
エマルゲンA60 20 g/L
ハイテノールN08 6 g/L
コール酸ナトリウム 6 g/L
次に、キドニー インターナショナル(Kidney International)、 Vol.39,755ページ(1991)に記載された超遠心法を基準法とし、該血清30検体各々からLDL(比重1.006〜1.063)を超遠心分離し、得られたLDL分画中のトリグリセリド量をデタミナーC TG(協和メデックス社製)を用いて測定した。各実施例及び比較例のキットを用いた測定と、基準法による測定との相関係数を第2表に示す。
(1)超遠心法を用いたLDL中トリグリセリドの定量
新鮮ヒト血清3検体を用いてキドニー インターナショナル(Kidney International)、 Vol.39,755ページ(1991)に記載された超遠心法にて該検体中のLDL(比重1.006〜1.063)を遠心分離し、得られたLDL分画中のトリグリセリド量をデタミナーC TG(協和メデックス社製)を用いて測定した。
(2)検量線の作成
超遠心法による測定より、LDL中トリグリセリド濃度が40.0mg/dLであることが判明している新鮮ヒト血清を標準品として用いて、これを検量線作成用サンプルとした。実施例12の(1)記載の測定方法と同様にして日立7170S自動分析装置により、検量線作成用サンプル検体の反応吸光度を測定し、該反応吸光度と検量線作成用サンプル中のLDL中トリグリセリド濃度との関係から検量線を作成した。
(3)ヒト血清3検体中のLDL中トリグリセリドの定量
検量線作成用サンプルの代わりに新鮮ヒト血清3検体を用いて、上記(2)と同様の方法により、該2検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と上記(2)で作成した検量線とから、各検体中のLDL中トリグリセリド濃度を定量した。
3検体について、上記(1)で測定した超遠心法を用いた測定値と、上記(3)で測定した実施例15のキットを用いた測定値を表3に示す。
測定用キットA
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
エマルゲンB66 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
エマルゲンB66 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
参考例2
測定用キットA
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューコール610 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューコール610 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
参考例3
測定用キットA
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューコール2608F 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューコール2608F 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
参考例4
測定用キットA
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューカルゲンGP120 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューカルゲンGP120 5 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
参考例5
測定用キットA
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
CEBP−M 2 kU/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニッコールR1020 2 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
第一試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
硫酸マグネシウム 0.5 g/L
GY−301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニッコールR1020 2 g/L
第二試薬
PIPES(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3 g/L
パーオキシダーゼ 20 kU/L
参考例6
(1)各リポ蛋白分画中トリグリセリドと各測定用キットとの反応による反応吸光度の算出
日立7170S形自動分析装置を用いて、以下の操作により反応吸光度を算出した。
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ(2μL)添加し、次いで参考例1〜5の測定用キットAまたは測定用キットBの第一試薬(0.15mL)を添加し反応(第一反応)を開始させ、37℃で5分間加温し、反応5分後の反応液の吸光度(E1)を主波長600nm、副波長700nmで測定した。
次いで、この反応液に参考例1〜5の測定用キットAまたは測定用キットBの第二試薬(0.05mL)をそれぞれ添加しさらに37℃で5分間加温して反応(第二反応)を行い、第二反応5分後の反応液の吸光度(E2)を主波長600nm、副波長700nmで測定し、E2からE1を差し引いて、吸光度変化(ΔEリポ蛋白分画)を算出した。
また、各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化(ΔEブランク)を算出した。各リポ蛋白分画における「反応吸光度」は、下記式1により算出した。
式1より求めた参考例1〜5の測定用キットAおよび測定用キットBのリポ蛋白分画における反応吸光度を用い、参考例1〜5における各リポ蛋白分画中に存在する遊離グリセロールの反応を差し引いた各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応吸光度を下記式により算出した。
(2)各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率の算出
実施例12と同様、デタミナーC TG(協和メデックス社製)を用い、リポ蛋白中トリグリセリドが全て反応した際の「反応吸光度」を算出し、参考例1〜5における各リポ蛋白分画中トリグリセリドとの反応率(%)を以下の計算式にて算出した。
参考例1〜5における各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率を第3表に示す。なお、反応率が0〜10%を「−」、10〜20%を「±」、20〜40%を「+」、40〜60%を「++」、60〜80%を「+++」、80〜100%を「++++」とした。
Claims (20)
- 下記工程(i)〜(iv)を順次行うことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの測定方法。
(i)検体及びポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びHLB値が13.2以上14以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する水性媒体中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程;
(ii)前記工程(i)の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程;
(iii)前記工程(ii)で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩、及びHLB値が11以上12.8以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程;
(iv)前記工程(iii)で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。 - 工程(i)で生成する遊離型グリセロールが、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドから生成するものである請求項1記載の方法。
- 工程(ii)の遊離型グリセロールの除去が、遊離型グリセロールを工程(iv)の遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することにより行われる請求項1又は2記載の方法。
- 工程(ii)の遊離型グリセロールの除去が、遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次いで該過酸化水素を除去することにより行われる請求項1又は2記載の測定方法。
- 過酸化水素の除去が、過酸化水素にカタラーゼを作用させるか、又は、酸化カップリング色原体の片方の存在下に、過酸化水素に過酸化活性物質を作用させることにより行われる請求項4に記載の測定方法。
- 工程(iv)の遊離型グリセロールの測定が、遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次いで該過酸化水素を測定することにより行われる請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 遊離型グリセロールから過酸化水素を発生させる試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロール3−リン酸オキシダーゼとを含有する試薬又はグリセロールオキシダーゼを含有する試薬である請求項4〜6のいずれかに記載の測定方法。
- 過酸化水素の測定が、過酸化水素に過酸化活性物質と酸化発色型色原体とを作用させて色素を生成させ、該色素の吸光度を測定することにより行われる請求項6又は7に記載の方法。
- 胆汁酸誘導体の存在下に、工程(iii)のリポプロテインリパーゼを作用させる請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩、一般式(I)
- (a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びHLB値が13.2以上14以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、リポプロテインリパーゼ、及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する第一試薬と、(b)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸塩及びHLB値が11以上12.8以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、及び遊離型グリセロール測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリド測定用キット。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物及びHLB値が13.2以上14以下のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤が、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドにリポプロテインリパーゼを作用させるものである請求項11記載のキット。
- 遊離グリセロール除去試薬が、遊離グリセロールを遊離グリセロール測定試薬による測定に係る成分以外の成分に変換する酵素である請求項11又は12記載のキット。
- 遊離グリセロール除去試薬が、グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素除去試薬を含有する試薬である、請求項11又は12記載のキット。
- 過酸化水素除去試薬が、カタラーゼ、又は、酸化カップリング色原体の片方と過酸化活性物質とを含有する試薬である請求項14記載のキット。
- 遊離型グリセロール測定試薬が、遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する試薬である、請求項11〜15のいずれかに記載のキット。
- 遊離型グリセロールから過酸化水素を生成させる試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロール3−リン酸オキシダーゼとを含む試薬又はグリセロールオキシダーゼを含む試薬である請求項14〜16のいずれかに記載のキット。
- 過酸化水素測定試薬が、過酸化活性化物質と酸化発色型色原体とを含有する試薬である請求項16又は17に記載のキット。
- 第二試薬が、さらに胆汁酸誘導体を含有する請求項11〜18のいずれかに記載のキット。
- 胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩、一般式(I)
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