ES2197294T3 - Metodo para reducir inhibidores de la hibridacion de acidos nucleicos. - Google Patents
Metodo para reducir inhibidores de la hibridacion de acidos nucleicos.Info
- Publication number
- ES2197294T3 ES2197294T3 ES97122878T ES97122878T ES2197294T3 ES 2197294 T3 ES2197294 T3 ES 2197294T3 ES 97122878 T ES97122878 T ES 97122878T ES 97122878 T ES97122878 T ES 97122878T ES 2197294 T3 ES2197294 T3 ES 2197294T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- samples
- cells
- hline
- sample
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA REDUCIR LA CANTIDAD DE SUSTANCIAS CAPACES DE INHIBIR LA HIBRIDACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS PRESENTES EN LAS MUESTRAS. EL METODO SE APLICA ANTES DE LIBERAR EL ACIDO NUCLEICO DIANA DE LAS CELULAS DE INTERES Y CONSISTE EN PONER EN CONTACTO LA MUESTRA CON UN AGENTE QUE SOLUBILIZA LAS SUSTANCIAS INHIBIDORAS Y NO EFECTUA LA LIBERACION DE ACIDOS NUCLEICOS DE LAS CELULAS PRESENTES EN LA MUESTRA NI LAS CELULAS DEL AGENTE.
Description
Método para reducir inhibidores de la hibridación
de ácidos nucleicos.
El campo de la presente invención se refiere en
sentido amplio a la hibridación de ácidos nucleicos. Más
específicamente, la presente invención se refiere a la reducción de
sustancias en muestras que inhiben los eventos de hibridación de
ácidos nucleicos. Entre tales eventos se incluyen la hibridación de
sondas de ácidos nucleicos para determinar la presencia y/o cantidad
de un ácido nucleico blanco y la hibridación de cebadores de ácidos
nucleicos para la iniciación de un proceso de amplificación de
ácidos nucleicos.
Los procesos de amplificación de ácidos nucleicos
tales como la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena
de la ligasa (LCR), la amplificación basada en secuencias de ácidos
nucleicos (NASBA), la amplificación mediada por transcripción (TMA)
y otros se utilizan para crear múltiples copias de una secuencia
de ácido nucleico particular de interés (secuencia blanco) que
está presente en un menor número de copias en una muestra. No
obstante, una serie de sustancias habitualmente encontradas en
tales muestras ocasionan la inhibición de los procesos de
amplificación de ácidos nucleicos debido a la inhibición de la
hibridación de los cebadores para iniciar el proceso de
amplificación. De forma similar, tales sustancias inhiben las
reacciones directas de hibridación de sondas de ácidos nucleicos
utilizadas para la detección de ácidos nucleicos blanco sin
amplificar.
Un ejemplo de tales sustancias inhibidoras de la
hibridación de ácidos nucleicos son los compuestos porfirínicos
derivados de hemo y hematina, ambos habitualmente encontrados en
muestras de sangre e inhibidores de la PCR (PCR Technology,
Stockton Press, Henry A. Erlich ed., pp 33-34,
1989). Para reducir la cantidad de estos inhibidores se han
utilizado protocolos que usan la lisis osmótica y el
apastillamiento de residuos nucleicos y celulares.
También se han informado muestras salivares que
contenían sustancias inhibidoras de la PCR. Ochert y otros, PCR
Methods and Applications 3, 365-368 (1994).
Aunque no se identificaron las sustancias inhibidoras, se encontró
que el tratamiento prolongado en microondas o a ebullición de las
muestras salivares eliminaba totalmente la inhibición de la
PCR.
Frickofen y Young, J. Virol. Methods 35,
65-72 (1991) informan que el calentamiento de
muestras séricas durante 45 segundos a 70ºC mejora la
amplificación por PCR de secuencias de ácidos nucleicos víricos. Se
teoriza que esta mejora es debida a la inactivación térmica de
enzimas séricas tales como aprotinina, leupeptina, PMSF y
pepstatina que se cree son inhibidoras de los procesos PCR.
Otra aproximación para eliminar del suero
sustancias inhibidoras de la PCR previamente a la amplificación de
una secuencia de ácido nucleico vírico se revela en Zeldis y
otros, J. Clin. Invest. 84, 1503-1508
(1989). Esta aproximación conlleva adsorber el virus en
micropartículas recubiertas de anticuerpo, lavar las
micropartículas y luego destruir las proteínas restantes que
pueden ser inhibidoras de la PCR con proteinasa K.
En un intento de detectar Treponema
pallidum en líquido amniótico, líquido cefaloraquídeo y suero
fetal y neonatal mediante PCR, se intentaron cuatro procesos
diferentes para eliminar los compuestos inhibidores de la PCR.
Grimprel y otros, J. Clin. Microbiol. 29,
1711-1718 (1991). Brevemente, los cuatro procesos
para la eliminación de compuestos inhibidores de la PCR eran: (1)
un método de ebullición en el que un tubo con una muestra se
colocaba en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, se
enfriaba sobre hielo y luego se centrifugaba; (2) un método de
separación a bajas revoluciones en el que la muestra se añadía a
medio salino tamponado con fosfato estéril y se sometía a una
serie de centrifugaciones, resuspendiéndose después la pastilla
que se llevaba a ebullición durante 10 minutos tras los que se
enfriaba sobre hielo; (3) un método de extracción por lisis
alcalina en el que la muestra se llevaba a ebullición durante 1,5
minutos en NaCl 1 M, NaOH 1 N y SDS al 0,1%, luego se neutralizaba
con Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0) y después se sometía a
una serie de extracciones con fenol y
cloroformo-alcohol isoamílico y se precipitaba con
alcohol isopropílico; y (4) un método de extracción por
revoluciones en el que la muestra se sometía a una separación de
bajas revoluciones como se describió anteriormente en (2), seguida
de 10 minutos de ebullición y una extracción en
fenol-cloroformo antes de su precipitación en
etanol absoluto frío. Los autores informaron éxitos variables de
estos métodos dependiendo del tipo de muestras utilizado.
Con muestras de heces, se encontró que la
precipitación en polietilenglicol eliminaba una cantidad
significativa de pequeñas partículas y sustancias solubles que
podrían ser inhibidoras de un proceso de PCR con transcriptasa
reversa. Jiang y otros, J. Clin. Microbiol. 30,
2529-2534 (1992). A continuación de la
precipitación, se efectuó un proceso de extracción utilizando el
detergente catiónico bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) en alta
concentración salina conjuntamente con extracción en fenol-
cloroformo.
Una aproximación diferente para eliminar
sustancias inhibidoras de la PCR de muestras de heces la informan
Wilde y otros, J. Clin. Microbiol. 28, 1300- 1307 (1990).
Antes de usar la PCR para detectar ácido nucleico de rotavirus a
partir de muestras de heces, se modificó el proceso de extracción
con un paso añadido que utilizaba polvo de fibra de celulosa
cromatográfica (polvo CF11) para purificar el ARN del rotavirus
durante una serie de rápidos pasos de lavado y elución.
Al efectuar un estudio para detectar
citomegalovirus (CMV) en orina usando PCR, se encontró que la urea
es inhibidora de la PCR. Khan y otros, J. Clin. Pathol. 44,
360-365 (1991). Esta referencia informa que los
efectos inhibidores de la PCR de la urea en orina se eliminan de
forma efectiva mediante simple diálisis o ultracentrifugación.
Otro proceso para eliminar sustancias inhibidoras
de la PCR de la orina antes de la detección de ácido nucleico de
CMV lo informan Buffone y otros, Clin. Chem. 37,
1945-1949 (1991). Este proceso ocurre de forma
subsiguiente a la liberación del ácido nucleico de los organismos
CMV y utiliza finas perlas de vidrio para adsorber ácido nucleico
de modo que puedan hacerse eluir selectivamente la proteína y
otras sustancias antes de la recuperación del ácido nucleico para su
amplificación.
Un proceso alternativo para eliminar sustancias
inhibidoras de la PCR se divulga también en el documento
EP-A-O 626 456.
Como evidencian las referencias anteriormente
descritas, la mayoría de las publicaciones referentes a la
inhibición de la amplificación de ácidos nucleicos se refieren a
la PCR. No obstante, se ha encontrado que estas mismas sustancias
que son inhibidoras de la PCR, además de una serie de otras
sustancias habitualmente encontradas en muestras clínicas tales
como sustancias proteináceas, EDTA, ADN humano y hierro, son
inhibidoras también de la SDA y otros procesos de amplificación de
ácidos nucleicos.
Igualmente, la mayoría de estos métodos para
reducir o eliminar sustancias inhibidoras de la hibridación de
ácidos nucleicos conllevan pasos complicados que llevan bastante
tiempo y que deben añadirse a la metodología de procesado de la
muestra. Otro problema con los métodos que utilizan pasos o
condiciones de procesado relativamente severos y/o requieren la
separación del ácido nucleico blanco de otras sustancias es la
pérdida de algo de la secuencia de ácido nucleico blanco. A pesar
de la habilidad de los procesos de amplificación de ácidos
nucleicos para hacer múltiples copias de la secuencia blanco
(amplicones) a partir de muy pocos blancos originales, la eficacia
de la amplificación y la habilidad de detección mejoran si hay
números más altos de blancos originales en la muestra. La mayor
habilidad de detección puede ser muy importante cuando se procesan
muestras particularmente difíciles de detectar tales como muestras
de Mycobacterium tuberculosis con baciloscopía AFB (bacilos
resistentes a ácidos) negativa.
Con el fin de hacer frente a los problemas
asociados con la presencia de sustancias inhibidoras de la
hibridación de ácidos nucleicos en las muestras y de ese modo
obtener los beneficios de una amplificación más eficaz y una
detección mejorada de las secuencias de ácido nucleico blanco, la
presente invención proporciona un método para reducir la cantidad
de tales sustancias en muestras mediante, previamente a la lisis
de las células de la muestra que contienen el ácido nucleico a
amplificar, el contacto de la muestra con un agente que no efectúa
la liberación del ácido nucleico de las células y la posterior
separación de las células del agente.
Las características específicas del método de la
invención se divulgan en la reivindicación 1. En las
reivindicaciones dependientes se divulgan realizaciones preferidas
del mismo.
Son agentes útiles para uso en la presente
invención los caótropos tiocianato de guanidina, perclorato sódico
y tiocianato sódico. Asimismo, la separación de las células del
agente se consigue generalmente mediante un paso de lavado y
centrifugación con una disolución en la que el agente es
soluble.
Los distintos objetos, ventajas y características
novedosas de la invención se apreciarán más fácilmente a partir de
la descripción detallada siguiente cuando se lea conjuntamente con
las figuras adjuntas, en las que:
La figura 1 es una representación gráfica de los
resultados de un experimento llevado a cabo para determinar si el
método de la presente invención reduce la cantidad de inhibición
de la amplificación de ácidos nucleicos de una muestra clínica en
comparación con un método de procesado estándar de la muestra de
control.
La figura 2 es una representación gráfica de los
resultados de un experimento llevado a cabo para determinar los
valores óptimos de pH y concentración para un agente particular
utilizado en el método de la presente invención.
Las figuras 3A y 3B son representaciones gráficas
de los resultados de un experimento que muestran la efectividad del
método de la presente invención en la reducción de la cantidad de
inhibidores de la hibridación de ácidos nucleicos de muestras
clínicas.
Como se indicó anteriormente, la presente
invención se refiere a un método para reducir la cantidad de
sustancias que son inhibidoras de procesos de hibridación de
ácidos nucleicos en muestras que contienen células con ácido
nucleico y van a ser sometidas a un proceso de hibridación. En el
método, se pone en contacto con una muestra un agente que
solubiliza tales sustancias y no efectúa la liberación del ácido
nucleico de las células previamente a la lisis de las células de la
muestra de modo que las células que contienen ácido nucleico
permanezcan en la muestra. Entonces, se separan tales células del
agente.
Los resultados de este método fueron
particularmente inesperados debido a la complejidad de algunos de
los procesos probados por otros para eliminar sustancias
inhibidoras como evidencian las descripciones de la sección de
antecedentes anterior. Asimismo, se creía de forma general entre
los diestros en la técnica que los agentes usados en el método de
la presente invención eran útiles para efectuar la liberación de
ácido nucleico de las células mediante solubilización o lisis de
la pared celular, como evidencian varias referencias tales como el
documento US-A-5 482 834 en el que
se revela que sales caotrópicas son útiles específicamente para la
solubilización o lisis de las células. En general, tales agentes
se usaban en combinación con calor para conseguir la lisis o
solubilización de las células.
Las propiedades lisogénicas de la pared celular
de caótropos tales como el tiocianato de guanidina (GuSCN) se han
informado también en referencias tales como Hubbard y otros,
\def\x{Experimental \textamp{} Applied Acarology}\ul\x
19, 473-478 (1995), Boom y otros, J. Clin.
Microbiol. 28, 495-503 (1990), Reek y otros,
BioTechniques 19, 282-285 (1995), Chunge y
otros, J. Med. Virol. 40, 142-145 (1993) y
Shah y otros, J. Clin. Microbiol. 33, 322-328
(1995). De forma similar, caótropos y detergentes tales como GuSCN
se han utilizado extensamente en la extracción de ácidos nucleicos
a partir de células tal como se revela en referencias como
Delacourt y otros, J. Pediatrics 126,
703-710 (1995), Lee y Choi, \def\x{J.
Microbiol. \textamp{} Biotechnol.}\ul\x 5,
181-187 (1995), Cano y otros, J. Food
Protection 58, 614-620 (1995), Bartolomé y
otros, J. Hepatol. 17, s90-s93 (1993),
Rajagopaian y otros, Lett. Applied Microbiol. 21,
14-17 (1995) y Shieh y otros, J. Virol.
Methods 54, 51-66 (1995). Así pues, el método
simple y rápido de la presente invención en el que las células de
una muestra se ponen en contacto (se lavan) con un tal agente
previamente a la lisis celular para eliminar sustancias inhibidoras
de la hibridación de ácidos nucleicos era inesperado a la vista de
otros procesos que se utilizaban en la técnica.
Asimismo, una de las ventajas del método de la
presente invención es la habilidad para aumentar el rendimiento
inicial de ácido nucleico blanco procedente de las células de una
muestra. Aunque los procesos de amplificación de ácidos nucleicos
son capaces de crear muchas copias de una secuencia blanco
(amplicones) a partir de muy pocos blancos iniciales, resulta
ventajoso comenzar el proceso de amplificación con tantos blancos
iniciales como sea posible. Otros procesos para eliminar
sustancias inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos
subsiguientemente a la lisis de las células son notoriamente
ineficaces porque están basados en la separación del ácido nucleico
de otras sustancias presentes en el lisado y, así pues, muchos
blancos iniciales no se recuperan. En el presente método, donde
las sustancias inhibidoras se eliminan previamente a la lisis
celular, no es necesaria tal separación subsiguiente y se obtienen
mejores rendimientos de blanco inicial.
Las muestras que pueden ser sometidas al método
de la presente invención incluyen virtualmente todas las muestras
clínicas humanas y veterinarias tales como muestras de esputo,
muestras de sangre, muestras de orina, muestras de líquido
cefalorraquídeo (``LCF'') y otras, muestras medioambientales tales
como muestras de agua, aire y suelo, y muestras de alimentos. Las
muestras que pueden ser sometidas al método de la presente
invención son sospechosas de contener células con una secuencia de
ácido nucleico blanco a someter a un proceso de hibridación tal
como la hibridación directa de sondas o la hibridación de un
cebador para la iniciación de un proceso de amplificación.
Las sustancias que son inhibidoras de procesos de
hibridación de ácidos nucleicos y se encuentran típicamente en
tales muestras incluyen materiales proteináceos y ADN humano en
muestras humanas y ADN animal en muestras veterinarias. Como se
discutió en la sección de antecedentes anterior, se sabe que estas
sustancias son inhibidoras de procesos de amplificación de ácidos
nucleicos tales como SDA, PCR, LCR, NASBA, TMA y otros.
El primer paso del método de la presente
invención es poner en contacto la muestra con un agente en el que
la sustancia inhibidora es soluble y que no efectúa la liberación
del ácido nucleico de las células. Este contacto puede ocurrir en
cualquier momento previo a la lisis de las células para liberar el
ácido nucleico blanco. No obstante, un momento preferido para poner
en contacto las células con un tal agente es tras alguna
manipulación de la muestra para concentrar la ubicación de las
células o apastillar las células. Típicamente, tal concentración
es resultado de la centrifugación, aunque también puede ser
resultado de una filtración o una adsorción selectiva.
Tal concentración de las células proporciona una
mayor garantía de que el agente entrará en contacto con las células
y permite un uso más eficiente del agente debido a la ubicación
definida de las células. La puesta en contacto de las células con
el agente es preferiblemente un lavado relativamente breve de las
células. Típicamente, el contacto de las células y el agente dura
hasta aproximadamente cinco minutos.
Muchos agentes son útiles en un método contra la
inhibición de procesos de hibridación de ácidos nucleicos. Entre
los ejemplos de tales agentes útiles se incluyen caótropos y
detergentes que son bien conocidos para los diestros en la técnica
tales como Triton X-100®, Triton
X-114®, NP-40, Brij 35, Brij 58,
Tween 20®, Tween 80®, octil glucósido, octil tioglucósido, Chaps,
ioduro sódico, perclorato sódico, ioduro potásico, tiocianato
sódico, tiocianato potásico, tiocianato de guanidina,
isotiocianato de guanidina, tricloroacetato sódico,
trifluoroacetato sódico y urea. Otros agentes útiles en tal método
pueden ser identificados por alguien diestro en la técnica con una
expectativa de éxito razonable realizando ensayos de cribado
rutinarios dirigidos hacia las dos características primarias de
tales agentes: grado de solubilización de sustancias inhibidoras
de la hibridación de ácidos nucleicos y ausencia de efectuación de
la liberación de ácidos nucleicos de las células.
Brevemente, se pone un agente en contacto con las
células, se centrifugan las células y se lleva a cabo en el
sobrenadante una reacción de amplificación de una secuencia de
ácido nucleico blanco común a las células en un ensayo de cribado
rutinario. Si la secuencia blanco se amplifica, entonces el agente
no cumple los requisitos para uso en el método, ya que ha efectuado
la liberación del ácido nucleico de las células, mientras que la
ausencia de amplificación de la secuencia blanco y la amplificación
de una secuencia de control interno indicaría que el agente puede
ser útil en el método de la presente invención. A continuación, el
agente que no ha efectuado la liberación del ácido nucleico de las
células se pone en contacto con sustancias inhibidoras de la
hibridación de ácidos nucleicos conocidas y se determina
rápidamente el grado de solubilización de la sustancia inhibidora
en un ensayo de cribado rutinario. Aquellos agentes que
solubilizan la sustancia inhibidora son útiles en el método para
inhibir procesos de hibridación de ácidos nucleicos.
La concentración y la cantidad del agente
utilizadas en tal método dependen del tipo de muestra que se esté
sometiendo al método. En la tabla 1 a continuación se presentan
ejemplos de concentraciones adecuadas de caótropos y detergentes
para uso en tal método.
\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Caótropo/detergente \+ Concentraciones\cr Triton
X - 100® \+ 0,024 mM; 0,24 mM; 2,4 mM\cr Triton
X - 114® \+ 0,021 mM; 0,21 mM; 2,1 mM\cr
NP - 40 \+ 0,029 mM; 0,29 mM; 2,9 mM\cr Brij 35 \+
0,009 mM; 0,09 mM; 0,9 mM\cr Brij 58 \+ 0,0077 mM; 0,077 mM; 0,77
mM\cr Tween 20® \+ 0,006 mM; 0,06 mM; 0,6 mM\cr Tween 80® \+
0,0012 mM; 0,012 mM; 0,12 mM\cr Octil glucósido \+ 2,4 mM; 24 mM\cr
Octil tioglucósido \+ 0,9 mM; 9,0 mM\cr Chaps \+ 0,9 mM; 9,0 mM\cr
NaI \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr NaClO _{4} \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5
M, 6 M\cr KI \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr NaSCN \+ 2 M, 3 M, 4 M,
5 M, 6 M\cr KSCN \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr Isotiocianato de
guanidina \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr Tricloroacetato sódico \+ 2
M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M\cr Trifluoroacetato sódico \+ 2 M, 3 M, 4 M,
5 M, 6 M\cr Urea \+ 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6
M\cr}
Generalmente, el volumen del agente usado en tal
método es al menos igual al volumen de muestra. Más
particularmente, la relación volumen:volumen del agente a la
muestra es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1.
También, generalmente, es preferible que el agente se prepare como
disolución básica, determinándose los pHs más preferibles para
agentes particulares mediante un ensayo de cribado rutinario
basado, por ejemplo, en los experimentos presentados en el ejemplo
3 aquí expuesto, en el que se encontró que una disolución de
isotiocianato de guanidina 6,0 M de pH 9,0 era particularmente
ventajosa para reducir la cantidad de sustancias inhibidoras de la
hibridación de ácidos nucleicos. La concentración (molaridad)
óptima de un agente particular puede determinarse asimismo usando
el mismo tipo de ensayo de cribado rutinario basado en los
experimentos presentados en el ejemplo 3 aquí expuesto. También,
generalmente, el agente se pone en contacto con la muestra a
temperatura ambiente.
Cuando el agente se pone en contacto con las
células de la muestra, las sustancias inhibidoras de la
hibridación de ácidos nucleicos resultan solubilizadas por el
agente, lavándose así tales sustancias de las paredes de las
células. Puesto que los agentes adecuados no efectúan la liberación
del ácido nucleico de las células, no es motivo de preocupación la
pérdida de ácido nucleico blanco cuando se separe el agente de las
células.
No obstante, los agentes usados en el método de
la presente invención pueden afectar también adversamente a los
procesos de hibridación de ácidos nucleicos y, así pues, tales
agentes se separan subsiguientemente de las células. Tal
separación puede conseguirse mediante cualquier medio adecuado tal
como filtración o lavado y centrifugación con o sin un tampón en el
que el agente es soluble. Preferiblemente, se utiliza un tal
tampón con el fin de asegurar la eliminación de las sustancias
inhibidoras así como el agente previamente a la lisis celular. Así
pues, cuando tales células se someten a lisis, el ácido nucleico
blanco se encuentra en un entorno con mínimas cantidades de
sustancias inhibidoras del proceso de hibridación al que se va a
someter el ácido nucleico blanco.
Actualmente se utilizan una variedad de procesos
para preparar ácidos nucleicos blanco en muestras para hibridación
o amplificación. Por ejemplo, las muestras de esputo que se
procesan para amplificar secuencias de ácido nucleico
micobacteriano se someten típicamente a un proceso con NALC/NaOH.
El método de la presente invención puede ser particularmente útil
con muestras micobacterianas sometidas a tal proceso con NALC/NaOH
debido a su solubilización selectiva de las pastillas de NALC/NaOH
para reducir el aglutinamiento de tales muestras. Similarmente,
otros tipos de muestras clínicas se someten a otros procesos
estándar bien conocidos, por ejemplo centrifugación para muestras de
gran volumen como sangre y orina. El método de la presente
invención puede usarse antes, como parte de, o después de esos
procesos estándar, con tal de que el método se practique
previamente a la lisis de las células que contienen el ácido
nucleico blanco.
El método de la presente invención no requiere la
fijación y liberación cuantitativa de ácido nucleico blanco en una
superficie de fijación, y así pues permite el uso de más muestra que
la que convencionalmente se utiliza en ensayos de amplificación o
hibridación basados en ácidos nucleicos. Esa habilidad de usar más
muestra confiere una mayor sensibilidad a tales ensayos, ya que hay
más ácido nucleico blanco presente en las etapas iniciales del
ensayo. La selectividad de los agentes al solubilizar las sustancias
inhibidoras pero no solubilizar de forma concomitante el ácido
nucleico blanco o las paredes celulares es una de las
características de los agentes que contribuye a los resultados del
método de la presente invención como se evidencia en los ejemplos
expuestos a continuación.
Los ejemplos siguientes ilustran realizaciones
específicas de la invención aquí descrita. Como resultará patente
para los artesanos diestros, son posibles varios cambios y
modificaciones que se contemplan dentro del alcance de la
invención descrita.
El propósito de este ejemplo era determinar si un
método de la presente invención reduce la cantidad de inhibición
de la amplificación de ácidos nucleicos en una muestra clínica y
por lo tanto arroja mejores valores de detección del blanco en
comparación con un método de procesado de muestras estándar de
control.
- \bullet
- Perclorato sódico (Sigma)
- \bullet
- Tiocianato sódico (Sigma)
- \bullet
- Tiocianato de guanidina (Sigma)
- \bullet
- H_{2}O destilada por ósmosis inversa (``RODI'')
- \bullet
- MycroPrep (BBL)
- \bullet
- Diluyente de muestras MAC/TB
- \bullet
- Disolución de tampón fosfato (BBL)
- \bullet
- Cápsulas que contienen perlas de circonio (Becton Dickinson)
- \bullet
- Muestras de esputo clínicas; identificadores de muestra 785, 657, 634, 8594, 8894, 13883, 8396, 13867, 13088 y 146
- \bullet
- Células de complejo micobacteriano M. avium (``MAC'')
- \bullet
- H_{2}O RODI
- \bullet
- KPO_{4} 500 mM
- \bullet
- PBA 50x
- \bullet
- dCAG 50x
- \bullet
- BSA, 5 mg/ml
- \bullet
- DTT 100 mM
- \bullet
- Trehalosa al 50%
- \bullet
- UDG, 1 U/ul
- \bullet
- Magnesio 192 mM
- \bullet
- dU 50x
- \bullet
- UDI, 5 U/ul
- \bullet
- Bst, 120 U/ul
- \bullet
- Bso BI, 160 U/ul
- \bullet
- Control de amplificación interno (``IAC'') 10^{3}
- \bullet
- Glicerol al 55%
- \bullet
- DMSO
- \bullet
- ADN placental humano
- \bullet
- Antiespumante
- \bullet
- Diluyente del blanco
- \bullet
- Mezcla de hibridación de M tb.
- \bullet
- Sondas de MAC
- \bullet
- Diluyente de hibridación
- \bullet
- Mezcla de hibridación del IAC
- \bullet
- Fluido del sistema
- \bullet
- Fluido de lavado
- \bullet
- Dispositivo de ensayo (``AD'')
- \bullet
- LUMIPHOS 530
- \bullet
- Tubos Labcraft® de 2,0 ml
- \bullet
- Calibradores de ensayo de MAC
- \bullet
- Calibradores de ensayo
Se preparó NaClO_{4} en concentración 2 M en
agua destilada. Se preparó NaSCN en concentración 3 M en agua
destilada. Se preparó GuSCN en concentración 4 M en agua
destilada. Se dispensaron cada una de estas tres disoluciones
caotrópicas en diez tubos LabCraft® de 2,0 ml a razón de 1,0
ml/tubo. Se dispensó una alícuota de 1,0 ml de tampón de muestra
MAC/TB en diez tubos LabCraft® de 2,0 ml.
Se descongelaron hasta temperatura ambiente diez
muestras de esputo clínicas. Se añadió tampón MycoPrep en un
volumen igual a los volúmenes de las muestras de esputo; se
sometieron a vórtice las muestras y se mantuvieron a temperatura
ambiente durante 15 minutos.
Se añadió entonces tampón fosfato a cada muestra
para ajustar el volumen total de cada muestra a 50 ml. Las
muestras se sometieron a vórtice y se centrifugaron con una fuerza
centrífuga relativa (FCR) de 3.000 durante 20 minutos. Se decantó
el sobrenadante, se añadieron 2,0 ml de tampón fosfato a cada
muestra y se sometieron a vórtice las muestras. Las muestras
resultantes se doparon con células MAC a razón de 75
partículas/ml.
Se dispensó entonces una alícuota de 500 ul de
cada muestra en los cuatro tipos de tampón de lavado descritos
(tampón de muestra, NaClO_{4} 2 M, NaSCN 3 M y GuSCN 4 M a razón
de 1,0 ml/tubo, véase anteriormente). Las muestras se sometieron a
vórtice y se centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0
minutos. Se decantó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla
con 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB, y luego se centrifugó con
una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. De nuevo, se decantó el
sobrenadante y se resuspendió la pastilla con 1,0 ml de tampón de
muestra MAC/TB y se centrifugó con una FCR de 12.200 durante 3,0
minutos.
Se insertó una cápsula que contenía perlas de
circonio en cada tubo, y se resuspendió cada pastilla con 400 ul de
tampón de muestra MAC/TB. Las muestras se calentaron durante 30
minutos a 105ºC en un horno de aire caliente forzado para producir
la lisis de las células micobacterianas y convertir cualquier
organismo micobacteriano en no infeccioso. Se cargaron entonces los
tubos de muestra en un instrumento Savant CellPrep™ que se hizo
funcionar con un parámetro de 5,0 m/s durante 45 segundos para
separar los ácidos nucleicos de otros componentes celulares. Las
muestras se procesaron entonces adicionalmente en un sistema de
amplificación y detección de MAC/TB como sigue.
Se efectuó una SDA termofílica esencialmente como
se describe en la solicitud de patente europea publicada con el nº
0 684 315 en una mezcla de reacción que comprendía fosfato potásico
25 mM de pH 7,6, 100 \mug/ml de albúmina sérica bovina
acetilada (BSA), dUTP 0,5 mM, dATP y dGTP cada uno 0,2 mM, y
2'-desoxicitidin
5'-O-(1-tiotrifosfato)
(\alpha-tio dCTP) 1,4 mM, glicerol al 12%,
acetato magnésico 6,5 mM, cebadores de amplificación 0,5 \muM,
cebadores deflectores 0,05 \muM, 50 ng de ADN placental humano,
12,5 unidades de polimerasa Bst, 160 unidades de BsoBI, 1 unidad
de uracil-N- glicosilasa (UNG) y 2 unidades de
inhibidor de la uracil-N-glicosilasa
(Ugi).
Previamente a la adición de las enzimas y la
iniciación de la reacción de amplificación, se llevaron a
ebullición las muestras durante 2 minutos. Las muestras se
incubaron entonces a 41ºC durante 2 minutos y se añadió UNG para
degradar cualquier amplicón contaminante. Tras 30 minutos de
incubación con UNG, se transfirieron las muestras a 52ºC durante 5
minutos. Se añadió la mezcla enzimática (polimerasa Bst, BsoBI,
Ugi y glicerol) y se dejó proceder la amplificación durante 30
minutos a 52ºC. La reacción se detuvo por ebullición durante 5
minutos.
Los productos de amplificación se detectaron en
un ensayo de quimioluminiscencia esencialmente como el descrito por
C. A. Spargo y otros (Molec. Cell. Probes 7,
395-404, 1993). Se añadieron sondas de detector
etiquetadas con fosfatasa alcalina para M. tb, MAC e IAC, sondas
de captura biotiniladas para M. tb, MAC e IAC, y las muestras al
pocillo de una placa de microtitulación recubierta con
estreptavidina y se incubaron durante 50 minutos a 37ºC. Los
pocillos se lavaron entonces tres veces con tampón astringente. Se
añadió LUMIPHOS (Lumigen, Inc.) y se incubó la reacción durante 30
minutos a 37ºC. Se detectó la luminiscencia en un luminómetro
(Dynatech) y se registraron las unidades de luz relativas
(RLUs).
Los resultados se proporcionan en la tabla a
continuación, como los valores medios de M. tb, MAC e IAC para las
diez muestras, y en forma gráfica en la figura 1.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|}\hline
Caótropo \+ TB (RLU) \+ MAC (RLU) \+ IAC (RLU) \\\hline
NaClO _{4} 2 M \+ 0,42 \+ 189,1 \+ 157,4 \\\hline NaSCN 3 M \+
0,42 \+ 166,6 \+ 122,5 \\\hline GuSCN 4 M \+ 0,5; 11,91* \+
196,1 \+ 87,7 \\\hline Control \+ 0,6; 2,33* \+ 36,2 \+ 54,1
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
* Ambos métodos de lavado tenían la misma
muestra con valores de M. tb. positivos, lo que indica un posible
diagnóstico erróneo en el centro clínico.
Los datos de este ejemplo indican que,
estadísticamente, no hay diferencia en los valores de IAC para
ninguna de las condiciones de lavado; no obstante, resulta
interesante el que los valores medios de todas las condiciones de
agente sean más altos que los del procedimiento de lavado de
control. Los datos muestran también estadísticamente que la
condición de GuSCN 4 M produjo valores de RLU de MAC
específicamente más altos que ninguna de las otras tres
condiciones. Eso indica que el método de la presente invención como
se practicó aquí no daña a la micobacteria y, de hecho, en el caso
del GuSCN 4 M, mejora la recuperación del organismo MAC y
subsiguientemente el ADN blanco.
El propósito de este ejemplo era cribar muestras
clínicas en función de la inhibición de la amplificación de ácidos
nucleicos.
- \bullet
- Reactivo MycoPrep
- \bullet
- Tampón fosfato BBL, pH 6,8
- \bullet
- Diluyente de muestras TB/MAC
- \bullet
- Esputos de cultivo negativo y frotis negativo procedentes de N. Carolina Public Health [Salud Pública de Carolina del Norte], identificadores de muestra 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406, 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243 y 103
- \bullet
- Cápsulas que contienen perlas de circonio
Los mismos que para el ejemplo 1 y un plásmido
IN2 de control.
Los mismos que para el ejemplo 1.
Se descongelaron hasta temperatura ambiente
veintitrés muestras de esputo clínicas. Cualquier esputo con más
de 12 ml de esputo se dividió a un tubo separado, de modo que el
rango de volúmenes de una cualquiera de las muestras de esputo
procesadas fuera 7,5 y 12 ml.
Se añadió reactivo MycoPrep a las muestras de
esputo en un volumen igual al volumen de esputo. Las muestras se
sometieron a vórtice y se mantuvieron a temperatura ambiente
durante 15 minutos. El volumen de cada disolución de esputo se
ajustó a 50 ml con tampón fosfato.
Se centrifugaron las disoluciones con una FCR de
3.000 durante 20 minutos. Se decantó el sobrenadante de cada
pastilla de muestra y se añadieron 2,0 ml de tampón fosfato a cada
tubo. Las muestras se dividieron en alícuotas de 500 ul en tubos
LabCraft® de 2,0 ml. Una muestra de cada tipo se mantuvo a
temperatura ambiente y las muestras restantes se almacenaron a
-70ºC.
Se añadió un ml de tampón de muestra MAC/TB a
cada muestra mantenida a temperatura ambiente. Las muestras se
centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se
decantó el sobrenadante, se añadió 1,0 ml de tampón de muestra
MAC/TB a cada tubo y se centrifugaron los tubos con una FCR de
12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante, se añadió
una cápsula que contenía perlas de circonio a cada tubo y
dispensaron 400 ul de tampón de muestra MAC/TB en cada tubo. Los
tubos se calentaron en un horno de aire caliente forzado a 105ºC
durante 30 minutos para producir la lisis de las células
micobacterianas y convertir cualquier organismo micobacteriano en
no infeccioso. Se agitaron los tubos en un instrumento Savant
CellPrep™ usando el parámetro de 5,0 m/s durante 45 segundos. Se
usaron un ensayo de desplazamiento de hebra termofílica (tSDA)
usando el líquido de triple MAC/TB y procedimientos de detección
como los descritos en el ejemplo 1 para generar los resultados de
este experimento en unidades de luz relativas (RLUs).
Los resultados se presentan en la tabla a
continuación.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|}\hline
ID de muestra \+ M TB (RLU) \+ MAC (RLU) \+ IAC (RLU) \\\hline
8207 \+ 0,3 \+ 5,3 \+ 0,3 \\\hline 13506 \+ 0,3 \+ 3,8 \+ 0,7
\\\hline 13472 \+ 0,3 \+ 3,9 \+ 12 \\\hline 14199 \+ 0,3 \+
2,1 \+ 44 \\\hline 13847 \+ 0,3 \+ 2,9 \+ 116 \\\hline 3675
\+ 0,3 \+ 2,4 \+ 24 \\\hline 6401 \+ 0,4 \+ 0,9 \+ 0,7
\\\hline 4691 \+ 0,4 \+ 1,3 \+ 2 \\\hline 13545 \+ 0,4 \+ 4,0
\+ 16 \\\hline 13711 \+ 0,3 \+ 2,3 \+ 69 \\\hline 9939 \+ 0,3
\+ 2,0 \+ 10 \\\hline 1514 \+ 0,3 \+ 2,7 \+ 50 \\\hline 12228
\+ 0,3 \+ 0,7 \+ 7 \\\hline 12161 \+ 0,2 \+ 3,5 \+ 6 \\\hline
8406 \+ 0,4 \+ 1,6 \+ 8 \\\hline 782 \+ 0,3 \+ 1,5 \+ 0,4
\\\hline 13547 \+ 0,6 \+ 2,4 \+ 41 \\\hline 13319 \+ 0,9 \+
3,0 \+ 10 \\\hline 243 \+ 0,5 \+ 0,7 \+ 106 \\\hline 13448 \+
0,4 \+ 1,1 \+ 0,8 \\\hline 13420 \+ 0,4 \+ 1,2 \+ 54 \\\hline
103 \+ 0,8 \+ 0,5 \+ 123 \\\hline 12227 \+ 0,5 \+ 1,4 \+ 66
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
De las veintitrés muestras clínicas ensayadas en
el sistema MAC/TB, nueve produjeron valores de IAC de menos de 10
RLUs, lo que indica una severa inhibición de la reacción de
amplificación/detección por parte de la muestra clínica. Estos
especímenes inhibidores producidos bajo condiciones de lavado
``estándar'' de la muestra se procesaron adicionalmente como se
muestra en los ejemplos a continuación.
El propósito de este ejemplo era determinar si se
podían ajustar el pH y la molaridad del lavado con GuSCN para
eliminar más inhibidores de las muestras clínicas.
- \bullet
- Muestras apastilladas tratadas con NALC negativas, nºs. 6401, 8406, 782, 13448 y 13506 del ejemplo 2
- \bullet
- Isotiocianato de guanidina (GuSCN) Gibco BRL
- \bullet
- Tampón de muestra MAC/TB
- \bullet
- Cápsulas que contienen perlas de circonio
- \bullet
- Fosfato potásico (KPO_{4}) 500 mM
- \bullet
- NaOH 5 N Ricca
- \bullet
- Células micobacterianas M. tb.
Los mismos que para el ejemplo 1.
Los mismos que para el ejemplo 1.
Se preparó una mezcla inhibidora tratada con NALC
negativa dispensando 1,0 ml de la muestra 782 y 500 ul de las
muestras 6401, 8406, 13448 y 13506 en un tubo de polipropileno de
2 ml. La mezcla inhibidora se dopó con organismos M. tb a razón de
200 partículas/ml (7,5 partículas/reacción tSDA final). Las
disoluciones de GuSCN se prepararon como se resume en la tabla a
continuación. Las disoluciones de pH 7,0 y 9,0 se ajustaron al pH
indicado con NaOH 5 N.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline
GuSCN 6,0 M, pH 4,9 \+ GuSCN 4,0 M, pH 5,6 \\\hline GuSCN 6,0 M,
pH 7,0 \+ GuSCN 4,0 M, pH 7,0 \\\hline GuSCN 6,0 M, pH 9,0 \+
GuSCN 4,0 M, pH 9,0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se dispensó cada disolución de GuSCN en un tubo
LabCraft® de 2,0 ml a razón de 1,0 ml/tubo. La mezcla inhibidora
tratada con NALC negativa dopada se dispensó en cada tubo que
contenía GuSCN a razón de 500 ul/tubo.
Se sometieron a vórtice brevemente los tubos y se
centrifugaron los tubos con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos.
Se decantó el sobrenadante y se dispensó 1,0 ml de tampón de
muestra MAC/TB en cada tubo y se centrifugaron los tubos con una
FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se
dispensó 1,0 ml de tampón de muestra MAC/TB en cada tubo. Se
centrifugaron los tubos con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos.
Se decantó el sobrenadante y se insertó una cápsula que contenía
circonio en cada tubo.
Se decantó tampón de muestra MAC/TB en cada tubo
a razón de 400 ul/tubo. Se calentaron los tubos en un horno de aire
caliente forzado a 105ºC durante 30 minutos. Se agitaron los tubos
en un instrumento Savant CellPrep™ utilizando el parámetro de 5,0
m/s durante 45 segundos. Se utilizaron un ensayo tSDA usando el
líquido de triple MAC/TB y los procedimientos de detección
descritos en el ejemplo 1 para generar los resultados de este
experimento en unidades de luz relativas (RLUs).
Los resultados se presentan en la tabla a
continuación y en forma gráfica en la figura 2.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
GuSCN (M) \+ pH \+ RLUs M TB \+ RLUs MAC \+ RLUs IAC \\\hline
4 \+ 5,7 \+ 2,4 \+ 0,3 \+ 1,9 \\\hline 6 \+ 4,9 \+ 1,5 \+
0,4 \+ 0,7 \\\hline 4 \+ 7 \+ 2,4 \+ 0,4 \+ 1,3 \\\hline 6
\+ 7 \+ 32,8 \+ 0,4 \+ 6,6 \\\hline 4 \+ 9 \+ 2,6 \+ 0,4 \+
5,3 \\\hline 6 \+ 9 \+ 1022,7 \+ 0,4 \+ 320,4
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Nota: los valores de M.tb., MAC e IAC son las
medias de cinco muestras de amplificación/detección replicadas.
La condición de GuSCN 6,0 M de pH 9,0 produjo
valores de RLU para M. tb. e IAC estadísticamente mejores que las
otras condiciones, sin producir valores de MAC no específicos. Eso
indica que se elimina una mayor cantidad de inhibidores de la
hibridación de ácidos nucleicos usando la disolución de GuSCN 6,0 M
de pH 9,0, sin liberar ácido nucleico blanco de las
micobacterias.
El propósito de este ejemplo era determinar si
muestras clínicas dopadas con M.tb. y lavadas con la disolución de
GuSCN 6 M de pH 9,0 eliminarían los inhibidores de la hibridación de
ácidos nucleicos no deseados y permitirían la amplificación y
detección del ADN específico de M. tb. blanco.
- \bullet
- Muestras apastilladas tratadas con NALC negativas, nºs. 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406, 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243 y 103
- \bullet
- Isotiocianato de guanidina (GuSCN) Gibco BRL
- \bullet
- Tampón de muestra MAC/TB
- \bullet
- Cápsulas que contienen perlas de circonio
- \bullet
- Fosfato potásico (KPO_{4}) 500 mM
- \bullet
- NaOH 5 N Ricca
Los mismos que para el ejemplo 1.
Los mismos que para el ejemplo 1.
Se preparó una disolución de GuSCN en
concentración 6 M con KPO_{4} 200 mM y se ajustó a pH 9,0 con
NaOH 5 N como en el ejemplo 3. Se doparon con organismos M. tb.
500 ul de cada muestra clínica de la sección Materiales del ejemplo
2 a razón de 200 partículas/ml (7,5 partículas/reacción de
amplificación). Algunas de estas muestras del ejemplo 2 eran
inhibidoras de la hibridación de ácidos nucleicos. Se doparon con
M. tb 500 ul de tampón MAC/TB a razón de 200 partículas/ml y se
etiquetaron como ``control de procesado de la muestra''.
Se dispensó la disolución de GuSCN en un tubo
LabCraft® de 2,0 ml a razón de 1,0 ml y se etiquetó el tubo como
``control negativo de GuSCN''. Se dispensó un ml de la disolución
GuSCN 6 M de pH 9,0 en cada tubo de muestra clínica.
Los tubos se sometieron a vórtice y se
centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se
decantó el sobrenadante y se dispensó 1,0 ml de tampón MAC/TB en
cada tubo y los tubos se centrifugaron con una FCR de 12.200
durante 3,0 minutos. Se decantó el sobrenadante y se dispensó 1,0
ml de tampón de muestra MAC/TB en cada tubo; los tubos se
centrifugaron con una FCR de 12.200 durante 3,0 minutos. Se
decantó el sobrenadante y se añadió una cápsula de circonio a cada
tubo. Se añadió tampón de muestra MAC/TB a cada tubo a razón de
400 ul/tubo. Los tubos se calentaron y agitaron como se describió
en los ejemplos anteriores. Se utilizaron un ensayo tSDA usando el
líquido de triple MAC/TB y procedimientos de detección descritos en
el ejemplo 1 para generar los resultados de este experimento en
unidades de luz relativas (RLUs).
\newpage
Los resultados se presentan en una tabla a
continuación como la media de tres réplicas de amplificación para
cada muestra procesada y en forma gráfica en las figuras 3A y
3B.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline
ID Muestra clínica \+ M TB (RLUs) \+ IAC (RLUs) \\\hline 8207
\+ 1515,7 \+ 298,9 \\\hline 1514 \+ 1290,5 \+ 200,8 \\\hline
13472 \+ 223,5 \+ 79,6 \\\hline 14199 \+ 1004,8 \+ 263,4
\\\hline 13847 \+ 1342,1 \+ 154,3 \\\hline 3675 \+ 294,7 \+
20,2 \\\hline 6401 \+ 279,5 \+ 71,6 \\\hline 13545 \+ 396,5 \+
43,6 \\\hline 13711 \+ 275,5 \+ 32,8 \\\hline 9939 \+ 335 \+
134,6 \\\hline 12227 \+ 1144,1 \+ 185,4 \\\hline 12228 \+ 297,7
\+ 43,6 \\\hline 12161 \+ 778,1 \+ 66,6 \\\hline 8406 \+ 478,6
\+ 90,9 \\\hline 4691 \+ 344,6 \+ 15,3 \\\hline 13547 \+
1271,9 \+ 188 \\\hline 13448 \+ 358,5 \+ 16,3 \\\hline 13506
\+ 1470,4 \+ 101,8 \\\hline 13319 \+ 993,7 \+ 88 \\\hline 13420
\+ 1490,5 \+ 305 \\\hline 243 \+ 1406,2 \+ 117,9 \\\hline 103
\+ 1052,2 \+ 132,5 \\\hline 782 \+ 158,9 \+ 171,3 \\\hline
Control negativo GuSCN \+ 1,8 \+ 91,7 \\\hline Control M. tb y
tampón \+ 568,5 \+ 37,9
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Veintitrés valores de IAC dieron valores de tSDA
aceptables superiores a 10 RLUs, lo que indica que no se inhibió
la reacción de amplificación. Además, se detectó M.tb. a razón de
7,5 partículas/reacción de amplificación en todas las muestras
dopadas, como evidencian la relaciones de las RLU específicas con
las de fondo menores de 88,2:1 para cada muestra. En el ejemplo 2,
se demostró que cinco de las muestras clínicas con las que no se
usaba lavado con GuSCN tenían valores de IAC inhibidores de menos
de 10 RLUs. Se consiguieron mejoras en casi todas las muestras
(incluso en las que se mostraron como inhibidoras por la baja
generación de señal en el ejemplo 2) con el método de la presente
invención como se practica en este ejemplo.
Si bien se ha descrito la invención con cierta
especificidad, pueden realizarse modificaciones patentes para
quienes tengan una destreza ordinaria en la técnica sin salirse
del alcance de la invención. Varias características de la invención
se exponen en las reivindicaciones siguientes.
Claims (7)
1. Un método para reducir la cantidad de
sustancias que son inhibidoras de procesos de hibridación de
ácidos nucleicos en una muestra que contiene células seleccionadas
del grupo consistente en complejo M. avium y células de
M. tuberculosis que comprende los pasos de:
- (a)
- previamente a la lisis de las células, poner en contacto dichas células con un agente caótropo, seleccionado de entre el grupo consistente en NaClO_{4}, NaSCN y/o isotiocianato de guanidina, que (i) solubiliza dichas sustancias y (ii) no efectúa la liberación del ácido nucleico de dichas células; y
- (b)
- separar dichas células de dicho agente.
2. El método de la reivindicación 1 en el que el
caótropo es isotiocianato de guanidina.
3. El método de la reivindicación 2 en el que el
isotiocianato de guanidina está presente en una disolución con un
pH básico.
4. El método de la reivindicación 3 en el que el
pH es aproximadamente 9,0.
5. El método de la reivindicación 3 en el que la
concentración de isotiocianato de guanidina es aproximadamente 6
M.
6. El método de la reivindicación 1 en el que la
separación es mediante lavado y centrifugación.
7. El método de la reivindicación 1 en el que
previamente al paso (a) se apastillan las células.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/774,476 US5763185A (en) | 1996-12-30 | 1996-12-30 | Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization |
| US08/774476 | 1996-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2197294T3 true ES2197294T3 (es) | 2004-01-01 |
Family
ID=25101356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97122878T Expired - Lifetime ES2197294T3 (es) | 1996-12-30 | 1997-12-24 | Metodo para reducir inhibidores de la hibridacion de acidos nucleicos. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5763185A (es) |
| EP (1) | EP0851032B1 (es) |
| JP (1) | JP4271273B2 (es) |
| AU (1) | AU728014B2 (es) |
| BR (1) | BR9706374A (es) |
| CA (1) | CA2220270C (es) |
| DE (1) | DE69722159T2 (es) |
| ES (1) | ES2197294T3 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6210881B1 (en) * | 1996-12-30 | 2001-04-03 | Becton, Dickinson And Company | Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization |
| US7569342B2 (en) * | 1997-12-10 | 2009-08-04 | Sierra Molecular Corp. | Removal of molecular assay interferences |
| US6656685B2 (en) * | 2001-01-29 | 2003-12-02 | Ventana Medical Systems, Inc. | Hybridization buffers using low molecular weight dextran sulfate and methods for their use |
| EP1540009B1 (en) * | 2002-08-05 | 2011-09-28 | Quanta Biosciences, Inc. | Improved compositions for in vitro amplification of nucleic acids |
| CN101384715A (zh) * | 2006-02-15 | 2009-03-11 | 东曹株式会社 | 从生物材料中提取核酸的方法 |
| JP2008167722A (ja) | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法 |
| JP5568968B2 (ja) * | 2009-11-30 | 2014-08-13 | 東洋紡株式会社 | 抗酸菌の溶菌方法 |
| CN112662663B (zh) * | 2021-01-27 | 2022-11-08 | 苏州赛普生物科技有限公司 | 一种适于常温运输的rna提取试剂盒及提取方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5482834A (en) * | 1982-05-17 | 1996-01-09 | Hahnemann University | Evaluation of nucleic acids in a biological sample hybridization in a solution of chaotrophic salt solubilized cells |
| CA1301606C (en) * | 1986-05-02 | 1992-05-26 | David H. Gillespie | Chaotropic method for evaluating nucleic acids in a biological sample |
| NL8900725A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| US5010183A (en) * | 1989-07-07 | 1991-04-23 | Macfarlane Donald E | Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents |
| US5130423A (en) * | 1990-07-13 | 1992-07-14 | Microprobe Corporation | Non-corrosive compositions and methods useful for the extraction of nucleic acids |
| US5284940A (en) * | 1990-11-14 | 1994-02-08 | Hri Research, Inc. | Preparation for nucleic acid samples |
| US5571894A (en) * | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
| BR9206341A (pt) * | 1991-08-06 | 1994-11-08 | World Health Org | Processo de isolamento de DNA |
| CA2121659C (en) * | 1993-05-11 | 2000-11-28 | Michael C. Little | Sample processing method for mycobacteria |
| AU4586096A (en) * | 1995-03-10 | 1996-09-19 | Becton Dickinson & Company | Sample processing method for whole blood |
| US5620869A (en) * | 1995-09-28 | 1997-04-15 | Becton, Dickinson And Company | Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions |
-
1996
- 1996-12-30 US US08/774,476 patent/US5763185A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-05 CA CA002220270A patent/CA2220270C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-17 BR BR9706374A patent/BR9706374A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-12-24 ES ES97122878T patent/ES2197294T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-24 EP EP97122878A patent/EP0851032B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-24 DE DE69722159T patent/DE69722159T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-26 JP JP36852297A patent/JP4271273B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-30 AU AU49314/97A patent/AU728014B2/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10191978A (ja) | 1998-07-28 |
| CA2220270A1 (en) | 1998-06-30 |
| DE69722159D1 (de) | 2003-06-26 |
| CA2220270C (en) | 2001-10-09 |
| EP0851032B1 (en) | 2003-05-21 |
| EP0851032A1 (en) | 1998-07-01 |
| MX9709074A (es) | 1998-06-30 |
| JP4271273B2 (ja) | 2009-06-03 |
| AU4931497A (en) | 1998-07-02 |
| US5763185A (en) | 1998-06-09 |
| AU728014B2 (en) | 2001-01-04 |
| DE69722159T2 (de) | 2003-11-27 |
| BR9706374A (pt) | 1999-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2259742C (en) | Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization | |
| US5386024A (en) | Method to prepare nucleic acids from a biological sample using low pH and acid protease | |
| AU693836B2 (en) | Method for extracting nucleic acids from a wide range of organisms | |
| WO1995014768A9 (en) | Method for extracting nucleic acids from a wide range of organisms | |
| JP2575290B2 (ja) | ミコバクテリアの試料処理方法 | |
| EP1856295B1 (en) | Compositions and methods for detecting viral specific nucleic acids in urine | |
| ES2197294T3 (es) | Metodo para reducir inhibidores de la hibridacion de acidos nucleicos. | |
| Frickhofen et al. | A rapid method of sample preparation for detection of DNA viruses in human serum by polymerase chain reaction | |
| US6268127B1 (en) | Method for preparing DNA from serum and plasma | |
| MXPA97009074A (es) | Metodo para reducir los inhibidores de hibridizacion del acido nucleico | |
| KR950008291B1 (ko) | B형과c형 간염 바이러스의 동시분석 방법과 이를 위한 시약키트 | |
| WO1997037040A2 (en) | Isolation and/or amplification of hepatitis c virus (hcv) nucleic acids from samples suspected to contain hcv |