Die
klinische Labordiagnostik stellt einen wesentlichen Bestandteil
der rheumatologischen Diagnostik dar. Eine wichtige Rolle spielen
die so genannten Rheumafaktoren, wobei der Begriff Rheumafaktor
ein historischer Begriff ist. Bei diesen Rheumafaktoren handelt
es sich um Autoantikörper
gegen Gammaglobuline, wobei die Analytik der jeweiligen Rheumafaktor-IgG,
-IgM und IgAs von unterschiedlicher klinischer Relevanz ist. Es
handelt sich überwiegend
um anti-isotypische Immunglobuline, d.h. um Antikörper, die
gegen die konstanten Regionen (Fc) von Immunglobulin-Molekülen gerichtet
sind. RF-IgM ist,
in Abhängigkeit
zur Titerhöhe
relevant für
rheumatoide Arthritis, SLE, Sjögren
Syndrom, MCTD und weitere Krankheitsbilder. Dementsprechend sind
diese Parameter auch nicht spezifisch für rheumatoide Erkrankungen.
Der RF-IgA-Wert hat eine Bedeutung bei klinisch auffälligen Patienten
mit negativem RF-IgM. RF-IgG spielt eine pathophysiologische Rolle
in späteren
Krankheitsstadien.
Eine
direkte Ableitung einer rheumatischen Erkrankung aus diesen Laborwerten
ist nicht möglich,
da diese auch bei Schwangerschaft, Asthma, einigen entzündlichen
Erkrankungen, Herpes oder Grippe erhöht sein können. 6–8% der Gesunden und 10% in
hohem Alter haben einen Rheumafaktor. Dies ist auch der Grund, warum
Rheumafaktoren nicht den pathologischen Stellenwert haben, wie beispielsweise
Anti-ds-DNA-AK bei der Diagnostik des SLE. Trotzdem stellt der Nachweis
dieser Autoantikörper
ein wesentliches diagnostisches Kriterium dar. Zudem kommt ihnen
auch eine prognostische Bedeutung zu, da Rheumafaktor-positive Polyarthriden
zumeist einen progredienteren Verlauf als Rheumafaktor-negative
Erkrankungsformen nehmen. Anscheinend spielen die Rheumafaktoren
pathogenetisch insbesondere bei der Ausprägung von extrazellulären Manifestationen
der rheumatischen Arthritis eine Rolle. Patienten mit auch rheumatoider Vaskulitis
weisen jedenfalls zumeist höhere
Rheuma-Faktoren-Titer auf, als Patienten mit nur artikulären Manifestationen.
Auch konnten bei Lungen-Manifestationen Immunkomplexe aus Rheumafaktoren
und IgG-Molekülen
in den Zellwänden
pulmonaler Gefäße sowie
auch in den Alveolen nachgewiesen werden.
In
der Labordiagnostik für
rheumatische Erkrankungen werden noch Entzündungswerte wie CRP, das Blutbild
zur Beurteilung der Krankheitsaktivität und die Bestimmung der Harnsäure im Zusammenhang
mit Gicht herangezogen.
Die
pathogenetisch auslösenden
Ursachen einer rheumatischen Erkrankung sind mit allen bisher bekannten
Methoden nicht zu erfassen.
Dementsprechend
werden von den genannten Untersuchungen viele rheumatisch Erkrankte
nicht erfasst. Andererseits werden auch viele sonstige Erkrankte,
insbesondere Autoimmunerkrankte miterfasst, die nicht rheumatisch
erkrankt sind.
Rheumatische
Erkrankungen haben eine verbesserte Chance zur Behandlung, wenn
sie frühzeitig und
eindeutig diagnostiziert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Behandlungsmöglichkeiten
zur Therapie der rheumatischen Arthritis stehen zur Verfügung. Nicht
jede Gelenkentzündung
verläuft
gleich schnell und gleich aggressiv. Die Therapie ist deshalb individuell
auf den einzelnen Patienten abzustimmen. Von großer Bedeutung für den Behandlungserfolg
ist eine gezielte und ganz besonders eine frühzeitige Behandlung. Die rheumatologische
Forschung hat gezeigt, dass bei Erkrankungen mit schwerem Verlauf
die Behandlung innerhalb der ersten Jahre besonders erfolgreich
ist und irreparable Gelenkstörungen
aufhalten kann.
Eine
Diagnostik, die Hinweise auf eine mögliche Ursache der Erkrankungen
liefert, die sich damit u.U. durch Metaphylaxe/Sekundärprävention
vermeiden oder vermindern läßt, ist
mithin von erstrangiger Bedeutung. Hier setzt das nach den Ansprüchen der
zu schützenden
Stoffe und Verfahren Zugrunde liegende pathogenetische Konzept an.
Aus
diesem Grund ist eine frühzeitige
und eindeutige Diagnostik für
einen Therapieerfolg von besonderem Interesse. In früheren Jahren
wurde die rheumatoide Arthritis häufig erst in einem fortgeschrittenen
Stadium erkannt, in dem bereits irreversible makroskopische Schäden der
Strukturen aufgetreten waren. Mittlerweile weiß man, dass die Erkrankung
innerhalb der ersten beiden Jahre nach Auftreten der ersten Symptome besonders
schnell fortschreitet. Je früher
eine wirkungsvolle Therapie beginnt, umso größer ist die Chance, den Entzündungsprozess
zu beeinflussen und die Zerstörung
von Knor peln und Gelenken aufzuhalten. Deshalb ist eine frühzeitige
und eindeutige Diagnose besonders wichtig.
Der
Aufbau des kollagenen Gewebes erfolgt allgemein in folgenden Schritten:
Faserbildende Zellen, wie Fibrozyten, Chondrozyten, Osteozyten,
Retikuläre
Zellen und andere hierauf spezialisierte Zellen, produzieren bindegewebige
Strukturen durch Exozytose von trihelikalen, seilartigen Faserproteinen
bzw. deren Vorstufen.
Der
Syntheseablauf wird im Folgenden am Beispiel der Chondrozyten und
deren spezifischen Produkten dargestellt, ist aber unter der Berücksichtigung
der jeweiligen Variabilitäten
der verschiedenen bekannten Kollagene auf andere faserbildende Zellen übertragbar.
Im
Golgi-Apparat dieser Zellen werden zunächst unabhängig voneinander drei Aminosäureketten (nachfolgend
als Kardele bezeichnet) synthetisiert die sich durch folgende characteristische
Abschnitte auszeichnen:
- • Einem 15 bis 50 Aminosäuren (AS)
langen N-terminalen Abschnitt, welcher später zur Bildung des N-terminalen
Propeptids beiträgt.
Dieser Abschnitt weist unter den verschiedenen Kollagenen eine höhere Variabilität auf und
ist reich an den Aminosäuren
Cystein, bezw. in der Cystin Form Cys-S-S-Cys bei Schleifen und
Taschen bildenden Längsvernetzungen,
insbesondere bei den einen großen
Teil der Gesamtmasse aller Faserproteine ausmachenden Kollagenen
I – III.
- • Im
weiteren folgt ein durch hohe Regelmäßigkeit geprägter Abschnitt
der repetetiv die Sequenz (Gly, X, Y)n enthält und ca.
1050 AS umfaßt.
Unter X wird fast ausschließlich
die Aminosäure
Prolin oder Leucin gefunden; im Zuge der weiteren intrazellulären Prozessierung
werden diese fakultativ posttranslational in Hydroxprolin bezw.
Hydroxylysin umgewandelt. Diese Hydroxyaminosäuren dienen im Folgenden der Quervernetzung
der Kardele nach Verseilung und weiter der Vernetzung der verseilten
Fasersegmente untereinander. Die mit Y gekennzeichnete Position
ist durch gewebespezifische, variable Aminosäuren besetzt.
- • Anschließend folgt
ein dem N-terminalen Ende analoges und vergleichbar langes Propeptid.
Abgesehen davon, dass auch dieser Abschnitt insgesamt wieder einen
hohen Anteil an Cystein/Cystin einhält, ist ein spezielles Motiv
von zwei bezw. drei Cystein AS dicht nebeneinander (zum Beispiel
die Sequenz GlyProCysCysGly) am (N-terminalen) Ende des C-Propeptids – also dicht
an der Über gangsstelle
zwischen Telopeptid und C-terminalen Propeptid – characteristisch und von
großer
Bedeutung: Hier beginnt die Vernetzung der drei AS Ketten.
Nach
gleichsinniger paralleler Ausrichtung der drei AS-Ketten (wobei
die N-terminalen Enden gemeinsam an einer Seite liegen und ebenso
die C-terminalen Enden gemeinsam an der anderen Seite liegen) beginnt
an dieser Stelle die Verseilung der drei einzelnen Kardele durch
die Ausbildung von kovalenten Cys-S-S-Cys Bindungen der Kardele
untereinander, und zwar mit zweifachen oder dreifachen Quervernetzungen.
Die Ausbildung und Lokalisation dieser „Cystin-Knoten" genannten Struktur
ist aus der Primärstruktur
der AS-Ketten der einzelnen Kardele exakt festgelegt.
Der
Cystinknoten ist die evolutionäre
Lösung
für die
Aufgabe, die relative Verschieblichkeit der drei Kardele in der
Längsachse
zueinander zu fixieren. In der Folge können sich die drei Kardele
ineinander Umschlingen. Diese Verseilung verläuft spontan vom Cystinknoten
ausgehend in Richtung zum N-terminalen Ende (und in geringem Umfang
z.T auch in das C-terminale Propeptid). Sie ist nur möglich durch
die gleichmäßigen Repetivität der Gly-X-Y
Gruppen, die so in ein starres, jeweils versetztes Raster der Kardele
zueinander kommen. Diese Rastersynchronisation verläuft durch
den ganzen mittleren Seilabschnitt, der somit das Telopeptid bildet,
bis hinein in den N-terminalen Abschnitt, der anfänglich noch
verseilt ist, sich dann aber wegen der Auflösung der Repetivität als unverseiltes
Ende darstellt. Auch wenn die drei Arme des – nun N-terminales Propeptid – genannten
Abschnitts jeweils frei bleiben, so ist doch die räumliche
Struktur der auf diesen Armen liegenden Aminosäuren mit den von ihnen ausgehenden
Bindungsepitopen zueinander festgelegt.
Der
auf dem C-terminalen Propeptid realisierte Cystinknoten hat also
eine Fernwirkung auf die Raumstruktur des entgegengesetzten Endes,
den freien Kardelen Armen des N-terminalen
Propeptids. Diese durch den Cystinknoten erzwungene Rastersynchronisation
der freien Enden der Propeptide bleibt erhalten, auch wenn die Propeptide
im Rahmen der Prozessierung vom Prokollagen zum Tropokollagen abgeschnitten
werden, jedenfalls solange der Schnitt der jeweils zuständigen Endopeptidasen
(Metalloproteinasen) an der physiologisch korrekten Stelle auftritt.
Somit
ist nicht nur die exakte Tertiärstruktur
des C-terminalen Propeptids, auf dem der Cysteinknoten lokalisiert
ist, definiert, sondern dieses gilt in gleicher Weise für das N- terminale Propeptid,
auch wenn an diesem Fragment die die Rastersynchronisation auslösende Struktur – eben der
Cysteinknoten – nicht
mehr nachweisbar ist.
Nach
Bereitstellung der intrazellulären,
verseilten Prokollagen – Faserstücke mit
einer Länge
von ca. 300 nm werden diese auf die Zelloberfläche transportiert und dort
weiter prozessiert.
Zum
Aufbau von Kollagengewebe werden mittels Matrix-Metalloproteinase-Enzymen
(MMP), z.B. MMP3, die oben erwähnten,
als Propeptide bezeichneten Enden der Prokollagenfasern abgetrennt
und das jeweils „zugeschnittene" Faserstück als Tropokollagen
in die Matrix abgegeben. Das auf diese Weise konditionierte Faserstück wird
im weiteren spezifisch in das jeweilige kollagene Gewebe eingebaut
(linear, rasterförmig,
netzartig, filzartig etc).
Entzündliche
oder degenerative Erkrankungen der aus Faserproteinen gebildeten
Bindegewebsstrukturen, sei es daß diese eigene Organe darstellen,
wie Bänder,
Sehnen, Gelenke, Faszien, etc., oder daß sie in parenchymatösen Organen
als Gerüststrukturen
dienen, sind in verschiedene Gruppen einzuteilen.
Bei
den rheumatischen Erkrankungen im engeren Sinne kommt es, nach einer
anfänglich
klinisch häufig
wenig auffälligen
Phase zur Ausbildung von Autoantikörpern gegen die Bindegewebsstrukturen
selbst – oder
mit diesen unmittelbar assoziierten Geweben. Es folgen entzündliche
Schübe,
die die weitere Bildung von Autoantikörpern unterhalten.
Bei
der zweiten Gruppe, den rheumatoiden Erkrankungen, fehlen die für eine Autoimmunerkrankung typischen
Autoantikörper;
primär
entzündliche
und schmerzhafte Symptome ohne erkennbaren Hintergrund beherrschen
die Klinik. Die primäre
Ursache dieser Erkrankungen ist unbekannt; sie können nach rezidivierendem Verlauf
in das o.g. Vollbild einer rheumatischen Erkrankung übergehen,
so daß in
der Literatur strittig ist, ob letztere Erkrankungen unter Umständen nur
Vorstufen der Ersteren darstellen. Es ist nicht bekannt, welche zusätzlichen
Komplikationen auftreten müssen,
damit sich aus einer rheumatoiden Erkrankung das Vollbild einer
rheumatischen Autoimmunerkrankung entwickelt, auf jeden Fall ist
ein längerer
und progredienter Verlauf als ungünstige Voraussetzung anzusehen.
Es wird diskutiert, daß es
durch die anhaltenden Entzündungen
in der Folge als Fehlleistung des Immunsystems zuletzt zur Bildung
von Autoantikörpern
gegen eigene, nicht pathologisch veränderte Strukturen kommt, weil
die im Laufe der Zeit exprimierten Antikörper ihre spezifische Selektivität zur Unterscheidung
zwischen selbst und nicht-selbst einbüßen.
Andererseits
gibt es eine als primäre
Arthrose bezeichnete Gruppe von Erkrankungen bindegewebiger Strukturen,
insbesondere der Gelenke und Sehnen, die weder mit entzündlichen
Schüben
beginnen, noch durch das Auftreten der für eine Autoimmunerkrankung
typischen Autoantikörper
gekennzeichnet sind. Für diese
Erkrankungen ist ein langfristiger Untergang der faserbildenden
Zellen, z.B. der Chondrozyten gesichert, ohne daß deren Ursache bekannt ist.
Diese
Erkrankungen werden ursächlich
dem Verschleiß (durch
unphysiologische Belastung) zugeordnet, jedoch ist zu vermuten,
daß weniger
die übermäßige Abnutzung
der Strukturen im Vordergrund steht, sondern vielmehr eine reduzierte
Regenerationskapazität
vorherrscht. Das klinische Bild wird beherrscht durch einen langsamen, über Jahre/Jahrzehnte
laufenden unerklärten
Schwund der bindegewebigen Funktionsgewebe, insbesondere des Knorpels.
Der
vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, neue Mittel
und Verfahren zur Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von Bindegewebserkrankungen
und Erkrankungen des Bewegungsapparates anzugeben.
Die
der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch
die Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend:
- i) wenigstens eine zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz;
und
- ii) wenigstens ein trihelikales Faserprotein, ein Fragment oder
eine Variante davon.
Weitere
Lösungen
ergeben sich aus dem Gegenstand der Ansprüche.
Im
Folgenden werden einige Begriffe erläutert, um klarzustellen, wie
sie im Zusammenhang der vorliegenden Anmeldung verstanden werden
soll.
PAMP – Rezeptoren
umfassen Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die für Parasiten,
speziell Mikroorganismen, typische molekulare Strukturen erkennen.
Die pathogen associated molecular patterns (= PAMP) sind charakteristische
Strukturen von Mikroorganismen, die eine hohe genetische und phänotypische
Stabilität
innerhalb größerer Gruppen
von Mikroorganismen (=Pilze, Bakterien und Protozoen) zeigen. Dies
weist auf eine für
die betroffenen Mikroorganismen (= MO) unverzichtbare Struktureinheit
hin, die nicht ohne gravierenden evolutionären Nachteil geändert werden
kann. Diese speziellen molekularen Muster erweisen sich gerade deshalb
als für
den Wirtsorganismus bedeutsam aus, der er selbst in seinem Strukturinventar nicht
auf diese Merkmale angewiesen ist, und daher sich diese molekularen
Muster als sicheres Erkennungskriterium für körperfremde MO eignen.
Der
Ausdruck „Pathogen-associated
molecular patterns (PAMP)-Rezeptor" wird synonym zu dem Ausdruck „Pattern
Recognition Receptor (PRR)-Rezeptor" verstanden. Zur Übersicht wird auf den Artikel
von Medzhitov und Janeway, Current Opinion Immunol (1997), 9, 4–9 verwiesen.
Erfindungsgemäß umfassen PAMP-Rezeptoren
Toll-like Rezeptoren. Weiterhin umfasst der Ausdruck Nicht-Toll-like,
zellmembranständige PAMP-Rezeptoren wie phagozytische
Rezeptoren. Hier seien beispielhaft die Scavenger-Rezeptoren, insbesondere
SR-A und MARCO, der Makrophagen Mannose-Rezeptor, der B-Glucan-Rezeptor
und Peptidoglycan-recognition proteins (PGRP) genannt. Ferner umfasst
der Ausdruck intrazelluläre
PAMP-Rezeptoren wie Proteinkinase R, Oligoadenylat-Synthase und
Moleküle
der NOD-Familie. Außerdem
umfasst der Ausdruck lösliche
PAMP-Rezeptoren Pentraxine wie z.B. CRP, Serum Amyloid A, Collectine,
Lipid-Transferasen
wie das Lipid-bindende Protein (LBP) und lösliche Varianten der vorstehend
genannten PGRP erwähnt.
Vorzugsweise sind die PAMP-Rezeptoren humanen Ursprungs. Die Aminosäuresequenzen
sind aus den allgemein zugänglichen
Sequenzdatenbanken wie Genbank und SwissProt erhältlich.
Es
gibt zellständige
und in Köperflüssigkeiten
gelöste
PAMP-Rezeptoren. Zellständige
Rezeptoren dienen entweder der Signaltransduktion in die Zelle,
z.B. CD-14 Rezeptor, oder haben, keinen bekannten intrazellulären Signalanschluß zur Auslösung einer
Reaktion. Gleiches gilt auch für
lösliche
Formen von PAMP-Liganden, die keinen direkten Kontakt zu Zellen
haben. Die Funktion der Rezeptoren ohne intrazellulären Signal-Transduktions-Anschluß (zellständig oder
löslich)
besteht in der Bindung von vagabundierenden MO oder Fragmenten von
MO; dementsprechend werden sie als Scavenger-Rezeptoren (Scavenger = Ausputzer) bezeichnet.
„Scavenger-Rezeptor" (= SR) umfassten
hierbei SR-A einschließlich
SR-A I und SR-A II, und MARCO. Ferner werden von SR umfasst SR-A-artige
SR. Diese umfassen SR-CLI (SR mit C-Typ Lectin I), SR-CLII, CL-P1
(=Collektin aus Plazenta-Rezeptor I), LOX-I (=Lectin-artiger oxidierter
LDL-Rezeptor I), dSR-CI (Drosophila SR-CI). Vorzugsweise ist der
Scavenger-Rezeptor SR-A, insbesondere SR-AI. Ferner wird in Bezug
auf die Sca venger-Rezeptoren auf den Übersichtsartikel Peiser et
al., in Current Opinion in Immunology 2002, 14:123–128 Bezug
genommen.
„Zur Bindung
an einen PAMP-Rezeptor fähige
Substanzen" umfassen
erfindungsgemäß sämtliche
im Stand der Technik bekannten PAMPs. Zur Übersicht siehe Artikel von
Medzhitov und Janeway, Current Opinion Immunol. (1997), 9, 4–9. PAMPs
umfassen bakterielle und mykobakterielle PAMPs und von Pilzen stammende
PAMPs. Zu den PAMPs gehören
z.B. Lipopolysaccharide (=LPS, auch Endotoxine genannt), Lipoteichonsäure (= LTA)
und ihre Varianten, wandspezifische Proteoglykane (= PGN), für Mikroorganismen
spezifische, nicht-methylierte DNA-Abschnitte (CpG), Lipoproteine
und N-formylierte
Peptide wie F-Met-Leu-Phe und bakterielle Proteine. Von Pilzen stammende
PAMP sind z.B. Pilz-spezifische Peptidoglykane. Von Mykobakterien
stammende PAMP sind Mycolsäure
und Mycolsäureester.
Die
Bindung von Lipoteichonsäure,
Lipopolysaccharid (LPS), bakterieller DNA, Bakterienzellfragmenten
an SR, der einen PAMP-Rezeptor darstellt, ist aus Peiser et al.,
vorstehend bekannt.
Weitere
zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanzen können durch
einfaches Durchführen
eines Bindungsassays erhalten werden, wie er beispielsweise in Dunne
et al., PNAS 91 (1994), 1863–1867 beschrieben
ist, wobei für
den Bindungsassay der PAMP-Rezeptor vorzugsweise SR-AI ist.
Der
Begriff „trihelikales
Faserprotein" umfasst
erfindungsgemäß Kollagen,
Prokollagen, Tropokollagen, Elastin, Fibrillin, Fibronectin, Scavenger-Rezeptoren
und weitere kollagenartige Bestandteile. Ferner umfasst der Ausdruck
die Synthesevorstufen der vorgenannten. Wie allgemein bekannt und
oben beschrieben, werden Kollagene zunächst als Prokollagen-Alphaketten
synthetisiert. Diese werden nach Hydroxylierung von L-Prolin- und L-Lysin-Resten
sowie nach Glykosylierung im endoplasmatischen Retikulum bzw. im
Golgi-Apparat, wobei sie zu je drei Ketten zusammentreten, in den
extrazellulären
Raum ausgeschieden. Dort werden von den Enden der Ketten sog. Propeptide
oder solche, die an einer nichttypischen Schnittstelle abgetrennt wurden,
abgespalten, und es entsteht das Tropokollagen, das sich zu Fibrillen
zusammenlagert. Durch Oxidation von Aminogruppen der L-Lysin-Seitenketten
zu Aldehyd-Gruppen und deren Aldol- und Aldimin-Bildung mit Aldehyd- bzw. Aminogruppen
benachbarter Ketten werden diese miteinander verknüpft. (Vernetzung).
Der
Ausdruck „Fragmente" bedeutet, sofern
es sich um Proteine handelt, vorzugsweise Fragmente mit einer Mindestlänge von
10, besonders bevorzugt 20 Aminosäuren. Sofern es sich um Nukleinsäuren handelt, haben
die Fragmente wenigstens 20 Nukleotide, vorzugsweise 50 Nukleotide.
Der
Ausdruck „Varianten" umfasst grundsätzlich sämtliche
Modifikationen einer gegebenen Sequenz, wobei Muteine bevorzugt
sind, die sich auf Aminosäureebene
durch Addition, Substitution, Deletion, Insertion oder Inversion
wenigstens einer Aminosäure
von der gegebenen Peptidsequenz unterscheiden. Besonders bevorzugt
umfasst die Mutation 1 bis 5 Aminosäuren, insbesondere 1 bis 3
Aminosäuren.
Der
Ausdruck „Konjugate" umfasst Di-, Oligo-,
und Polymerisierungen, wobei sowohl Homo- als auch Hetero Di-, Oligo-,
und Polymerisierungen umfasst werden. Die Kopplung kann hierbei
an ein Trägermolekül, wie beispielsweise
Polyethylenglykol oder weitere im Stand der Technik bekannte Trägermoleküle erfolgen. Ferner
werden vom Begriff Konjugate auch natürlicherweise vorkommende Konjugate,
wie beispielsweise posttranslationale Modifikationen, wie beispielsweise
Hydroxylierungen der Seitenkette umfasst.
Lipopolysaccharide
(LPS) enthalten einen sehr streng konservierten Aminozucker-2-X-Phosphat-Lipidkomplex
der Lipid (A) genannt wird, und der der eigentliche Membranteil
ist. Im Endotoxin-Molekül
folgt auf das – die
Bakterien-Membran konstituierende Lipid (A) ein im wesentlichen
aus spezifischem Zucker mit manchmal weiteren Phosphaten als Kern-Antigen
(Core-A) bezeichneter Bereich. An das Kern-Antigen folgen die als
Oberflächen-Antigen
(Surface-A) bezeichneten, sehr variablen und sehr unterschiedlich
langen Zuckerketten, die sich von Bakterienspecies, aber auch innerhalb
einer Spezies von Stamm zu Stamm sehr unterscheiden können. Erfindungsgemäß werden
sowohl die mono- als auch die bi-phosphorylierte Form des Lipid (A)
umfasst.
Die
vorliegende Erfindung beruht auf den folgenden überraschenden Feststellungen
der Erfinder:
Es konnte in zahlreichen Fällen beobachtet werden, dass
Personen, die sich in Gebäuden
aufhalten, in denen es bestimmte Feuchtigkeitsschäden gibt,
die einhergehen mit einem mikrobiellen Befall, auffällig oft
unter Schmerzen im Bereich der Gelenke, sogenannte rheumatoide Beschwerden,
leiden. Diese Beschwerden stehen in der Regel in zeitlichem Zusammenhang
mit dem Aufenthalt im Gebäude,
d.h. bei Abwesenheit klin gen die Beschwerden ab und bei erneutem
Aufenthalt im entsprechenden Gebäude
treten sie in relativ kurzer Zeit wieder auf. Je häufiger die
Betroffenen exponiert wurden, desto schneller kommen die Beschwerden
bei Exposition und desto langsamer klingen sie ab nach Beseitigung
der Exposition.
Genauere
Untersuchungen zeigten, dass zunächst
im Anfangsstadium meist nicht die Gelenke im engeren anatomischen
Sinne schmerzten, sondern gelenknahe Weichteilstrukturen. Das Auftreten
der Schmerzen war hierbei streng korreliert mit einer vorangegangenen
biomechanischen Belastung. Die Beobachtungen zeigten, dass es genau
die Stellen höchster
querschnittsbezogener Beanspruchungen sind, die den Patienten am
nächsten
Tage schmerzten.
Bei
der Untersuchung zahlreicher entsprechender Gebäude konnte nachgewiesen werden,
dass die Bindegewebserkrankungen mit einem charakteristischen mikrobiellen
Befallsmuster in Baumaterialien korrelierten.
Durch
in vitro-Experimente konnte nachgewiesen werden, dass bakterielle
Endotoxine (= LPS), extrahiert aus feuchten Baumaterialien, im Bereich
von Feuchtigkeitsschäden,
menschliches Knorpelgewebe zerstören.
Bei dieser Zerstörung
werden die Chondrozyten und die extrazelluläre Matrix zerstört und es
ist ein starker Anstieg der Mengen an MMP-Enzymen in der Gewebekultur
feststellbar. Es war ferner nachweisbar, dass die Wirkung der Endotoxine
auf das Gewebe eine klare Dosis-Wirkungsbeziehung zeigt, d.h. je
höher die Konzentration
an Endotoxinen war, um so größer war
auch die Zerstörung
der Chondrozyten, die für
die Kollagensynthese verantwortlich sind.
Somit
konnten erstmals LPS, bzw. Endotoxine als Noxe, d.h. als krankheitserregende
Ursache für
Bindegewebserkrankungen von Patienten festgestellt werden, die sich
in Gebäuden
mit mikrobiellem Befall aufhielten. Es ist daher erstmals eine Unterscheidung
zwischen einer mikrobiell-bedingten Bindegewebserkrankung und einer
nicht mikrobiellbedingten Bindegewebserkrankung möglich.
Diagnostischer
Ansatz der hier in Rede stehenden Verfahren ist der Nachweis einer
reduzierten Reparatur- und Regenerationskapazität für fibrilläre Strukturen durch eine exogene
Noxe (PAMP, Definition siehe unten).
Die
Aufgabe von PAMP-Rezeptoren, insbesondere von Scavenger-Rezeptoren
ist u.a. die Bindung von Endotoxinen zur Entfernung aus dem Blutkreislauf.
Die Erfinder der vor liegenden Erfindung haben ferner festgestellt,
dass die LPS-bindenden Epitope der Scavenger-Rezeptoren eine hohe
Homologie zu analogen Strukturen an den Enden der Prokollagen-Moleküle aufweisen.
Die räumlichen
Strukturen von SR-AI und SR-AII und Prokollagen sind in den 1 und 2 schematisch
dargestellt. Hierdurch bieten sich insbesondere die N- und/oder
C-terminalen Propeptide in verschiedenen Fragmentationslängen ggf.
unter Einbeziehung eines Teils oder der gesamten Länge des
Telopeptids beziehungsweise Modifikationen dieser Strukturen als
naturnahe und damit gering antigene Liganden an.
Bei
einer Überlastung
des systemischen Reinigungssystems mit PAMP's, das durch Scavenger-Rezeptoren bereitgestellt
wird, wie z.B. bei septischen Infekten, antibiotischer Therapie
mit bakteriziden Antibiotika, oder wie im vorliegenden Fall durch
exogene Endotoxinbelastung, kommt es zu einer Verfrachtung der PAMP's, speziell LPS,
im Kreislauf und diese können
an die nächste
vergleichsweise avide Struktur binden. Dieses ist das frisch gebildete,
noch nicht zu Tropokollagen prozessierte Prokollagen auf stimulierten
faserprotein-bildenden Zellen, z.B. Chondrozyten.
Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung konnten am Beispiel der wachstumsangeregten
Chondrozyten zeigen, dass eine vollständige Blockierung der Kollagensynthese
durch Endotoxin durch eine übermäßige Aktivierung
der an der Prozessierung beteiligten Metalloproteinasen zu einem
Schaden an schon vorhandenen Faserstrukturen und letztlich zu einem
Absterben der faserbildenden Zellen führt. Es ist anzunehmen, dass
die nicht erfolgte Prozessierung zu Prokollagen die Zelle veranlasst,
im großen
Umfang weiter Prokollagen auf der Oberfläche bereitzustellen und Metalloproteinasen
zur Prozessierung zur Verfügung
zu stellen. Eine übermäßige, nicht
mehr nur lokal wirkende Synthese von MMP's führt
zu einer großräumigen Zerstörung von
Fasern und Zellen; bei umfangreichen Zerstörungen in der Folge zur klinisch
apparenten Entzündung
und Schmerz.
1 zeigt
die räumlichen
Strukturen von SR-AI und SR-AII.
2 zeigt
die räumliche
Struktur von Prokollagen.
3(a) bis (c) zeigen zerstörte Chondrozyten nach Zugabe
von in Beispiel 1 beschriebenem Eluat.
4(a) bis (b) zeigen gesunde Chondrozyten.
Gegenstand
der Erfindung ist somit eine Zusammensetzung enthaltend:
- i) wenigstens eine zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor
fähige
Substanz; und
- ii) wenigstens ein trihelikales Faserprotein, ein Fragment oder
eine Variante davon.
Vorzugsweise
ist die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ein bakterielles,
mykobakterielles oder von Pilzen stammendes PAMP, vorzugsweise ist
das PAMP ein Lipopolysaccharid (=LPS, auch Endotoxin genannt), Lipoteichonsäure (= LTA)
und ihre Varianten, wandspezifische Proteoglykane (= PGN), für Mikroorganismen
spezifische, nicht-methylierte DNA-Abschnitte (CpG), Lipoproteine
und N-formylierte Peptide wie F-Met-Leu-Phe und bakterielle Proteine.
Ferner ist bevorzugt, dass das von Pilzen stammende PAMP ein Pilz-spezifisches
Peptidoglykan ist. Weiterhin bevorzugt ist das PAMP von Mykobakterien
stammende Mycolsäure
oder Mycolsäureester.
Besonders bevorzugt ist das PAMP Lipopolysaccharid.
Ferner
sind Fragmente, Varianten oder Konjugate der zur Bindung an einen
PAMP-Rezeptor fähigen Substanz
bevorzugt, wobei die Fragmente, Varianten oder Konjugate davon,
wenigstens 50% der Bindungsfähigkeit
von LPS aus E. coli an den Scavenger-Rezeptor SR-A I. Die Bindung des LPS
an den Scavenger-Rezeptor wird, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Besonders bevorzugt haben die Fragmente, Varianten oder Konjugate
eine Bindungsfähigkeit
von wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 90% der Bindungsfähigkeit
von LPS an den Scavenger-Rezeptor.
Besonders
bevorzugt ist die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz
ein Lipolysaccharid (LPS), Fragmente oder Varianten davon, wobei
die Fragmente oder Varianten ein phosphoryliertes N-Acetylglucosamin-Dimer
aufweisen, vorzugsweise einen vollständigen Lipid-A-Komplex enthalten.
Es ist bekannt, dass Lipid (A) über
dieses Strukturelement an den CD14-Rezeptor LBP-Komplex die Bindung
von LPS an den Makrophagen-Rezeptor vermittelt. Vorzugsweise ist
das Lipopolysaccharid das Lipopolysaccharid der Gattungen z.B. Salmonella,
Shigella, E. coli, Pseudomonas, Neisseria, Klebsiella und Haemophilus.
Besonders
bevorzugt ist ferner, dass die von Mikroorganismen stammenden PAMP's aus Bakterien der
Ordnung Actinomycetales und Pilzen der Gattungen Aspergillus, Botrytis,
Cladosporium, Eurotium, Penicillium, Wallemia, Chaetomium, Mucor,
oder Scopulariopsis stammt.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
ist das trihelikale Faserprotein (Komponente (ii) der Zusammensetzung)
ausgewählt
aus Kollagen, Prokollagen, Tropokollagen, Elastin, Fibrillin, Fibronectin,
Scavenger-Rezeptoren oder anderen kollagenen Bestandteilen, Synthesevorstufen,
Fragmente, Varianten oder Konjugate der vorstehenden Komponenten.
Das
Kollagen umfasst erfindungsgemäß die Typen
I bis XIV, wobei die Typen I, II, III, V und IX bevorzugt sind.
Elastin ist der Hauptbestandteil der elastischen Fasern des Bindegewebes,
vor allem in Organen mit hoher Elastizität, wie Blutgefäßen, Lunge,
Haut, Sehnen und Uterus. Elastin unterscheidet sich von den ähnlichen
Kollagenen durch den höheren
Gehalt an Valin und Leucin, durch den niedrigeren Arginin- und Hydroxyprolingehalt
und das Fehlen von Lysinresten. Die vorstehend genannten Proteine
sind vorzugsweise humanen Ursprungs, jedoch sind auch tierische
Proteine von der Erfindung mitumfasst. Vorzugsweise ist das trihelikale
Faserprotein Prokollagen, Fragmente oder Varianten davon. Die Fragmente
oder Varianten von Prokollagen weisen hierbei vorzugsweise wenigstens
50 %, besonders bevorzugt wenigstens 80 %, insbesondere wenigstens
90 % der Bindungsfähigkeit
von humanem Prokollagen an LPS von E. coli auf. Die Bindungsfähigkeit
kann hierbei mit einem allgemein bekannten Bindungsassay durchgeführt werden.
Die
Varianten von Prokollagen sind vorzugsweise wenigstens 60 % homolog,
bevorzugt wenigstens 80 %, besonders bevorzugt wenigstens 90 %,
insbesondere wenigstens 95 % homolog auf Aminosäureebene zu humanem Prokollagen.
Die Bestimmung der Homologie kann hierbei unter Verwendung von dem
Fachmann bekannten Standard-Progarammen
(z.B. FASTA, BLAST) unter Verwendung von Standard-Einstellungen
erfolgen.
Das
Fragment von Prokollagen weist bevorzugt mindestens 10, besonders
bevorzugt 20, insbesondere 50 Aminosäuren von Prokollagen auf. Die
Variante von Prokollagen ist vorzugsweise ein Mutein, das sich durch
die Addition, Substitution, Deletion, Insertion oder Inversion wenigstens
einer Aminosäure
von Prokollagen unterscheidet. Bevorzugt umfassen die Mutationen
1 bis 5 Aminosäuren,
insbesondere 1 bis 3 Aminosäuren.
Besonders bevorzugt ist die Substitution eine konservative Substitution,
bei der eine Aminosäure
durch eine andere Aminosäure
ausgetauscht wird, die zur gleichen physikochemischen Gruppe gehört.
Allgemein
können
die Fragmente und Varianten durch chemische Verfahren oder rekombinant
hergestellt werden.
Prokollagen
weist eine Verseilung der drei Peptidketten ca. 10 bis 30 Aminosäurereste
vor dem jeweiligen Ende auf. Die Stelle des Übergangs von der verseilten
Struktur zu den freien Armen ist von besonderer Bedeutung. An dieser Übergangsstelle
ist ein sehr markantes Aminosäuremotiv
für kovalente
Bindungen verantwortlich. Durch den zweifachen bzw. dreifachen Einbau
der Aminosäure-Cystein
in genau definierten Abständen
auf jeder der drei Peptidketten wird eine Struktur ausgebildet,
bei der jede Kette mit jeder Kette über Cys-S-S-Cys bindungsstarr
miteinander verbunden wird. Diese Koordinationsstruktur aus Cystein-Bausteinen wird
Cystein-Knoten genannt.
Vorzugsweise
umfasst daher das trihelikale Faserprotein, das Fragment oder die
Variante davon eine zur Ausbildung eines Cystein-Knotens geeignete
Sequenz, um so Bindungsstellen für
die Bindung der Substanz, die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor
fähig ist
bereit, bereitzustellen. Bevorzugt ist die zur Ausbildung eines
Cystein-Knotens geeignete Sequenz die Sequenz GlyProCysCysGly (SEQ
ID NO: 1).
Für die im
Rahmen der Erfindung diskutierenden Varianten des Prokollagens,
seiner Folge- und Spaltprodukte ist festzuhalten, daß die Evolution
des Cysteinknotens nur eine der denkbaren Lösungen der Aufgabe der Rastersynchronisation
darstellt. Für
biosynthetisch darzustellende, relevante Abschnitte des Prokollagens und
Varianten seiner Propeptide ist festzuhalten, daß die Aufgabe der Rastersynchronisation,
die für
die Erhaltung der im folgenden genutzten Affinität der Propeptide zu PAMP's wesentlich ist,
auch durch andere raumkoordinierende Maßnahmen zwischen den drei Kardelen
der AS-Stränge
zu lösen
ist.
Die
gilt für
insbesondere für
Nutzung der Bindungsfähigkeit
eines N-terminalen Fragments des Prokollagens. Neben der naheliegenden
Variante der ganz oder teilweisen Verkürzung des telopeptidischen
Abschnitts in einem biotechnologische exprimierten Produkt, wodurch
der Cystinknoten weiter N-terminal verlagert würde, können auch anders (als durch
kovalente Cys-S-S-Cys) ausgebildete Bindungen zwischen den AS der
drei Kardele genutzt werden, solange die räumliche Koordination der freien,
zusammen das Bindungsepitop für
PAMP's bildenden
Enden der drei Kardele erhalten bleibt. Diese Technik, ohne Nutzung
des natürlichen Cysteinknotens
oder eines funktionellen Equivalents, ist auch auf die C-terminale
Seite anwendbar.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
weist daher das Fragment oder die Variante des trihelikalen Faserproteins
das N- und/oder C-terminalen Ende eines trihelikalen Faserproteins
und gegebenenfalls einen Teil des Telomers.
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz ein Lipopolysaccharid
und das trihelikale Faserprotein ist Kollagen, Prokollagen oder
Tropokollagen, vorzugsweise Prokollagen, Fragmente oder Varianten
davon.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
die Zusammensetzung ferner Chondrozyten, Fibrozyten, Osteozyten,
retikulo-endotheliale Zellen, Endothelzellen und/oder Bestandteile
davon. Die vorgenannten Zellen sind zur Herstellung von Kollagen
befähigt.
Bevorzugt sind hierbei Chondrozyten und deren Bestandteile. Bevorzugte
Bestandteile sind hierbei die Zellmembran oder Fragmente davon.
Bestandteile der Zellen können
erfindungsgemäß der Zellkern,
Golgi-Apparat, Endoplasmatisches Retikulum, und Mitochondrien sein.
In
der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
können
die Komponenten (i) und (ii) nicht-kovalent oder kovalent miteinander verbunden
sein. Eine kovalente Bindung der Komponenten (i) und (ii) der Zusammensetzung
kann, sofern diese nicht bereits vorliegt, durch Quervernetzung
mit Hilfe bekannter Verfahren, wie z.B. durch Carbodiimide erreicht
werden.
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
angegeben, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Komponente
(i) mit der Komponente (ii) und ggf. das Aufreinigen und Isolieren
der Zusammensetzung umfasst. Die Komponente (i) als auch die Komponente
(ii) können
sowohl in der natürlicherweise
vorkommenden Form verwendet werden, als auch synthetisch hergestellt
werden. Syntheseverfahren hierzu sind dem Fachmann bekannt. Das
Inkontaktbringen der Komponenten kann hierbei in flüssiger Form
erfolgen oder eine der beiden Komponenten kann hierbei an einen
Träger
gebunden sein.
Verfahren
zum Aufreinigen oder Isolieren der Zusammensetzung umfassen hierbei
Zentrifugation, Gradientenfraktionierung, chromatographische Verfahren,
ein- bzw. zweidimensionale Gelelektrophorese.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens wird das Verfahren als in vitro-Verfahren durchgeführt, das
die Schritte umfasst:
- a) Bereitstellen eines
eine Komponente (i) enthaltenden Bakterien- oder Pilz-Eluates;
- b) Bereitstellen einer wachstumsangeregten Chondrozytenkultur;
- c) Inkontaktbringen des Bakterien- oder Pilz-Eluates mit der
Chondrozytenkultur; und
- d) gegebenenfalls Aufreinigen der Zusammensetzung.
Das
Pilz-Eluat ist vorzugsweise ein Eluat gewonnen aus Aspergillus,
Botrytis, Cladosporium, Eurotium, Penicillium, Wallemia, Chaetomium,
Mucor oder Scopulariopsis. Das Bakterien-Eluat ist vorzugsweise
ein Eluat gewonnen aus Actinomycetales, Salmonella, Shigella, E.
coli, Pseudomonas, Neisseria, Klebsiella, und Haemophilus. Eine
wachstumsangeregte Chondrozytenkultur wird vorzugsweise wie von
Shakibaei et al., Biochem. J. (1999), 342, 615–623 beschrieben, erhalten.
Hierbei wird das Knorpelgewebe mechanisch zerkleinert, inkubiert
und gereinigt in Ham's
F-12 Medium. Die Chondrozyten werden anschließend in Wachstumsmedium suspendiert.
Das Wachstumsmedium besteht aus Ham's F-12 und Dulbecco's modifiziertem Medium nach Eagle (50%:50%).
Diesem Medium werden 10% fötales
Kälberserum,
25 μg/ml
Ascorbinsäure
und 50 μg/ml
Gentamicin beigegeben.
Wie
vorstehend ausgeführt,
kann das Aufreinigen dem Fachmann bekannte Verfahren, chromatographische
Verfahren, Zentrifugation, Ultrafiltration und Gel-Elektrophorese
umfassen. Eine bevorzugte Ausführungsform
zur Herstellung besteht darin, die Komponente (i) an eine Säulenmatrix
zu koppeln und nachfolgend ein Detergenz-lysiertes Chrondrozyten-Lysat über diese
so präparierte
Säule zu
geben. Nach Inkubation des Chondrozyten-Lysates mit der gekoppelten
Komponente (i) kann nachfolgend nach Waschen der Säule die
Zusammensetzung eluiert werden. Die Elutionsbedingungen sind hierbei
vorzugsweise so zu wählen,
dass die Zusammensetzung nicht denaturiert.
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereitgestellt, die die vorstehend ausgeführte Zusammensetzung
und wenigstens einen pharmakologisch verträglichen Träger enthält. Pharmakologisch verträgliche Träger sind
dem Fachmann auf dem Gebiet der Galenik bekannt. Bevorzugt ist die
pharmazeutischen Zusammensetzungen als Vakzin geeignet, um eine Immunreaktion
der Person gegen wenigstens eine Komponente der Zusammensetzung
zur Prophylaxe gegen die Ausbildung einer Autoimmun-Reaktion hervorzurufen.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
kann die Vakzin-Formulierung ferner im Stand der Tech nik geeignete
Carrier-Moleküle
enthalten, um die Immunogenität
der Zusammensetzung zu erhöhen.
Die Vakzinformulierung kann vorzugsweise subkutan, intravenös oder intramuskulär verabreicht
werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann allgemein in flüssiger Form
oder in Form eines Aerosols unter geeigneter Verwendung Aerosol-stabilisierender
Verbindungen vorliegen.
Somit
wird erfindungsgemäß die Verwendung
der pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere als Vakzin zur
Prophylaxe und/oder Behandlung von Bindegewebserkrankungen bereitgestellt.
Bindegewebserkrankungen umfassen erfindungsgemäß Erkrankungen des Bewegungsapparates,
aber auch anderer bekanntermaßen
bindegewebig vermittelter Erkrankungen wie zum Beispiel Vaskulitiden,
Glomerulonephritiden, Endokarditis (mit und ohne Klappenbeteiligung),
Dermatitis und Dermatomyositis. Vorzugsweise sind die Bindegewebserkrankungen
ausgewählt
aus Arthrose, Weichteilrheuma, Fibromyalgie, rheumatischen Erkrankungen
oder rheumatischer Autoimmunreaktion.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Test-Kit zur Diagnostik von
Bindegewebserkrankungen bereitgestellt, der die erfindungsgemäße Zusammensetzung
enthält.
Der Test-Kit ist insbesondere geeignet zum Nachweis von Antikörpern, die
der Körper
als Reaktion auf die, unter natürlichen
Bedingungen gebildete Zusammensetzung insbesondere einen Komplex
aus Endotoxin und Prokollagen erzeugt. Der Antikörper Titer gegen die unter
natürlichen
Bedingungen gebildete Zusammensetzung ist hierbei ein Indikator
dafür,
ob die Beschwerden des Bindegewebes und des Bewegungsapparates auf
die Exposition durch die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor fähige Substanz,
insbesondere Endotoxine zurückzuführen sind.
Ein Vergleich mit dem Titer auf Autoantikörper gegen normales Kollagen
zeigt, ob eine Vorstufe der beginnenden rheumatischen Erkrankung
vorliegt oder bereits die rheumatische Erkrankung voll entwickelt ist.
Ersteres würde
angezeigt durch einen deutlichen Titer auf die natürlich gebildete
Zusammensetzung, wobei ggf. ein zusätzlicher schwacher Titer auf
körpereigenes
Kollagen vorliegt. Im weiteren Fall ist ein Titer auf die natürlicherweise
gebildete Zusammensetzung und ein hoher Titer auf körpereigenes
Kollagen festzustellen. Die erfindungsgemäßen Test-Kits sind demgemäss zum Nachweisen
eines Antikörpers
geeignet. Der Test-Kit kann ferner die im Stand der Technik bekannten
Puffersubstanzen enthalten, die zur Verwendung des Test-Kits im
Bestimmungs- und diagnostischen Verfahren geeignet sind. Vorzugsweise
ist die Körperflüssigkeit
zur Untersuchung durch den Test-Kit aus Blut bzw. Blutprodukten
einschließlich
Serum ausgewählt.
Für Bestimmungszwecke
vorteilhafte Verfahren sind hierbei Immuno-Assays, ELISA, RIA, membrangebundene
Teststreifen, Rezeptorbindungstests oder biosensorische Bestimmungen,
deren Durchführung
dem Fachmann bekannt ist. In einem ELISA-Nachweis würde beispielsweise
die Zusammensetzung auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden.
Im Test binden die spezifischen Antikörper und werden dann durch
entsprechend markierte Autoantikörper
durch bekannte Verfahren in ein Signal umgesetzt.
Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Reagenzien bereit, die an
die erfindungsgemäße Zusammensetzung
binden, vorzugsweise spezifisch für diese sind. Ein Beispiel
solcher spezifischer Reagenzien sind Antikörper, Antikörperfragmente, z.B. Fv-, F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente oder Antikörperderivate. Die Antikörper, Antikörperfragmente,
z.B. Fv-, F(ab) oder F(ab)2-Fragmente oder
Antikörperderivate
können
monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs sein. Allgemein sind spezifische
Antikörper
erhältlich,
in dem Versuchstiere, wie z.B. Mäuse
oder Kaninchen mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder wenigstens
der Komponente (i) bzw. Komponente (ii), die vorzugsweise an geeignete
hochmolekulare Trägermoleküle gekoppelt sind,
immunisiert werden. Das Immunisieren kann hierbei durch den Zusatz
geeigneter Adjuvanzien erleichtert werden, die im Stand der Technik
bekannt sind. Monoklonale Antikörper
sind üblicherweise
durch Fusionieren von Milzzellen, die aus einer immunisierten Maus
entnommen wurden, mit Tumorzellen und Selektionieren der dabei entstehenden
Hybridome erhältlich.
Diejenige Hybridome, die effizient spezifische Antikörper sezernieren,
können
hierbei durch Absuchen des Überstandes
bestimmt werden. Alternativ können
Antikörper
rekombinant hergestellt werden; bei der Herstellung rekombinater
Antikörper
wird die mRNA aus Hybridomazellen oder B-Lymphozyten isoliert, die
als Grundlage für
die Synthese der entsprechenden cDNA fungiert und über PCR
amplifiziert wird. Nach der Ligation in einen geeigneten Vektor
und der Einführung
einer geeigneten Wirtszellkultur lässt sich der Antikörper aus
den Zellkulturüberständen oder
den Zell-Lysaten gewinnen. Rekombinante Antikörper erlauben eine „Humanisierung" des Antikörpers und
sind dadurch weniger immunogen. Die diesbezüglichen Verfahren sind im Stand
der Technik bekannt. Antikörperderivate
umfassen Konjugate von Antikörpern
mit zur Detektion geeigneten Markern, beispielsweise zur Verwendung
in der Szintigraphie.
Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit,
enthaltend einen ersten Bindungspartner, der an die Komponente (i)
bindet, vorzugsweise für
diese spezifisch ist, und/oder einen zweiten Bindungspartner, der
an die Komponente (ii) bindet, vorzugsweise für diese spezifisch ist. Die
Zusammensetzung ist vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung.
Der erste und zweite Bindungspartner ist vorzugsweise ein Antikörper. Ein
weiteres Beispiel für
die Ausführungsform,
dass die Komponente (i) ein Endotoxin, vorzugsweise LPS darstellt,
ist der Bindungspartner LAL. Weitere Bindungspartner von Endotoxin, vorzugsweise
LPS, sind Albumin, Transferrin, HDL, LDL, Apolipoproteine, C-reaktives
Protein, CR1, CR3, CD14, Scavenger-Rezeptoren, CD18, Ganglioside, Lectin-ähnliche
Rezeptoren, Polysaccharid-Rezeptoren, bactericidal/permeability
increasing protein (BPI), cationic antimicrobial proteins (CAP),
und LPS-bindendes Protein (LBP), sowie lösliche Varianten der vorstehend
genannten Faktoren. Als weitere Bindungspartner für Komponente
(i) wird erfindungsgemäß Komponente
(ii) angegeben. Die Komponente (ii) ist hierbei vorzugsweise Prokollagen,
Tropokollagen, Kollagen, Synthesevorstufen, Fragmente oder Varianten
davon. Insbesondere ist die Komponente Prokollagen, Fragmente und
Varianten davon. Die Fragmente und Varianten von Prokollagen sind
hierbei wie vorstehend definiert. Die pharmazeutische Zusammensetzung
kann neben dem ersten Bindungspartner und/oder zweiten Bindungspartner
einen pharmakologisch verträglichen
Träger
enthalten. Geeignete Träger
sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugt sind die pharmazeutischen
Zusammensetzungen zur intravenösen,
subkutanen oder intramuskulären
Verabreichung geeignet. Wie vorstehend ausgeführt, stellt die zur Bindung
an einen PAMP-Rezeptor fähige
Substanz, insbesondere Endotoxin, die Noxe für das Absterben der kollagenproduzierenden
Chondrozyten dar, wobei die Substanz über das trihelikale Faserprotein
an den Chondrozyten bindet. Die pharmazeutische Zusammensetzung
kann daher einerseits direkt die zur Bindung an einen PAMP-Rezeptor
fähige
Substanz neutralisieren, bevor diese an den Chondrozyten bindet.
Andererseits kann die pharmazeutische Zusammensetzung bereits entstandene
toxische Komplexe aus dem Blutkreislauf beseitigen.
Geeignete
Konzentrationen an Bindungspartner in der pharmazeutischen Zusammensetzung
können bevorzugt
hierbei im Bereich von 1 μg/ml
bis 10 mg/ml sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist geeignet
zur Behandlung von Bindegewebserkrankungen einschließlich Erkrankungen
des Bewegungsapparates. Vorzugsweise ist die Bindegewebserkrankung
Arthrose, Weichteilrheuma, Fibromyalgie oder rheumatische Erkrankung.
Erfindungsgemäß wird ferner
ein Test-Kit zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen enthaltend den
erfindungsgemäßen Antikörper und/oder
die vorstehend genannte Zusammensetzung bereitgestellt. Der Test-Kit
kann ferner dem Stand der Technik bekannte Puffersubstanzen enthalten,
die zur Verwendung des Test-Kits in Bestimmungs- und diagnostischen
Verfahren geeignet sind. Der Test-Kit kann verwendet werden zur
Bestimmung der natürlicherweise
gebildeten Zusammensetzung, insbesondere einen Komplex enthaltend Endotoxin
und Prokollagen und/oder der in der Körperflüssigkeit befindlichen zur Bindung
an einen PAMP-Rezeptor fähigen
Substanz, insbesondere einem Endotoxin. Vorzugsweise ist die Körperflüssigkeit
aus Blut bzw. Blutprodukten einschließlich Serum ausgewählt. Der
Nachweis kann unter Verwendung von Immuno-Assays, ELISA, RIA, membran-gebundenen
Teststreifen, Rezeptorbindungstests oder biosensorischen Bestimmungen,
deren Durchführungen
dem Fachmann bekannt sind, ausgeführt werden.
Demgemäss wird
erfindungsgemäß ein Verfahren
zur Diagnostik von Bindegewebserkrankungen umfassend das Nachweisen
der Zusammensetzung durch Inkontaktbringen mit dem Antikörper oder
mit der Zusammensetzung enthaltend einen ersten Bindungspartner,
der die Komponente (i) bindet, vorzugsweise für diese spezifisch ist, und/oder
einen zweiten Bindungspartner, der an die Komponente (ii) bindet,
vorzugsweise für
diese spezifisch ist.
Ferner
wird erfindungsgemäß die Verwendung
der Komponente (ii) zur Neutralisierung von Endotoxinen wie LPS
zur Prophylaxe einer Autoimmunreaktion angegeben. Die Verabreichung
der Komponente (ii) führt
zur Bindung und damit zur Neutralisation der in der Körperflüssigkeit
des Patienten befindlichen Endotoxine. Komponente (ii) ist vorzugsweise
ausgewählt
aus Prokollagen, Tropokollagen, Kollagen, Synthesevorstufen, Fragmente
oder Varianten davon, besonders bevorzugt Prokollagen, Fragmente
oder Varianten. Die Fragmente oder Varianten sind hierbei wie vorstehend
definiert.
Es
ist beabsichtigt, mit den nachfolgenden Beispielen die Erfindung
zu erläutern,
diese jedoch in keiner Weise einzuschränken. Dem Fachmann sind aufgrund
der Beschreibung der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich,
die ebenfalls umfasst sind.
Beispiele
Beispiel 1:
Bestimmung
der wirksamen Noxe in Bakterien-Eluaten aus mikrobiell besiedeltem
Baumaterial.
Es
wurden aus dem Keller eines Wohnhauses mikrobiell besiedeltes Baumaterial
entnommen. Zur Eluat-Herstellung wurden 150 g dieses Materials und
60 ml PBS suspendiert und 30 Minuten bei 200 U/min gerührt. Danach
wurde die Probe 5 Minuten abgestellt, damit die festen Bestandteile
sedimentieren konnten. Sodann wurde der flüssige Teil zentrifugiert (bei
4000 g) und dann mit einem 0,2 μm
Celluloseacetatfilter gefiltert. Die auf diese Weise gewonnene Flüssigkeit
wurde mittels Kultivierung auf Nährböden auf
Sterilität
getestet. Dieses sterile Eluat wurde mit einer Verdünnung von
1:100 Chondrocyten-Kulturen zugesetzt.
Die
hierbei verwendeten primären
Chondrozyten-Kulturen wurden präpariert
gemäß Shakibaei
et al., Biochem. J. (1999), 342, 615–623; Shakibaei et al., J.
Biol. Chem (2001), 276, 13289–13294.
Knorpelgewebe
wurde mechanisch zerkleinert, inkubiert und gereinigt in Ham's F-12 Medium. Die Knorpelgewebestückchen wurden
anschließend
mit 1 % Pronase (2 Stunden bei 37°C)
und dann mit 0,2% Kollagenase (4 Stunden bei 37°C) aufgelöst. Hierbei wird die extrazelluläre Matrix
aufgelöst,
während
die Chondrozyten nicht angegriffen werden wurden. Beide Enzyme wurden
in Hanks Lösung
mit 5% (v/v) fötalem
Kälberserum
gelöst.
Die
Chondrozyten wurden anschließend
in Wachstumsmedium suspendiert. Das Wachstumsmedium bestand aus
Ham's F-12 und DMEM
(3:1) (v/v)). Diesem Medium wurden 10% (v/v) fötales Kälberserum, 25 μg/ml Ascorbinsäure und
50 μg/ml
Gentamicin hinzugefügt.
Die Chondrozyten wurden durch wiederholtes Pipettieren voneinander
getrennt. Die Zellen (Zelldichte: 2 × 106/10μl) wurden
in Alginate-Kügelchen
(Shakibaei und de Souza, Cell Biol. Int. (1997), 21, 75–86), kultiviert.
Nach zwei Wochen waren einige Zellen kontinuierlich aus den Alginate-Kügelchen
herausgewachsen und an die Petrischalen adhäriert. Nach drei Tagen, als
die Zellen konfluent gewachsen waren, wurden die Zellen der ersten
Passage mit 0,05% (v/v) Trypsin/1,0 mM EDTA entfernt und in Kulturflaschen
wieder ausgesät.
Alle drei Tage wurde die konfluente Monoschicht passagiert. Die
Zellen aus der Monolayer-Passage wurden in Kulturen hoher Dichte
eingeführt.
Die Kulturen hoher Dichte wurden hergestellt, wie im Detail von
Zimmermann et al., Cell Differ. Dev. (1990), 11–22 beschrieben. Kurz gefasst
wurden die Zellen zweimal in Wachstumsmedium gewaschen und durch
Zentrifugation (600 U/min über 10
Minuten) sedimentiert. Ein oder zwei Tropfen einer dichten Zellsuspension
(1,5 × 106Zellen/10 μl) wurden auf einen Membranfilter
aufgebracht (Porendurchmesser 0,2 μm, Sartorius, Göttin gen,
Deutschland) auf der Oberfläche
eines Edelstahlgitters im Zwischenbereich zwischen Medium und Luft
in einer Petrischale. Alle drei Tage wurde das Medium gewechselt.
Die Kulturen wurden bei 37°C
in einer befeuchteten Atmosphäre
mit 5% CO2 kultiviert.
Diesem
Medium wurde das Eluat zugesetzt. Nach drei Tagen und sieben Tagen
wurde das Knorpelgewebe mikroskopisch untersucht. Hierzu wurden
Schnitte angefertigt. 3(a) bis
(c) zeigen die Zerstörung der
Chondrozyten nach Zugabe des Eluates. 4(a) und
(b) zeigen zum Vergleich gesunde Chondozyten. Es war klar zu erkennen,
dass sowohl die extrazelluläre
Matrix als auch die Chondrozyten selbst, größtenteils aufgelöst waren.
Weitere Untersuchungen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Western
Blot zeigten, dass gleichzeitig mit der Gewebezerstörung eine
deutliche Zunahme von Enzymen der Gruppe der Matrixmetalloproteinasen
einhergeht.
Ferner
wurde dem Proben-Eluat 1 × 1
mg/ml, 1 × 10
mg/ml bzw. 1 × 100
mg/ml Polymyxin B (Sigma, P1004; Polymyxin B Sulfat Salz, >6000 USP Einheiten/mg)
zugesetzt. Polymyxin B bindet spezifisch Endotoxine. Es wurden verschiedene
Mengen Polymyxin B zugesetzt, bis schließlich mittels LAL-Tests (LAL-Test,
Pyrogent, BioWhittaker, Inc., MD, USA) nur noch sehr geringe Mengen
an Endotoxinen nachweisbar waren. Sodann wurden die Chondrozyten-Expositionsversuche
wiederholt. Es zeigte sich, dass in Korrelation zur LPS-Konzentration
im Eluat die Chondrozyten und die extrazelluläre Matrix geschädigt wurden.
Die Enzymproduktion von Kollagenase und Matrixmetalloproteinase
war hierbei umgekehrt proportional zum Endotoxingehalt.
Beispiel 2:
Anwendungen
von Nachweisverfahren zur Detektion von Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäße Zusammensetzung
gerichtet sind, zur Diagnostik.
Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann als Marker zur medizinischen Diagnostik von Bindegewebserkrankungen
an Mensch und Tier angewendet werden. Er kann in dieser Funktion
auch zur Therapiekontrolle angewendet werden. Auch hygienische Untersuchungen
beispielsweise des Wohn- und Arbeitsumfeldes im Hinblick auf bakterielle
Besiedelung oder Schimmelpilzbesiedelung und in diesem Zusammenhang die
Kontamination mit Endotoxinen sowie im Bedarfsfall Maßnahmen
zu deren Beseitigung spielen im Rahmen von Therapiekonzepten eine
wichtige Rolle.
Der
Einsatz der beschriebenen Antigene als Marker erfolgt vorzugsweise
im üblichen
diagnostischen Verfahren, wie Immuno-Assays, Blotting-Verfahren,
biosensorischen Verfahren oder vergleichbaren Verfahren. Dadurch,
dass das antigene Markermolekül
oder dessen Modifikationen (beispielsweise Modifikationen zur Verbesserung
der Beschichtungseffizienz) in entsprechenden Bindungstests, beispielsweise
Immuno-Assays eingesetzt wurden. Es kann direkt adsorptiv an die
Oberflächen
geeigneter hochadsorbierender Mikrotiter-Platten gebunden werden.
Nach entsprechenden Verfahren zur Blockierung und zum Coating-Schutz,
wie sie im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, erfolgt
der Assay, wobei verdünnte
Seren oder Plasmaproben im Assay eingesetzt werden. Autoantikörper, die
bei spezifisch betroffenen rheumatischen Patienten in entsprechendem
Titer vorhanden sind, binden an das immobilisierte Antigen. Die
Signalerzeugung erfolgt nach dem Stand der Technik bekannten Methoden
mit Enzym markierten (häufig
Meerrettichperoxidase), Antihuman-IgG (ggf. auch IgM oder IgA)-Antikörpern aus
Kaninchen, Schaf oder Ziege. Die endgültige Signalerzeugung findet über die
enzymatische Bildung eines Chromogens statt. Ein häufig verwendetes
Substrat ist das Tetramethylbenzidin-Substrat. Die Auswertung erfolgt
bei 450 nm einem ELISA-Photometer nach Abstoppen der Reaktion mit
verdünnter
Schwefelsäure.
Zur
Kalibrierung werden spezifische und hochtitrige Autoantikörper eines
Patientenserums (spezifisch erkrankter Patient) oder eines Pools
von mehreren Patienten-Seren verwendet. Die Konzentration bzw. der
Titer der spezifisch gerichteten Autoantikörper in den einzelnen Kalibrations-Seren
ist durch die Herstellung geeigneter Verdünnungen so einzustellen, dass
eine geeignete Standardkurve erzielt wird.
Die
Einstellung des Cut-Off-Wertes zur Diskriminierung zwischen normalen
und pathologischen Werten erfolgt durch Messung und Auswertung von
Seren- oder Plasmakollektiven von spezifisch erkrankten Patienten
und Kontrollprobanden. Der Cut-Off-Wert wird auf der Basis dieser
Messungen durch statistische Auswertung berechnet. Das beschriebene
diagnostische Verfahren ist bei rheumatischen Erkrankungen, die
mit inkorporierten Endotoxinen im Zusammenhang stehen, indiziert.
Erhöhte
Titer an spezifischen Autoantikörpern indizieren
rheumatische Erkrankungen, die häufig
durch bisher verwendete Laboruntersuchungen, wie beispielweise der
Messung des bekannten Rheumafaktors, nicht erfasst werden können. Die
Diagnostik erfasst demnach weitere spezifisch erkrankte Patienten
und verbessert und ergänzt
alleine dadurch die etablierte Labor-Diagnostik. Des weiteren ist nach erfolgter
positiver Diagnose eine hygienische Analytik des Wohn- und Arbeitsumfeldes
möglich,
die eine Eliminierung auslösender
Faktoren, insbesondere Endotoxine bzw. die Ursachen für die Existenz
dieser Endotoxine beseitigt.
Der
Test kann in diesem Zusammenhang zur Therapiekontrolle eingesetzt
werden. Einerseits zur Kontrolle einer Behandlung, andererseits
zur Kontrolle der erörterten
Beseitigung der möglichen
Ursachen, also Endotoxin-Belastungen des Umfeldes.
Beispiel 3:
Anwendungen
von Nachweisverfahren des Markers und dessen Modifkationen zur Diagnostik.
Neben
den Autoantikörpern
kann auch die Zusammensetzung selbst, insbesondere das Endotoxin oder
der Endotoxin-Prokollagen-Komplex im Serum nachgewiesen werden.
Der Nachweis der Autoantikörper ist
jedoch bevorzugt.
Das
Antigen selbst kann in einem üblichen
Verfahren wie in einem Immuno-Assay nachgewiesen werden. Darüber wird
das Antigen vorzugsweise in einem Sandwich-ELISA nachgewiesen. Grundlage
sind zwei, vorzugsweise verschiedene Antikörper, die durch Immunisierung
mit der Zusammensetzung, vorzugsweise an Endotoxin-Prokollagen-Komplex nach Verfahren,
die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen werden. In einem
ELISA, der als eine bevorzugte Methode zur Anwendung kommen kann,
wird einer der beiden Antikörper
in einem bevorzugten Verfahren zur Beschichtung verwendet, während der
andere mit einem Markerenzym gekoppelt wird. Die Kopplungsmethoden
sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Dieses
Verfahren kann alternativ oder ergänzend zur Autoantikörperbestimmung
eingesetzt werden. Ebenso, wie in Beispiel 3, sind auch veterinärmedizinische
Untersuchungen möglich.
Auch relevante Strukturen bzw. Antigene aus Zellkulturen lassen
sich mit der hier beschriebenen Erfindung nachweisen.
