JPH09512101A - Mycobacterium種の存在の検出法およびその方法に用いられるキットおよび抗体 - Google Patents
Mycobacterium種の存在の検出法およびその方法に用いられるキットおよび抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒトおよび動物起源の生物学的標本におけるMycobacterium種の検出および同定を行なうための診断試験に関する。この試験はMycobacteriumから得られる1種類以上の抗原の免疫学的検出に基づいている。抗体−抗原反応を検出することができるようにするため、これらの抗原に特異的な抗体を酵素または蛍光染料で標識し、またはラテックス粒子または任意の他の好適な標識に結合させることができる。診断試験はELISAの形態であり、実際の試験の前にMycobacterium抗原の濃縮を必要とすることもありまたはない。本発明は、好適なマイコバクテリア種および菌株の選択および入手、抗原の単離および精製、各種のキャリヤー分子を用いる実験動物の免疫感作に必要な抱合体の調製、抗体産生を監視する分析法の開発、(複数の)Mycobacterium抗原に特異的な抗体の特性決定、および診断法/キットの開発を含んでいる。
Description
【発明の詳細な説明】
Mycobacterium種の存在の検出法および
その方法に用いられるキットおよび抗体発明の背景
本発明は、免疫学的方法に基づいた、Mycobacterium種の存在の検出法および
その方法に用いられるキットおよび抗体に関する。
Mycobacteriumの様々な既知種は、ヒトおよび動物に多数の感染症を引き起こ
すことが知られている。このようなMycobacterium種の一つである、Mycobacteri
um tuberculosisは、ヒトで結核を引き起こす。
結核は、世界のほとんど至る所で見られる主要な伝染病であると考えられてい
る。医科学および有効薬剤の範囲の長足の進歩により、ある時期には、この疾病
は克服されてしまったという印象を生んだにも拘らず、また組織化された国際的
努力にも拘らず、結核は世界の健康問題において大きな割合を占めている。19
90年だけでも、世界中で8百万人を上回る新たな患者と3百万人を上回る死亡
が報告された(Snider,1994)。世界保険機構が行なった予測によれば、西暦2
000年までに年間の数字は新たな患者数が10.2百万人および死亡が3.5
百万人にまで増え、アジアおよびサハラ砂漠以南のアフリカが最も患者数の多い
大陸となることが示されている(Dolin,RaviglioneおよびKoch,1994)。19
90年代の結核患者の推定数および同じ期間での死亡推定数の世界的な分布を、
それぞれ第1図および第2図に示す(Dolin,RaviglioneおよびKoch,1994)。
結核とAIDSとの間の緊密な関連性が立証されたこと、並びにこれらの疾病
が両方共共存することが多いことにより、事態は重大性を増している(Torresら
、1990; De Cock,1994; CantwellおよびBinkin,1994; Murray,1994)。Mycoba
cterium tuberculosisおよび他の変則的なマイコバクテリアの菌株に多剤耐性が
出現したことにより、この非常に大きな問題に別の局面が加わった(Blumberg,M
illerおよびKoomhof,1994; Morse,1994)。
結核および関連のマイコバクテリアによる疾病の正確且つ時機を得た検出を行
なうことは、これらの疾病と闘うための更に良好な結果が得られる包括的な戦略
を開発する上で重要な要件の一つである。
従来の実験室検出法は、生および死桿菌を識別することができず(迅速且つ単
純なZiehl-Neelsen染色)、またはこれらの方法によって生桿菌の存在が確認さ
れた場合に、実験室試験を完了するまでに数週間を要するといった主要な不利益
を有する。また、これによって治療の開始が遅れることがあり、また疾患が更に
蔓延することがある。
更に最近の方法は、血清学的試験、マイコバクテリア抗原に対するリンパ細胞
の増殖応答のような方法、またはアデノシンデアミナーゼの濃度を測定すること
による感染に対する患者の応答の検出、またはELISAのようなイムノアッセ
イ、ガスおよび液体クロマトグラフィまたはマススペクトル分析法を用いるマイ
コバクテリア抗原および成分の検出に基づいている。更に最近では、分子生物学
的方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、DNAプローブまたはDN
A指紋作成(DNA fingerprinting)が挙げられる(Musialら、1988; Godfrey-Fauss
ett,1994)。
しかしながら、上記の方法のいずれも生および死マイコバクテリア細胞を識別
することができる迅速、簡単で、信頼性のある試験の総ての要件を満たしてはい
ない。発明の要約
本発明によれば、動物の生物学的試料中のMycobacterium種の少なくとも1種
の細胞内マイコバクテリア抗原を免疫学的に検出することにより、この試料中の
種を検出して同定するための診断分析法が提供される。
「細胞内マイコバクテリア抗原」とは、本明細書では非表面抗原またはMycoba
cterium種の代謝生成物であると定義される。
細胞内マイコバクテリア抗原は、好ましくは生物学的試料を細胞内マイコバク
テリア抗原に特異的な(複数の)抗体に暴露することによって検出される。
この分析法は、好ましくは試料中に含まれるマイコバクテリア細胞の少なくと
も幾つかをリーシスしてその細胞壁に含まれる抗原の少なくとも幾つかを放出し
た後、試料を抗体と接触させる工程を含んでいる。
この分析法は、好ましくは生物学的試料を処理して、任意の有機破片から埋設
されているマイコバクテリア細胞を放出させ、生物学的試料の汚染を除去して、
その中に含まれる望ましくない微生物を除去した後、マイコバクテリア細胞をリ
ーシスする工程をも含んでいる。
細胞内マイコバクテリア抗原は、好ましくはMycobacterium種の細胞壁に含ま
れるミコール酸の混合物であって、それぞれが下記の一般構造を有するものであ
る。
生物学的試料は、好ましくは喀啖、血液、脳脊髄液、糞便、尿、消化器洗浄物
、唾液、組織、喉頭用綿棒、または皮膚外傷からの滲出物である。
この分析法は、好ましくは固定化した抗体へのアフィニティにより試料中のミ
コール酸を濃縮した後、これらを標識した抗体と接触させる工程をも含んでいる
。濃縮工程は、免疫−アフィニティカラムを用いて行なうのが好ましい。
本発明のもう一つの態様によれば、抽出したマイコバクテリア性ミコール酸お
よび混入物の混合物からの上記の一般構造を有するマイコバクテリア性ミコール
酸の群分離およびそれに続く精製法は、
二相性溶媒にミコール酸と混入物との混合物を溶解し、
この混合物を液−液相分離を行なう
工程を含んでいる。
好ましくは、精製したミコール酸は、続いて化学的に誘導体形成されない。二
相溶媒系は、好ましくはクロロホルム、メタノールおよび水を含んでなる。この
二相溶媒系は、上相と下相とを含んでなるのが好ましい。
この方法は、好ましくは上相と下相とを混合して、平衡にする工程をも含んで
なる。
上相の組成は、好ましくは12〜18%クロロホルム、45〜55%メタノー
ル、および20〜40%水である。更に好ましくは、上相の組成は、15%クロ
ロホルム、52%メタノールおよび3%水である。
下相の組成は、好ましくは50〜80%クロロホルム、15〜40%メタノー
ルおよび2〜8%水である。更に好ましくは、下相の組成は、68%クロロホル
ム、27%メタノール、および5%水である。
精製は、好ましくは向流装置または任意の他の液−液抽出装置を用いて行なう
。
本発明のもう一つの態様によれば、下記の一般構造を有する精製されたミコー
ル酸である分離され精製された群が提供される。
本発明のもう一つの態様によれば、細胞内マイコバクテリア性抗原に対する抗
体が提供される。
この抗体はモノクローン性抗体またはポリクローン性抗体でもよく、好ましく
は動物性のものである。
本発明のもう一つの態様によれば、マイコバクテリア性細胞内抗原/キャリヤ
ー抱合体(conjugate)が提供される。
細胞内抗原は、好ましくはミコール酸であり、これは好ましくはキャリヤーに
吸着される。
このキャリヤーは、牛血清アルブミン、ゼラチンまたはキーホール・リンペッ
ツ・ヘモシアニン(keyhole limpets hemocyanin)のようなタンパク質であること
ができる。
本発明の更にもう一つの態様によれば、生物学的試料でMycobacterium種の存
在を検出するためのキットは、
上記の方法によって精製し、検出可能に標識したミコール酸に対して生じた抗
体
を含んでなる。
このキットは、かなりの量のマイコバクテリア性ミコール酸/キャリヤー抱合
体と、場合によっては固定化抗体を含むこともできる。発明の詳細な説明
本発明の目的は、喀啖、脳脊髄液、血液、尿、糞便、または組織試料、消化器
洗浄物、唾液、喉頭用綿棒、または皮膚外傷からの滲出物のようなヒトまたは動
物性の生物学的標本中のMycobacteriaの存在を確認するための診断試験を開発す
ることである。
この試験は、Mycobacteriaから生じる1種類以上の細胞性抗原/ミコール酸の
免疫学的検出に基づいている。この試験は、酵素、蛍光染料、ラテックス粒子、
または任意の他の好適な標識で標識した抗体の使用に基づいている。
ミコール酸は、α−位に中程度の長さの脂肪族鎖を有する高分子量のα−ヒド
ロキシ脂肪酸である。
Mycobacterium属のそれぞれの種は、得意な型のミコール酸を特徴とすること
が知られているので(Butler,jostおよびKilburn,1991; ButlerおよびKilburn
,1988)、分析に供給される特異抗体を用いてこの属の様々な構成員を識別する
ことが可能であろう。実施例1
本発明の基礎を形成する研究により、下記の段階からなる生物学的試料中のMy
cobacterium種の検出および同定の方法が提供される。
段階1 Mycobacterium菌株の獲得。培養物は、American Type Culture Collect
ion(ATCC)から購入した。
段階2 Mycobacterium培養物からのミコール酸の単離、HPLC分析によるミ
コール酸の同定、およびそれらの精製。
段階3 BSA、KLHおよびゼラチンをキャリヤー分子として用いるミコール
酸抱合体の調製。
段階4 実験動物の免疫感作およびミコール酸に特異的な抗体の産生。抗体の特
性決定。
段階5 (抗原−抗体反応を検出可能にする)診断試験/アッセイの実施。
段階6 続いて、診断試験/アッセイの評価、このアッセイの特異性および感受
性の確認、実地試験、現行の試験/アッセイとの比較。
研究中に用いた材料(実験動物を含む)、方法および結果を、以下に説明する
。材料
培養
Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294である感染したヒトの肺から
最初に単離された伝染性の強い菌株を、実験に用いた。
培養物は、American Type Culture Collection(ATCC)、メリーランド、アメ
リカ合衆国から凍結乾燥した形態で購入した。
培地
下記の培地をM.tuberculosisの培養に用いた。
液体培地: Dubosブロス
固体培地: Loewenstein-Jensen(LJ)培地
Middlebrook 7H-10 培地
これらの培地の調製に必要な成分の詳細な組成、並びにそれらの殺菌に推奨さ
れた条件は、Laboratory Manual of Tuberculosis Methods,Tuberculosis Rese
arch Institute of the SA Medical Research Council (1980年、第6章
、83〜105頁;第2版、EE Nel,HH KleebergおよびEMS Gatnerにより改訂
)に記載されている。
これらの培地は、Pretoria大学、病理学研究所、医用微生物学部で調
製した。
試薬
下記の試薬を、ミコール酸のケン化、抽出、誘導体形成、および高性能液体ク
ロマトグラフィ(HPLC)分析に用いた。
試薬A: メタノール−水(1:1)に溶解した25%水酸化カリウム(分析
級);62.5gの水酸化カリウムを水125mlに溶解し、メタノール125
ml(BDH、HPLC級(grade))を加えた。
試薬B: 濃塩酸(BDH、分析級)、水で1:1に希釈。
試薬C: メタノール−水(1:1)に溶解した2%重炭酸カリウム(BDH
、分析級);10gの重炭酸カリウムを250mlの水に溶解し、250mlの
メタノールを加えた。
試薬D: パラ−ブロモフェナシルブロミドをクラウンエーテル(Pierce Chem
ical Co,Cat.No.48891)に溶解したものを500μlずつテフロンコーティン
グを施したした隔壁を有する小型の琥珀色のねじ栓の付い
たバイアルに分配した。栓をきつく閉めて、バイアルをParafilmで包装した。試
薬Dを4℃で保存した。
試薬E: 試薬Eは、試薬Bをメタノールと1:1で混合することによって調
製した。
HPLC標準:
Ribi Immuno Chem Research Company,Cat No R-50からの高分子量内部
標準(C−100)。標準1mgを塩化メチレン(BDH、HPLC級)に懸濁
し、350μlずつをテフロンコーティングを施した隔膜を有する小型のねじ栓
付きバイアルに分配した。このバイアルをパラフィルムで包装して、4℃で保管
した。
塩化メチレンの蒸発を制限するため、HPLC標準分配液を操作中に氷
上に保持した。
クロロホルム(Associated Chemical Enterprises,化学的純粋級)。
塩化メチレン(BDH、HPLC級)。
試薬A、B、CおよびEは、総ての必要な安全性の注意を払いながら、実験前
に新たに調製した。
二回蒸留して脱イオン化した水を用いて、試薬を調製した。
下記の試薬を、抽出したミコール酸の精製に用いた。
クロロホルム(Saarchem,分析級)。
メタノール(Merck,化学的に純粋)。
下記の試薬を用いて、実験動物の免疫感作を行なった。
牛血清アルブミン(BSA)−Sigma Lot 11H1040。
ミコール酸−BSA抱合体。
キーホール・リンペッツ・ヘモシアニン(Keyhole Limpets Hemocyanin)
−KLH Sigma Immuno Chemicals。
ミコール酸−KLH抱合体。
Freundの不完全アジュバント(FIA)。
AdjuPrime Immune Modulator(Pierce Chemical Company,Cat No77138)
。
滅菌食塩水−二回蒸留水中の塩化ナトリウム0.85%(m/v)溶液
。
下記の試薬をミコール酸に特異的な抗体を検出するためのELISAの開発に
おいて使用した。
牛血清アルブミン(BSA)−Sigma Lot 11H1040。
ゼラチン(Serva,Lot 22151,Reinst-Research Grade)。
ゼラチン−MA抱合体
PBS− 塩化ナトリウム(Unilab,化学的純粋級,Lot 28159)、
リン酸水素ナトリウム12水和物(Merck,化学的純粋級,
Lot 7468715)、
塩化カリウム(Merck,化学的純粋級,Lot 6420150)、
リン酸二水素ナトリウム(Merck,化学的純粋級,Lot 6332
422)
を含んでなるリン酸緩衝食塩水(pH7.4)。
0.1Mクエン酸(Merck,Lot 775A)、
0.1Mクエン酸三ナトリウム(Merck,Lot 8533833)を
を含んでなるクエン酸緩衝液(pH4.5)。
カゼイン(Merck,Lot 0100 336 V279342)。
O−フェニレンジアミン(二塩酸塩)(Sigma,Lot 59F-5021)。
メタノール(Saarchem,分析級,バッチ番号31260)。
ヤギ抗マウスモノクローン性抗体−ペルオキシダーゼ抱合体(Cappel,Lo
t 37081)。
基質: 8mg尿素水素ペルオキシダーゼ、
10mgo−フェニレンジアミン/10ml 0.1Mク
エン酸緩衝液。
5匹の免疫感作したマウスおよび3匹のコントロールマウスから得た血
清試料をこの試験で用いた。
実験動物
6週齢の雌性Balb-Cマウスを免疫感作実験に用いた。これらのマウスは
、ヨハネスブルグのSouth African Institure for Medical ResearchのAnimal C
entreで飼育した。
ELISAプレート
Nunc Immunoplates(Maxisorp)プレートを、ELISA試験に用いた。
向流分離装置
H O POST,Instrument Company Inc.,ミドル・ヴィレッジ、ニューヨー
ク、製の向流装置を、研究に用いた。
方法
下記の方法を、実験作業に用いた。
細菌株の培養
細菌を Dubosブロス、
Loewnestein-Jensen培地(斜面培地)、および
Middlebrook 7H-10寒天培地(斜面培地)
を用いて37℃で培養した。
細菌試料からのミコール酸の調製
細菌試料の調製は、下記の3段階からなっていた。
Mycobacteria細胞の収集、
ケン化、および
ミコール酸の抽出。
ミコール酸のケン化、抽出、および誘導体形成は、Butler,Jostおよび
Kilburn(1991)の方法によって、若干の修飾を加えて行ない、関連見出しの下で
記載されている。
ミコール酸の抽出、誘導体形成およびHPLC分析に用いたガラス器は
2%(v/v)Contrad(Merck)で洗浄し、水で濯いだ後、クロロホルム、水、
技術級エタノール、水で濯ぎ、最後に2回蒸留脱イオン水で濯いだ。洗浄したガ
ラス器を温和な空気オーブンで乾燥した。
収集は、斜面培地の表面から(滅菌したプラスチック製ループを用いて
)細菌成長物をを掻き取ることによって行なった。均質な細菌懸濁液は、試薬A
中で、滅菌したガラスビーズと共に収集した細胞を浸透または混合(vortexing)
することによって調製した。
Mycobacteriaの試薬A中でのケン化は、121℃のオートクレーブ中で
1時間行なった。
ミコール酸の抽出は、下記の工程からなっていた。
試料を冷却し、それぞれの試料に1.5mlの試薬Bを加えた。混合し
た後、それぞれの試料のpHをチェックし、必要ならば、試薬BでpH1に調整
した。
次いで、2.0mlのクロロホルムをそれぞれの試料に加え、30秒間
混合した。層分離を行なった。下層をパスツール・ピペットで除去し、WISP
バイアルに移して、窒素気流中で熱ブロック蒸発装置で85℃で蒸発乾固した。
残部の微量の酸を中和するため、試薬C100μlをそれぞれの試料に加え、流
体を窒素気流中で熱ブロック蒸発装置で85℃で蒸発乾固した。
HOLC分析のためのミュール酸誘導体形成
抽出したミコール酸は、下記のようにして誘導体形成を行なった。
それぞれの冷却した試料に、1.0mlのクロロホルムを加えた後、試
薬D50μlを加えた。蓋をした試料を30秒間混合し、熱ブロック蒸発装置で
85℃で20分間加熱した。次いで、試料を冷却し、試薬E1.0mlを加えた
。試料を30秒間混合し、層を分離させた。下層をパスツール・ピペットで除去
し、WISPバイアルに移した。バイアルを熱ブロック蒸発装置に入れて、その
内容物を窒素気流中で85℃で蒸発乾固した。
残渣を0.212g(160μlに相当)塩化メチレンに再懸濁し、蓋
をして、混合した。それぞれの再構成した試料に5μlのHPLC内部標準を加
えた物を0.45μm膜フィルターを通して濾過して、琥珀色のWISPバイア
ルに入れた。再度蓋をしたバイアルを、HPLC分析の準備が整うまで4℃で保
管した。
ミコール酸のHPLC分析および定量
HPLC分析には、それぞれの試料(操作中氷上に保持)25μlを分
析した。コントロール試料、すなわち濾過した塩化メチレン25μl、を、それ
ぞれの試料の組を分析する前に分析した。多数の試料を分析するときには、HP
LC装置の信頼性を立証する目的で、3または4試験試料毎にコントロール試料
を分析した。
逆相HPLC分析は、
ポンプ(Beckman 110B Solvent Delivery Module)、
検出器(プログラム可能な検出器モジュール166または168)、
カラム(Mova-Pak C18 4μm 3.9×150mm)、およびスチー
ルカートリッジカラム用の末端コネクターセット
からなるBeckman System Gold High Performance Liquid Chromatograp
hy装置を用いて行なった。
実験条件は、下記の通りであった。
移動相:
溶媒A: HPLC級メタノール、
溶媒B: HPLC級塩化メチレン、
流速: 2.5ml/分、
カラム温度: 30℃。
検出器は、260nmに設定した。
HPLCグラディエントは、最初は、98%(v/v)メタノール(溶
媒A)および2%(v/v)塩化メチレン(溶媒B)からなっていた。
グラディエントは、1分で80%Aおよび20%Bまで直線的に増加し
、10分後に35%Aおよび65%Bとなり、30秒間保持した後、30秒間か
けて98%Aおよび2%Bまで減少した。この比率を4分間保持して系を安定化
させた後、次の試料を注入した。
ミコール酸の数学的定量は、試験試料の合わせたピーク面積を高分子量
内部HPLC標準の導入量のピーク面積と比較することによって行なった。
ミコール酸の精製および他の脂肪酸のグループ分け
0〜24の番号の25本の試験管からなる向流分布列を実験に用いた。緩衝液
溜めに、上相約900mlを加えた。試験管番号0に、大規模抽出実験(30〜
150mg)から得たM.tuberculosisの粗製細胞抽出物の試料を下相10ml
および上相10mlに溶解したものを加えた。残りの24本の試験管に10ml
の下相のアリュートを入れた。サイクル当たり10mlの上相を自動的に試験管
番号0に分配し、25サイクルを繰り返し、約16時間の操作を行なった。この
ようにして、それぞれのサイクルが20回の混合と40分の相分離時間とからな
る25回の向流サイクルを行なった。
それぞれの移行により、試料から生じて上相に含まれる溶質は次の試験管に運
ばれる。25回の移行を完了した後、分離した溶質画分は、25本の試験管の列
に沿って分布されることになる。
25本の試験管中の脂肪酸の分布を明確に記載するため、上相および下相の乳
化パターンを試験管列内部で観察し、画分をそれによって決定した。
次に、向流により分離した材料を試験管からテフロンチューブが取り付けられ
た50mlガラス注射器を用いて採取した。材料を7個の画分にプールし、それ
ぞれ70℃のBuchiエバポレーター中で真空乾燥し、乾燥した材料をクロロホル
ム、メタノールまたは水(約5ml)に再溶解し、琥珀色のWISPバイアルに
移して、必要になるまで4℃で保管した。
向流分離によって精製したミコール酸の収率
精製/分離のおおよその収率を計算するため、向流分離/精製の後に得られた
試料に含まれるミコール酸の秤量した量をミコール酸ピーククラスターの相対ピ
ーク面積から算出した向流装置に導入される粗製の細胞抽出物に含まれるこれら
の化合物の量および粗製の細胞抽出物のHPLCクロマトグラム中の標準のピー
ク面積から算出されるものと比較した。
ミコール酸の向流精製
ミコール酸を単離する目的でButler,JostおよびKilburn(1991)によって提案
された方法によりM.tuberculosisから抽出された材料は、10%未満のミコー
ル酸を含むことを見いだした(第1表)。ミコール酸を免疫原性にするには、牛
血清アルブミンのようなキャリヤー分子にこの精製した材料を結合させる必要が
ある。この方法の重要な要件は、好適な溶媒中でのミコール酸の溶解度の比率で
ある。
上記の相系を用いるM.tuberculosis H37Rv ATCC 27294からの粗製のミコール
酸の抽出物の向流精製を、25サイクル行なった。
試験管列で最終的相を混合し、数分間沈降させたところ、材料が試験管列にど
のように分布しているかを極めて正確に表している乳化パターンが観察された。
画分1、2、3、4および5をHPLCによって分析したところ、ピーク1お
よび2はミコール酸の性状を示し、ピーク4および5は短鎖脂肪酸の性状を示し
ていた(グラフ1)。
画分6および7は、クロロホルムに可溶性でなかったため、HPLCによって
分析することはできなかった。
質量分布パターン(第1表)は、ミコール酸の更に極性の大きい混入物からの
ベースライン分離が得られたが、8%の収率は実験誤差の限界内で粗抽出物から
のミコール酸の理論収率と相関したことを示している。
ミコール酸−BSA抱合体の調製
0.1N NaHCO3(pH8.3)5mg/500μlを含むBSAの溶
液を調製した。向流精製したミコール酸(4.5mg)の試料を450μlのク
ロロホルムに溶解した。BSA溶液を、ミコール酸溶液200μlに1分20秒
掛けて徐々に室温で加えた。この工程中に、混合物を混合しておいた。更に30
秒間混合した後、試料を氷上に15分間置いた。次いで、試料を氷上に保持した
まま、氷冷アセトン(2ml)を2分間で加えた。混合物を半時間放置した。
HPLC分析のため溶液の4分の1をもう一つのバイアルに採取した後(0.
5mg)、試料を3回の短い10秒間の遠心分離パルスで遠心分離し、ペレット
をアセトンで2回洗浄した。次に、ペレットをWISPバイアルに戻して、風乾
し、箔の下で4℃に保持した。HPLC分析用に採取した試料は、熱ブロック上
で乾燥した。
アジュバントの添加は、下記のようにして行なった。
AdjuPrime Immune Modulatorの試料(10mg)をガラス棒で粉砕し、熱ブロ
ック上で乾燥したミコール酸−BSA抱合体の試料を加えた。粉末を一緒に粉砕
して、均質な粉末として、この1mgを秤量により採取して、1mlの滅菌食塩
水に溶解した。残りのAdjuPrime/BSA−ミコール酸混合物は、真空下で密封し
て、箔で覆い、4℃で保管した)。
食塩溶液を、Branson Sonifier-Cell disruptor B-30を用いて、10秒間のパ
ルスサイクルを10回行ない、10秒間停止した後、30秒間のパルスサイクル
を1回行なって超音波処理を行なったところ、均一な粒子の分散体を得た。超音
波処理中に、試料は氷上に保持した。製造業者によって添付された用法に従い、
食塩溶液を4℃で4時間放置した後、免疫感作に用いた。
免疫感作に要する免疫原を採取した後、大過剰の氷冷アセトンを残りの食塩溶
液に加え、タンパク質を沈澱させた。沈澱を冷アセトンで2回濯ぎ、箔で覆って
4℃のアセトン下で保管した。
ミコール酸−ゼラチン抱合体の調製
0.1N NaHCO3(pH8.3)2ml中5mgのゼラチンを含んでな
るゼラチンの溶液を調製した。この溶液の500μlをメタノール600μlに
加えて、混合した。次に、この混合物を、2mgのミコール酸をクロロホルム5
0μlに溶解したものに1分20秒掛けて徐々に、攪拌しながら加えた。次に、
試料を更に30秒間混合し、氷上に15分間置いた。
試料を100mlのSchottボトルに移し、氷冷したアセトン80mlを加えた
。このScottボトルを氷上に30分間置いた。ゼラチンに吸着したミコール酸を
含んでなる沈澱をアセトンで2回濯ぎ、試料を4℃でアセトン下に保管した。
マウスの免疫感作
マウスの免疫感作は、下記のプロトコールに従って行なった。
免疫感作手続きのそれぞれは、コントロール実験も行ない、2匹のマウスの群
にキャリヤー分子および相当するアジュバントだけを同じ注射法を用いて注射し
た。
第一の免疫感作中に、5匹の雌性Balb-Cマウスの後足掌にミコール酸−抱合体
およびアジュバント混合物の一部を注射した。混合物約50μlは、足から注射
した。次の免疫感作中に、ミコール酸抱合体とアジュバントとの混合物の同容積
を皮下注射した。
最初および次の出血について、数滴の血液をコントロールマウスを含むそれぞ
れのマウスの尾静脈から採取した。
抗体産生の監視
血清の調製
抗体産生を監視するため、数滴の血液をそれぞれのマウスの尾静脈から
得た。最初の出血中に、5匹の免疫感作したマウスおよび3匹のコントロールマ
ウスからの血液をプールし、2本のEppendorff試験管に入れて、混合し、凝固さ
せた。血清を、Eppendorffベンチ遠心分離機て10分間遠心分離することによっ
て赤血球から分離した。集めた血清上清を4℃で保管した。次の出血に対して、
血液試料を集めて、個々に滴定した。
ELISAプレートの調製
ELISAプレートをBSAまたはミコール酸−ゼラチン抱合体を10
μg/mlBSA緩衝液(pH7.4)の濃度で含むコーティング溶液でコーテ
ィングした。
BSAまたはミコール酸−ゼラチンコーティング溶液50μlの分量を
個々のウェルに入れ、ELISAプレートを室温で16時間インキュベーション
した。
次に、ELISAプレートを、ウェル当たり0.5%(m/v)カゼイ
ン/PBS緩衝液(pH7.4)200μlで、室温で1時間ブロックした。ブ
ロッキング溶液をフリッキング・アウト(flicking-out)によって除去し、プレー
トを乾燥した。
血清の滴定
免疫感作したマウスから得た血清を0.5%(m/v)カゼイン/PB
S緩衝液(pH7.4)で希釈して、ELISAプレートに3回ロードした。コ
ントロールマウス、すなわちBSA AdjuPrimeで感作したマウスおよび免疫感作さ
れていないマウスから得られる血清も、同様に0.5%(m/v)カゼイン/P
BS緩衝液(pH7.4)で希釈し、ウェル当たり50μlでELISAプレー
トに3回ロードした。
BSA−ミコール酸抱合体で免疫感作したマウスから得られた血清の直
接滴定は、阻害分析(inhibition assay)も行ない、抗体の特異性を確認した。阻
害実験については、BSA−ミコール酸抱合体をELISAプレート上でインキ
ュベーション中に抗血清に対して0.32mg/mlで競合抗原として加えた。
このプレートを、プレートシェーカーで室温で1時間インキュベーショ
ンした。その後、血清を除き、プレートを0.5%(m/v)カゼイン/PBS
緩衝液(pH7.4)でAnthos Autowashを用いて3回洗浄した。
ヤギ抗マウスペルオキシダーゼと抱合したモノクローン性抗体を1:4
000に希釈したものをELISAプレート(50μl/ウェル)に加え、プレ
ートを室温で60分間プレートシェーカーに置いた。ペルオキシダーゼ抱合体溶
液をフリック・アウト(flicked out)し、プレートを0.5%(m/v)カゼイ
ン/PBS緩衝液(pH7.4)で3回洗浄して、過剰の抱合体を除去した。基
質を混合し、ウェル当たり50μlでウェルに加えた。
個々のウェルの吸光度をSLT 340 ATC ELISA記録装置を用いて1.5時
間記録した。
ELISA免疫感作実験の結果および考察
第3図は、マウスをミコール酸−BSA抱合体で免疫することによって
得た抗体応答を示している。棒グラフは、それぞれ3回の希釈物の組についての
標準偏差の大きさと共に、記録された吸光度の読み(x103)を表す。BSA
キャリヤーに対する強い応答(右欄)およびミコール酸に対する弱い応答(左欄
)を得た。
免疫感作プログラムの59日後に、免疫した5匹のマウスの2匹が抗血
清を産生し、0.32mg/ml可溶性BSA−ミコール酸抱合体と混合した抗
血清の1:50希釈では、ELISA−シグナルの24%が阻害されることを示
した。阻害は、ミコール酸特異抗体の結合部位を溶液中でBSAに配位したミコ
ール酸でブロッキングし、これによりELISAプレートに結合するミコール酸
特異抗体の数を低下させることによって行なった。
BSAをコーティング抗原として用いるときには、強いELISA−シ
グナルが得られ、5匹総てのマウスの免疫感作が高度であることを示していた。
抗ミコール酸活性を示すマウスから得られた抗血清の1:50希釈物のシグナル
の阻害がないことは、0.32mg/ml可溶性BSA−ミコール酸抱合体で抗
血清をインキュベーションすることによって観察することができた。これは、抗
BSA抗体が高濃度で含まれているため、感受性範囲外の抗キャリヤーBSA抗
体が阻害されることによるものと思われる。
抗ミコール酸免疫応答は、抗体濃度の増加および/または抗体に対する
親和性の増加を生じる応答の適度な成熟を得るには、更に長時間の免疫感作を必
要とする。また、マウスは、ミコール酸に対してモノ特異性となるモノクローン
性抗体の産生に用いることもできる。
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Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 動物の生物学的試料のMycobacterium種の少なくとも1個の細胞内マイ コバクテリア抗原を免疫学的に検出することによる、生物学てき試料中のMycoba cterium種を検出し、同定するための診断法。 2. 細胞内マイコバクテリア抗原を、生物学的試料を細胞内マイコバクテリ ア抗原に特異的な抗体に暴露することによって検出する、請求の範囲第1項に記 載の診断法。 3. 試料を抗体と接触させる前に試料中に含まれる任意のマイコバクテリア 細胞の少なくとも幾つかをリーシスする工程を含んでなる、請求の範囲第1項ま たは第2項に記載の診断法。 4. 生物学的試料を処理して、任意の有機破片からそれに含まれているマイ コバクテリア細胞を放出させ、生物学的試料の汚染を除去することによりその中 に含まれる望ましくない微生物を除去した後、マイコバクテリア細胞をリーシス する工程をも含んでなる、請求の範囲第3項に記載の診断法。 5. 試料中の細胞内マイコバクテリア抗原を、固定化抗体へのアフィニティ によって濃縮した後、これを標識した抗体と接触させる工程を更に含んでなる、 請求の範囲第1〜4項のいずれか1項に記載の診断法。 6. 細胞内マイコバクテリア抗原がMycobacterium種の細胞壁に含まれるミ コール酸の混合物であり、それぞれが下記の一般構造を有するものである、請求 の範囲第1〜5項のいずれか1項に記載の診断法。 7. 生物学的試料が、喀啖、血液、脳脊髄液、糞便、尿、消化器洗浄物、唾 液、組織、喉頭用綿棒、または皮膚外傷からの滲出物である、請求の範囲第1〜 6項のいずれか1項に記載の診断法。 8. 抽出したマイコバクテリア性ミコール酸および混入物から下記の一般構 造を有するマイコバクテリア性ミコール酸群の分割およびそれに続く精製法であ って、二相性溶媒にミコール酸と混入物との混合物を溶解し、 この混合物を液−液相分離を行なう 工程を含んでなる、方法。 9. 精製したミコール酸が引き続いて化学的な誘導体形成に付されない、請 求の範囲第8項に記載の方法。 10. 二相溶媒系がクロロホルム、メタノールおよび水からなる、請求の範 囲第8項または第9項に記載の方法。 11. 二相溶媒系が上相と下相とを有する、請求の範囲第8〜10項のいず れか1項に記載の方法。 12. 上相および下相を混合して平衡にする工程を更に含んでなる、請求の 範囲第11項に記載の方法。 13. 上相の組成が12〜18%クロロホルム、45〜55%メタノール、 および20〜40%水である、請求の範囲第11項または第12項に記載の方法 。 14. 上相の組成が15%クロロホルム、52%メタノール、および3%水 である、請求の範囲第13項に記載の方法。 15. 下相の組成が50〜80%クロロホルム、15〜40%メタノール、 および2〜8%水である、請求の範囲第11〜14項のいずれか1項に記載の方 法。 16. 下相の組成が68%クロロホルム、27%メタノール、および5%水 である、請求の範囲第15項に記載の方法。 17. 精製が、向流装置または任意の他の液−液抽出装置を用いて行なう、 請求の範囲第8〜16項のいずれか1項に記載の方法。 18. 請求の範囲第8〜17項のいずれか1項に記載の方法によって群に分 けられ精製された、下記の一般構造を有する精製されたミコール酸。 19. Mycobacterium種の細胞壁に含まれるミコール酸の混合物に対する単 離された抗体において、それぞれのミコール酸が下記の一般構造を有する抗体。 20. モノクローン性抗体またはポリクローン性抗体である、請求の範囲第 19項に記載の単離された抗体。 21. 動物性のポリクローナル抗体である、請求の範囲第20項に記載の単 離された抗体。 22. ミコール酸が請求の範囲第8〜17項のいずれか1項に記載のいずれ か1項に記載の方法によって精製される、請求の範囲第19〜21項のいずれか 1項に記載の単離された抗体。 23. 細胞内抗原がキャリヤーに吸着している、マイコバクテリア性細胞内 抗原/キャリヤー抱合体。 24. 細胞内抗原がミコール酸の混合物であり、それぞれのミコール酸が下 記の一般構造を有する、請求の範囲第23項に記載のマイコバクテリア性細胞内 抗原/キャリヤー抱合体。 25. キャリヤーが牛血清アルブミン、ゼラチンまたはキーホール・リンペ ッツ・ヘモシアニンである、請求の範囲第23項または第24項に記載のマイコ バクテリア性の細胞内抗原/キャリヤー抱合体。 26. 生物学的試料中のMycobacterium種の存在を検出するキットにおいて 、 請求の範囲第8〜17項のいずれか1項に記載の方法によって精製し、検出可 能に標識したミコール酸混合物に対して生じた抗体 を含んでなる、キット。 27. 請求の範囲第23〜25項のいずれか1項に記載のマイコバクテリア 性ミコール酸/キャリヤー抱合体のかなりの量および場合によっては固定化抗体 を更に含んでなる、請求の範囲第26項に記載のキット。
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