JPH09512101A

JPH09512101A - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の存在の検出法およびその方法に用いられるキットおよび抗体

Info

Publication number: JPH09512101A
Application number: JP7526812A
Authority: JP
Inventors: アドリアヌスバースコアー，ヤン; ノエルバイ，サンドラ
Original assignee: アドコック、イングラム、リミテッド
Priority date: 1994-04-14
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 1997-12-02
Also published as: GR3032471T3; DK0755517T3; ATE187251T1; US6124105A; PT755517E; EP0755517B1; PL181579B1; MXPA96004705A; DE69513649T2; ES2141348T3; EP0755517A1; PL316792A1; CN1150840A; DE69513649D1; AU2220595A; AU695968B2; BR9507389A; CA2187779A1; WO1995028642A1; US6458367B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトおよび動物起源の生物学的標本におけるMycobacterium種の検出および同定を行なうための診断試験に関する。この試験はMycobacteriumから得られる１種類以上の抗原の免疫学的検出に基づいている。抗体−抗原反応を検出することができるようにするため、これらの抗原に特異的な抗体を酵素または蛍光染料で標識し、またはラテックス粒子または任意の他の好適な標識に結合させることができる。診断試験はＥＬＩＳＡの形態であり、実際の試験の前にMycobacterium抗原の濃縮を必要とすることもありまたはない。本発明は、好適なマイコバクテリア種および菌株の選択および入手、抗原の単離および精製、各種のキャリヤー分子を用いる実験動物の免疫感作に必要な抱合体の調製、抗体産生を監視する分析法の開発、（複数の）Mycobacterium抗原に特異的な抗体の特性決定、および診断法／キットの開発を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】 Mycobacterium種の存在の検出法およびその方法に用いられるキットおよび抗体発明の背景本発明は、免疫学的方法に基づいた、Mycobacterium種の存在の検出法およびその方法に用いられるキットおよび抗体に関する。 Mycobacteriumの様々な既知種は、ヒトおよび動物に多数の感染症を引き起こすことが知られている。このようなMycobacterium種の一つである、Mycobacteri um tuberculosisは、ヒトで結核を引き起こす。結核は、世界のほとんど至る所で見られる主要な伝染病であると考えられている。医科学および有効薬剤の範囲の長足の進歩により、ある時期には、この疾病は克服されてしまったという印象を生んだにも拘らず、また組織化された国際的努力にも拘らず、結核は世界の健康問題において大きな割合を占めている。１９９０年だけでも、世界中で８百万人を上回る新たな患者と３百万人を上回る死亡が報告された（Snider，1994）。世界保険機構が行なった予測によれば、西暦２０００年までに年間の数字は新たな患者数が１０．２百万人および死亡が３．５百万人にまで増え、アジアおよびサハラ砂漠以南のアフリカが最も患者数の多い大陸となることが示されている（Dolin，RaviglioneおよびKoch，1994）。１９９０年代の結核患者の推定数および同じ期間での死亡推定数の世界的な分布を、それぞれ第１図および第２図に示す(Dolin，RaviglioneおよびKoch，1994)。結核とＡＩＤＳとの間の緊密な関連性が立証されたこと、並びにこれらの疾病が両方共共存することが多いことにより、事態は重大性を増している(Torresら、1990; De Cock，1994; CantwellおよびBinkin，1994; Murray，1994)。Mycoba cterium tuberculosisおよび他の変則的なマイコバクテリアの菌株に多剤耐性が出現したことにより、この非常に大きな問題に別の局面が加わった(Blumberg，M illerおよびKoomhof，1994; Morse，1994)。結核および関連のマイコバクテリアによる疾病の正確且つ時機を得た検出を行なうことは、これらの疾病と闘うための更に良好な結果が得られる包括的な戦略を開発する上で重要な要件の一つである。従来の実験室検出法は、生および死桿菌を識別することができず（迅速且つ単純なZiehl-Neelsen染色）、またはこれらの方法によって生桿菌の存在が確認された場合に、実験室試験を完了するまでに数週間を要するといった主要な不利益を有する。また、これによって治療の開始が遅れることがあり、また疾患が更に蔓延することがある。更に最近の方法は、血清学的試験、マイコバクテリア抗原に対するリンパ細胞の増殖応答のような方法、またはアデノシンデアミナーゼの濃度を測定することによる感染に対する患者の応答の検出、またはＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ、ガスおよび液体クロマトグラフィまたはマススペクトル分析法を用いるマイコバクテリア抗原および成分の検出に基づいている。更に最近では、分子生物学的方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡプローブまたはＤＮＡ指紋作成(DNA fingerprinting)が挙げられる(Musialら、1988; Godfrey-Fauss ett，1994)。しかしながら、上記の方法のいずれも生および死マイコバクテリア細胞を識別することができる迅速、簡単で、信頼性のある試験の総ての要件を満たしてはいない。発明の要約本発明によれば、動物の生物学的試料中のMycobacterium種の少なくとも１種の細胞内マイコバクテリア抗原を免疫学的に検出することにより、この試料中の種を検出して同定するための診断分析法が提供される。「細胞内マイコバクテリア抗原」とは、本明細書では非表面抗原またはMycoba cterium種の代謝生成物であると定義される。細胞内マイコバクテリア抗原は、好ましくは生物学的試料を細胞内マイコバクテリア抗原に特異的な（複数の）抗体に暴露することによって検出される。この分析法は、好ましくは試料中に含まれるマイコバクテリア細胞の少なくとも幾つかをリーシスしてその細胞壁に含まれる抗原の少なくとも幾つかを放出した後、試料を抗体と接触させる工程を含んでいる。この分析法は、好ましくは生物学的試料を処理して、任意の有機破片から埋設されているマイコバクテリア細胞を放出させ、生物学的試料の汚染を除去して、その中に含まれる望ましくない微生物を除去した後、マイコバクテリア細胞をリーシスする工程をも含んでいる。細胞内マイコバクテリア抗原は、好ましくはMycobacterium種の細胞壁に含まれるミコール酸の混合物であって、それぞれが下記の一般構造を有するものである。生物学的試料は、好ましくは喀啖、血液、脳脊髄液、糞便、尿、消化器洗浄物、唾液、組織、喉頭用綿棒、または皮膚外傷からの滲出物である。この分析法は、好ましくは固定化した抗体へのアフィニティにより試料中のミコール酸を濃縮した後、これらを標識した抗体と接触させる工程をも含んでいる。濃縮工程は、免疫−アフィニティカラムを用いて行なうのが好ましい。本発明のもう一つの態様によれば、抽出したマイコバクテリア性ミコール酸および混入物の混合物からの上記の一般構造を有するマイコバクテリア性ミコール酸の群分離およびそれに続く精製法は、二相性溶媒にミコール酸と混入物との混合物を溶解し、この混合物を液−液相分離を行なう工程を含んでいる。好ましくは、精製したミコール酸は、続いて化学的に誘導体形成されない。二相溶媒系は、好ましくはクロロホルム、メタノールおよび水を含んでなる。この二相溶媒系は、上相と下相とを含んでなるのが好ましい。この方法は、好ましくは上相と下相とを混合して、平衡にする工程をも含んでなる。上相の組成は、好ましくは１２〜１８％クロロホルム、４５〜５５％メタノール、および２０〜４０％水である。更に好ましくは、上相の組成は、１５％クロロホルム、５２％メタノールおよび３％水である。下相の組成は、好ましくは５０〜８０％クロロホルム、１５〜４０％メタノールおよび２〜８％水である。更に好ましくは、下相の組成は、６８％クロロホルム、２７％メタノール、および５％水である。精製は、好ましくは向流装置または任意の他の液−液抽出装置を用いて行なう。本発明のもう一つの態様によれば、下記の一般構造を有する精製されたミコール酸である分離され精製された群が提供される。本発明のもう一つの態様によれば、細胞内マイコバクテリア性抗原に対する抗体が提供される。この抗体はモノクローン性抗体またはポリクローン性抗体でもよく、好ましくは動物性のものである。本発明のもう一つの態様によれば、マイコバクテリア性細胞内抗原／キャリヤー抱合体(conjugate)が提供される。細胞内抗原は、好ましくはミコール酸であり、これは好ましくはキャリヤーに吸着される。このキャリヤーは、牛血清アルブミン、ゼラチンまたはキーホール・リンペッツ・ヘモシアニン(keyhole limpets hemocyanin)のようなタンパク質であることができる。本発明の更にもう一つの態様によれば、生物学的試料でMycobacterium種の存在を検出するためのキットは、上記の方法によって精製し、検出可能に標識したミコール酸に対して生じた抗体を含んでなる。このキットは、かなりの量のマイコバクテリア性ミコール酸／キャリヤー抱合体と、場合によっては固定化抗体を含むこともできる。発明の詳細な説明本発明の目的は、喀啖、脳脊髄液、血液、尿、糞便、または組織試料、消化器洗浄物、唾液、喉頭用綿棒、または皮膚外傷からの滲出物のようなヒトまたは動物性の生物学的標本中のMycobacteriaの存在を確認するための診断試験を開発することである。この試験は、Mycobacteriaから生じる１種類以上の細胞性抗原／ミコール酸の免疫学的検出に基づいている。この試験は、酵素、蛍光染料、ラテックス粒子、または任意の他の好適な標識で標識した抗体の使用に基づいている。ミコール酸は、α−位に中程度の長さの脂肪族鎖を有する高分子量のα−ヒドロキシ脂肪酸である。 Mycobacterium属のそれぞれの種は、得意な型のミコール酸を特徴とすることが知られているので(Butler，jostおよびKilburn，1991; ButlerおよびKilburn ，1988)、分析に供給される特異抗体を用いてこの属の様々な構成員を識別することが可能であろう。実施例１本発明の基礎を形成する研究により、下記の段階からなる生物学的試料中のMy cobacterium種の検出および同定の方法が提供される。段階１ Mycobacterium菌株の獲得。培養物は、American Type Culture Collect ion（ATCC）から購入した。段階２ Mycobacterium培養物からのミコール酸の単離、ＨＰＬＣ分析によるミコール酸の同定、およびそれらの精製。段階３ＢＳＡ、ＫＬＨおよびゼラチンをキャリヤー分子として用いるミコール酸抱合体の調製。段階４実験動物の免疫感作およびミコール酸に特異的な抗体の産生。抗体の特性決定。段階５（抗原−抗体反応を検出可能にする）診断試験／アッセイの実施。段階６続いて、診断試験／アッセイの評価、このアッセイの特異性および感受性の確認、実地試験、現行の試験／アッセイとの比較。研究中に用いた材料（実験動物を含む）、方法および結果を、以下に説明する。材料培養 Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294である感染したヒトの肺から最初に単離された伝染性の強い菌株を、実験に用いた。培養物は、American Type Culture Collection（ATCC）、メリーランド、アメリカ合衆国から凍結乾燥した形態で購入した。培地下記の培地をM．tuberculosisの培養に用いた。液体培地： Dubosブロス固体培地： Loewenstein-Jensen（LJ）培地 Middlebrook 7H-10 培地これらの培地の調製に必要な成分の詳細な組成、並びにそれらの殺菌に推奨された条件は、Laboratory Manual of Tuberculosis Methods，Tuberculosis Rese arch Institute of the SA Medical Research Council （１９８０年、第６章、８３〜１０５頁；第２版、EE Nel，HH KleebergおよびEMS Gatnerにより改訂）に記載されている。これらの培地は、Ｐｒｅｔｏｒｉａ大学、病理学研究所、医用微生物学部で調製した。試薬下記の試薬を、ミコール酸のケン化、抽出、誘導体形成、および高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析に用いた。試薬Ａ：メタノール−水（１：１）に溶解した２５％水酸化カリウム（分析級）；６２．５ｇの水酸化カリウムを水１２５ｍｌに溶解し、メタノール１２５ｍｌ（ＢＤＨ、ＨＰＬＣ級(grade)）を加えた。試薬Ｂ：濃塩酸（ＢＤＨ、分析級）、水で１：１に希釈。試薬Ｃ：メタノール−水（１：１）に溶解した２％重炭酸カリウム（ＢＤＨ、分析級）；１０gの重炭酸カリウムを２５０ｍｌの水に溶解し、２５０ｍｌのメタノールを加えた。試薬Ｄ：パラ−ブロモフェナシルブロミドをクラウンエーテル(Pierce Chem ical Co，Cat．No．48891)に溶解したものを５００μｌずつテフロンコーティングを施したした隔壁を有する小型の琥珀色のねじ栓の付いたバイアルに分配した。栓をきつく閉めて、バイアルをParafilmで包装した。試薬Ｄを４℃で保存した。試薬Ｅ：試薬Ｅは、試薬Ｂをメタノールと１：１で混合することによって調製した。ＨＰＬＣ標準： Ribi Immuno Chem Research Company，Cat No R-50からの高分子量内部標準（Ｃ−１００）。標準１ｍｇを塩化メチレン（ＢＤＨ、ＨＰＬＣ級）に懸濁し、３５０μｌずつをテフロンコーティングを施した隔膜を有する小型のねじ栓付きバイアルに分配した。このバイアルをパラフィルムで包装して、４℃で保管した。塩化メチレンの蒸発を制限するため、ＨＰＬＣ標準分配液を操作中に氷上に保持した。クロロホルム（Associated Chemical Enterprises,化学的純粋級）。塩化メチレン（ＢＤＨ、ＨＰＬＣ級）。試薬Ａ、Ｂ、ＣおよびＥは、総ての必要な安全性の注意を払いながら、実験前に新たに調製した。二回蒸留して脱イオン化した水を用いて、試薬を調製した。下記の試薬を、抽出したミコール酸の精製に用いた。クロロホルム（Saarchem,分析級）。メタノール（Merck,化学的に純粋）。下記の試薬を用いて、実験動物の免疫感作を行なった。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−Sigma Lot 11H1040。ミコール酸−ＢＳＡ抱合体。キーホール・リンペッツ・ヘモシアニン(Keyhole Limpets Hemocyanin) −KLH Sigma Immuno Chemicals。ミコール酸−ＫＬＨ抱合体。 Freundの不完全アジュバント（FIA）。 AdjuPrime Immune Modulator(Pierce Chemical Company，Cat No77138) 。滅菌食塩水−二回蒸留水中の塩化ナトリウム０．８５％（ｍ／ｖ）溶液。下記の試薬をミコール酸に特異的な抗体を検出するためのＥＬＩＳＡの開発において使用した。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−Sigma Lot 11H1040。ゼラチン(Serva，Lot 22151，Reinst-Research Grade)。ゼラチン−ＭＡ抱合体ＰＢＳ− 塩化ナトリウム（Unilab，化学的純粋級，Lot 28159)、リン酸水素ナトリウム１２水和物(Merck，化学的純粋級， Lot 7468715）、塩化カリウム(Merck，化学的純粋級，Lot 6420150)、リン酸二水素ナトリウム（Merck,化学的純粋級，Lot 6332 422) を含んでなるリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）。０．１Ｍクエン酸(Merck，Lot 775A)、０．１Ｍクエン酸三ナトリウム（Merck，Lot 8533833）をを含んでなるクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）。カゼイン(Merck，Lot 0100 336 V279342)。Ｏ−フェニレンジアミン（二塩酸塩）（Sigma，Lot 59F-5021）。メタノール(Saarchem,分析級，バッチ番号31260)。ヤギ抗マウスモノクローン性抗体−ペルオキシダーゼ抱合体(Cappel,Lo t 37081)。基質：８ｍｇ尿素水素ペルオキシダーゼ、１０ｍｇｏ−フェニレンジアミン／１０ｍｌ０．１Ｍクエン酸緩衝液。５匹の免疫感作したマウスおよび３匹のコントロールマウスから得た血清試料をこの試験で用いた。実験動物６週齢の雌性Balb-Cマウスを免疫感作実験に用いた。これらのマウスは、ヨハネスブルグのSouth African Institure for Medical ResearchのAnimal C entreで飼育した。ＥＬＩＳＡプレート Nunc Immunoplates(Maxisorp)プレートを、ＥＬＩＳＡ試験に用いた。向流分離装置 H O POST，Instrument Company Inc.,ミドル・ヴィレッジ、ニューヨーク、製の向流装置を、研究に用いた。方法下記の方法を、実験作業に用いた。細菌株の培養細菌を Dubosブロス、 Loewnestein-Jensen培地（斜面培地）、および Middlebrook 7H-10寒天培地（斜面培地）を用いて３７℃で培養した。細菌試料からのミコール酸の調製細菌試料の調製は、下記の３段階からなっていた。 Mycobacteria細胞の収集、ケン化、およびミコール酸の抽出。ミコール酸のケン化、抽出、および誘導体形成は、Butler，Jostおよび Kilburn(1991)の方法によって、若干の修飾を加えて行ない、関連見出しの下で記載されている。ミコール酸の抽出、誘導体形成およびＨＰＬＣ分析に用いたガラス器は２％（ｖ／ｖ）Contrad（Merck）で洗浄し、水で濯いだ後、クロロホルム、水、技術級エタノール、水で濯ぎ、最後に２回蒸留脱イオン水で濯いだ。洗浄したガラス器を温和な空気オーブンで乾燥した。収集は、斜面培地の表面から（滅菌したプラスチック製ループを用いて）細菌成長物をを掻き取ることによって行なった。均質な細菌懸濁液は、試薬Ａ中で、滅菌したガラスビーズと共に収集した細胞を浸透または混合(vortexing) することによって調製した。 Mycobacteriaの試薬Ａ中でのケン化は、１２１℃のオートクレーブ中で１時間行なった。ミコール酸の抽出は、下記の工程からなっていた。試料を冷却し、それぞれの試料に１．５ｍｌの試薬Ｂを加えた。混合した後、それぞれの試料のｐＨをチェックし、必要ならば、試薬ＢでｐＨ１に調整した。次いで、２．０ｍｌのクロロホルムをそれぞれの試料に加え、３０秒間混合した。層分離を行なった。下層をパスツール・ピペットで除去し、ＷＩＳＰバイアルに移して、窒素気流中で熱ブロック蒸発装置で８５℃で蒸発乾固した。残部の微量の酸を中和するため、試薬Ｃ１００μｌをそれぞれの試料に加え、流体を窒素気流中で熱ブロック蒸発装置で８５℃で蒸発乾固した。ＨＯＬＣ分析のためのミュール酸誘導体形成抽出したミコール酸は、下記のようにして誘導体形成を行なった。それぞれの冷却した試料に、１．０ｍｌのクロロホルムを加えた後、試薬Ｄ５０μｌを加えた。蓋をした試料を３０秒間混合し、熱ブロック蒸発装置で８５℃で２０分間加熱した。次いで、試料を冷却し、試薬Ｅ１．０ｍｌを加えた。試料を３０秒間混合し、層を分離させた。下層をパスツール・ピペットで除去し、ＷＩＳＰバイアルに移した。バイアルを熱ブロック蒸発装置に入れて、その内容物を窒素気流中で８５℃で蒸発乾固した。残渣を０．２１２ｇ（１６０μｌに相当）塩化メチレンに再懸濁し、蓋をして、混合した。それぞれの再構成した試料に５μｌのＨＰＬＣ内部標準を加えた物を０．４５μｍ膜フィルターを通して濾過して、琥珀色のＷＩＳＰバイアルに入れた。再度蓋をしたバイアルを、ＨＰＬＣ分析の準備が整うまで４℃で保管した。ミコール酸のＨＰＬＣ分析および定量ＨＰＬＣ分析には、それぞれの試料（操作中氷上に保持）２５μｌを分析した。コントロール試料、すなわち濾過した塩化メチレン２５μｌ、を、それぞれの試料の組を分析する前に分析した。多数の試料を分析するときには、ＨＰＬＣ装置の信頼性を立証する目的で、３または４試験試料毎にコントロール試料を分析した。逆相ＨＰＬＣ分析は、ポンプ(Beckman 110B Solvent Delivery Module)、検出器（プログラム可能な検出器モジュール166または168）、カラム（Mova-Pak C18 4μｍ３．９×１５０ｍｍ）、およびスチールカートリッジカラム用の末端コネクターセットからなるBeckman System Gold High Performance Liquid Chromatograp hy装置を用いて行なった。実験条件は、下記の通りであった。移動相：溶媒Ａ：ＨＰＬＣ級メタノール、溶媒Ｂ：ＨＰＬＣ級塩化メチレン、流速：２．５ｍｌ／分、カラム温度：３０℃。検出器は、２６０ｎｍに設定した。ＨＰＬＣグラディエントは、最初は、９８％（ｖ／ｖ）メタノール（溶媒Ａ）および２％（ｖ／ｖ）塩化メチレン（溶媒Ｂ）からなっていた。グラディエントは、１分で８０％Ａおよび２０％Ｂまで直線的に増加し、１０分後に３５％Ａおよび６５％Ｂとなり、３０秒間保持した後、３０秒間かけて９８％Ａおよび２％Ｂまで減少した。この比率を４分間保持して系を安定化させた後、次の試料を注入した。ミコール酸の数学的定量は、試験試料の合わせたピーク面積を高分子量内部ＨＰＬＣ標準の導入量のピーク面積と比較することによって行なった。ミコール酸の精製および他の脂肪酸のグループ分け０〜２４の番号の２５本の試験管からなる向流分布列を実験に用いた。緩衝液溜めに、上相約９００ｍｌを加えた。試験管番号０に、大規模抽出実験（３０〜１５０ｍｇ）から得たM．tuberculosisの粗製細胞抽出物の試料を下相１０ｍｌおよび上相１０ｍｌに溶解したものを加えた。残りの２４本の試験管に１０ｍｌの下相のアリュートを入れた。サイクル当たり１０ｍｌの上相を自動的に試験管番号０に分配し、２５サイクルを繰り返し、約１６時間の操作を行なった。このようにして、それぞれのサイクルが２０回の混合と４０分の相分離時間とからなる２５回の向流サイクルを行なった。それぞれの移行により、試料から生じて上相に含まれる溶質は次の試験管に運ばれる。２５回の移行を完了した後、分離した溶質画分は、２５本の試験管の列に沿って分布されることになる。２５本の試験管中の脂肪酸の分布を明確に記載するため、上相および下相の乳化パターンを試験管列内部で観察し、画分をそれによって決定した。次に、向流により分離した材料を試験管からテフロンチューブが取り付けられた５０ｍｌガラス注射器を用いて採取した。材料を７個の画分にプールし、それぞれ７０℃のBuchiエバポレーター中で真空乾燥し、乾燥した材料をクロロホルム、メタノールまたは水（約５ｍｌ）に再溶解し、琥珀色のＷＩＳＰバイアルに移して、必要になるまで４℃で保管した。向流分離によって精製したミコール酸の収率精製／分離のおおよその収率を計算するため、向流分離／精製の後に得られた試料に含まれるミコール酸の秤量した量をミコール酸ピーククラスターの相対ピーク面積から算出した向流装置に導入される粗製の細胞抽出物に含まれるこれらの化合物の量および粗製の細胞抽出物のＨＰＬＣクロマトグラム中の標準のピーク面積から算出されるものと比較した。ミコール酸の向流精製ミコール酸を単離する目的でButler，JostおよびKilburn(1991)によって提案された方法によりM．tuberculosisから抽出された材料は、１０％未満のミコール酸を含むことを見いだした（第１表）。ミコール酸を免疫原性にするには、牛血清アルブミンのようなキャリヤー分子にこの精製した材料を結合させる必要がある。この方法の重要な要件は、好適な溶媒中でのミコール酸の溶解度の比率である。上記の相系を用いるM．tuberculosis H37Rv ATCC 27294からの粗製のミコール酸の抽出物の向流精製を、２５サイクル行なった。試験管列で最終的相を混合し、数分間沈降させたところ、材料が試験管列にどのように分布しているかを極めて正確に表している乳化パターンが観察された。画分１、２、３、４および５をＨＰＬＣによって分析したところ、ピーク１および２はミコール酸の性状を示し、ピーク４および５は短鎖脂肪酸の性状を示していた（グラフ１）。画分６および７は、クロロホルムに可溶性でなかったため、ＨＰＬＣによって分析することはできなかった。質量分布パターン（第１表）は、ミコール酸の更に極性の大きい混入物からのベースライン分離が得られたが、８％の収率は実験誤差の限界内で粗抽出物からのミコール酸の理論収率と相関したことを示している。ミコール酸−ＢＳＡ抱合体の調製０．１ＮＮａＨＣＯ₃（ｐＨ８．３）５ｍｇ／５００μｌを含むＢＳＡの溶液を調製した。向流精製したミコール酸（４．５ｍｇ）の試料を４５０μｌのクロロホルムに溶解した。ＢＳＡ溶液を、ミコール酸溶液２００μｌに１分２０秒掛けて徐々に室温で加えた。この工程中に、混合物を混合しておいた。更に３０秒間混合した後、試料を氷上に１５分間置いた。次いで、試料を氷上に保持したまま、氷冷アセトン（２ｍｌ）を２分間で加えた。混合物を半時間放置した。ＨＰＬＣ分析のため溶液の４分の１をもう一つのバイアルに採取した後（０．５ｍｇ）、試料を３回の短い１０秒間の遠心分離パルスで遠心分離し、ペレットをアセトンで２回洗浄した。次に、ペレットをＷＩＳＰバイアルに戻して、風乾し、箔の下で４℃に保持した。ＨＰＬＣ分析用に採取した試料は、熱ブロック上で乾燥した。アジュバントの添加は、下記のようにして行なった。 AdjuPrime Immune Modulatorの試料（１０ｍｇ）をガラス棒で粉砕し、熱ブロック上で乾燥したミコール酸−ＢＳＡ抱合体の試料を加えた。粉末を一緒に粉砕して、均質な粉末として、この１ｍｇを秤量により採取して、１ｍｌの滅菌食塩水に溶解した。残りのAdjuPrime/ＢＳＡ−ミコール酸混合物は、真空下で密封して、箔で覆い、４℃で保管した）。食塩溶液を、Branson Sonifier-Cell disruptor B-30を用いて、１０秒間のパルスサイクルを１０回行ない、１０秒間停止した後、３０秒間のパルスサイクルを１回行なって超音波処理を行なったところ、均一な粒子の分散体を得た。超音波処理中に、試料は氷上に保持した。製造業者によって添付された用法に従い、食塩溶液を４℃で４時間放置した後、免疫感作に用いた。免疫感作に要する免疫原を採取した後、大過剰の氷冷アセトンを残りの食塩溶液に加え、タンパク質を沈澱させた。沈澱を冷アセトンで２回濯ぎ、箔で覆って４℃のアセトン下で保管した。ミコール酸−ゼラチン抱合体の調製０．１ＮＮａＨＣＯ₃（ｐＨ８．３）２ｍｌ中５ｍｇのゼラチンを含んでなるゼラチンの溶液を調製した。この溶液の５００μｌをメタノール６００μｌに加えて、混合した。次に、この混合物を、２ｍｇのミコール酸をクロロホルム５０μｌに溶解したものに１分２０秒掛けて徐々に、攪拌しながら加えた。次に、試料を更に３０秒間混合し、氷上に１５分間置いた。試料を１００ｍｌのSchottボトルに移し、氷冷したアセトン８０ｍｌを加えた。このScottボトルを氷上に３０分間置いた。ゼラチンに吸着したミコール酸を含んでなる沈澱をアセトンで２回濯ぎ、試料を４℃でアセトン下に保管した。マウスの免疫感作マウスの免疫感作は、下記のプロトコールに従って行なった。免疫感作手続きのそれぞれは、コントロール実験も行ない、２匹のマウスの群にキャリヤー分子および相当するアジュバントだけを同じ注射法を用いて注射した。第一の免疫感作中に、５匹の雌性Balb-Cマウスの後足掌にミコール酸−抱合体およびアジュバント混合物の一部を注射した。混合物約５０μｌは、足から注射した。次の免疫感作中に、ミコール酸抱合体とアジュバントとの混合物の同容積を皮下注射した。最初および次の出血について、数滴の血液をコントロールマウスを含むそれぞれのマウスの尾静脈から採取した。抗体産生の監視血清の調製抗体産生を監視するため、数滴の血液をそれぞれのマウスの尾静脈から得た。最初の出血中に、５匹の免疫感作したマウスおよび３匹のコントロールマウスからの血液をプールし、２本のEppendorff試験管に入れて、混合し、凝固させた。血清を、Eppendorffベンチ遠心分離機て１０分間遠心分離することによって赤血球から分離した。集めた血清上清を４℃で保管した。次の出血に対して、血液試料を集めて、個々に滴定した。ＥＬＩＳＡプレートの調製ＥＬＩＳＡプレートをＢＳＡまたはミコール酸−ゼラチン抱合体を１０ μｇ／ｍｌＢＳＡ緩衝液（ｐＨ７．４）の濃度で含むコーティング溶液でコーティングした。ＢＳＡまたはミコール酸−ゼラチンコーティング溶液５０μｌの分量を個々のウェルに入れ、ＥＬＩＳＡプレートを室温で１６時間インキュベーションした。次に、ＥＬＩＳＡプレートを、ウェル当たり０．５％（ｍ／ｖ）カゼイン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２００μｌで、室温で１時間ブロックした。ブロッキング溶液をフリッキング・アウト(flicking-out)によって除去し、プレートを乾燥した。血清の滴定免疫感作したマウスから得た血清を０．５％（ｍ／ｖ）カゼイン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、ＥＬＩＳＡプレートに３回ロードした。コントロールマウス、すなわちBSA AdjuPrimeで感作したマウスおよび免疫感作されていないマウスから得られる血清も、同様に０．５％（ｍ／ｖ）カゼイン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、ウェル当たり５０μｌでＥＬＩＳＡプレートに３回ロードした。ＢＳＡ−ミコール酸抱合体で免疫感作したマウスから得られた血清の直接滴定は、阻害分析(inhibition assay)も行ない、抗体の特異性を確認した。阻害実験については、ＢＳＡ−ミコール酸抱合体をＥＬＩＳＡプレート上でインキュベーション中に抗血清に対して０．３２ｍｇ／ｍｌで競合抗原として加えた。このプレートを、プレートシェーカーで室温で１時間インキュベーションした。その後、血清を除き、プレートを０．５％（ｍ／ｖ）カゼイン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）でAnthos Autowashを用いて３回洗浄した。ヤギ抗マウスペルオキシダーゼと抱合したモノクローン性抗体を１：４０００に希釈したものをＥＬＩＳＡプレート（５０μｌ／ウェル）に加え、プレートを室温で６０分間プレートシェーカーに置いた。ペルオキシダーゼ抱合体溶液をフリック・アウト(flicked out)し、プレートを０．５％（ｍ／ｖ）カゼイン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄して、過剰の抱合体を除去した。基質を混合し、ウェル当たり５０μｌでウェルに加えた。個々のウェルの吸光度をSLT 340 ATC ELISA記録装置を用いて１．５時間記録した。ＥＬＩＳＡ免疫感作実験の結果および考察第３図は、マウスをミコール酸−ＢＳＡ抱合体で免疫することによって得た抗体応答を示している。棒グラフは、それぞれ３回の希釈物の組についての標準偏差の大きさと共に、記録された吸光度の読み（ｘ１０³）を表す。ＢＳＡキャリヤーに対する強い応答（右欄）およびミコール酸に対する弱い応答（左欄）を得た。免疫感作プログラムの５９日後に、免疫した５匹のマウスの２匹が抗血清を産生し、０．３２ｍｇ／ｍｌ可溶性ＢＳＡ−ミコール酸抱合体と混合した抗血清の１：５０希釈では、ＥＬＩＳＡ−シグナルの２４％が阻害されることを示した。阻害は、ミコール酸特異抗体の結合部位を溶液中でＢＳＡに配位したミコール酸でブロッキングし、これによりＥＬＩＳＡプレートに結合するミコール酸特異抗体の数を低下させることによって行なった。ＢＳＡをコーティング抗原として用いるときには、強いＥＬＩＳＡ−シグナルが得られ、５匹総てのマウスの免疫感作が高度であることを示していた。抗ミコール酸活性を示すマウスから得られた抗血清の１：５０希釈物のシグナルの阻害がないことは、０．３２ｍｇ／ｍｌ可溶性ＢＳＡ−ミコール酸抱合体で抗血清をインキュベーションすることによって観察することができた。これは、抗ＢＳＡ抗体が高濃度で含まれているため、感受性範囲外の抗キャリヤーＢＳＡ抗体が阻害されることによるものと思われる。抗ミコール酸免疫応答は、抗体濃度の増加および／または抗体に対する親和性の増加を生じる応答の適度な成熟を得るには、更に長時間の免疫感作を必要とする。また、マウスは、ミコール酸に対してモノ特異性となるモノクローン性抗体の産生に用いることもできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｓ 33/543 ５０１ 0276−2Ｊ 33/543 ５０１Ｆ 33/577 0276−2Ｊ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．動物の生物学的試料のMycobacterium種の少なくとも１個の細胞内マイコバクテリア抗原を免疫学的に検出することによる、生物学てき試料中のMycoba cterium種を検出し、同定するための診断法。２．細胞内マイコバクテリア抗原を、生物学的試料を細胞内マイコバクテリア抗原に特異的な抗体に暴露することによって検出する、請求の範囲第１項に記載の診断法。３．試料を抗体と接触させる前に試料中に含まれる任意のマイコバクテリア細胞の少なくとも幾つかをリーシスする工程を含んでなる、請求の範囲第１項または第２項に記載の診断法。４．生物学的試料を処理して、任意の有機破片からそれに含まれているマイコバクテリア細胞を放出させ、生物学的試料の汚染を除去することによりその中に含まれる望ましくない微生物を除去した後、マイコバクテリア細胞をリーシスする工程をも含んでなる、請求の範囲第３項に記載の診断法。５．試料中の細胞内マイコバクテリア抗原を、固定化抗体へのアフィニティによって濃縮した後、これを標識した抗体と接触させる工程を更に含んでなる、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の診断法。６．細胞内マイコバクテリア抗原がMycobacterium種の細胞壁に含まれるミコール酸の混合物であり、それぞれが下記の一般構造を有するものである、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の診断法。７．生物学的試料が、喀啖、血液、脳脊髄液、糞便、尿、消化器洗浄物、唾液、組織、喉頭用綿棒、または皮膚外傷からの滲出物である、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の診断法。８．抽出したマイコバクテリア性ミコール酸および混入物から下記の一般構造を有するマイコバクテリア性ミコール酸群の分割およびそれに続く精製法であって、二相性溶媒にミコール酸と混入物との混合物を溶解し、この混合物を液−液相分離を行なう工程を含んでなる、方法。９．精製したミコール酸が引き続いて化学的な誘導体形成に付されない、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．二相溶媒系がクロロホルム、メタノールおよび水からなる、請求の範囲第８項または第９項に記載の方法。１１．二相溶媒系が上相と下相とを有する、請求の範囲第８〜１０項のいずれか１項に記載の方法。１２．上相および下相を混合して平衡にする工程を更に含んでなる、請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．上相の組成が１２〜１８％クロロホルム、４５〜５５％メタノール、および２０〜４０％水である、請求の範囲第１１項または第１２項に記載の方法。１４．上相の組成が１５％クロロホルム、５２％メタノール、および３％水である、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．下相の組成が５０〜８０％クロロホルム、１５〜４０％メタノール、および２〜８％水である、請求の範囲第１１〜１４項のいずれか１項に記載の方法。１６．下相の組成が６８％クロロホルム、２７％メタノール、および５％水である、請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．精製が、向流装置または任意の他の液−液抽出装置を用いて行なう、請求の範囲第８〜１６項のいずれか１項に記載の方法。１８．請求の範囲第８〜１７項のいずれか１項に記載の方法によって群に分けられ精製された、下記の一般構造を有する精製されたミコール酸。１９． Mycobacterium種の細胞壁に含まれるミコール酸の混合物に対する単離された抗体において、それぞれのミコール酸が下記の一般構造を有する抗体。２０．モノクローン性抗体またはポリクローン性抗体である、請求の範囲第１９項に記載の単離された抗体。２１．動物性のポリクローナル抗体である、請求の範囲第２０項に記載の単離された抗体。２２．ミコール酸が請求の範囲第８〜１７項のいずれか１項に記載のいずれか１項に記載の方法によって精製される、請求の範囲第１９〜２１項のいずれか１項に記載の単離された抗体。２３．細胞内抗原がキャリヤーに吸着している、マイコバクテリア性細胞内抗原／キャリヤー抱合体。２４．細胞内抗原がミコール酸の混合物であり、それぞれのミコール酸が下記の一般構造を有する、請求の範囲第２３項に記載のマイコバクテリア性細胞内抗原／キャリヤー抱合体。２５．キャリヤーが牛血清アルブミン、ゼラチンまたはキーホール・リンペッツ・ヘモシアニンである、請求の範囲第２３項または第２４項に記載のマイコバクテリア性の細胞内抗原／キャリヤー抱合体。２６．生物学的試料中のMycobacterium種の存在を検出するキットにおいて、請求の範囲第８〜１７項のいずれか１項に記載の方法によって精製し、検出可能に標識したミコール酸混合物に対して生じた抗体を含んでなる、キット。２７．請求の範囲第２３〜２５項のいずれか１項に記載のマイコバクテリア性ミコール酸／キャリヤー抱合体のかなりの量および場合によっては固定化抗体を更に含んでなる、請求の範囲第２６項に記載のキット。