JPH10191978A - 核酸ハイブリダイゼーションの阻害物質を減少させる方法 - Google Patents
核酸ハイブリダイゼーションの阻害物質を減少させる方法Info
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- JPH10191978A JPH10191978A JP9368522A JP36852297A JPH10191978A JP H10191978 A JPH10191978 A JP H10191978A JP 9368522 A JP9368522 A JP 9368522A JP 36852297 A JP36852297 A JP 36852297A JP H10191978 A JPH10191978 A JP H10191978A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、試料中の核酸ハイブリダイゼーシ
ョンを阻害する物質の量を減少させる方法に関する。 【解決手段】 この方法は、目的とする細胞から標的核
酸を放出する前に実行され、阻害物質を可溶化し、且つ
試料中の細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触
させるステップと、その後、試薬と細胞を分離させるス
テップとを含む。
ョンを阻害する物質の量を減少させる方法に関する。 【解決手段】 この方法は、目的とする細胞から標的核
酸を放出する前に実行され、阻害物質を可溶化し、且つ
試料中の細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触
させるステップと、その後、試薬と細胞を分離させるス
テップとを含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の分野は、広く核酸ハ
イブリダイゼーションに関する。さらに詳細には、本発
明は、試料中の核酸ハイブリダーゼーションを阻害する
物質の減少に関する。このようなハイブリダイゼーショ
ンには、目的とする核酸の存在および／または量を決定
するための核酸プローブハイブリダイゼーション、およ
び核酸増幅過程を開始するための核酸プライマーハイブ
リダイゼーションが含まれる。
イブリダイゼーションに関する。さらに詳細には、本発
明は、試料中の核酸ハイブリダーゼーションを阻害する
物質の減少に関する。このようなハイブリダイゼーショ
ンには、目的とする核酸の存在および／または量を決定
するための核酸プローブハイブリダイゼーション、およ
び核酸増幅過程を開始するための核酸プライマーハイブ
リダイゼーションが含まれる。
【０００２】
【従来の技術】鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌ
ａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤ
Ａ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）、リガーゼ連
鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ；ＬＣＲ）、核酸配列を基本とする増幅（ｎｕｃｌｅ
ｉｃａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅
（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）などの核酸増幅過程
を使用して、試料中に存在するコピー数が少ない、目的
とする特定の核酸配列（標的配列）のコピーが多数作製
される。しかし、このような試料中によくみられる多く
の物質は、増幅過程を開始するためのプライマーのハイ
ブリダイゼーションを阻害するため、核酸増幅過程の阻
害を引き起こす。同様に、このような物質は、未増幅標
的核酸の検出に使用される直接核酸プローブハイブリダ
ーゼーション反応を阻害する。
ａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤ
Ａ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）、リガーゼ連
鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ；ＬＣＲ）、核酸配列を基本とする増幅（ｎｕｃｌｅ
ｉｃａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅
（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）などの核酸増幅過程
を使用して、試料中に存在するコピー数が少ない、目的
とする特定の核酸配列（標的配列）のコピーが多数作製
される。しかし、このような試料中によくみられる多く
の物質は、増幅過程を開始するためのプライマーのハイ
ブリダイゼーションを阻害するため、核酸増幅過程の阻
害を引き起こす。同様に、このような物質は、未増幅標
的核酸の検出に使用される直接核酸プローブハイブリダ
ーゼーション反応を阻害する。
【０００３】このような核酸ハイブリダイゼーション阻
害物質の例は、血液試料中によくみられ、ＰＣＲを阻害
するヘムおよびヘマチンから誘導されるポルフィリン化
合物である（PCR Technology, Stockton Press, Henry
A. Erlich, Ed. pp 33-34, 1989)。浸透による溶解、及
び、核片と細胞片のペレット化を用いるプロトコルが、
これらの阻害物質の量を減らすために使用されてきた。
唾液試料もＰＣＲ阻害物質を含むと報告されている。 O
chert et al., PCR Methods and Applications 3, 365-
368 (1994)。阻害物質は同定されなかったが、唾液試料
をマイクロ波で長時間加熱したり煮沸したりすると、Ｐ
ＣＲ阻害が完全に排除されることが確認された。
害物質の例は、血液試料中によくみられ、ＰＣＲを阻害
するヘムおよびヘマチンから誘導されるポルフィリン化
合物である（PCR Technology, Stockton Press, Henry
A. Erlich, Ed. pp 33-34, 1989)。浸透による溶解、及
び、核片と細胞片のペレット化を用いるプロトコルが、
これらの阻害物質の量を減らすために使用されてきた。
唾液試料もＰＣＲ阻害物質を含むと報告されている。 O
chert et al., PCR Methods and Applications 3, 365-
368 (1994)。阻害物質は同定されなかったが、唾液試料
をマイクロ波で長時間加熱したり煮沸したりすると、Ｐ
ＣＲ阻害が完全に排除されることが確認された。
【０００４】Frickhofen and Young, J, Virol, Method
s 35, 65-72 (1991)には、血清試料を７０℃で４５秒間
加熱すると、ウイルス核酸配列のＰＣＲ増幅が改善する
と報告されている。この改善は、ＰＣＲ過程を阻害する
と考えられるアプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦ、
ペプスタチンなどの血清酵素の熱不活化に起因すると理
論づけられている。ウイルス核酸配列の増幅に先立って
ＰＣＲ阻害物質を血清から除外する他の方法は、Zeldis
et al., J. Clin. Invest. 84, 1503-1508 (1989)によ
り示されている。この方法には、ウイルスを抗体被覆微
粒子に吸着させること、微粒子を洗浄すること、ＰＣＲ
を阻害すると考えられる残りのタンパク質をプロテイナ
ーゼＫで破壊することが含まれる。
s 35, 65-72 (1991)には、血清試料を７０℃で４５秒間
加熱すると、ウイルス核酸配列のＰＣＲ増幅が改善する
と報告されている。この改善は、ＰＣＲ過程を阻害する
と考えられるアプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦ、
ペプスタチンなどの血清酵素の熱不活化に起因すると理
論づけられている。ウイルス核酸配列の増幅に先立って
ＰＣＲ阻害物質を血清から除外する他の方法は、Zeldis
et al., J. Clin. Invest. 84, 1503-1508 (1989)によ
り示されている。この方法には、ウイルスを抗体被覆微
粒子に吸着させること、微粒子を洗浄すること、ＰＣＲ
を阻害すると考えられる残りのタンパク質をプロテイナ
ーゼＫで破壊することが含まれる。
【０００５】羊水中、胎児血清中、新生児血清中および
脳脊髄液中のトレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍ
ａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）をＰＣＲで検出しようとして、
ＰＣＲ阻害化合物を除去するために異なる４つの方法を
試みた。 Grimprel et al.,J. Clin. Microbiol. 29, 1
711-1718 (1991)。簡単に記述すると、ＰＣＲ阻害化合
物を除去するための４つの方法は、（１）試験管内の試
料を沸騰している水浴中に１０分間入れ、氷で冷却し、
遠心分離する煮沸法、（２）試料に滅菌リン酸緩衝食塩
水を加え、一連の遠心分離に供し、ペレットを再懸濁し
て１０分間煮沸し、その後氷で冷却する低スピン分離
法、（３）１ＭのＮａＣｌ、１ＮのＮａＯＨおよび０．
１％ＳＤＳ中で試料を１．５分間煮沸し、０．５ＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、フェノールと
クロロホルム−イソアミルアルコールによる一連の抽出
に供し、イソプロピルアルコールで沈殿させるアルカリ
溶解抽出法、（４）試料を上述の（２）に記載の通りに
低スピン分離に供し、続いて１０分間煮沸し、フェノー
ル−クロロホルム抽出を１回行った後、冷無水エタノー
ルで沈殿させた。著者の報告によれば、これらの方法は
使用した試料のタイプによって成功が異なる。
脳脊髄液中のトレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍ
ａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）をＰＣＲで検出しようとして、
ＰＣＲ阻害化合物を除去するために異なる４つの方法を
試みた。 Grimprel et al.,J. Clin. Microbiol. 29, 1
711-1718 (1991)。簡単に記述すると、ＰＣＲ阻害化合
物を除去するための４つの方法は、（１）試験管内の試
料を沸騰している水浴中に１０分間入れ、氷で冷却し、
遠心分離する煮沸法、（２）試料に滅菌リン酸緩衝食塩
水を加え、一連の遠心分離に供し、ペレットを再懸濁し
て１０分間煮沸し、その後氷で冷却する低スピン分離
法、（３）１ＭのＮａＣｌ、１ＮのＮａＯＨおよび０．
１％ＳＤＳ中で試料を１．５分間煮沸し、０．５ＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、フェノールと
クロロホルム−イソアミルアルコールによる一連の抽出
に供し、イソプロピルアルコールで沈殿させるアルカリ
溶解抽出法、（４）試料を上述の（２）に記載の通りに
低スピン分離に供し、続いて１０分間煮沸し、フェノー
ル−クロロホルム抽出を１回行った後、冷無水エタノー
ルで沈殿させた。著者の報告によれば、これらの方法は
使用した試料のタイプによって成功が異なる。
【０００６】糞便試料では、逆転写酵素−ＰＣＲ過程を
阻害する可能性がある小粒子および可溶性物質のかなり
の量がポリエチレングリコール沈殿により除去されるこ
とが確認された。Jiang et al., J. Clin. Microbiol.
30, 2529-2534 (1992)。沈殿後、フェノール−クロロホ
ルム抽出とともに、陽イオン洗浄剤である臭化セチルト
リメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を高塩濃度で使用し
て、抽出過程を実施しした。Wilde et al., J. Clin. M
icrobiol. 28, 1300-1307 (1990)により、ＰＣＲ阻害物
質を糞便試料から除去する別の方法が報告されている。
糞便試料からロタウイルス核酸を検出するためにＰＣＲ
を使用する前に、一連の急速洗浄工程中および溶出工程
中にクロマトグラフィーセルロース繊維粉末（ＣＦ１１
粉末）を使用してロタウイルスＲＮＡを精製する工程を
付加して抽出過程を一部変更した。
阻害する可能性がある小粒子および可溶性物質のかなり
の量がポリエチレングリコール沈殿により除去されるこ
とが確認された。Jiang et al., J. Clin. Microbiol.
30, 2529-2534 (1992)。沈殿後、フェノール−クロロホ
ルム抽出とともに、陽イオン洗浄剤である臭化セチルト
リメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を高塩濃度で使用し
て、抽出過程を実施しした。Wilde et al., J. Clin. M
icrobiol. 28, 1300-1307 (1990)により、ＰＣＲ阻害物
質を糞便試料から除去する別の方法が報告されている。
糞便試料からロタウイルス核酸を検出するためにＰＣＲ
を使用する前に、一連の急速洗浄工程中および溶出工程
中にクロマトグラフィーセルロース繊維粉末（ＣＦ１１
粉末）を使用してロタウイルスＲＮＡを精製する工程を
付加して抽出過程を一部変更した。
【０００７】ＰＣＲを使用して尿中のサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）を検出する試験を実施するとき、尿素が
ＰＣＲを阻害することが確認された。 Khan et al., J.
Clin. Pathol. 44, 360-365 (1991) 。この参考文献に
は、単純透析または超遠心分離によって尿中の尿素のＰ
ＣＲ阻害作用が効果的に除去されることが報告されてい
る。Buffone et al., Clin. Chem. 37, 1945-1949 (199
1)には、ＣＭＶ核酸を検出する前にＰＣＲ阻害物質を尿
から除去する別の方法が報告されている。この過程は、
ＣＭＶからの核酸放出後に行われ、増幅用核酸の回収前
に、タンパク質および他の物質を選択的に溶出すること
ができるように、細かいガラスビーズを使用して核酸を
吸着させる。
ルス（ＣＭＶ）を検出する試験を実施するとき、尿素が
ＰＣＲを阻害することが確認された。 Khan et al., J.
Clin. Pathol. 44, 360-365 (1991) 。この参考文献に
は、単純透析または超遠心分離によって尿中の尿素のＰ
ＣＲ阻害作用が効果的に除去されることが報告されてい
る。Buffone et al., Clin. Chem. 37, 1945-1949 (199
1)には、ＣＭＶ核酸を検出する前にＰＣＲ阻害物質を尿
から除去する別の方法が報告されている。この過程は、
ＣＭＶからの核酸放出後に行われ、増幅用核酸の回収前
に、タンパク質および他の物質を選択的に溶出すること
ができるように、細かいガラスビーズを使用して核酸を
吸着させる。
【０００８】上述の参考文献から明白なように、核酸増
幅阻害に関する出版物は、そのほとんどがＰＣＲに関連
している。しかし、これらのＰＣＲを阻害する同物質、
ならびに、タンパク質物質、ＥＤＴＡ、ヒトＤＮＡおよ
び鉄などの臨床試料によくみられる他の多くの物質は、
ＳＤＡおよび他の核酸増幅過程も阻害することが確認さ
れている。
幅阻害に関する出版物は、そのほとんどがＰＣＲに関連
している。しかし、これらのＰＣＲを阻害する同物質、
ならびに、タンパク質物質、ＥＤＴＡ、ヒトＤＮＡおよ
び鉄などの臨床試料によくみられる他の多くの物質は、
ＳＤＡおよび他の核酸増幅過程も阻害することが確認さ
れている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】これらの核酸ハイブリ
ダイゼーション阻害物質を減少または除去するための方
法は、そのほとんどが、試料処理方法論を加えなければ
ならない、かなり時間のかかる複雑な工程を含む。比較
的厳しい処理工程または条件を使用し、及び／または他
の物質から標的核酸を分離することが必要な方法に伴う
別の問題は、一部の標的核酸配列が喪失することであ
る。核酸増幅過程は非常に少数のオリジナル標的から標
的配列（アンプリコン）のコピーを多数作製する能力を
有するが、より多数のオリジナル標的が試料中に存在す
れば、増幅効率および検出能力が改善される。抗酸性バ
チルス属（ａｃｉｄ ｆａｓｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａ
ＦＢ）スミア陰性結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）試料など、検出すること
が特に難しい試料を処理するとき、検出能力が高いこと
は非常に重要であろう。
ダイゼーション阻害物質を減少または除去するための方
法は、そのほとんどが、試料処理方法論を加えなければ
ならない、かなり時間のかかる複雑な工程を含む。比較
的厳しい処理工程または条件を使用し、及び／または他
の物質から標的核酸を分離することが必要な方法に伴う
別の問題は、一部の標的核酸配列が喪失することであ
る。核酸増幅過程は非常に少数のオリジナル標的から標
的配列（アンプリコン）のコピーを多数作製する能力を
有するが、より多数のオリジナル標的が試料中に存在す
れば、増幅効率および検出能力が改善される。抗酸性バ
チルス属（ａｃｉｄ ｆａｓｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａ
ＦＢ）スミア陰性結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）試料など、検出すること
が特に難しい試料を処理するとき、検出能力が高いこと
は非常に重要であろう。
【００１０】
【課題を解決するための手段】核酸ハイブリダイゼーシ
ョンを阻害する物質が試料中に存在することに関連した
問題に対処するために、したがって、標的核酸配列のよ
り効率のよい増幅および検出改良を実現するために、本
発明は、増幅すべき核酸を含有する試料中の細胞溶解前
に、細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触さ
せ、その後、細胞を試薬と分離させることによって、試
料中の阻害物質の量を減少させる方法を提供する。
ョンを阻害する物質が試料中に存在することに関連した
問題に対処するために、したがって、標的核酸配列のよ
り効率のよい増幅および検出改良を実現するために、本
発明は、増幅すべき核酸を含有する試料中の細胞溶解前
に、細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触さ
せ、その後、細胞を試薬と分離させることによって、試
料中の阻害物質の量を減少させる方法を提供する。
【００１１】本発明で使用するのに有用な試薬の例とし
ては、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、
チオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック試薬など
がある。また、細胞と試薬との分離は、一般にその試薬
が溶解できる溶液を用いた洗浄工程および遠心分離工程
によって行われる。添付の図とともに以下の詳細な説明
を読むと、本発明の様々な目的、長所および斬新な特徴
を容易に理解できるであろう。
ては、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、
チオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック試薬など
がある。また、細胞と試薬との分離は、一般にその試薬
が溶解できる溶液を用いた洗浄工程および遠心分離工程
によって行われる。添付の図とともに以下の詳細な説明
を読むと、本発明の様々な目的、長所および斬新な特徴
を容易に理解できるであろう。
【００１２】
【発明の実施の形態】上述の通り、本発明は、ハイブリ
ダイゼーション過程に供せられる核酸を含む細胞を含有
する試料から、核酸ハイブリダイゼーション過程を阻害
する物質の量を減少させる方法に関する。本方法では、
核酸を含有する細胞が試料中に残存するように、試料中
の細胞を溶解する前に、このような物質を可溶化し且つ
細胞から核酸を放出させない試薬を試料と接触させる。
次に、このような細胞を試薬とから分離させる。上述の
従来の技術の章の記載から明白なように、他者が阻害物
質を除去するために試行した方法のいくつかは複雑であ
ったため、本方法の結果は特に意外であった。また、カ
オトロピック塩類は細胞の可溶化や溶解に特に有用であ
ることが教示されている米国特許第５，４８２，８３４
号などの様々な参考文献から明白なように、本発明の方
法に使用される試薬は、一般に細胞壁溶解や可溶化によ
って細胞から核酸を放出させるのに有用であると当業者
により考えられていた。
ダイゼーション過程に供せられる核酸を含む細胞を含有
する試料から、核酸ハイブリダイゼーション過程を阻害
する物質の量を減少させる方法に関する。本方法では、
核酸を含有する細胞が試料中に残存するように、試料中
の細胞を溶解する前に、このような物質を可溶化し且つ
細胞から核酸を放出させない試薬を試料と接触させる。
次に、このような細胞を試薬とから分離させる。上述の
従来の技術の章の記載から明白なように、他者が阻害物
質を除去するために試行した方法のいくつかは複雑であ
ったため、本方法の結果は特に意外であった。また、カ
オトロピック塩類は細胞の可溶化や溶解に特に有用であ
ることが教示されている米国特許第５，４８２，８３４
号などの様々な参考文献から明白なように、本発明の方
法に使用される試薬は、一般に細胞壁溶解や可溶化によ
って細胞から核酸を放出させるのに有用であると当業者
により考えられていた。
【００１３】Hubbard et al., Experimental & Applied
Acarology 19, 473-478 (1995), Boom et al., J. Cli
n. Microbiol. 28 495-503 (1990), Reek et al., BioT
echniques 19, 282-285 (1995), Chungue et al. J. Me
d. Virol. 40, 142-145 (1993)およびShah et al., J.
Clin. Microbiol. 33, 322-328 (1995) などの参考文献
には、チオシアン酸グアニジウム（ＧｕＳＣＮ）など、
カオトロピック試薬の細胞壁溶解特性も報告されてい
る。同様に、Delacourt et al., J. Pediatrics126, 70
3-710 (1995), Lee and Choi, J. Micorobiol. & Biote
chnol. 5, 181-187 (1995), Cano et al., J. Food Pro
tection 58, 614-620 (1995), Bartolomeet al, J. Hep
atol. 17, s90-s93 (1993), Rajagopaian et al., Let
t. Applied Microbiol. 21, 14-17 (1995) およびShieh
et al. J.Virol. Methods 54, 51-66 (1995)などの参
考文献に教示されているように、ＧｕＳＣＮなどのカオ
トロピック試薬や洗浄剤は、細胞からの核酸の抽出に広
く使用されてきた。それゆえ、細胞溶解前に試料中の細
胞をこのような試薬と接触させて核酸ハイブリダイゼー
ション阻害物質を除去することを特徴とする本発明の迅
速且つ簡単な方法は、当該分野で使用されている他の方
法を考慮すると意外であった。
Acarology 19, 473-478 (1995), Boom et al., J. Cli
n. Microbiol. 28 495-503 (1990), Reek et al., BioT
echniques 19, 282-285 (1995), Chungue et al. J. Me
d. Virol. 40, 142-145 (1993)およびShah et al., J.
Clin. Microbiol. 33, 322-328 (1995) などの参考文献
には、チオシアン酸グアニジウム（ＧｕＳＣＮ）など、
カオトロピック試薬の細胞壁溶解特性も報告されてい
る。同様に、Delacourt et al., J. Pediatrics126, 70
3-710 (1995), Lee and Choi, J. Micorobiol. & Biote
chnol. 5, 181-187 (1995), Cano et al., J. Food Pro
tection 58, 614-620 (1995), Bartolomeet al, J. Hep
atol. 17, s90-s93 (1993), Rajagopaian et al., Let
t. Applied Microbiol. 21, 14-17 (1995) およびShieh
et al. J.Virol. Methods 54, 51-66 (1995)などの参
考文献に教示されているように、ＧｕＳＣＮなどのカオ
トロピック試薬や洗浄剤は、細胞からの核酸の抽出に広
く使用されてきた。それゆえ、細胞溶解前に試料中の細
胞をこのような試薬と接触させて核酸ハイブリダイゼー
ション阻害物質を除去することを特徴とする本発明の迅
速且つ簡単な方法は、当該分野で使用されている他の方
法を考慮すると意外であった。
【００１４】また、本発明の方法の長所の１つは、試料
中の細胞からの標的核酸の初期収率を上昇させることが
できることである。核酸増幅過程は非常に少数の初期標
的から標的配列の多くのコピー（アンプリコン）を作製
することができるが、できる限り多い初期標的物を用い
て増幅過程を開始することは有益である。細胞溶解に後
続する核酸ハイブリダイゼーション阻害物質配列を除去
する他の方法は、核酸を溶解物中の他の物質と分離する
ことに基づいているため、悪名が高いほど非能率的であ
る。それゆえ、多くの初期標的は回収されない。本方法
では、細胞溶解の前に阻害物質が除去され、その後の分
離を必要とせず、初期標的のよりよい収率が達成され
る。
中の細胞からの標的核酸の初期収率を上昇させることが
できることである。核酸増幅過程は非常に少数の初期標
的から標的配列の多くのコピー（アンプリコン）を作製
することができるが、できる限り多い初期標的物を用い
て増幅過程を開始することは有益である。細胞溶解に後
続する核酸ハイブリダイゼーション阻害物質配列を除去
する他の方法は、核酸を溶解物中の他の物質と分離する
ことに基づいているため、悪名が高いほど非能率的であ
る。それゆえ、多くの初期標的は回収されない。本方法
では、細胞溶解の前に阻害物質が除去され、その後の分
離を必要とせず、初期標的のよりよい収率が達成され
る。
【００１５】本発明の方法に供することが可能な試料に
は喀痰試料、血液試料、尿試料、脳脊髄液（「ＣＳ
Ｆ」）試料などの実質的にすべてのヒト臨床試料および
獣医学臨床試料、水試料、空気試料および土壌試料など
の環境試料、および食物試料などが含まれる。本発明の
方法に供することが可能な試料は、増幅過程開始のため
の直接プローブハイブリダイゼーションやプライマーハ
イブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション過
程に供せられる標的核酸配列を含む細胞の含有が疑わし
い。
は喀痰試料、血液試料、尿試料、脳脊髄液（「ＣＳ
Ｆ」）試料などの実質的にすべてのヒト臨床試料および
獣医学臨床試料、水試料、空気試料および土壌試料など
の環境試料、および食物試料などが含まれる。本発明の
方法に供することが可能な試料は、増幅過程開始のため
の直接プローブハイブリダイゼーションやプライマーハ
イブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション過
程に供せられる標的核酸配列を含む細胞の含有が疑わし
い。
【００１６】核酸ハイブリダイゼーション過程を阻害
し、且つ一般にこのような試料中でみられる物質として
は、ヒト試料中のタンパク質材料およびヒトＤＮＡや獣
医学試料中の動物ＤＮＡなどがある。上述の従来技術の
章で検討した通り、これらの物質はＳＤＡ、ＰＣＲ、Ｎ
ＡＳＢＡ、ＴＭＡなどの核酸増幅過程を阻害することが
知られている。本発明の方法の第一のステップでは、阻
害物質が溶解でき、且つ細胞から核酸を放出させない試
薬と試料を接触させる。この接触は、標的核酸を放出さ
せるための細胞溶解前の何時でも行うことが可能であ
る。しかし、細胞をこのような試薬と接触させる好まし
い時期は、試料を幾らか操作して、細胞の位置を集中さ
せたり細胞をペレット化した後である。一般に、このよ
うな集中は遠心分離の結果であるが、濾過や選択的吸着
に起因することもある。
し、且つ一般にこのような試料中でみられる物質として
は、ヒト試料中のタンパク質材料およびヒトＤＮＡや獣
医学試料中の動物ＤＮＡなどがある。上述の従来技術の
章で検討した通り、これらの物質はＳＤＡ、ＰＣＲ、Ｎ
ＡＳＢＡ、ＴＭＡなどの核酸増幅過程を阻害することが
知られている。本発明の方法の第一のステップでは、阻
害物質が溶解でき、且つ細胞から核酸を放出させない試
薬と試料を接触させる。この接触は、標的核酸を放出さ
せるための細胞溶解前の何時でも行うことが可能であ
る。しかし、細胞をこのような試薬と接触させる好まし
い時期は、試料を幾らか操作して、細胞の位置を集中さ
せたり細胞をペレット化した後である。一般に、このよ
うな集中は遠心分離の結果であるが、濾過や選択的吸着
に起因することもある。
【００１７】このように細胞を集中させると、細胞の位
置が限定されているため、試薬はより確実に細胞と接触
し、試薬をより効率よく使用することが可能になる。細
胞と試薬との接触は、好ましくは細胞の比較的短時間の
洗浄である。一般に、細胞と試薬の接触は、約５分間ま
でである。多くの試薬が本発明の方法に有用である。こ
のような有用な試薬の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒ
ｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ５８、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗ
ｅｅｎ ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグル
コシド、Ｃｈａｐｓ、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナト
リウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チ
オシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチ
オシアン酸グアニジン、トリクロロ酢酸ナトリウム、ト
リフルオロ酢酸ナトリウム、尿素など、当業者に周知の
カオトロピック試薬や洗浄剤などがある。当該分野で通
常の熟練者は、このような試薬の２つの主たる特徴、す
なわち、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の可溶化
の程度および細胞から核酸が放出されないことに向けら
れた通常行われるスクリーニングアッセイを実施するこ
とによって、本発明の方法に有用な他の試薬を確認する
ことができ、成功がかなり期待される。
置が限定されているため、試薬はより確実に細胞と接触
し、試薬をより効率よく使用することが可能になる。細
胞と試薬との接触は、好ましくは細胞の比較的短時間の
洗浄である。一般に、細胞と試薬の接触は、約５分間ま
でである。多くの試薬が本発明の方法に有用である。こ
のような有用な試薬の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒ
ｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ５８、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗ
ｅｅｎ ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグル
コシド、Ｃｈａｐｓ、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナト
リウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チ
オシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチ
オシアン酸グアニジン、トリクロロ酢酸ナトリウム、ト
リフルオロ酢酸ナトリウム、尿素など、当業者に周知の
カオトロピック試薬や洗浄剤などがある。当該分野で通
常の熟練者は、このような試薬の２つの主たる特徴、す
なわち、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の可溶化
の程度および細胞から核酸が放出されないことに向けら
れた通常行われるスクリーニングアッセイを実施するこ
とによって、本発明の方法に有用な他の試薬を確認する
ことができ、成功がかなり期待される。
【００１８】簡単に記述すると、試薬を細胞と接触さ
せ、その細胞を遠心分離し、通常行われるスクリーニン
グアッセイで細胞に共通な標的核酸配列の増幅反応を上
清に実施した。標的配列が増幅される場合、試薬は細胞
から核酸を放出させるため、この試薬は本発明の方法で
使用するための要件を満たさないが、標的配列の増幅が
みられず、内部コントロール配列が増幅すれば、この試
薬は本発明の方法に有用と考えられる。次に、細胞から
核酸を放出させない試薬を既知の核酸ハイブリダイゼー
ション阻害物質と接触させ、通常行われるスクリーニン
グアッセイで阻害物質の可溶化の程度を迅速に測定す
る。阻害物質を可溶化する試薬は、本発明の方法に有用
である。本発明の方法に使用される試薬の濃度および量
は、本方法に供する試料の種類によって異なる。本発明
の方法に使用するのに適したカオトロピック試薬および
洗浄剤の濃度の例を下表１に示す。
せ、その細胞を遠心分離し、通常行われるスクリーニン
グアッセイで細胞に共通な標的核酸配列の増幅反応を上
清に実施した。標的配列が増幅される場合、試薬は細胞
から核酸を放出させるため、この試薬は本発明の方法で
使用するための要件を満たさないが、標的配列の増幅が
みられず、内部コントロール配列が増幅すれば、この試
薬は本発明の方法に有用と考えられる。次に、細胞から
核酸を放出させない試薬を既知の核酸ハイブリダイゼー
ション阻害物質と接触させ、通常行われるスクリーニン
グアッセイで阻害物質の可溶化の程度を迅速に測定す
る。阻害物質を可溶化する試薬は、本発明の方法に有用
である。本発明の方法に使用される試薬の濃度および量
は、本方法に供する試料の種類によって異なる。本発明
の方法に使用するのに適したカオトロピック試薬および
洗浄剤の濃度の例を下表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】一般に、本発明の方法に使用される試薬の
体積は、少なくとも試料の体積と等しい。さらに詳細に
は、試薬と試料の体積：体積比は、約１：１から約５：
１である。また、一般に、試薬が塩性溶液として調製さ
れることが望ましく、個々の試薬の最も好ましいｐＨ
は、たとえば、本願明細書の実施例３に記載の実験に基
づいた通常行われるスクリーニングアッセイで測定さ
れ、ｐＨ９．０での６．０Ｍイソチオシアン酸グアニジ
ン溶液は、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の量を
減少させるのに特に有益であった。本願明細書の実施例
３に記載の実験に基づいた同じタイプの通常のスクリー
ニングアッセイを使用して、個々の試薬の最適濃度（モ
ル濃度）も決定することが可能である。また、一般に、
試料は、室温で試料と接触させる。試薬を試料の細胞と
接触させるとき、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質
は、試薬により可溶化されるため、このような細胞壁か
らの物質を洗浄する。適当な試薬は細胞から核酸を放出
させないため、試薬を細胞と分離したときの標的核酸の
喪失は問題ではない。
体積は、少なくとも試料の体積と等しい。さらに詳細に
は、試薬と試料の体積：体積比は、約１：１から約５：
１である。また、一般に、試薬が塩性溶液として調製さ
れることが望ましく、個々の試薬の最も好ましいｐＨ
は、たとえば、本願明細書の実施例３に記載の実験に基
づいた通常行われるスクリーニングアッセイで測定さ
れ、ｐＨ９．０での６．０Ｍイソチオシアン酸グアニジ
ン溶液は、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の量を
減少させるのに特に有益であった。本願明細書の実施例
３に記載の実験に基づいた同じタイプの通常のスクリー
ニングアッセイを使用して、個々の試薬の最適濃度（モ
ル濃度）も決定することが可能である。また、一般に、
試料は、室温で試料と接触させる。試薬を試料の細胞と
接触させるとき、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質
は、試薬により可溶化されるため、このような細胞壁か
らの物質を洗浄する。適当な試薬は細胞から核酸を放出
させないため、試薬を細胞と分離したときの標的核酸の
喪失は問題ではない。
【００２１】しかし、本発明の方法で使用される試薬
は、核酸ハイブリダイゼーション過程に悪影響を及ぼす
可能性があり、それゆえ、その後、このような薬剤を細
胞から分離する。このような分離は、試薬が溶解できる
緩衝液を使用して、あるいは使用せずに、濾過または洗
浄および遠心分離など、適当な手段で遂行することが可
能である。好ましくは、このような緩衝液は、阻害物質
の除去ならびに細胞溶解前の試薬の除去を確実に行うた
めに使用される。それゆえ、このような細胞を溶解する
とき、標的核酸は、標的核酸が供せられるハイブリダイ
ゼーション過程を阻害する物質の最小量を含む環境にあ
る。
は、核酸ハイブリダイゼーション過程に悪影響を及ぼす
可能性があり、それゆえ、その後、このような薬剤を細
胞から分離する。このような分離は、試薬が溶解できる
緩衝液を使用して、あるいは使用せずに、濾過または洗
浄および遠心分離など、適当な手段で遂行することが可
能である。好ましくは、このような緩衝液は、阻害物質
の除去ならびに細胞溶解前の試薬の除去を確実に行うた
めに使用される。それゆえ、このような細胞を溶解する
とき、標的核酸は、標的核酸が供せられるハイブリダイ
ゼーション過程を阻害する物質の最小量を含む環境にあ
る。
【００２２】現在、様々な方法を使用してハイブリダイ
ゼーション試料中または増幅用試料中で標的核酸が調製
される。たとえば、ミコバクテリウム核酸配列を増幅す
るために処理が行われる喀痰試料は、一般に、ＮＡＬＣ
／ＮａＯＨ過程に供せられる。本発明の方法は、ＮＡＬ
Ｃ／ＮａＯＨペレットを選択的に可溶化してこのような
試料の凝集を減少させるため、このようなＮＡＬＣ／Ｎ
ａＯＨ過程に供せられるミコバクテリウム試料を用いる
場合に特に有用である。同様に、他種の臨床試料は他の
周知の標準方法に供せられ、たとえば、血液や尿など、
多量の試料は遠心分離に供せられる。本発明の方法は、
標的核酸を含有する細胞の溶解前にこの方法が実行され
るという条件で、標準法の前、標準法の一部、または標
準法の後で使用することが可能である。
ゼーション試料中または増幅用試料中で標的核酸が調製
される。たとえば、ミコバクテリウム核酸配列を増幅す
るために処理が行われる喀痰試料は、一般に、ＮＡＬＣ
／ＮａＯＨ過程に供せられる。本発明の方法は、ＮＡＬ
Ｃ／ＮａＯＨペレットを選択的に可溶化してこのような
試料の凝集を減少させるため、このようなＮＡＬＣ／Ｎ
ａＯＨ過程に供せられるミコバクテリウム試料を用いる
場合に特に有用である。同様に、他種の臨床試料は他の
周知の標準方法に供せられ、たとえば、血液や尿など、
多量の試料は遠心分離に供せられる。本発明の方法は、
標的核酸を含有する細胞の溶解前にこの方法が実行され
るという条件で、標準法の前、標準法の一部、または標
準法の後で使用することが可能である。
【００２３】本発明の方法は、定量的結合および結合表
面からの標的核酸の放出を必要とせず、それゆえ、核酸
に基づくハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅ア
ッセイに従来使用されている量より多い試料を使用する
ことが可能である。このより多い試料を使用できること
は、アッセイの初期段階により多くの標的核酸が存在す
るため、アッセイの感度が高くなる。阻害物質を可溶化
するが、標的核酸や細胞壁を同時に可溶化しない試薬の
選択性は、以下に記載する実施例で明白なように、本発
明の方法の結果に貢献する試薬の特徴の１つである。
面からの標的核酸の放出を必要とせず、それゆえ、核酸
に基づくハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅ア
ッセイに従来使用されている量より多い試料を使用する
ことが可能である。このより多い試料を使用できること
は、アッセイの初期段階により多くの標的核酸が存在す
るため、アッセイの感度が高くなる。阻害物質を可溶化
するが、標的核酸や細胞壁を同時に可溶化しない試薬の
選択性は、以下に記載する実施例で明白なように、本発
明の方法の結果に貢献する試薬の特徴の１つである。
【００２４】
【実施例】以下の実施例は、本願明細書に記載の発明の
具体的な実施態様を例示するものである。熟練者には明
白なように、様々な変化および修正が可能であり、それ
らも本発明の範囲内と考えられる。
具体的な実施態様を例示するものである。熟練者には明
白なように、様々な変化および修正が可能であり、それ
らも本発明の範囲内と考えられる。
【００２５】実施例１ 対照試料処理方法と本発明の方法との比較 この実施例の目的は、本発明の方法が臨床試料から核酸
増幅阻害の量を減少させるかどうか、したがって対照標
準試料処理方法と比較して、よりよい標的検出値を生じ
るかどうかを決定することである。
増幅阻害の量を減少させるかどうか、したがって対照標
準試料処理方法と比較して、よりよい標的検出値を生じ
るかどうかを決定することである。
【００２６】材料 試料処理試薬 ・過塩素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ） ・チオシアン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ） ・チオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ） ・Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｏｓｍｏｓｉｓ ＤＩｓｔｉｌｌｅ
ｄ（「ＲＯＤＩ」）Ｈ2Ｏ ・ＭｙｃｏＰｒｅｐ（ＢＢＬ） ・ＭＡＣ／ＴＢ試料希釈剤 ・リン酸緩衝液（ＢＢＬ） ・ジルコニウムビーズ含有カプセル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ） ・臨床喀痰試料、試料番号７８５、６５７、６３４、８
５４９、８８９４、１３８８３、８３９６、１３８６
７、１４６ ・Ｍ．ａｖｉｕｍ複合体（「ＭＡＣ」）ミコバクテリウ
ム細胞
ｄ（「ＲＯＤＩ」）Ｈ2Ｏ ・ＭｙｃｏＰｒｅｐ（ＢＢＬ） ・ＭＡＣ／ＴＢ試料希釈剤 ・リン酸緩衝液（ＢＢＬ） ・ジルコニウムビーズ含有カプセル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ） ・臨床喀痰試料、試料番号７８５、６５７、６３４、８
５４９、８８９４、１３８８３、８３９６、１３８６
７、１４６ ・Ｍ．ａｖｉｕｍ複合体（「ＭＡＣ」）ミコバクテリウ
ム細胞
【００２７】増幅試薬 ・ＲＯＤＩＨ2 Ｏ ・５００ｍＭのＫＰＯ4 ・５０×ＰＢＡ ・５０×ｄＣＡＧ ・５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ ・１００ｍＭのＤＴＴ ・５０％トレハロース ・１Ｕ／μｌのＵＤＧ ・１９２ｍＭのマグネシウム ・５０×ｄＵ ・５Ｕ／μｌのＵＤＩ ・Ｂｓｔ、１２０Ｕ／μｌ ・Ｂｓｏ ＢＩ、１６０Ｕ／μｌ ・内部増幅対照（「ＩＡＣ」） １０3 ・５５％グリセロール ・ＤＭＳＯ ・ヒト胎盤ＤＮＡ ・消泡剤 ・標的希釈剤
【００２８】検出試薬 ・Ｍ．ｔｂ．ハイブリダイゼーション混合物 ・ＭＡＣプローブ ・ハイブリダイゼーション希釈剤 ・ＩＡＣハイブリダイゼーション混合物 ・システム液 ・洗浄液 ・検定装置（「ＡＤ」） ・ＬＵＭＩＰＨＯＳ ５３０ ・２．０ｍｌのＬａｂｃｒａｆｔTM試験管 ・ＭＡＣアッセイキャリブレーター ・アッセイキャリブレーター
【００２９】手順：蒸留水中、２ＭのＮａＣｌＯ4 を調
製した。蒸留水中、３ＭのＮａＳＣＮを調製した。蒸留
水中、４ＭのＧｕＳＣＮを調製した。この３種のカオト
ロピック試薬溶液を２．０ｍＬ ＬａｂＣｒａｆｔR 試
験管１０本に１．０ｍｌ／試験管で分注した。ＭＡＣ／
ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌのアリコートを２．０ｍＬの
ＬａｂＣｒａｆｔR 試験管に分注した。臨床喀痰試料１
０本を室温で解凍した。喀痰試料体積と等量のＭｙｃｏ
Ｐｒｅｐ緩衝液を加え、試料を攪拌し、室温で１５分間
維持した。各試料にリン酸緩衝液を加えて、各試料の総
量を５０ｍｌに調整した。試料を攪拌し、３，０００相
対遠心力（ＲＦＣ）で２０分間遠心分離した。上清を傾
瀉し、リン酸緩衝液２．０ｍｌを各試料に加えて攪拌し
た。このようにして得られた試料に、７５粒子／ｍｌの
ＭＡＣ細胞をスパイクした。各試料の５００μｌのアリ
コートを、記載の４種の洗浄緩衝液（上述の試料緩衝
液、２ＭのＮａＣｌＯ4 、３ＭのＮａＳＣＮ、および４
ＭのＧｕＳＣＮ、１．０ｍｌ）すべてに分注した。試料
を攪拌し、１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌ
でペレットを再懸濁した後、１２，２００ＲＣＦで３．
０分間遠心分離した。再び上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ
試料緩衝液１．０ｍｌでペレットを再懸濁した後、１
２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。
製した。蒸留水中、３ＭのＮａＳＣＮを調製した。蒸留
水中、４ＭのＧｕＳＣＮを調製した。この３種のカオト
ロピック試薬溶液を２．０ｍＬ ＬａｂＣｒａｆｔR 試
験管１０本に１．０ｍｌ／試験管で分注した。ＭＡＣ／
ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌのアリコートを２．０ｍＬの
ＬａｂＣｒａｆｔR 試験管に分注した。臨床喀痰試料１
０本を室温で解凍した。喀痰試料体積と等量のＭｙｃｏ
Ｐｒｅｐ緩衝液を加え、試料を攪拌し、室温で１５分間
維持した。各試料にリン酸緩衝液を加えて、各試料の総
量を５０ｍｌに調整した。試料を攪拌し、３，０００相
対遠心力（ＲＦＣ）で２０分間遠心分離した。上清を傾
瀉し、リン酸緩衝液２．０ｍｌを各試料に加えて攪拌し
た。このようにして得られた試料に、７５粒子／ｍｌの
ＭＡＣ細胞をスパイクした。各試料の５００μｌのアリ
コートを、記載の４種の洗浄緩衝液（上述の試料緩衝
液、２ＭのＮａＣｌＯ4 、３ＭのＮａＳＣＮ、および４
ＭのＧｕＳＣＮ、１．０ｍｌ）すべてに分注した。試料
を攪拌し、１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌ
でペレットを再懸濁した後、１２，２００ＲＣＦで３．
０分間遠心分離した。再び上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ
試料緩衝液１．０ｍｌでペレットを再懸濁した後、１
２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。
【００３０】ジルコニウムビーズ含有カプセルを各試験
管に挿入し、各ペレットをＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液４０
０μｌで再懸濁した。試料を強制熱空気炉内、１０５℃
で３０分間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あ
らゆるミコバクテリウム生物体を非感染性にさせた。
５．０ｍ／ｓ、４５秒間に設定したＳａｖａｎｔ Ｃｅ
ｌｌＰｒｅｐTM装置に試料試験管を充填して実行し、核
酸を他の細胞成分から分離させた。以下の通り、ＭＡＣ
／ＴＢ増幅および検出システムで試料をさらに処理し
た。公開された欧州特許出願第０６８４３１５号に記載
の通りに、２５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、
１００μｇ／ｍＬのアセチル化ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、０．５ｍＭのｄＵＴＰ、各々０．２ｍＭのｄＡ
ＴＰおよびｄＧＴＰ、および１．４ｍＭの２’デオキシ
シチジン５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）（α
−チオｄＣＴＰ）、１２％グリセロール、６．５ｍＭの
酢酸マグネシウム、０．５μＭの増幅プライマー、０．
０５μＭのバンパープライマー、５０ｎｇのヒト胎盤Ｄ
ＮＡ、１２．５単位のＢｓｔポリメラーゼ、６０単位の
ＢｓｏＢＩ１、１単位ウラシル−Ｎ−グリコシレート
（ＵＮＧ）および２単位のウラシル−Ｎ−グリコシレー
トインヒビター（Ｕｇｉ）を含む反応混合物で好熱性Ｓ
ＤＡを実施した。
管に挿入し、各ペレットをＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液４０
０μｌで再懸濁した。試料を強制熱空気炉内、１０５℃
で３０分間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あ
らゆるミコバクテリウム生物体を非感染性にさせた。
５．０ｍ／ｓ、４５秒間に設定したＳａｖａｎｔ Ｃｅ
ｌｌＰｒｅｐTM装置に試料試験管を充填して実行し、核
酸を他の細胞成分から分離させた。以下の通り、ＭＡＣ
／ＴＢ増幅および検出システムで試料をさらに処理し
た。公開された欧州特許出願第０６８４３１５号に記載
の通りに、２５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、
１００μｇ／ｍＬのアセチル化ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、０．５ｍＭのｄＵＴＰ、各々０．２ｍＭのｄＡ
ＴＰおよびｄＧＴＰ、および１．４ｍＭの２’デオキシ
シチジン５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）（α
−チオｄＣＴＰ）、１２％グリセロール、６．５ｍＭの
酢酸マグネシウム、０．５μＭの増幅プライマー、０．
０５μＭのバンパープライマー、５０ｎｇのヒト胎盤Ｄ
ＮＡ、１２．５単位のＢｓｔポリメラーゼ、６０単位の
ＢｓｏＢＩ１、１単位ウラシル−Ｎ−グリコシレート
（ＵＮＧ）および２単位のウラシル−Ｎ−グリコシレー
トインヒビター（Ｕｇｉ）を含む反応混合物で好熱性Ｓ
ＤＡを実施した。
【００３１】酵素を加えて増幅反応を開始する前に、試
料を２分間沸騰させた。次に試料を４１℃で２分間イン
キュベートし、ＵＮＧを加えてあらゆる含有アンプリコ
ンを分解した。ＵＮＧとともに３０分間インキュベート
した後、試料を５２℃に５分間移した。酵素混合物（Ｂ
ｓｔポリメラーゼ、ＢｓｏＢＩ、Ｕｇｉおよびグリセロ
ール）を加え、増幅を５２℃で３０分間続行させた。５
分間沸騰させて反応を停止させた。C.A. Spargo ら（19
93. Molec. Cell. Probes 7, 395-404）により記載され
ている通りに、化学ルミネッセントアッセイで増幅産物
を検出した。Ｍ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣ用アルカ
リホスファターゼ標識検出プローブ、Ｍ．ｔｂ．、ＭＡ
ＣおよびＩＡＣ用ビオチニル化捕捉プローブおよび試料
を、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープ
レートのウェルに加え、３７℃で５０分間インキュベー
トした。ウェルを厳密度の高い緩衝液で３回洗浄した。
ＬＵＭＩＰＨＯＳ（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を加
え、反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。照
度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）でルミネセンスを検出し、相
対光単位（ＲＬＵ）を記録した。
料を２分間沸騰させた。次に試料を４１℃で２分間イン
キュベートし、ＵＮＧを加えてあらゆる含有アンプリコ
ンを分解した。ＵＮＧとともに３０分間インキュベート
した後、試料を５２℃に５分間移した。酵素混合物（Ｂ
ｓｔポリメラーゼ、ＢｓｏＢＩ、Ｕｇｉおよびグリセロ
ール）を加え、増幅を５２℃で３０分間続行させた。５
分間沸騰させて反応を停止させた。C.A. Spargo ら（19
93. Molec. Cell. Probes 7, 395-404）により記載され
ている通りに、化学ルミネッセントアッセイで増幅産物
を検出した。Ｍ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣ用アルカ
リホスファターゼ標識検出プローブ、Ｍ．ｔｂ．、ＭＡ
ＣおよびＩＡＣ用ビオチニル化捕捉プローブおよび試料
を、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープ
レートのウェルに加え、３７℃で５０分間インキュベー
トした。ウェルを厳密度の高い緩衝液で３回洗浄した。
ＬＵＭＩＰＨＯＳ（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を加
え、反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。照
度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）でルミネセンスを検出し、相
対光単位（ＲＬＵ）を記録した。
【００３２】結果 結果を試料１０検体のＭ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣ
の平均値として下表に示し、あわせて図１にグラフとし
て示す。
の平均値として下表に示し、あわせて図１にグラフとし
て示す。
【００３３】
【表２】 ＊両洗浄方法は、陽性のＭ．ｔｂ．値と同じ試料であ
り、臨床現場での診断間違いの可能性を示す。
り、臨床現場での診断間違いの可能性を示す。
【００３４】結論 実施例のデータから、統計学的に、洗浄条件のいずれで
もＩＡＣ値に差がないことがわかるが、すべての試薬条
件で平均値が対照洗浄手順より高値であることは興味深
い。統計学的に、４ＭのＧｕＳＣＮ条件では、他の３条
件よりも高い特異的なＭＡＣ ＲＬＵ値を示すことがデ
ータからわかる。このことから、本明細書で実行される
本発明の方法は、ミクロバクテリウムを損傷せず、それ
どころか、４ＭのＧｕＳＣＮの場合には、ＭＡＣ生物体
の回復、ひいては標的ＤＮＡの回復を改善することがわ
かる。
もＩＡＣ値に差がないことがわかるが、すべての試薬条
件で平均値が対照洗浄手順より高値であることは興味深
い。統計学的に、４ＭのＧｕＳＣＮ条件では、他の３条
件よりも高い特異的なＭＡＣ ＲＬＵ値を示すことがデ
ータからわかる。このことから、本明細書で実行される
本発明の方法は、ミクロバクテリウムを損傷せず、それ
どころか、４ＭのＧｕＳＣＮの場合には、ＭＡＣ生物体
の回復、ひいては標的ＤＮＡの回復を改善することがわ
かる。
【００３５】実施例２ 核酸増幅阻害用臨床試料のスクリーニング この実施例の目的は、核酸増幅阻害用臨床試料をスクリ
ーンングすることであった。材料 試料処理試薬 ・ＭｙｃｏＰｒｅｐ試薬 ・ＢＢＬリン酸緩衝液（ｐＨ６．８） ・ＴＢ／ＭＡＣ試料希釈剤 ・Ｎ．Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ
のスミア陰性、培養陰性喀痰、試料番号８２０７、１５
１４、１３４７２、１４１９９、１３８４７、３６７
５、６４０１、４６９１、１３５４５、１３７１１、９
９３９、１２２２７、１２２２８、１２１６１、８４０
６、７８２、１３５４７、１３４４８、１３５０６、１
３３１９、１３４２０、２４３、１０３ ・ジルコニウムビーズ含有カプセル
ーンングすることであった。材料 試料処理試薬 ・ＭｙｃｏＰｒｅｐ試薬 ・ＢＢＬリン酸緩衝液（ｐＨ６．８） ・ＴＢ／ＭＡＣ試料希釈剤 ・Ｎ．Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ
のスミア陰性、培養陰性喀痰、試料番号８２０７、１５
１４、１３４７２、１４１９９、１３８４７、３６７
５、６４０１、４６９１、１３５４５、１３７１１、９
９３９、１２２２７、１２２２８、１２１６１、８４０
６、７８２、１３５４７、１３４４８、１３５０６、１
３３１９、１３４２０、２４３、１０３ ・ジルコニウムビーズ含有カプセル
【００３６】増幅試薬 実施例１と同じもの、およびＩＮ２プラスミド対照アッセイ試薬 実施例１と同じ
【００３７】手順：臨床喀痰試料２３検体を室温で解凍
した。処理した喀痰試料はどれも、体積が７．５〜１２
ｍｌの範囲になるように、１２ｍｌ以上の喀痰を分離管
に分配した。喀痰試料体積と等量のＭｙｃｏＰｒｅｐ試
薬を喀痰試料に加えた。試料を攪拌し、室温に１５分間
維持した。各喀痰溶液の体積をリン酸緩衝液で５０ｍｌ
に調節した。この溶液を３，０００ＲＣＦで２０分間遠
心分離した。各試料ペレットから上清を傾瀉し、リン酸
緩衝液２．０ｍｌを各試験管に加えた。試料を２．０ｍ
ｌＬａｂＣｒａｆｔR 試験管に５００μｌずつ等分し
た。各タイプの試料１本を室温で維持し、残りの試料を
−７０℃で保存した。
した。処理した喀痰試料はどれも、体積が７．５〜１２
ｍｌの範囲になるように、１２ｍｌ以上の喀痰を分離管
に分配した。喀痰試料体積と等量のＭｙｃｏＰｒｅｐ試
薬を喀痰試料に加えた。試料を攪拌し、室温に１５分間
維持した。各喀痰溶液の体積をリン酸緩衝液で５０ｍｌ
に調節した。この溶液を３，０００ＲＣＦで２０分間遠
心分離した。各試料ペレットから上清を傾瀉し、リン酸
緩衝液２．０ｍｌを各試験管に加えた。試料を２．０ｍ
ｌＬａｂＣｒａｆｔR 試験管に５００μｌずつ等分し
た。各タイプの試料１本を室温で維持し、残りの試料を
−７０℃で保存した。
【００３８】ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１ｍｌを、室温で
維持した各試料に加えた。試料を１２，２００ＲＣＦで
３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ
試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に加え、その試験管を
１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を
傾瀉し、ジルコニウムビーズ含有カプセルを各試験管に
加え、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液４００μｌを各試験管に
分注した。試験管を強制熱空気炉内、１０５℃で３０分
間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あらゆるミ
コバクテリウム生物体を非感染性にさせた。５．０ｍ／
ｓ、４５秒間の設定を使用して、Ｓａｖａｎｔ Ｃｅｌ
ｌＰｒｅｐTM装置で試験管を揺り動かした。液体ＭＡＣ
／ＴＢトリプレックスアッセイおよび実施例１に記載の
検出手順を使用した好熱性鎖置換（ｔＳＤＡ）を使用し
て、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。結果 ：結果を下表に示す。
維持した各試料に加えた。試料を１２，２００ＲＣＦで
３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ
試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に加え、その試験管を
１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を
傾瀉し、ジルコニウムビーズ含有カプセルを各試験管に
加え、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液４００μｌを各試験管に
分注した。試験管を強制熱空気炉内、１０５℃で３０分
間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あらゆるミ
コバクテリウム生物体を非感染性にさせた。５．０ｍ／
ｓ、４５秒間の設定を使用して、Ｓａｖａｎｔ Ｃｅｌ
ｌＰｒｅｐTM装置で試験管を揺り動かした。液体ＭＡＣ
／ＴＢトリプレックスアッセイおよび実施例１に記載の
検出手順を使用した好熱性鎖置換（ｔＳＤＡ）を使用し
て、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。結果 ：結果を下表に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】結論 ＭＡＣ／ＴＢシステムでアッセイした臨床試料２３検体
のうち、９検体は、ＩＡＣ値が１０ＲＬＵ未満であり、
臨床試料による増幅／検出反応の重大な阻害を示した。
「標準」試料洗浄条件下で生じたこれらの阻害標本を、
以下の実施例に示す通り、さらに処理した。
のうち、９検体は、ＩＡＣ値が１０ＲＬＵ未満であり、
臨床試料による増幅／検出反応の重大な阻害を示した。
「標準」試料洗浄条件下で生じたこれらの阻害標本を、
以下の実施例に示す通り、さらに処理した。
【００４１】実施例３ カオトロピック試薬溶液のｐＨおよびモル濃度調節 この実施例の目的は、より多くの阻害物質を臨床サンプ
ルから除去できるように、ＧｕＳＣＮ洗浄液のｐＨおよ
びモル濃度を調節することができるかどうかを決定する
ことであった。材料 試料処理試薬 ・実施例２の陰性ＮＡＬＣペレット試料番号６４０１、
８４０６、７８２、１３４４８、１３５０６ ・イソチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ ・ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液 ・ジルコニウムビーズ含有カプセル ・５００ｍＭのリン酸カリウム（ＫＰＯ4 ） ・５ＮのＮａＯＨ Ｒｉｃｃａ ・Ｍ．ｔｂ．ミコバクテリウム細胞増幅試薬 実施例１と同じ。アッセイ試薬 実施例１と同じ。手順 試料７８２を１．０ｍｌ、試料６４０１、８４０６、１
３４４８および１３５０６を５００μｌずつ、２ｍｌの
ポリプロピレン製試験管に分注することにより陰性のＮ
ＡＬＣ阻害プールを作製した。２００粒子／ｍｌでＭ．
ｔｂ．生物体を阻害プールにスパイクした（７．５粒子
／最終ｔＳＤＡ反応）。作製したＧｕＳＣＮ溶液を下表
に示す。ｐＨ７．０およびｐＨ９．０の溶液は、５Ｎの
ＮａＯＨで指示されたｐＨに調製した。
ルから除去できるように、ＧｕＳＣＮ洗浄液のｐＨおよ
びモル濃度を調節することができるかどうかを決定する
ことであった。材料 試料処理試薬 ・実施例２の陰性ＮＡＬＣペレット試料番号６４０１、
８４０６、７８２、１３４４８、１３５０６ ・イソチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ ・ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液 ・ジルコニウムビーズ含有カプセル ・５００ｍＭのリン酸カリウム（ＫＰＯ4 ） ・５ＮのＮａＯＨ Ｒｉｃｃａ ・Ｍ．ｔｂ．ミコバクテリウム細胞増幅試薬 実施例１と同じ。アッセイ試薬 実施例１と同じ。手順 試料７８２を１．０ｍｌ、試料６４０１、８４０６、１
３４４８および１３５０６を５００μｌずつ、２ｍｌの
ポリプロピレン製試験管に分注することにより陰性のＮ
ＡＬＣ阻害プールを作製した。２００粒子／ｍｌでＭ．
ｔｂ．生物体を阻害プールにスパイクした（７．５粒子
／最終ｔＳＤＡ反応）。作製したＧｕＳＣＮ溶液を下表
に示す。ｐＨ７．０およびｐＨ９．０の溶液は、５Ｎの
ＮａＯＨで指示されたｐＨに調製した。
【００４２】
【表４】
【００４３】各ＧｕＳＣＮ溶液を１．０ｍｌ／試験管で
２．０ｍｌのＬａｂＣｒａｆｔR 試験管１本に分注し
た。スパイクした陰性ＮＡＬＣ阻害プールを、ＧｕＳＣ
Ｎが入っている各試験管に５００μｌ／試験管で分注し
た。試験管を短時間攪拌し、この試験管を１２，２００
ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡ
Ｃ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注し、こ
の試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌ
を各試験管に分注した。この試験管を１２，２００ＲＣ
Ｆで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニ
ウムビーズ含有カプセルを各試験管に挿入した。ＭＡＣ
／ＴＢ試料緩衝液を４００μｌ／試験管で各試験管に傾
瀉した。試験管を強制熱空気炉内、１０５℃で３０分間
加熱した。５．０ｍ／ｓ、４５秒間の設定を使用して、
Ｓａｖａｎｔ ＣｅｌｌＰｒｅｐTM装置で試験管を揺り
動かした。液体ＭＡＣ／ＴＢトリプレックスアッセイお
よび実施例１に記載の検出手順を使用したｔＳＤＡを使
用して、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。
２．０ｍｌのＬａｂＣｒａｆｔR 試験管１本に分注し
た。スパイクした陰性ＮＡＬＣ阻害プールを、ＧｕＳＣ
Ｎが入っている各試験管に５００μｌ／試験管で分注し
た。試験管を短時間攪拌し、この試験管を１２，２００
ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ＭＡ
Ｃ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注し、こ
の試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌ
を各試験管に分注した。この試験管を１２，２００ＲＣ
Ｆで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニ
ウムビーズ含有カプセルを各試験管に挿入した。ＭＡＣ
／ＴＢ試料緩衝液を４００μｌ／試験管で各試験管に傾
瀉した。試験管を強制熱空気炉内、１０５℃で３０分間
加熱した。５．０ｍ／ｓ、４５秒間の設定を使用して、
Ｓａｖａｎｔ ＣｅｌｌＰｒｅｐTM装置で試験管を揺り
動かした。液体ＭＡＣ／ＴＢトリプレックスアッセイお
よび実施例１に記載の検出手順を使用したｔＳＤＡを使
用して、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。
【００４４】結果：結果を下表に示し、あわせて図２に
グラフとしてで示す。
グラフとしてで示す。
【００４５】
【表５】 注：Ｍ．ｔｂ．、ＭＡＣおよびＩＡＣ値は、５回反復し
た増幅／検出試料の平均値である。
た増幅／検出試料の平均値である。
【００４６】結論：６．０Ｍ、ｐＨ９．０のＧｕＳＣＮ
条件で、非特異的ＭＡＣ値を生じることなく、他の条件
よりも統計学的にすぐれたＭ．ｔｂ．ＲＬＵ値およびＩ
ＡＣ ＲＬＵ値が得られた。これは、６．０Ｍ、ｐＨ
９．０のＧｕＳＣＮ溶液を使用すると、ミコバクテリウ
ムから標的核酸が放出されずに、より多量の核酸ハイブ
リダイゼーション阻害物質が除去されることを示すもの
である。
条件で、非特異的ＭＡＣ値を生じることなく、他の条件
よりも統計学的にすぐれたＭ．ｔｂ．ＲＬＵ値およびＩ
ＡＣ ＲＬＵ値が得られた。これは、６．０Ｍ、ｐＨ
９．０のＧｕＳＣＮ溶液を使用すると、ミコバクテリウ
ムから標的核酸が放出されずに、より多量の核酸ハイブ
リダイゼーション阻害物質が除去されることを示すもの
である。
【００４７】実施例４ Ｍ．ｔｂ．スパイクした陰性臨床試料を使用したＧｕＳ
ＣＮ（６Ｍ、ｐＨ９．０）洗浄 この実施例の目的は、Ｍ．ｔｂ．をスパイクして、６Ｍ
のＧｕＳＣＮ（ｐＨ９．０）溶液で洗浄した臨床試料
は、望ましくない核酸ハイブリダイゼーション阻害物質
を除去し、特異的Ｍ．ｔｂ．ＤＮＡ標的の増幅および検
出が可能かどうかを決定することであった。材料 試料処理試薬 ・陰性ＮＡＬＣペレット試料番号８２０７、１５１４、
１３４７２、１４１９９、１３８４７、３６７５、６４
０１、４６９１、１３５４５、１３７１１、９９３９、
１２２２７、１２２２８、１２１６１、８４０６、７８
２、１３５４７、１３４４８、１３５０６、１３３１
９、１３４２０、２４３、１０３ ・イソチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ ・ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液 ・ジルコニウムビーズ含有カプセル ・５００ｍＭのリン酸カリウム（ＫＰＯ4 ） ・５ＮのＮａＯＨ Ｒｉｃｃａ
ＣＮ（６Ｍ、ｐＨ９．０）洗浄 この実施例の目的は、Ｍ．ｔｂ．をスパイクして、６Ｍ
のＧｕＳＣＮ（ｐＨ９．０）溶液で洗浄した臨床試料
は、望ましくない核酸ハイブリダイゼーション阻害物質
を除去し、特異的Ｍ．ｔｂ．ＤＮＡ標的の増幅および検
出が可能かどうかを決定することであった。材料 試料処理試薬 ・陰性ＮＡＬＣペレット試料番号８２０７、１５１４、
１３４７２、１４１９９、１３８４７、３６７５、６４
０１、４６９１、１３５４５、１３７１１、９９３９、
１２２２７、１２２２８、１２１６１、８４０６、７８
２、１３５４７、１３４４８、１３５０６、１３３１
９、１３４２０、２４３、１０３ ・イソチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ ・ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液 ・ジルコニウムビーズ含有カプセル ・５００ｍＭのリン酸カリウム（ＫＰＯ4 ） ・５ＮのＮａＯＨ Ｒｉｃｃａ
【００４８】増幅試薬 実施例１と同じ。アッセイ試薬 実施例１と同じ。
【００４９】手順：２００ｍＭのＫＰＯ4 で６ＭのＧｕ
ＳＣＮ溶液を調製し、実施例３と同様に、５ＮのＮａＯ
ＨでｐＨ９．０に調整した。実施例２の材料のセクショ
ンの各臨床試料５００μｌに、Ｍ．ｔｂ．生物体を２０
０粒子／ｍｌ（７．５粒子／増幅反応）でスパイクし
た。これらの実施例２の試料の一部は核酸ハイブリダイ
ゼーションを阻害した。ＭＡＣ／ＴＢ緩衝液５００μｌ
に、Ｍ．ｔｂ．を２００粒子／ｍｌでスパイクし、これ
を標識「試料処理対照」とした。ＧｕＳＣＮ溶液１．０
ｍｌを２．０ｍｌのＬａｂＣｒａｆｔR 試験管１本に分
注し、この試験管を標識「ＧｕＳＣＮ陰性対照」とし
た。６Ｍ、ｐＨ９．０のＧｕＳＣＮ溶液１ｍｌを各臨床
試料試験管に分注した。この試験管を攪拌し、１２，２
００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、
ＭＡＣ／ＴＢ緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注し、こ
の試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌ
を各試験管に分注し、この試験管を１２，２００ＲＣＦ
で３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニウ
ムカプセルを各試験管に加えた。ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝
液を各試験管に４００μｌ／試験管で加えた。上述の実
施例に記載の通りに、この試験管を加熱し、揺り動かし
た。液体ＭＡＣ／ＴＢトリプレックスアッセイおよび実
施例１に記載の検出手順を使用したｔＳＤＡを使用し
て、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。
ＳＣＮ溶液を調製し、実施例３と同様に、５ＮのＮａＯ
ＨでｐＨ９．０に調整した。実施例２の材料のセクショ
ンの各臨床試料５００μｌに、Ｍ．ｔｂ．生物体を２０
０粒子／ｍｌ（７．５粒子／増幅反応）でスパイクし
た。これらの実施例２の試料の一部は核酸ハイブリダイ
ゼーションを阻害した。ＭＡＣ／ＴＢ緩衝液５００μｌ
に、Ｍ．ｔｂ．を２００粒子／ｍｌでスパイクし、これ
を標識「試料処理対照」とした。ＧｕＳＣＮ溶液１．０
ｍｌを２．０ｍｌのＬａｂＣｒａｆｔR 試験管１本に分
注し、この試験管を標識「ＧｕＳＣＮ陰性対照」とし
た。６Ｍ、ｐＨ９．０のＧｕＳＣＮ溶液１ｍｌを各臨床
試料試験管に分注した。この試験管を攪拌し、１２，２
００ＲＣＦで３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、
ＭＡＣ／ＴＢ緩衝液１．０ｍｌを各試験管に分注し、こ
の試験管を１２，２００ＲＣＦで３．０分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝液１．０ｍｌ
を各試験管に分注し、この試験管を１２，２００ＲＣＦ
で３．０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニウ
ムカプセルを各試験管に加えた。ＭＡＣ／ＴＢ試料緩衝
液を各試験管に４００μｌ／試験管で加えた。上述の実
施例に記載の通りに、この試験管を加熱し、揺り動かし
た。液体ＭＡＣ／ＴＢトリプレックスアッセイおよび実
施例１に記載の検出手順を使用したｔＳＤＡを使用し
て、相対光単位（ＲＬＵ）で実験結果を得た。
【００５０】結果：結果を、各処理試料の３回の増幅繰
り返しの平均値として下表に示し、あわせて図３にグラ
フとして示す。
り返しの平均値として下表に示し、あわせて図３にグラ
フとして示す。
【００５１】
【表６】
【００５２】結論 ２３のＩＡＣ値は、１０ＲＬＵより大きい許容できるｔ
ＳＤＡ値を示し、増幅反応は阻害されなかったことがわ
かる。さらに、各試料の８８．２：１未満というバック
グラウンド特異的ＲＬＵ比から明白なように、スパイク
されたあらゆる試料で７．５粒子／増幅反応のＭ．ｔ
ｂ．が検出された。実施例２では、ＧｕＳＣＮ洗浄液を
使用しない臨床試料のうち５検体は、１０ＲＬＵ未満の
阻害的ＩＡＣ値を示した。実施例で実行される本発明の
方法で、ほぼすべての試料での改善（実施例２で低シグ
ナル発生により阻害的であることが証明される試料も）
が達成された。本発明は、ある程度特異的に記述されて
いるが、本発明の範囲から逸脱することなく当該技術で
通常の熟練者に明白な修正を行うことが可能である。本
発明の様々な特徴を請求の範囲に記述されている。
ＳＤＡ値を示し、増幅反応は阻害されなかったことがわ
かる。さらに、各試料の８８．２：１未満というバック
グラウンド特異的ＲＬＵ比から明白なように、スパイク
されたあらゆる試料で７．５粒子／増幅反応のＭ．ｔ
ｂ．が検出された。実施例２では、ＧｕＳＣＮ洗浄液を
使用しない臨床試料のうち５検体は、１０ＲＬＵ未満の
阻害的ＩＡＣ値を示した。実施例で実行される本発明の
方法で、ほぼすべての試料での改善（実施例２で低シグ
ナル発生により阻害的であることが証明される試料も）
が達成された。本発明は、ある程度特異的に記述されて
いるが、本発明の範囲から逸脱することなく当該技術で
通常の熟練者に明白な修正を行うことが可能である。本
発明の様々な特徴を請求の範囲に記述されている。
【図１】対照標準試料方法と比較して、本発明の方法が
臨床試料から核酸増幅阻害の量を減少させるかどうかを
決定するために実施した実験結果を示すグラフ図であ
る。
臨床試料から核酸増幅阻害の量を減少させるかどうかを
決定するために実施した実験結果を示すグラフ図であ
る。
【図２】本発明の方法に使用される個々の試薬の最適ｐ
Ｈおよびの濃度値を決定するために実施した実験結果を
示すグラフ図である。
Ｈおよびの濃度値を決定するために実施した実験結果を
示すグラフ図である。
【図３】臨床試料から核酸ハイブリダイゼーション阻害
物質の量を減少させる上で、本発明の方法の有効性を表
す実験の結果を示すグラフ図である。
物質の量を減少させる上で、本発明の方法の有効性を表
す実験の結果を示すグラフ図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル・シー・リトル アメリカ合衆国メリーランド州21234，ボ ルチモア，ロックウェル・コート ３ (72)発明者 オスカー・ジェイ・ロリン アメリカ合衆国メリーランド州21228，ケ イトンズヴィル，グレンモア・アヴェニュ ー 228
Claims (10)
- 【請求項１】 細胞を含有する試料から、核酸ハイブリ
ダイゼーション過程を阻害する物質の量を減少させる方
法であって、 （ａ）細胞を溶解させる前に、（ｉ）該物質を可溶化
し、且つ（ii）該細胞から核酸を放出させない試薬に該
細胞を接触させる工程と、 （ｂ）該試薬から該細胞を分離する工程とを含んでなる
方法。 - 【請求項２】 試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ ３
５、Ｂｒｉｊ ５８、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ
８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、
Ｃｈａｐｓ、ＮａＩ、ＮａＣｌＯ4 、ＫＩ、ＮａＳＣ
Ｎ、ＫＳＣＮ、イソチオシアン酸グアニジン、トリクロ
ロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウムおよび
尿素から成る群から選択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記試薬が、カオトロピック試薬である
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 カオトロピック試薬が、イソチオシアン
酸グアニジンである請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 塩基性ｐＨの溶液中にイソチオシアン酸
グアニジンが存在する請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 ｐＨが、約９．０である請求項５に記載
の方法。 - 【請求項７】 イソチオシアン酸グアニジンの濃度は約
６Ｍである請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 分離が、洗浄および遠心分離による請求
項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記試薬が、洗浄剤である請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１０】 工程（ａ）の前に、細胞がペレット化
される請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/774,476 US5763185A (en) | 1996-12-30 | 1996-12-30 | Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization |
| US08/774,476 | 1996-12-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191978A true JPH10191978A (ja) | 1998-07-28 |
| JP4271273B2 JP4271273B2 (ja) | 2009-06-03 |
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