JPH10191978A - 核酸ハイブリダイゼーションの阻害物質を減少させる方法 - Google Patents
核酸ハイブリダイゼーションの阻害物質を減少させる方法Info
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Abstract
ョンを阻害する物質の量を減少させる方法に関する。 【解決手段】 この方法は、目的とする細胞から標的核
酸を放出する前に実行され、阻害物質を可溶化し、且つ
試料中の細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触
させるステップと、その後、試薬と細胞を分離させるス
テップとを含む。
Description
イブリダイゼーションに関する。さらに詳細には、本発
明は、試料中の核酸ハイブリダーゼーションを阻害する
物質の減少に関する。このようなハイブリダイゼーショ
ンには、目的とする核酸の存在および/または量を決定
するための核酸プローブハイブリダイゼーション、およ
び核酸増幅過程を開始するための核酸プライマーハイブ
リダイゼーションが含まれる。
acement amplification;SD
A)、ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase
chain reaction;PCR)、リガーゼ連
鎖反応(ligase chain reactio
n;LCR)、核酸配列を基本とする増幅(nucle
icacid sequence based amp
lification;NASBA)、転写介在増幅
(transcription mediatedam
plification;TMA)などの核酸増幅過程
を使用して、試料中に存在するコピー数が少ない、目的
とする特定の核酸配列(標的配列)のコピーが多数作製
される。しかし、このような試料中によくみられる多く
の物質は、増幅過程を開始するためのプライマーのハイ
ブリダイゼーションを阻害するため、核酸増幅過程の阻
害を引き起こす。同様に、このような物質は、未増幅標
的核酸の検出に使用される直接核酸プローブハイブリダ
ーゼーション反応を阻害する。
害物質の例は、血液試料中によくみられ、PCRを阻害
するヘムおよびヘマチンから誘導されるポルフィリン化
合物である(PCR Technology, Stockton Press, Henry
A. Erlich, Ed. pp 33-34, 1989)。浸透による溶解、及
び、核片と細胞片のペレット化を用いるプロトコルが、
これらの阻害物質の量を減らすために使用されてきた。
唾液試料もPCR阻害物質を含むと報告されている。 O
chert et al., PCR Methods and Applications 3, 365-
368 (1994)。阻害物質は同定されなかったが、唾液試料
をマイクロ波で長時間加熱したり煮沸したりすると、P
CR阻害が完全に排除されることが確認された。
s 35, 65-72 (1991)には、血清試料を70℃で45秒間
加熱すると、ウイルス核酸配列のPCR増幅が改善する
と報告されている。この改善は、PCR過程を阻害する
と考えられるアプロチニン、ロイペプチン、PMSF、
ペプスタチンなどの血清酵素の熱不活化に起因すると理
論づけられている。ウイルス核酸配列の増幅に先立って
PCR阻害物質を血清から除外する他の方法は、Zeldis
et al., J. Clin. Invest. 84, 1503-1508 (1989)によ
り示されている。この方法には、ウイルスを抗体被覆微
粒子に吸着させること、微粒子を洗浄すること、PCR
を阻害すると考えられる残りのタンパク質をプロテイナ
ーゼKで破壊することが含まれる。
脳脊髄液中のトレポネマ・パリダム(Treponem
a pallidum)をPCRで検出しようとして、
PCR阻害化合物を除去するために異なる4つの方法を
試みた。 Grimprel et al.,J. Clin. Microbiol. 29, 1
711-1718 (1991)。簡単に記述すると、PCR阻害化合
物を除去するための4つの方法は、(1)試験管内の試
料を沸騰している水浴中に10分間入れ、氷で冷却し、
遠心分離する煮沸法、(2)試料に滅菌リン酸緩衝食塩
水を加え、一連の遠心分離に供し、ペレットを再懸濁し
て10分間煮沸し、その後氷で冷却する低スピン分離
法、(3)1MのNaCl、1NのNaOHおよび0.
1%SDS中で試料を1.5分間煮沸し、0.5MのT
ris−HCl(pH8.0)で中和し、フェノールと
クロロホルム−イソアミルアルコールによる一連の抽出
に供し、イソプロピルアルコールで沈殿させるアルカリ
溶解抽出法、(4)試料を上述の(2)に記載の通りに
低スピン分離に供し、続いて10分間煮沸し、フェノー
ル−クロロホルム抽出を1回行った後、冷無水エタノー
ルで沈殿させた。著者の報告によれば、これらの方法は
使用した試料のタイプによって成功が異なる。
阻害する可能性がある小粒子および可溶性物質のかなり
の量がポリエチレングリコール沈殿により除去されるこ
とが確認された。Jiang et al., J. Clin. Microbiol.
30, 2529-2534 (1992)。沈殿後、フェノール−クロロホ
ルム抽出とともに、陽イオン洗浄剤である臭化セチルト
リメチルアンモニウム(CTAB)を高塩濃度で使用し
て、抽出過程を実施しした。Wilde et al., J. Clin. M
icrobiol. 28, 1300-1307 (1990)により、PCR阻害物
質を糞便試料から除去する別の方法が報告されている。
糞便試料からロタウイルス核酸を検出するためにPCR
を使用する前に、一連の急速洗浄工程中および溶出工程
中にクロマトグラフィーセルロース繊維粉末(CF11
粉末)を使用してロタウイルスRNAを精製する工程を
付加して抽出過程を一部変更した。
ルス(CMV)を検出する試験を実施するとき、尿素が
PCRを阻害することが確認された。 Khan et al., J.
Clin. Pathol. 44, 360-365 (1991) 。この参考文献に
は、単純透析または超遠心分離によって尿中の尿素のP
CR阻害作用が効果的に除去されることが報告されてい
る。Buffone et al., Clin. Chem. 37, 1945-1949 (199
1)には、CMV核酸を検出する前にPCR阻害物質を尿
から除去する別の方法が報告されている。この過程は、
CMVからの核酸放出後に行われ、増幅用核酸の回収前
に、タンパク質および他の物質を選択的に溶出すること
ができるように、細かいガラスビーズを使用して核酸を
吸着させる。
幅阻害に関する出版物は、そのほとんどがPCRに関連
している。しかし、これらのPCRを阻害する同物質、
ならびに、タンパク質物質、EDTA、ヒトDNAおよ
び鉄などの臨床試料によくみられる他の多くの物質は、
SDAおよび他の核酸増幅過程も阻害することが確認さ
れている。
ダイゼーション阻害物質を減少または除去するための方
法は、そのほとんどが、試料処理方法論を加えなければ
ならない、かなり時間のかかる複雑な工程を含む。比較
的厳しい処理工程または条件を使用し、及び/または他
の物質から標的核酸を分離することが必要な方法に伴う
別の問題は、一部の標的核酸配列が喪失することであ
る。核酸増幅過程は非常に少数のオリジナル標的から標
的配列(アンプリコン)のコピーを多数作製する能力を
有するが、より多数のオリジナル標的が試料中に存在す
れば、増幅効率および検出能力が改善される。抗酸性バ
チルス属(acid fast Bacillus;A
FB)スミア陰性結核菌(Mycobacterium
tuberculosis)試料など、検出すること
が特に難しい試料を処理するとき、検出能力が高いこと
は非常に重要であろう。
ョンを阻害する物質が試料中に存在することに関連した
問題に対処するために、したがって、標的核酸配列のよ
り効率のよい増幅および検出改良を実現するために、本
発明は、増幅すべき核酸を含有する試料中の細胞溶解前
に、細胞から核酸を放出させない試薬と試料を接触さ
せ、その後、細胞を試薬と分離させることによって、試
料中の阻害物質の量を減少させる方法を提供する。
ては、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、
チオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック試薬など
がある。また、細胞と試薬との分離は、一般にその試薬
が溶解できる溶液を用いた洗浄工程および遠心分離工程
によって行われる。添付の図とともに以下の詳細な説明
を読むと、本発明の様々な目的、長所および斬新な特徴
を容易に理解できるであろう。
ダイゼーション過程に供せられる核酸を含む細胞を含有
する試料から、核酸ハイブリダイゼーション過程を阻害
する物質の量を減少させる方法に関する。本方法では、
核酸を含有する細胞が試料中に残存するように、試料中
の細胞を溶解する前に、このような物質を可溶化し且つ
細胞から核酸を放出させない試薬を試料と接触させる。
次に、このような細胞を試薬とから分離させる。上述の
従来の技術の章の記載から明白なように、他者が阻害物
質を除去するために試行した方法のいくつかは複雑であ
ったため、本方法の結果は特に意外であった。また、カ
オトロピック塩類は細胞の可溶化や溶解に特に有用であ
ることが教示されている米国特許第5,482,834
号などの様々な参考文献から明白なように、本発明の方
法に使用される試薬は、一般に細胞壁溶解や可溶化によ
って細胞から核酸を放出させるのに有用であると当業者
により考えられていた。
Acarology 19, 473-478 (1995), Boom et al., J. Cli
n. Microbiol. 28 495-503 (1990), Reek et al., BioT
echniques 19, 282-285 (1995), Chungue et al. J. Me
d. Virol. 40, 142-145 (1993)およびShah et al., J.
Clin. Microbiol. 33, 322-328 (1995) などの参考文献
には、チオシアン酸グアニジウム(GuSCN)など、
カオトロピック試薬の細胞壁溶解特性も報告されてい
る。同様に、Delacourt et al., J. Pediatrics126, 70
3-710 (1995), Lee and Choi, J. Micorobiol. & Biote
chnol. 5, 181-187 (1995), Cano et al., J. Food Pro
tection 58, 614-620 (1995), Bartolomeet al, J. Hep
atol. 17, s90-s93 (1993), Rajagopaian et al., Let
t. Applied Microbiol. 21, 14-17 (1995) およびShieh
et al. J.Virol. Methods 54, 51-66 (1995)などの参
考文献に教示されているように、GuSCNなどのカオ
トロピック試薬や洗浄剤は、細胞からの核酸の抽出に広
く使用されてきた。それゆえ、細胞溶解前に試料中の細
胞をこのような試薬と接触させて核酸ハイブリダイゼー
ション阻害物質を除去することを特徴とする本発明の迅
速且つ簡単な方法は、当該分野で使用されている他の方
法を考慮すると意外であった。
中の細胞からの標的核酸の初期収率を上昇させることが
できることである。核酸増幅過程は非常に少数の初期標
的から標的配列の多くのコピー(アンプリコン)を作製
することができるが、できる限り多い初期標的物を用い
て増幅過程を開始することは有益である。細胞溶解に後
続する核酸ハイブリダイゼーション阻害物質配列を除去
する他の方法は、核酸を溶解物中の他の物質と分離する
ことに基づいているため、悪名が高いほど非能率的であ
る。それゆえ、多くの初期標的は回収されない。本方法
では、細胞溶解の前に阻害物質が除去され、その後の分
離を必要とせず、初期標的のよりよい収率が達成され
る。
は喀痰試料、血液試料、尿試料、脳脊髄液(「CS
F」)試料などの実質的にすべてのヒト臨床試料および
獣医学臨床試料、水試料、空気試料および土壌試料など
の環境試料、および食物試料などが含まれる。本発明の
方法に供することが可能な試料は、増幅過程開始のため
の直接プローブハイブリダイゼーションやプライマーハ
イブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション過
程に供せられる標的核酸配列を含む細胞の含有が疑わし
い。
し、且つ一般にこのような試料中でみられる物質として
は、ヒト試料中のタンパク質材料およびヒトDNAや獣
医学試料中の動物DNAなどがある。上述の従来技術の
章で検討した通り、これらの物質はSDA、PCR、N
ASBA、TMAなどの核酸増幅過程を阻害することが
知られている。本発明の方法の第一のステップでは、阻
害物質が溶解でき、且つ細胞から核酸を放出させない試
薬と試料を接触させる。この接触は、標的核酸を放出さ
せるための細胞溶解前の何時でも行うことが可能であ
る。しかし、細胞をこのような試薬と接触させる好まし
い時期は、試料を幾らか操作して、細胞の位置を集中さ
せたり細胞をペレット化した後である。一般に、このよ
うな集中は遠心分離の結果であるが、濾過や選択的吸着
に起因することもある。
置が限定されているため、試薬はより確実に細胞と接触
し、試薬をより効率よく使用することが可能になる。細
胞と試薬との接触は、好ましくは細胞の比較的短時間の
洗浄である。一般に、細胞と試薬の接触は、約5分間ま
でである。多くの試薬が本発明の方法に有用である。こ
のような有用な試薬の例としては、Triton X−
100、Triton X−114、NP−40、Br
ij 35、Brij 58、Tween 20、Tw
een 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグル
コシド、Chaps、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナト
リウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チ
オシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチ
オシアン酸グアニジン、トリクロロ酢酸ナトリウム、ト
リフルオロ酢酸ナトリウム、尿素など、当業者に周知の
カオトロピック試薬や洗浄剤などがある。当該分野で通
常の熟練者は、このような試薬の2つの主たる特徴、す
なわち、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の可溶化
の程度および細胞から核酸が放出されないことに向けら
れた通常行われるスクリーニングアッセイを実施するこ
とによって、本発明の方法に有用な他の試薬を確認する
ことができ、成功がかなり期待される。
せ、その細胞を遠心分離し、通常行われるスクリーニン
グアッセイで細胞に共通な標的核酸配列の増幅反応を上
清に実施した。標的配列が増幅される場合、試薬は細胞
から核酸を放出させるため、この試薬は本発明の方法で
使用するための要件を満たさないが、標的配列の増幅が
みられず、内部コントロール配列が増幅すれば、この試
薬は本発明の方法に有用と考えられる。次に、細胞から
核酸を放出させない試薬を既知の核酸ハイブリダイゼー
ション阻害物質と接触させ、通常行われるスクリーニン
グアッセイで阻害物質の可溶化の程度を迅速に測定す
る。阻害物質を可溶化する試薬は、本発明の方法に有用
である。本発明の方法に使用される試薬の濃度および量
は、本方法に供する試料の種類によって異なる。本発明
の方法に使用するのに適したカオトロピック試薬および
洗浄剤の濃度の例を下表1に示す。
体積は、少なくとも試料の体積と等しい。さらに詳細に
は、試薬と試料の体積:体積比は、約1:1から約5:
1である。また、一般に、試薬が塩性溶液として調製さ
れることが望ましく、個々の試薬の最も好ましいpH
は、たとえば、本願明細書の実施例3に記載の実験に基
づいた通常行われるスクリーニングアッセイで測定さ
れ、pH9.0での6.0Mイソチオシアン酸グアニジ
ン溶液は、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の量を
減少させるのに特に有益であった。本願明細書の実施例
3に記載の実験に基づいた同じタイプの通常のスクリー
ニングアッセイを使用して、個々の試薬の最適濃度(モ
ル濃度)も決定することが可能である。また、一般に、
試料は、室温で試料と接触させる。試薬を試料の細胞と
接触させるとき、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質
は、試薬により可溶化されるため、このような細胞壁か
らの物質を洗浄する。適当な試薬は細胞から核酸を放出
させないため、試薬を細胞と分離したときの標的核酸の
喪失は問題ではない。
は、核酸ハイブリダイゼーション過程に悪影響を及ぼす
可能性があり、それゆえ、その後、このような薬剤を細
胞から分離する。このような分離は、試薬が溶解できる
緩衝液を使用して、あるいは使用せずに、濾過または洗
浄および遠心分離など、適当な手段で遂行することが可
能である。好ましくは、このような緩衝液は、阻害物質
の除去ならびに細胞溶解前の試薬の除去を確実に行うた
めに使用される。それゆえ、このような細胞を溶解する
とき、標的核酸は、標的核酸が供せられるハイブリダイ
ゼーション過程を阻害する物質の最小量を含む環境にあ
る。
ゼーション試料中または増幅用試料中で標的核酸が調製
される。たとえば、ミコバクテリウム核酸配列を増幅す
るために処理が行われる喀痰試料は、一般に、NALC
/NaOH過程に供せられる。本発明の方法は、NAL
C/NaOHペレットを選択的に可溶化してこのような
試料の凝集を減少させるため、このようなNALC/N
aOH過程に供せられるミコバクテリウム試料を用いる
場合に特に有用である。同様に、他種の臨床試料は他の
周知の標準方法に供せられ、たとえば、血液や尿など、
多量の試料は遠心分離に供せられる。本発明の方法は、
標的核酸を含有する細胞の溶解前にこの方法が実行され
るという条件で、標準法の前、標準法の一部、または標
準法の後で使用することが可能である。
面からの標的核酸の放出を必要とせず、それゆえ、核酸
に基づくハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅ア
ッセイに従来使用されている量より多い試料を使用する
ことが可能である。このより多い試料を使用できること
は、アッセイの初期段階により多くの標的核酸が存在す
るため、アッセイの感度が高くなる。阻害物質を可溶化
するが、標的核酸や細胞壁を同時に可溶化しない試薬の
選択性は、以下に記載する実施例で明白なように、本発
明の方法の結果に貢献する試薬の特徴の1つである。
具体的な実施態様を例示するものである。熟練者には明
白なように、様々な変化および修正が可能であり、それ
らも本発明の範囲内と考えられる。
増幅阻害の量を減少させるかどうか、したがって対照標
準試料処理方法と比較して、よりよい標的検出値を生じ
るかどうかを決定することである。
d(「RODI」)H2O ・MycoPrep(BBL) ・MAC/TB試料希釈剤 ・リン酸緩衝液(BBL) ・ジルコニウムビーズ含有カプセル(Becton D
ickinson) ・臨床喀痰試料、試料番号785、657、634、8
549、8894、13883、8396、1386
7、146 ・M.avium複合体(「MAC」)ミコバクテリウ
ム細胞
製した。蒸留水中、3MのNaSCNを調製した。蒸留
水中、4MのGuSCNを調製した。この3種のカオト
ロピック試薬溶液を2.0mL LabCraftR 試
験管10本に1.0ml/試験管で分注した。MAC/
TB試料緩衝液1.0mlのアリコートを2.0mLの
LabCraftR 試験管に分注した。臨床喀痰試料1
0本を室温で解凍した。喀痰試料体積と等量のMyco
Prep緩衝液を加え、試料を攪拌し、室温で15分間
維持した。各試料にリン酸緩衝液を加えて、各試料の総
量を50mlに調整した。試料を攪拌し、3,000相
対遠心力(RFC)で20分間遠心分離した。上清を傾
瀉し、リン酸緩衝液2.0mlを各試料に加えて攪拌し
た。このようにして得られた試料に、75粒子/mlの
MAC細胞をスパイクした。各試料の500μlのアリ
コートを、記載の4種の洗浄緩衝液(上述の試料緩衝
液、2MのNaClO4 、3MのNaSCN、および4
MのGuSCN、1.0ml)すべてに分注した。試料
を攪拌し、12,200RCFで3.0分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、MAC/TB試料緩衝液1.0ml
でペレットを再懸濁した後、12,200RCFで3.
0分間遠心分離した。再び上清を傾瀉し、MAC/TB
試料緩衝液1.0mlでペレットを再懸濁した後、1
2,200RCFで3.0分間遠心分離した。
管に挿入し、各ペレットをMAC/TB試料緩衝液40
0μlで再懸濁した。試料を強制熱空気炉内、105℃
で30分間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あ
らゆるミコバクテリウム生物体を非感染性にさせた。
5.0m/s、45秒間に設定したSavant Ce
llPrepTM装置に試料試験管を充填して実行し、核
酸を他の細胞成分から分離させた。以下の通り、MAC
/TB増幅および検出システムで試料をさらに処理し
た。公開された欧州特許出願第0684315号に記載
の通りに、25mMのリン酸カリウム(pH7.6)、
100μg/mLのアセチル化ウシ血清アルブミン(B
SA)、0.5mMのdUTP、各々0.2mMのdA
TPおよびdGTP、および1.4mMの2’デオキシ
シチジン5’−O−(1−チオトリホスフェート)(α
−チオdCTP)、12%グリセロール、6.5mMの
酢酸マグネシウム、0.5μMの増幅プライマー、0.
05μMのバンパープライマー、50ngのヒト胎盤D
NA、12.5単位のBstポリメラーゼ、60単位の
BsoBI1、1単位ウラシル−N−グリコシレート
(UNG)および2単位のウラシル−N−グリコシレー
トインヒビター(Ugi)を含む反応混合物で好熱性S
DAを実施した。
料を2分間沸騰させた。次に試料を41℃で2分間イン
キュベートし、UNGを加えてあらゆる含有アンプリコ
ンを分解した。UNGとともに30分間インキュベート
した後、試料を52℃に5分間移した。酵素混合物(B
stポリメラーゼ、BsoBI、Ugiおよびグリセロ
ール)を加え、増幅を52℃で30分間続行させた。5
分間沸騰させて反応を停止させた。C.A. Spargo ら(19
93. Molec. Cell. Probes 7, 395-404)により記載され
ている通りに、化学ルミネッセントアッセイで増幅産物
を検出した。M.tb.、MACおよびIAC用アルカ
リホスファターゼ標識検出プローブ、M.tb.、MA
CおよびIAC用ビオチニル化捕捉プローブおよび試料
を、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープ
レートのウェルに加え、37℃で50分間インキュベー
トした。ウェルを厳密度の高い緩衝液で3回洗浄した。
LUMIPHOS(Lumigen,Inc.)を加
え、反応物を37℃で30分間インキュベートした。照
度計(Dynatech)でルミネセンスを検出し、相
対光単位(RLU)を記録した。
の平均値として下表に示し、あわせて図1にグラフとし
て示す。
り、臨床現場での診断間違いの可能性を示す。
もIAC値に差がないことがわかるが、すべての試薬条
件で平均値が対照洗浄手順より高値であることは興味深
い。統計学的に、4MのGuSCN条件では、他の3条
件よりも高い特異的なMAC RLU値を示すことがデ
ータからわかる。このことから、本明細書で実行される
本発明の方法は、ミクロバクテリウムを損傷せず、それ
どころか、4MのGuSCNの場合には、MAC生物体
の回復、ひいては標的DNAの回復を改善することがわ
かる。
ーンングすることであった。材料 試料処理試薬 ・MycoPrep試薬 ・BBLリン酸緩衝液(pH6.8) ・TB/MAC試料希釈剤 ・N.Carolina Public Health
のスミア陰性、培養陰性喀痰、試料番号8207、15
14、13472、14199、13847、367
5、6401、4691、13545、13711、9
939、12227、12228、12161、840
6、782、13547、13448、13506、1
3319、13420、243、103 ・ジルコニウムビーズ含有カプセル
した。処理した喀痰試料はどれも、体積が7.5〜12
mlの範囲になるように、12ml以上の喀痰を分離管
に分配した。喀痰試料体積と等量のMycoPrep試
薬を喀痰試料に加えた。試料を攪拌し、室温に15分間
維持した。各喀痰溶液の体積をリン酸緩衝液で50ml
に調節した。この溶液を3,000RCFで20分間遠
心分離した。各試料ペレットから上清を傾瀉し、リン酸
緩衝液2.0mlを各試験管に加えた。試料を2.0m
lLabCraftR 試験管に500μlずつ等分し
た。各タイプの試料1本を室温で維持し、残りの試料を
−70℃で保存した。
維持した各試料に加えた。試料を12,200RCFで
3.0分間遠心分離した。上清を傾瀉し、MAC/TB
試料緩衝液1.0mlを各試験管に加え、その試験管を
12,200RCFで3.0分間遠心分離した。上清を
傾瀉し、ジルコニウムビーズ含有カプセルを各試験管に
加え、MAC/TB試料緩衝液400μlを各試験管に
分注した。試験管を強制熱空気炉内、105℃で30分
間加熱してミコバクテリウム細胞を溶解し、あらゆるミ
コバクテリウム生物体を非感染性にさせた。5.0m/
s、45秒間の設定を使用して、Savant Cel
lPrepTM装置で試験管を揺り動かした。液体MAC
/TBトリプレックスアッセイおよび実施例1に記載の
検出手順を使用した好熱性鎖置換(tSDA)を使用し
て、相対光単位(RLU)で実験結果を得た。結果 :結果を下表に示す。
のうち、9検体は、IAC値が10RLU未満であり、
臨床試料による増幅/検出反応の重大な阻害を示した。
「標準」試料洗浄条件下で生じたこれらの阻害標本を、
以下の実施例に示す通り、さらに処理した。
ルから除去できるように、GuSCN洗浄液のpHおよ
びモル濃度を調節することができるかどうかを決定する
ことであった。材料 試料処理試薬 ・実施例2の陰性NALCペレット試料番号6401、
8406、782、13448、13506 ・イソチオシアン酸グアニジン(GuSCN)Gibc
o BRL ・MAC/TB試料緩衝液 ・ジルコニウムビーズ含有カプセル ・500mMのリン酸カリウム(KPO4 ) ・5NのNaOH Ricca ・M.tb.ミコバクテリウム細胞増幅試薬 実施例1と同じ。アッセイ試薬 実施例1と同じ。手順 試料782を1.0ml、試料6401、8406、1
3448および13506を500μlずつ、2mlの
ポリプロピレン製試験管に分注することにより陰性のN
ALC阻害プールを作製した。200粒子/mlでM.
tb.生物体を阻害プールにスパイクした(7.5粒子
/最終tSDA反応)。作製したGuSCN溶液を下表
に示す。pH7.0およびpH9.0の溶液は、5Nの
NaOHで指示されたpHに調製した。
2.0mlのLabCraftR 試験管1本に分注し
た。スパイクした陰性NALC阻害プールを、GuSC
Nが入っている各試験管に500μl/試験管で分注し
た。試験管を短時間攪拌し、この試験管を12,200
RCFで3.0分間遠心分離した。上清を傾瀉し、MA
C/TB試料緩衝液1.0mlを各試験管に分注し、こ
の試験管を12,200RCFで3.0分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、MAC/TB試料緩衝液1.0ml
を各試験管に分注した。この試験管を12,200RC
Fで3.0分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニ
ウムビーズ含有カプセルを各試験管に挿入した。MAC
/TB試料緩衝液を400μl/試験管で各試験管に傾
瀉した。試験管を強制熱空気炉内、105℃で30分間
加熱した。5.0m/s、45秒間の設定を使用して、
Savant CellPrepTM装置で試験管を揺り
動かした。液体MAC/TBトリプレックスアッセイお
よび実施例1に記載の検出手順を使用したtSDAを使
用して、相対光単位(RLU)で実験結果を得た。
グラフとしてで示す。
た増幅/検出試料の平均値である。
条件で、非特異的MAC値を生じることなく、他の条件
よりも統計学的にすぐれたM.tb.RLU値およびI
AC RLU値が得られた。これは、6.0M、pH
9.0のGuSCN溶液を使用すると、ミコバクテリウ
ムから標的核酸が放出されずに、より多量の核酸ハイブ
リダイゼーション阻害物質が除去されることを示すもの
である。
CN(6M、pH9.0)洗浄 この実施例の目的は、M.tb.をスパイクして、6M
のGuSCN(pH9.0)溶液で洗浄した臨床試料
は、望ましくない核酸ハイブリダイゼーション阻害物質
を除去し、特異的M.tb.DNA標的の増幅および検
出が可能かどうかを決定することであった。材料 試料処理試薬 ・陰性NALCペレット試料番号8207、1514、
13472、14199、13847、3675、64
01、4691、13545、13711、9939、
12227、12228、12161、8406、78
2、13547、13448、13506、1331
9、13420、243、103 ・イソチオシアン酸グアニジン(GuSCN)Gibc
o BRL ・MAC/TB試料緩衝液 ・ジルコニウムビーズ含有カプセル ・500mMのリン酸カリウム(KPO4 ) ・5NのNaOH Ricca
SCN溶液を調製し、実施例3と同様に、5NのNaO
HでpH9.0に調整した。実施例2の材料のセクショ
ンの各臨床試料500μlに、M.tb.生物体を20
0粒子/ml(7.5粒子/増幅反応)でスパイクし
た。これらの実施例2の試料の一部は核酸ハイブリダイ
ゼーションを阻害した。MAC/TB緩衝液500μl
に、M.tb.を200粒子/mlでスパイクし、これ
を標識「試料処理対照」とした。GuSCN溶液1.0
mlを2.0mlのLabCraftR 試験管1本に分
注し、この試験管を標識「GuSCN陰性対照」とし
た。6M、pH9.0のGuSCN溶液1mlを各臨床
試料試験管に分注した。この試験管を攪拌し、12,2
00RCFで3.0分間遠心分離した。上清を傾瀉し、
MAC/TB緩衝液1.0mlを各試験管に分注し、こ
の試験管を12,200RCFで3.0分間遠心分離し
た。上清を傾瀉し、MAC/TB試料緩衝液1.0ml
を各試験管に分注し、この試験管を12,200RCF
で3.0分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ジルコニウ
ムカプセルを各試験管に加えた。MAC/TB試料緩衝
液を各試験管に400μl/試験管で加えた。上述の実
施例に記載の通りに、この試験管を加熱し、揺り動かし
た。液体MAC/TBトリプレックスアッセイおよび実
施例1に記載の検出手順を使用したtSDAを使用し
て、相対光単位(RLU)で実験結果を得た。
り返しの平均値として下表に示し、あわせて図3にグラ
フとして示す。
SDA値を示し、増幅反応は阻害されなかったことがわ
かる。さらに、各試料の88.2:1未満というバック
グラウンド特異的RLU比から明白なように、スパイク
されたあらゆる試料で7.5粒子/増幅反応のM.t
b.が検出された。実施例2では、GuSCN洗浄液を
使用しない臨床試料のうち5検体は、10RLU未満の
阻害的IAC値を示した。実施例で実行される本発明の
方法で、ほぼすべての試料での改善(実施例2で低シグ
ナル発生により阻害的であることが証明される試料も)
が達成された。本発明は、ある程度特異的に記述されて
いるが、本発明の範囲から逸脱することなく当該技術で
通常の熟練者に明白な修正を行うことが可能である。本
発明の様々な特徴を請求の範囲に記述されている。
臨床試料から核酸増幅阻害の量を減少させるかどうかを
決定するために実施した実験結果を示すグラフ図であ
る。
Hおよびの濃度値を決定するために実施した実験結果を
示すグラフ図である。
物質の量を減少させる上で、本発明の方法の有効性を表
す実験の結果を示すグラフ図である。
Claims (10)
- 【請求項1】 細胞を含有する試料から、核酸ハイブリ
ダイゼーション過程を阻害する物質の量を減少させる方
法であって、 (a)細胞を溶解させる前に、(i)該物質を可溶化
し、且つ(ii)該細胞から核酸を放出させない試薬に該
細胞を接触させる工程と、 (b)該試薬から該細胞を分離する工程とを含んでなる
方法。 - 【請求項2】 試薬は、Triton X−100、T
riton X−114、NP−40、Brij 3
5、Brij 58、Tween 20、Tween
80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、
Chaps、NaI、NaClO4 、KI、NaSC
N、KSCN、イソチオシアン酸グアニジン、トリクロ
ロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウムおよび
尿素から成る群から選択される請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記試薬が、カオトロピック試薬である
請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 カオトロピック試薬が、イソチオシアン
酸グアニジンである請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 塩基性pHの溶液中にイソチオシアン酸
グアニジンが存在する請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】 pHが、約9.0である請求項5に記載
の方法。 - 【請求項7】 イソチオシアン酸グアニジンの濃度は約
6Mである請求項5に記載の方法。 - 【請求項8】 分離が、洗浄および遠心分離による請求
項1に記載の方法。 - 【請求項9】 前記試薬が、洗浄剤である請求項1に記
載の方法。 - 【請求項10】 工程(a)の前に、細胞がペレット化
される請求項1に記載の方法。
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