PL181579B1 - Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce, oczyszczony kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych, sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, wydzielone przeciwcialo, koniugat mikobakteryjny i zestaw do wykrywania obecnosci gatunków Mycobacterium PL - Google Patents
Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce, oczyszczony kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych, sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, wydzielone przeciwcialo, koniugat mikobakteryjny i zestaw do wykrywania obecnosci gatunków Mycobacterium PLInfo
- Publication number
- PL181579B1 PL181579B1 PL95316792A PL31679295A PL181579B1 PL 181579 B1 PL181579 B1 PL 181579B1 PL 95316792 A PL95316792 A PL 95316792A PL 31679295 A PL31679295 A PL 31679295A PL 181579 B1 PL181579 B1 PL 181579B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- mycolic
- mycobacterial
- mixture
- carrier
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
- C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C51/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by liquid-liquid treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1289—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/5695—Mycobacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
Abstract
1 Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce biologicznej zwierzecia, znam ienna tym, ze k ontaktuje sie próbke biologiczna z przeciwcialem specyficznym dla co najmniej jednego wewnatrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu gatunku mikobakteryjnego zawierajacego kwas mikolowy lub mieszanine kwasów mikolowych; i wykrywa sie tworzenie sie kompleksu przeciwciala z antygenem w próbce. 6 Oczyszczony z mieszaniny wyekstrahowanych kwasów mikolowych i zanieczyszczen kwas mikolowy lub mieszanina kwasów miko- lowych o wzorze ogólnym. 7. Sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, z mieszaniny wyekstrahowanych mikobakteryjnych kwasów mikolowych i zanie- czyszczen poekstrakcyjnych, mikobakteryjnych kwasów mikolowych o ogólnym wzorze znamienny tym, ze rozpuszcza sie mieszanine kwasów mikolowych w dwufazowym ukladzie rozpuszczalnikowym i poddaje sie mie- szanine rozdzialowi metoda podzialu przeciwpradowego 16 Wydzielone przeciwcialo wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w sciankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym- 20. Koniugat mikobakteryjny wewnatrzkomórkowy antygen/nosnik, znam ienny tym, ze wewnatrzkomórkowy antygen jest oczysz- czonym mikobakteryjnym kwasem mikolowym lub mieszanina kwasów mikolowych i jest skoniugowany z nosnikiem. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce, oczyszczony kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych, sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, wydzielone przeciwciało, koniugat mikobakteryjny i zestaw do wykrywania obecności gatunków Mycobacterium.
Różne znane gatunki Mycobacterium są przyczyną chorób zakaźnych u ludzi i zwierząt. Jeden z takich gatunków Mycobacterium, Mycobacterium tuberculosis, wywołują gruźlicę u ludzi.
Gruźlicę uważa się za główną chorobę zakaźną w większości świata. Pomimo wielkich postępów nauk medycznych i ilości skutecznych leków, co na pewien czas stworzyło wrażenie całkowitego pokonania choroby, i pomimo zorganizowanych międzynarodowych akcji, gruźlica pozostaje światowym problemem zdrowotnym zaskakujących rozmiarów. Tylko w 1990 roku stwierdzono ponad 8 milionów nowych przypadków na całym świecie i ponad 3 miliony przypadków śmierci (snider, 1994). Prognozy Światowej Organizacji Zdrowia wskazują, że w okolicach 2000 roku roczne liczby wzrosną do 10,2 milionów nowych przypadków i 3,5 milionów ofiar, przy czym Azja i Afryka Zasaharyjska będą najbardziej zaatakowanymi kontynentami (Dolin, Raviglione i Koch, 1994). Globalny rozkład szacowanej liczby przypadków gruźlicy dla obecnej dekady i szacowanej liczby ofiar śmiertelnych dla tegoż okresu przedstawiono odpowiednio na fig. 1 i 2 (Dolin, Raviglione i Koch, 1994).
Udokumentowany ścisły związek pomiędzy gruźlicą i AIDS, a także częste jednoczesne występowanie obu tych chorób zwiększa powagę sytuacji (Torres i in., 1990; De Cock, 1994; Cantwell i Binkin, 1994; Murray, 1994). Wytworzenie oporności na wiele leków w szczepach Mycobacterium tuberculosis i innych typowych prątkach powiększyło i tak gigantyczny problem (Blumberg, Miller i Koomhof, 1994; Morse, 1994).
Pewne i wczesne wykrywanie gruźlicy i innych mikobakteryjnych chorób jest jednym z ważnych warunków opracownia skuteczniejszej globalnej strategii zwalczania tych chorób.
Tradycyjne laboratoryjne sposoby wykrywania mają poważne wady, polegające albo na niezdolności odróżnienia żywych i martwych bakterii (szybka i prosta metoda barwienia Ziehl-Neelsena) lub, jeśli już sposoby potwierdzają obecność żywych bakterii (bezpośrednia hodowla), konieczne jest wiele tygodni na ukończenie prób laboratoryjnych. Może to z kolei opóźnić rozpoczęcie leczenia i prowadzić do dalszego rozprzestrzeniania choroby.
Najnowsze sposoby podejścia są oparte na wykrywaniu odpowiedzi pacjenta na infekcję metodą testów serologicznych, odpowiedzi namnażania limfocytów na miko bakteryjne antygeny lub określanie poziomu deaminazy adenozyny, albo też na wykrywaniu mikobakteryjnych antygenów i składników w testach immunologicznych’takich jak ELISA, chromatografia gazowa i cieczowa lub spektrofotometria masowa. Najnowsze, moleculame podejścia obejmująreakcję łańcuchową polimerazy (PCR), sondy DNA lub fingerprinting DNA (Musial i in., 1988;
Godfrey-Faussett, 1994).
181 579
Mason i in., 1993 (Tubercle and Lung Disease) opisują sposób identyfikacji i analizy gatunków prątków z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał między innymi skierowany na mikobakteryjny lipoarabinomannan i niewymienione glikolipidy.
Wiker i in., 1991 (Journal of General Microbiology) opisująsposób analizy i identyfikacji gatunków prątków hodowanych w kulturze przez wykrywanie charakterystycznych białkowych antygenów prątków.
Hamid i in., 1993 (Journal of General Biology) opisują sposób rozróżniania prątków od innych bakterii przez wytrącanie kwasów mikolowych i wykonywanie ich analizy TLC.
Young, 1980 (Journal of General Biology) opisuje sposób ekstrahowania i analizy kwasów mikolowych prątków metodąTLC i wykazuje różnicę w profilu kwasów mikolowych pomiędzy Mycobacterium leprae i innych bakterii w biopsjach trądowych.
Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 0407605 podaje sposób wykrywania przeciwciał w surowicy pacjenta bakterii Nacardia poprzez wykrywanie przeciwciał na nikardialne kwasy mikolowe.
Jednak żaden ze sposobów wymienionych powyżej nie spełnia wszystkich warunków, prostej i wiarygodnej próby zdolnej do odróżnienia żywych i martwych komórek prątków.
Celowym byłoby zatem wykonane odpowiedniej próby oraz odpowiedniego zestawu, za pomocą których można by odróżnić żywe i martwe prątki.
Przedmiotem wynalazku jest próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce bilogicznej zwierzęcia, polegająca na tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałem specyficznym dla co najmniej jednego wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu gatunku mikobakteryjnego zawierającego kwas mikolowy lub mieszanie kwasów mikolowych; i wykrywa się tworzenie się kompleksu przeciwciała z antygenem w próbce. Korzystnie, próba diagnostyczna obejmuje etap lizy co najmniej niektórych mikobakteryjnych komórek obecnych w próbce przed zetknięciem próbki z przeciwciałem. Bardziej korzystnie, próba diagnostyczna obejmuje także etap przetwarzania biologicznej próbki dla uwolnienia mikobakteryjnych komórek od resztek organicznych, w których mogą być zawarte i usunięcia zanieczyszczeń biologicznych próbki od niepożądanych mikroorganizmów.
Próba diagnostyczna według wynalazku może także obejmować etap zatężania wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu w próbce w procedurze powinowactwa z unieruchomionym przeciwciałem przed zetknięciem ze znakowanym przeciwciałem.
W korzystnym wykonaniu wynalazku, próba diagnostyczna jako wewnątrzkomórkowy mikobakteryjny antygen posiada kwas mikolowy lub mieszaninę kwasów mikolowych znajdujących się w ściankach komórek gatunków Mycobacterium, o następującym wzorze ogólnym:
β a
CH3 - (CH2)X - CH·OH - CH - COOH (CH2)y
CH3
Przedmiotem wynalazku jest także oczyszczony z mieszaniny wyekstrahowanych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych o wzorze ogólnym:
181 579 β α
CH3 - (CH2)x - CH·OH - CH - COOH (CH2)y
I
CH3
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, z mieszaniny wyekstrahowanych mikobakteryjnych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń poekstrakcyjnych, mikobakteryjnych kwasów mikolowych o ogólnym wzorze:
β a
CH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOH
I (CH2)y
CH3 polegający na tym, że rozpuszcza się mieszaninę kwasów mikolowych w rozpuszczalniku dwufazowym i poddaje się mieszaninę rozdziałowi metodąpodziału przeciwprądowego. W sposobie według wynalazku korzystnie oczyszczone kwasy mikolowe nie podlegają późniejszej chemicznej derywatyzacji. Również korzystnie jako dwufazowy układ rozpuszczalnikowy stosuje się układ zawierający fazę górna i fazę dolną.
Korzystnie fazę góma i fazę dolna można mieszać i równoważyć.
Dwufazowy układ rozpuszczalnikowy może zawierać chloroform, metanol i wodę.
Bardziej korzystnie, skład fazy górnej stanowi 12-18% chloroformu, 45-55% metanolu i 20-40% wody.
Inny korzystny skład fazy górnej obejmuje 15% chloroformu, 52% metanolu i 33% wody. Korzystnie skład fazy dolnej wynosi 50-80% chloroformu, 15-40% metanolu i 2-8% wody, oraz bardziej korzystnie 68% chloroformu, 27% metanolu i 5% wody.
Następnym przedmiotem wynalazku jest wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:
β a
CH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOH (CH2)y
CH3 .
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:
181 579 β α
CH3 - (CH2)X - CH-OH - CH - COOH
I (CH2)y
CH3 przy czym każdy kwas mikolowy skoniugowany jest z nośnikiem.
Korzystnie wydzielone przeciwciało charakteryzuje się tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne, a bardziej korzystnie poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego.
Przedmiotem wynalazku jest też koniugat mikobakteryjny wewnątrzkomórkowy antygen/nośnik, charakteryzujący się tym, że wewnątrzkomórkowy antygen jest oczyszczonym mikrobakteryjnym kwasem mikolowym lub mieszaninąkwasów mikolowych i jest skoniugowany z nośnikiem.
Korzystnie w koniugacie według wynalazku jako nośnik stosuje się białko, a bardziej korzystnie jako nośnik stosuje się żelatynę lub albuminę surowicy bydlęcej.
Można też korzystnie jako nośnik stosować hemocyjaninę pijawki.
Najbardziej korzystnie w koniugacie według wynalazku jako wewnątrzkomórkowy antygen stosuje się mieszaninę kwasów mikolowych, przy czym każdy ma wzór ogólny:
β a
CH3 - (CH2)X - CH-OH - CH - COOH
I (CH2)y
I
CH3
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do wykrywania obecności gatunków Mycobacterium w biologicznej próbce obejmujący przeciwciało i stałe podłoże, charakteryzujący się tym, że obejmuje wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego kwasu mikolowego lub kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:
β a
CH3 - (CH2)X - CH-OH - CH - COOH (CH2)y
CH3
181 579 ewentualnie skoniugowane z nośnikiem, korzystnie z nośnikiem białkowym oraz stałe podłoże pokryte częściowo koniugatem kwas mikolowy-żelatyna.
Korzystnie w zestawie według wynalazku jako przeciwciało znajduje się przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne. Bardziej korzystna odmiana zestawu według wynalazku zawiera poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego, a jako nośnik zawiera żelatynę lub albuminy surowicy bydlęcej.
Korzystnie zestaw według wynalazku jako nośnik zawiera hemocyjaninę pijawki oraz unieruchomione przeciwciało wobec oczyszczonego kwasu mikołowego lub mieszaniny kwasów mikolowych.
Szczegółowy opis wynalazku
Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie diagnostycznej próby na potwierdzenie obecności prątków w próbkach biologicznych pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, takich j ak plowocina, płyn mózgowo-rdzeniowy, krew, mocz, odchody, próbki tkanki, produkt płukania żołądka, ślina, wymaz z gardła lub wysięk z ran skóry.
Próba jest oparta na immunologicznym wykrywaniu jednego lub więcej komórkowych antygenów/kwasów mikolowych pochodzących z prątków. Próba może być oparta na zastosowaniu przeciwciał znakowanych eiizymem, barwnikiem fluorescencyjnym, cząstkami lateksu łub innymi odpowiednimi znacznikami.
Kwasy mikolowe sąa-hydroksylowymi tłuszczowymi kwasami o dużej masie cząsteczkowej, które maja względnie długie alifatyczne łańcuchy w pozycji a.
Ponieważ wiadomo, że każdy gatunek rodzaju Mycobacterium charakteryzuje się unikalnym rodzajem kwasów mikolowych (Butler, Jost i kilbum, 1991; Butler i Kilbum, 1988), powinno być możliwe rozróżnienie pomiędzy różnymi członkami rodzaju przy pomocy specyficznych przeciwciał dostarczanych w teście.
Przykład 1
Badania, które stanowiły podstawę wynalazku, dającego sposób wykrywania i identyfikacji różnych gatunków w próbce biologicznej, obejmowały następujące etapy:
Etap 1. Sprowadzenie szczepów Mycobacterium. Kultury nabyto w American Type Culture Cołlection (ATCC);
Etap 2. Wydzielenie kwasów mikolowych z kultur Mycobacterium, identyfikacja kwasów mikolowych metodą analizy HPLC i ich oczyszczanie;
Etap 3. Wytwarzanie koniugatów kwasów mikolowych z użyciem BSA, KLH i żelatyny jako cząsteczek nośnika;
Etap 4. Immunizacja zwierząt doświadczalnych i wytworzenie przeciwciał specyficznych dla kwasów mikolowych. Zbadanie przeciwciał;
Etap 5. Proponowane rozwijanie diagnostycznego testu/próby (nadawanie wykrywalności reakcji antygen/przeciwciało);
Etap 6. Dalsza ocena diagnostycznego testu/próby: potwierdzenie specyficzności i wrażliwości testu, testy połowę, porównanie z istniejącymi testami/próbami;
Materiały (w tym zwierzęta doświadczalne), sposoby i wyniki badań opisano poniżej.
MATERIAŁY
Kultura
W eksperymentach zastosowano Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294 - zjadliwy szczep oryginalne wydzielony z zainfekowanego ludzkiego płuca.
Kulturę nabyto w postaci liofilizowanej z American Type Culture Cołlection (ATCC), Maryland, USA.
Pożywki
W hodowli M. tuberculosis użyto następujących pożywek:
Ciekła pożywka: bulion Dubosa
Stałe pożywki: pożywka Lówenstein-Jensena (LJ) pożywka Middlebrook 7H-10
Szczegółowy zestaw składników koniecznych do wytwarzania tych pożywek, oraz warunki zalecane do ich sterylizacji, podano w Laboratory Manuał of Tuberculosis Methods, Tubercu10
181 579 losis Research Institute ofthe S.A. Medical Research CounciI (1980, rozdz. 6, str. 83-105; wyd. 2, przejrzane przez E. E. Nela, H.H. Kleeberga i E. M.S. Gatnera).
Pożywki wytworzył Departament of Medical Microbiology z Institute for Pathology of the University of Pretoria.
Reagenty
Poniższe reagenty zastosowano do zmydlania, ekstrakcji, derywatyzacji i wysokowydajnej cieczowej chromatografii (HPLC) w analizie kwasów mikolowych
Reagent A: 5% wodorotlenek potasu (czysty do analizy) rozpuszczony w mieszaninie metanol-woda (1:1), 62,5 g wodorotlenku potasu rozpuszczono w 125 ml wody i dodano 125 ml metanolu (BDH, chromatograficznie czysty).
Reagent B: Stężony kwas chlorowodorowy (BDH, czysty do analizy) rozcieńczono wodą 1:1.
Reagent C: 2% wodorowęglanu potasu (BDH, czysty do analizy) rozpuszczono w mieszaninie metanol-woda (1:1) 10 g wodorowęglanu potasu rozpuszczono w 250 ml wody i dodano 250 ml metanolu.
Reagent D: bromek para-bromofenacyłu w eterze koronowym (Pierce Chemical Co, nr kat 48391) rozdzielono w porcjach 500 μΐ do małych brunatnego koloru fiołek z zakrętami i powlekanymi Teflonem (znak handlowy zastrzeżony) przegrodami. Zakrętki dokręcono i fiolki owinięto Parafilmem (znak handlowy zastrzeżony). Reagent D przechowywano w temperaturze 4°C.
Reagent E: Reagent E wytworzono mieszając reagent B 1:1 z metanolem.
Wzorzec HPLC:
Wzorzec wewnętrzny o dużej masie cząsteczkowej (C-110) z Ribi ImmunoChem Research Company, nr kat. R-50). Wzorzec, 1 mg, umieszczono w zawiesinie w 2,0 ml chlorku metylenu (BDH, chromatograficznie czysty), rozdzielono w porcjach 350 μΐ do małych fiolek z zakrętkami i powlekanymi Teflonem (znak handlowy zastrzeżony) przegrodami. Fiolki owinięto Parafilmem (znak handlowy zastrzeżony) i przechowywano w temperaturze 4°C.
W celu ograniczenia odparowania chlorku metylenu porcje wzorca HPLC trzymano na lodzie w czasie manipulacji. Chloroform (Associated Chemical Enterprises, chemicznie czysty)
Chlorek metylenu (BDH, chromatograficznie czysty)
Reagenty A, B, C i E wytworzono świeżo przed eksperymentami, z zachowaniem koniecznych zasad bezpieczeństwa.
Do wytwarzania reagentów stosowano podwójnie destylowaną dejonizowaną wodę.
Następujące reagenty zastosowano do oczyszczania ekstrahowanych kwasów mikolowych: Chloroform (Saarchem, czysty do analizy) Metanol (Merck, chemicznie czysty) Poniższe reagent zastosowano do immunizacji zwierząt doświadczalnych: Albumina surowicy bydlęcej (BSA) - Sigma partia 11 HI 040 Koniugaty kwasy mikolowe-BSA
Hemocyjanina pijawki - KLH Sigma Immuno Chemicals
Koniugaty kwasy mikolowe - KLH
Niekompletna pożywka Freunda (FIA)
Modulator immunologiczny AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony (Pierce Chemical Company, ne kat. 77138)
Sterylna solanka - 0,85% roztwór chlorku sodu w podwójnie destylowanej wodzie.
Poniższe reagenty zastosowano do rozwijania w teście ELISA do wykrywania przeciwciał specyficznych dla kwasów mikolowych:
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) - Sigma partia 11 HI040
ŻelatynaServa, partia 22151, Reinst technicznie czysty)
Koniugat żelatyna-MA
PBS - solanka buforowana fosforanem (pH 7,4) zawierająca:
Chlorek sodu (Unilab, chemicznie czysty, partia 28159)
Dodekahydrat wodorofosforanu sodu (Merck, chemicznie czysty, partia 7468715)
Chlorek potasu (Merck, chemicznie czysty, partia 6420150)
181 579
Dwuwodorofosforan potasu (Merck, chemicznie czysty, partia 6332422)
Bufor cytrynianowy (pH 4,5) zawierający:
0,1 M kwas cytrynowy (Merck, partia 775A)
0,1 M cytrynian disodowy (Merck, partia 8333833)
Kazeina (Merck, partia 0100 336 V279342) o-Fenylenodiamina (dichlorowodorek) Sigma partia 59F-5021)
Metanol (Saarchem, czysty do analizy, partia 31260)
Koniugat kozie anty-mysie monoklonalne przeciwciało-peroksydaza (Cappel, partia 37081)
Substrat: 8 mg wodoroperoksydazy mocznika mg o-fenylenodiaminy w 10 ml 0,1 M bufora cytrynianowego
W eksperymencie zastosowano próbki surowic z 5 immunizowanych i 3 kontrolnych myszy.
Zwierzęta doświadczalne
Sześciotygodniowe samice myszy Balb-C zastosowano w doświadczeniach immunizacyjnych. Myszy wyhodowano w Animal Centre w South African Institute for Medical Research w Johannesburgu.
Płytki ELISA
Do testów ELISA zastosowano Nunc Immunoplates (Maxisorp).
Przeciwprądowy aparat rozdzielający
W czasie badań stosowano przeciwprądowy aparat produkcji H O POST, Instrument Company Inc., Middle Village, New York.
METODY
W pracach doświadczalnych zastosowano następujące metody:
Hodowla szczepu bakteryjnego
Bakterie hodowano w temperaturze 37°C stosując:
Bulion Dubosa
Pożywkę Lowenstein-Jensena (skośna hodowla), oraz
Pożywkę agarową Middlebrook 7H-10 (skośna hodowla).
Wytwarzanie kwasów mikolowych z próbek bakterii
Wytwarzanie próbek bakterii składało się z trzech etapów:
zbierania komórek prątków;
zmydlania oraz ekstrakcji kwasów mikolowych
Zmydlanie, ekstrakcję i derywatyzację kwasów mikolowych prowadzono zgodnie z opisem Butlera, Josta i Kilbuma (1991), z niewielkim modyfikacjami i opisano pod odpowiednimi nagłówkami.
Szkło stosowane do ekstrakcji, derywatyzacji i analiz HPLC kwasów mikolowych przemyto 2% (objętościowo) Contradem (Merck), przepłukano wodą następnie chloroformem, wodą etanolem technicznie czystym, wodą i na koniec podwójnie destylowaną dejonizowaną wodą. Przemyto szkło osuszono ciepłym powietrzem w piecu.
Zbioru dokonano zdrapując narośnięte bakterie z powierzchni skosów pożywki (przy pomocy sterylnych pętli z tworzywa sztucznego). Homogenne zawiesiny w reagencie A bakterii wytworzono wytrząsając lub odwracając zebrane komórki ze sterylnymi szklanymi kulkami.
Zmydlanie prątków w reagencie A prowadzono w autoklawie w temperaturze 121 °C, przez godzinę.
Ekstrakcja kwasów mikolowych obejmowała następujące czynności:
Próbki pozostawiono do ochłodzenia i wprowadzono 1,3 ml reagentu B do każdej próbki.
Po odwracaniu każdej próbki sprawdzono i w razie potrzeby ustawiono na pH 1 reagentem B.
Następnie do każdej próbki dodano 2,0 ml chloroformu i odwracano przez 30 s. Warstwy pozostawiono do rozdzielenia. Dolne warstwy usunięto pipetami Pasteura, przeniesiono do fiolek WISP i odparowano do suchej masy w temperaturze 85°C w odparowalniku blokowym pod strumieniem azotu. W celu neutralizacji przywleczonych śladów kwasu dodano do każdej próbki
181 579
100 μΐ reagentu C i ciecz odparowano do suchej masy w temperaturze 85°C w odparowalniku blokowym pod strumieniem azotu.
Derywatyzacja kwasów mikolowych do analizy HPLC
Ekstrahowane kwasy mikolowe dery waty zowano jak następuje:
Do każdej ochłodzonej próbki wprowadzono 1,0 ml chloroformu, a następnie 50 μΐ reagentu D. Zamknięte próbki odwracano przez 30 s i ogrzewano przez 20 minut w temperaturze 85°C w odparowalniku blokowym. Następnie próbki ochłodzono i dodano 1,0 ml reagentu E. Próbki odwracano przez 30 s i warstwy pozostawiono do rozdzielenia. Dolne warstwy usunięto pipetami Pasteura i przeniesiono do fiolek WISP. Fiolki umieszczono w odparowalniku blokowym i ich zawartość odparowano do suchej masy w temperaturze 85° stosując strumień azotu.
Pozostałości umieszczono w zawiesinie w 0,212 g (co odpowiada 160 μΐ chlorku metylenu, zamknięto i odwracano. Każdą uzupełnionąpróbkę, do której wprowadzono 5 μΐ HPLC wewnętrznego wzorca, przesączono przez 0,45 pm przeponowy filtr do brunatnego koloru fiolki WISP. Ponownie zatkane fiolki trzymano w temperaturze 4°C do analiz HPLC.
Analiza HPLC i ilościowe oznaczenie kwasów mikolowych
Dla celów analizy HPLC zanalizowano 25 pl każdej próbki (trzymanej na lodzie w czasie manipulacji). Próbki kontrolne, to jest 23pl przesączonego chlorku metylene, przepuszczano przed analizą każdego analizowanego zestawu próbek. Jeśli analizowano wiele próbek, w celu sprawdzenia rzetelności aparatu HPLC, kontrolne próbki przepuszczano po każdych trzech lub czterech testowych.
Analizy HPLC z odwróconymi fazami prowadzono stosując aparat Beckman System Gold High Perforamance Liąuid Chromatography złożony z pomp (Beckman 110 B Solvent Delivery Module);
detektora (programmable detector module 166 lub 168);
kolumny (Nova-Pack Cl 8 4 pm 3,9 χ 150 mm) i zestaw końcowego łącznika dla stalowej kolumny wkładowej.
Warunki pracy:
Faza ruchoma:
Rozpuszczalnik A: chromatograficznie czysty metanol
Rozpuszczalnik B: chromatograficznie czysty chlorek metylenu
Natężenie przepływu: 2,5 ml/min.
Temperatura kolumny: 30°C
Detektor ustawiono na 260 nm.
Gradient HPLC początkowo zawierał 98% (objętościowo) metanolu (rozpuszczalnik A) i 2% (objętościowo) chlorku metylenu (rozpuszczalnik B). Gradient podwyższano liniowo do 80% A i 20% B po 1 minucie; 35% A i 65% B po 10 minutach utrzymywane przez 30 s i zmniejszano następnie przez 30 s z powrotem do 98% A i 2% B. Stosunek ten utrzymywano przez 4 minuty dla stabilizacji systemu przed wstrzyknięciem nastęOpnej próbki.
Matematyczne ilościowe oznaczenie kwasów mikolowych prowadzono porównując połączone pola pod pikami badanych próbek z polami pod pikami wprowadzonej ilości wzorca wewnętrznego HPLC o dużej masie cząsteczkowej.
Oczyszczanie kwasów mikolowych i grupowe oddzielanie innych kwasów tłuszczowych
W eksperymencie zastosowano przeciwprądowy ciąg rozdzielający składający się z 25 probówek, ponumerowanych 0-24. Do buforowego zbiornika wprowadzono około 900 ml górnej fazy.
Do probówki numer 0 wprowadzono próbki surowego komórkowego ekstraktu M. tuberculosis otrzymane z wielkoskalowego eksperymentu ekstrakcji (30-150 mg), rozpuszczono w ml dolnej fazy i 10 ml górnej fazy. Do pozostałych 24 probówek wprowadzono porcje 10 ml dolnej fazy. Górną fazę, w ilości 10 ml na cykl, automatycznie usuwano do probówki numer 0, wielokrotnie przez 25 cykli dających operację trwającą około lógodzin. Tak więc przeprowadzono 25 przeciwprądowych cykli, przy czym każdy cykl składał się z 20 ruchów mieszania i 40 minut czasu rozdzielania faz.
181 579
Przy każdym przeniesieniu, każdą substancję rozpuszczoną pochodzącą z próbki i znajdującą się w górnej fazie przenosi się do kolejnej probówki. Po zakończeniu 25 przenoszeń oddzielone frakcje rozpuszczone będą rozłożone wzdłuż ciągu 25 probówek.
W celu ustalenia rozkładu kwasów tłuszczowych pomiędzy 25 probówkami obserwowano wzory emulgowania w górnych i dolnych fazach w ciągu probówek i odpowiednio określano frakcje.
Oddzielony przeciwprądowo materiał usuwano następnie z probówek stosując 50 ml szklaną strzykawkę z rurką z Teflonu (znak handlowy zastrzeżony). Materiał łączono w 7 frakcji, suszono indywidualnie pod zmniejszonym ciśnieniem w odparowalniku Buchi w temperaturze 70°C, osuszony materiał rozpuszczano w chloroformie, metanolu lub wodzie (około 5 ml), przenoszono do brunatnego koloru fiolek WISP i przechowywano w temperaturze 4°C aż do wykorzystania.
Wydajność kwasówmikolowych oczyszczonych metoda przeciwprądowego rozdzielania
W celu obliczenia przybliżonej wydajności oczy szczania/rozdzielania, zważoną ilość kwasów mikolowych z próbek po przeciwprądowym oczyszczaniu/rozdzielaniu porównano z ilością tych związków w surowym ekstrakcie komórkowym wprowadzanym do aparatu przeciwprądowego, obliczoną ze względnych powierzchni pików grupy kwasów mikolowych i powierzchni pików wzorca na chromatogramie HPLC surowego ekstraktu komórkowego.
Przeciwprądowe oczyszczanie kwasów mikolowych
Materiał ekstrahowany z M, tuberculosis, zgodnie ze sposobem proponowanym przez Butlera, Josta i Kilbuma (1991) wydzielania kwasów mikolowych, okazał się zawierać mniej niż 10% kwasów mikolowych (tablica 1). W celu nadania kwasom mikolowym immunogenności, konieczne jest związanie oczyszczonego materiału z cząsteczkami nośnika, takimi jak albumina surowicy bydlęcej. Ważnym wymaganiem tej procedury jest rozpuszczalność kwasu mikolowego w odpowiednim rozpuszczalniku.
Przeciwprądowe oczyszczanie ekstraktu surowych kwasów mikolowych z M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 z użyciem fazowego układu opisanego powyżej, wykonywano w ciągu 25 cykli.
Po zmieszaniu końcowych faz w ciągu probówek i pozostawieniu do osiadania przez kilka minut można było zaobserwować wzór emulgacji, wskazujący dokładnie, jak materiał rozkładał się wzdłuż ciągu probówek.
Frakcje 1,2,3,4 i 5 zanalizowano metoda HPLC, która ujawniła charakter kwasu mikolowego pików 1 i 2, i charakter krótkołańcuchowego kwasu tłuszczowego pików 4 i 5 (wykres 1).
Profile HPLC surowego ekstraktu komórkowego, frakcji 1 i frakcji 4 przedstawiono na wykresie 1.
Frakcji 6 i 7 nie można zanalizować metodą HPLC wskutek faktu, że nie rozpuszczają się w chloroformie.
Wzór rozkładu masy (tabela 1) wskazuje, że osiągnięto oddzielenie linii podstawowej kwasów mikolowych od ich bardziej polarnych zanieczyszczeń, a wydajność 8% korelowała z teoretyczną wydajnością kwasów mikolowych z surowego ekstraktu w granicach błędu doświadczalnego.
181 579
181 579
Tablica 1
Profil HPLC pierwszej frakcji z przeciwprądowo oczyszczonego materiału
9 | Łącznie: 35, 1 *) Kd=-^U- | |||||||
r- | 23 24 । | i'1 | V£> r-H | brak | ni ekrystal. związek organ i c z ny | 1 50% metanol- : woda | ||
lo r-4 | 20 21 22 | 9 '91 | 5, 5 | brak | cukier krystaliczny | 1 50% metanolwoda | ||
vn m cn | — | lD | 12 13 14 15 16 17 18 19 | 13, 3 | 1,26 | górna faza 1 .. . | mydło (zmydlone kwasy tłuszczowe) | r chloroform:metanol (3:7 obj.) |
8 1,3 2,7 — □□ o ΕΞΞΙ | <r | 8 9 10 11 | o »-♦ | dolna faza | ||||
rn | 5 6 7 | o | 1 | brak | brak | 1 | ||
CXI | 2 3 4 | 0/ 5 | 1 0, 08 | dolna faza . ______ | kwasy mikolowe | chloroform | ||
l 0 | o cn | |||||||
50 40 % rozkład 30 masy 20 10 | Numer frakcji | Numer probówki | Wydajność (mg) | Scala dystrybucji Kd*) | Wzór emulgacj i | Natura fizyczna | Rozpuszczalne w |
181 579
Wytwarzanie koniugatu kwasy mikolowe-BSA (albumina surowicy bydlęcej)
Wytworzono roztwór BSA zawierający 5 mg w 500 μΐ 0,1 N NaHCO3 (pH 8,3). Próbki oczyszczonego przeciwprądowo kwasu mikolowego (4,5 mg) rozpuszczono w 450 μΐ chloroformu. Roztwór BSA dodano powoli do porcji 200 μΐ roztworu kwasów mikolowych w czasie 1 min. 20 s, w temperaturze pokojowej. W czasie procesu mieszaninę zawracano. Po dodatkowym zawróceniu przez 30 s, próbki umieszczono na lodzie na 15 minut. Wprowadzono następnie ochłodzony lodem aceton (2 ml) w czasie 2 minut, ciągle trzymając próbki na lodzie. Mieszaninę odstawiono na godzinę.
Po usunięciu czwartej części roztworu do innej fiolki do analizy HPLC (0,5 mg), próbkę odwirowano w trzech krótkich 10 s impulsach i granulkę przemyto dwukrotnie acetonem. Granulkę przeniesiono następnie znów do fiolki WISP, osuszono na powietrzu i trzymano w temperaturze 4°C przez noc. Próbkę pobraną do analizy HPLC osuszono ogrzewaniem blokowym.
Dodawanie adiuwanta prowadzono w następujący sposób:
Próbkę modulatora immunologicznego AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony) (10 mg) zmielono szklanąbagietkąi dodano próbki koniugatu kwasy mikolowe-BSA (1 mg), osuszonego ogrzewaniem blokowym. Proszki zmielono ze sobą z wytworzeniem jednorodnego proszku, z którego odważono 1 mg i rozpuszczono w 1 ml sterylnej solanki, resztę mieszaniny AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony) /BSA-kwasy mikolowe zatopiono pod zmniejszonym ciśnieniem, zawinięto w folie i przechowywano w temperaturze 4°C.
Roztwór solanki poddano sonikacji stosując Branson Sonifier - Celi disruptor B-30 przez dziesięć 10 s cykli impulsów z przerwami 10 s, a następnie jeden 30 s cykl impulsów, co dało jednorodną dyspersję cząstek. W czasie sonikacji próbkę trzymano na lodzie. Zgodnie z instrukcją producenta roztwór solanki pozostawiono w temperaturze 4°C na 4 godziny przed użyciem do immunizacji.
Po usunięciu immunogenu koniecznego do immunizacji dodano znaczny nadmiar oziębionego lodem acetonu do pozostałego roztworu solanki, w celu wytrącenia białek. Osad przemyto dwukrotnie zimnym acetonem i przechowywano w folii pod acetonem w temperaturze 4°C.
Wytwarzanie koniugatu kwasy mikolowe-żelatyna
Wytworzono roztwór żelatyny zawierający 5 mg żelatyny w 2 ml 0,1 N NaHCO3 (pH 8,3). Próbkę 500 μΐ roztworu dodano do 600 μΐ metanolu i zmieszano. Mieszaninę dodano następnie stopniowo do 2 mg kwasów mikolowych rozpuszczonych w 50 μΐ chloroformu w czasie 1 min. 20 s z odwracaniem. Próbkę odwracano następnie przez 30 s i umieszczono na lodzie na 15 minut.
Próbkę przeniesiono do 100 ml kolby Schotta i dodano 80 ml oziębionego lodem acetonu. Kolbę Schotta z zawartościąpozostawiono na lodzie przez 30 min. Osad zawierający kwasy mikolowe adsorbowane na żelatynie przemyto dwukrotnie acetonem i próbki przechowywano pod acetonem w temperaturze 4°Ć.
Immunizacja myszy
Immunizację myszy prowadzi się zgodnie z następującym protokołem:
Czas Rodzaj manipulacji Miejsce manipulacji
Dzień 1 | pierwsza immunizacja | poduszka stopy |
Dzień 14 | druga immunizacja | podskórnie |
Dzień 21 | pierwsze pobieranie krwi | żyła ogonowa |
Dzień 28 | trzecia immunizacja | podskórnie |
Dzień 35 | drugie pobieranie krwi | żyła ogonowa |
Dzień 49 | trzecia immunizacja | podskórnie |
Dzień 59 | trzecie pobieranie krwi | żyła ogonowa |
Każdej z procedur immunizacji towarzyszył kontrolny eksperyment, w którym grupie dwu myszy wstrzykiwano tylko cząsteczki nośnika i odpowiedni adiuwant, w identyczny sposób.
W czasie pierwszej immunizacji, pięciu samicom myszy Balb-C wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap porcjami mieszaniny koniugatu kwasów mikolowych i adiuwanta. Do stopy wstrzyknięto około 50 μΐ mieszaniny. W czasie dalszych immunizacji wstrzyknięto podskórnie tę samą objętość mieszaniny koniugatu kwasów mikolowych i adiuwanta.
181 579
Przy pierwszym i następnych i pobieraniach krwi kilka kropli pobierano z żyły ogonowej każdej myszy, w tym kontrolnej.
Monitorowane wytwarzania przeciwciał
Wytwarzanie surowicy
W celu monitorowania przeciwciał pobrano kilka kropli krwi z żyły ogonowej każdej myszy. W czasie pierwszego pobierania krwi z pięciu immunizowanych myszy i trzech kontrolnych zebrano i wprowadzono do dwu oddzielnych probówek Eppendorffa (Eppendorff to zastrzeżony znak handlowy), zmieszano i pozostawiono do skrzepnięcia. Surowicę oddzielono do erytrocytów przez odwirowanie w wirówce Eppendorffa (Eppendorff to zastrzeżony znak handlowy) przez 10 min. Zebrane supernatanty surowic trzymano w temperaturze 4°C. Przy następnych pobieraniach próbki krwi zbierano i miareczkowano oddzielnie.
Wytwarzanie płytek ELISA
Płytki ELISA powlekano roztworami powlekającymi zawierającymi BSA lub koniugat kwasy mikolowe-żelatyna w stężeniu 10 pg/ml w buforze PBS (pH 7,4).
Porcje 50 pl roztworów powlekających BSA lub kwasów mikolowych-żelatyny wprowadzono do indywidualnych studzienek i płytki ELISA inkubowano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej.
Płytki ELISA zablokowano następnie 200 pl 0,5% kazeiny w buforze PBS (pH 7,4) na studzienkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Blokujący roztwór usunięto przez otrząśnięcie i płytki osuszono.
Miareczkowanie surowicy
Osocza otrzymane z immunizowanych myszy rozcieńczono 0,5% kazeiną w buforze PBS (pH 7,4) i załadowano na płytkę ELISA potrójnie. Osocza od myszy kontrolnych, to jest myszy immunizowanych BSA AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony) i nie immunizowanych, podobnie rozcieńczono 0,5% kazeinąw buforze PBS (pH 7,4) i załadowano na płytkę ELISA potrójnie, w ilości 50 pl na studzienkę.
Bezpośrednie miareczkowanie surowicy otrzymanego z myszy immunizowanych koniugatem BSA-kwas mikolowy połączono z testem inhibicji, w celu potwierdzenia specyficzności przeciwciała. Dla celów eksperymentów inhibitacji koniugat BSA-kwasy mikolowe wprowadzono jako współzawodniczący antygen w stężeniu 0,32 mg/ml do surowic odpornościowych w czasie inkubacji na płytce ELISA.
Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę na wytrząsalniku do płytek. Po tym okresie surowice usunięto i płytkę przemyto 3 x 0,5% kazeiny w buforze PBS (pH 7,4) w Anthos Autowash.
Koniugat kozie anty-mysie monoklonalne przeciwciało-peroksydaza rozcieńczono 1:4000 wprowadzono na płytki ELISA (50 μΐ na studzienkę) i płytki pozostawiono na 60 min w temperaturze pokojowej na wytrząsalniku do płytek. Roztwór konigatu peroksydazy strząśnięto i płytki przemyto 3 x 0,3% kazeiną w buforze PBS (pH 7,4) aby usunąć wszelki nadmiar koniugatu. Substrat zmieszano i pipetowano do studzienek w ilości 50 pl na studzienkę.
Absorbancję w indywidualnych studzienkach prowadzono przez 1,3 godziny stosując czytnik ELISA SLT 340 ATC.
Wyniki i dyskusja eksperymentów immunizacji ELISA
Wykres z fig. 3 wskazuje na odpowiedź przeciwciała otrzymaną przez immunizację myszy koniugatem kwasy mikolowe-BSA. Ciągłe słupki reprezentują odczyty absorbancji (pomnożone przez czynnik 103) ze wskazaniem standardowego odchylenia dla każdego zestawu potrójnych rozcieńczeń. Otrzymano silne odpowiedzi na nośnik BSA (prawa kolumna) i słabsze na kwasy mikolowe (lewa kolumna).
Po 59 dniach programu immunizacji dwie z pięciu immunizowanych myszy wytworzyło surowice odpornościowe o aktywności przeciwciała specyficznie wobec kwasów mikolowych, na co wskazuje 24% inhibitacji sygnału ELISA przy 1:50 rozcieńczeniu surowicy odpornościowej zmieszanej z 0,32 mg/ml rozpuszczalnymkoniugatem BSA-kwasy mikolowe. Inhibicję prowadzi się blokując miejsca wiązania specyficzne dla przeciwciał kwasów mikolowych kwasami
181 579 mikolowymi związanymi z BSA w roztworze, obniżając tak ilość przeciwciał specyficznych dla kwasów mikolowych wiążących się z płytą ELISA.
Gdy jako powlekający antygen stosowano BSA, otrzymano silne sygnały ELISA wskazujące na wysoki stopień immunizacji aktywnych myszy. Nie uzyskano sygnału rozcieńczenia 1:50 surowicy odpornościowej otrzymanej z myszy wykazującej aktywność anty-kwasu mikolowego przy inkubacji surowicy odpornościowej z 0,32 mg/ml rozpuszczalnego koniugatu BSA-kwasy mikolowe. Było tak prawdopodobnie wskutek wysokiego stężenia obecnych przeciwciał anty-BSA, przesuwających inhibicję przeciwciał anty-nośnik BSA poza zakres wrażliwości.
Odpowiedź immunologiczna anty-kwasy mikolowe wymaga dłuższego okresu immunizacji dla uzyskania odpowiedniego stanu dojrzenia odpowiedzi, prowadzącej do wzrostu stężenia przeciwciał i/lub zwiększenia powinowactwa do przeciwciał. Alternatywnie, można stosować myszy do wytwarzania monoklonalnych przeciwciał monospecyficznych wobec kwasów mikolowych.
Odnośniki
Blumberg, L., B. Miller i H.J. Koomhof 1994. Multiple drag resistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis - Towards 2000. Book of Abstracts: A sceintific conference a workshops on the short-term futurę of tuberculosis in the developing world, with particulsr emphasis on Africa, Pretoria, South Africa, 13-17 marca 1994, str. 9.
Butter, W.R. i J.O. Kilbum, 1988. Identification of Major Slowly Growing Pathogenic Mycobacteria and Mycobacterium gordonae by High-Performance Liquid Chromatography of Their Mycolic Acids. J. Clin. Microbiol., 26, (1), 50-53.
Butler, W.R., K.C. Jost i J.O. Kilbum, 1991. Identyfication of Mycobacteria by HighPerformance Liquid Chromatography. J. Clin. Microbiol., 29, (11), 2468-2472.
Cantwell, M.C. i N.J. Binkin, 1994. Tuberculosis and HIV in sub-Saharan Africa: Can a good tuberculosis control program make a difference Tuberculosis - Towards 2000. Book of Abs-tracts: A scientific conference a workshops on the short-term futurę of tuberculosis in the developing world, with particulsr emphasis on Africa, Pretoria, South Africa, 13-17 marca 1994, str. 8.
De Cock, K.M., 1994. Impact of Interaction with HIV, In:Tuberculosis: Back to the Futurę, str. 35-52. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Mc Adam. Opublikował: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore.
Dolin, P.J., M,C. Raviglione i A. Koch, 1994. Global gruźlicę incidence and mortality during 1990-2000. Bulletin of the World Health Organization, 72, (2), 213-220.
Godfery-Faussett, P., 1994. Of molecules and men: the detection of tuberculosis, past, present and futurę. W: Tuberculosisi;Backtothe Futurę, str. 79-98. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Mc Adam. Opublikował: John Wiley &, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore.
Laboratory Manuał of Tuberculosis Methods, Tuberculosis Research Institute of the SA Medical Research Council (1980, rozdz. 6, str. 83-103: wyd. 2, przejrzał E.E. Nel, H.H. Kleeberg i E.M.S. Gatner.
Morse, D.L., 1994. Multidrug resistance - the New York experience. W: Tuberculosis: Back to the Futurę, str. 225-237. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Mc Adam. Opublikował: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore
Murray, D.B., 1994. Update on Mycobacterial issues for the Acquired Immune Deficiency Syndrome Era. J. Of Intravenous Nursing, 17 (4), 217-219.
Musial, C.E., L.S. Tice, L. Stockman i G.D. Roberts, 1988. Identyficationof Mycobacteria from Culture by using the Gen-Probe Rapid Diagnostic Systems for Mycobacterium avium Complex and Mycobacterium tubelculosis Complex. J. Clin. Microbiol., 26, 2120-2123.
Sinder, D.E., 1994. Tuberculosis: the world situation. History of the disease i efforts to combat it. W: Tuberculosis: Back to the Futurę, str. 13-33. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Ac Adam.
Opublikował: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore.
Torres, R. A., Mani, J. Altholz i P. W. Brickner, 1990. Humań Immunodeficiency Virus Infection Among Homeless Men in a New York City Shelter. Arch. Intern. Med., 150, 2030-2036.
181 579
181 579
Powlekający antygen
<wasy mikolowe - żelatyna
SurowićS odoornościowa
BSA bez inhibicji
109 i------1
Mysz 1
2438
106 H inhibicja
2452
142 Γ bez inhibicji
2316
154 b~|
Mysz 2
inhibicja | 4 h |
2205
2189 bez inhibicji
Mysz 3 inhibicja
2223
2 1 | | 761- |
B6
2289 bez inhibicji
Mysz 4 inhibicja
2231
bez ihibicji Mysz 5 inhibicja | es | ____.2186 |
4 b | ___________ __2oj | |
_______________64 1 | _____________________1S67 | |
Β Η | ________________________68 F] | |
2000
100
1000
Fig·. 3
Sygnał Odpowiedzi wego - BSA przez ELISA
ELISA X 103 (przy 450nm) immunologiczne u myszy wobec kwasu mikolopo 59 dniach programu immunizacji, zmierzone
181 579
Μ (Π
0-4
Ο (D £ Ν υ rM
Φ ίΰ £ ο υ
Ν ω
Ό
Φ rM ,Μ
Ν Ο Μ
Φ ,Ώ
Ο £η Ή IX
ΟΊ ΟΊ ΟΊ
I Ο cn cn 'Ν □
Μ
Cn χί ο >1 £
Φ
-υ Μ
Φ
181 579
CD £ N O (V rH >1
N U
-H
Φ £ cd 3 O O 03 N 03
T3 rH
N O M
Cn •H Eli
CU CU CU
I o CU CU u •H 'N
Li tn & N M CU
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (31)
- Zastrzeżenia patentowe1. Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce biologicznej zwierzęcia, znamienna tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałem specyficznym dla co najmniej jednego wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu gatunku mikobakteryjnego zawierającego kwas mikolowy lub mieszaninę kwasów mikolowych; i wykrywa się tworzenie się kompleksu przeciwciała z antygenem w próbce.
- 2. Próba diagnostyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje etap lizy co najmniej niektórych mikobakteryjnych komórek obecnych w próbce przed zetknięciem próbki z przeciwciałem.
- 3. Próba diagnostyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że obejmuje także etap przetwarzania biologicznej próbki dla uwolnienia mikobakteryjnych komórek od reszetek organicznych, w których mogą być zawarte i usunięcia zanieczyszczeń biologicznych próbki od niepożądanych mikroorganizmów.
- 4. Próba diagnostyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje także etap zatężania wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu w procedurze powinowactwa z unieruchomionym przeciwciałem przed zetknięciem ze znakowanym przeciwciałem.
- 5. Próba diagnostyczna według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienna tym, że jako wewnątrzkomórkowy mikobakteryjny antygen stosuje się kwas mikolowy lub mieszaninę kwasów mikolowych znajdujących się w ściankach Komórek gatunków Mycobacterium, o następującym wzorze ogólnym: β αCH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOH (CH2)yCH3
- 6. Oczyszczony z mieszaniny wyekstrahowanych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych o wzorze ogólnym:β aCH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOHI (CH2)yICH3181 579
- 7. Sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, z mieszaniny wyekstrahowanych mikobakteryjnych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń poekstrakcyjnych, mikobakteryjnych kwasów mikolowych o ogólnym wzorze:β aCH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOHI (CH2)yI ch3 znamienny tym, że rozpuszcza się mieszaninę kwasów mikolowych w dwufazowym układzie rozpuszczalnikowym i poddaje się mieszaninę rozdziałowi metodą podziału przeciwprądowego.
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że oczyszczone kwasy mikolowe nie podlegają późniejszej chemicznej derywatyzacji.
- 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dwufazowy rozpuszczalnik zawiera fazę górna i fazę dolną.
- 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że także miesza się i równoważy fazę górną i dolną.
- 11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dwufazowy układ rozpuszczalnikowy zawiera chloroform, metanol i wodę.
- 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że skład fazy górnej stanowi 12-18% chloroformu, 45-55% metanolu i 20-40% wody.
- 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że skład fazy górnej stanowi 15% chloroformu, 52% metanolu i 33% wody.
- 14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że skład fazy dolnej stanowi 50-80% chloroformu, 15-40% metanolu i 2-8% wody.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że skład fazy dolnej stanowi 68% chloroformu, 27% metanolu i 5% wody.
- 16. Wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:β aCH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOHI (CH2)yCH3
- 17. Wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobakterium, o wzorze ogólnym:181 579 β αCH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOH (CH2)yCH3 przy czym każdy kwas mikolowy skoniugowany jest z nośnikiem.
- 18. Wydzielone przeciwciało według zastrz. 16, znamienne tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne.
- 19. Wydzielone przeciwciało według zastrz. 18, znamienne tym, że stanowi go poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego.
- 20. Koniugat mikobakteryjny wewnątrzkomórkowy antygen/nośnik, znamienny tym, że wewnątrzkomórkowy antygen jest oczyszczonym mikobakteryjnym kwasem mikolowym lub mieszaniną kwasów mikolowych i jest skoniugowany z nośnikiem.
- 21. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się białko.
- 22. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się żelatynę lub albuminę surowicy bydlęcej.
- 23. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się hemocyjaninę pijawki.
- 24. Koniugat według zastrz. 20 albo 21, albo 22 albo 23, znamienny tym, że jako wewnątrzkomórkowy antygen stosuje się mieszaninę kwasów mikolowych, przy czym każdy ma wzór ogólny:β aCH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOH (CH2)yCH3
- 25. Zestaw do wykrywania obecności gatunków Mycobacterium w biologicznej próbce obejmujący przeciwciało i stałe podłoże, znamienny tym, że jako przeciwciało zawiera wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego kwasu mikolowego lub kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:β aCH3 - (CH2)x - CH-OH - CH - COOHI (CH2)yICH3181 579
- 26. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, że przeciwciało jest skoniugowane z nośnikiem, korzystnie z nośnikiem białkowym.
- 27. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, żejako przeciwciało zawiera przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne.
- 28. Zestaw według zastrz. 27, znamienny tym, że zawiera poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego.
- 29. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, żejako nośnik zawiera żelatynę lub albuminy surowicy bydlęcej.
- 30. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, że jako nośnik zawiera hemocyjaninę pijawki.
- 31. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, że przeciwciało jest unieruchomione na podłożu.* * *
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ZA942575 | 1994-04-14 | ||
ZA951464 | 1995-02-22 | ||
PCT/GB1995/000856 WO1995028642A1 (en) | 1994-04-14 | 1995-04-13 | A method for detecting the presence of a mycobacterium species and a kit and antibodies for use therein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL316792A1 PL316792A1 (en) | 1997-02-17 |
PL181579B1 true PL181579B1 (pl) | 2001-08-31 |
Family
ID=27142386
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL95316792A PL181579B1 (pl) | 1994-04-14 | 1995-04-13 | Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce, oczyszczony kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych, sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, wydzielone przeciwcialo, koniugat mikobakteryjny i zestaw do wykrywania obecnosci gatunków Mycobacterium PL |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6124105A (pl) |
EP (1) | EP0755517B1 (pl) |
JP (1) | JPH09512101A (pl) |
CN (1) | CN1150840A (pl) |
AT (1) | ATE187251T1 (pl) |
BR (1) | BR9507389A (pl) |
CA (1) | CA2187779A1 (pl) |
DE (1) | DE69513649T2 (pl) |
DK (1) | DK0755517T3 (pl) |
ES (1) | ES2141348T3 (pl) |
GR (1) | GR3032471T3 (pl) |
MX (1) | MXPA96004705A (pl) |
NZ (1) | NZ283784A (pl) |
PL (1) | PL181579B1 (pl) |
PT (1) | PT755517E (pl) |
WO (1) | WO1995028642A1 (pl) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69637522D1 (de) * | 1995-02-22 | 2008-06-26 | Adcock Ingram Ltd | Verfahren zur isolierung und reinigung von lipidezellwandkomponenten |
US6015681A (en) * | 1995-07-28 | 2000-01-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Rapid immunoassay for cariogenic bacteria |
US6599691B1 (en) * | 1995-11-27 | 2003-07-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Rapid immunoassay to detect infection with Mycobacterium tuberculosis |
EP1098199B1 (en) * | 1997-03-03 | 2008-07-23 | Adcock Ingram Limited | A composition comprising a carrier and a purified mycobacterial lipid cell-wall component and its use in the prevention, treatment and diagnosis of disease |
KR101388611B1 (ko) | 2002-10-16 | 2014-04-23 | 퍼듀 퍼머 엘피 | 세포-연관된 ca 125/o772p에 결합하는 항체들 및 그것의 용도의 방법들 |
EP1747463B1 (en) * | 2004-05-13 | 2008-09-17 | University of Pretoria | A method for detecting mycobacterial infection |
DE102004024674A1 (de) * | 2004-05-18 | 2005-12-15 | Wolfgang Lorenz | Mittel und Verfahren zur Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Bindegewebserkrankungen |
CN103052883B (zh) * | 2010-07-15 | 2015-05-20 | 比勒陀利亚大学 | 检测血清样品中替代性标记的方法 |
WO2012102679A1 (en) | 2011-01-24 | 2012-08-02 | National University Of Singapore | Pathogenic mycobacteria-derived mannose-capped lipoarabinomannan antigen binding proteins |
EP2629095A1 (en) * | 2012-02-17 | 2013-08-21 | Biosure R & T Cell Co. | Detection of mycobacterial protein targets using quantum dots (QDs) and immunomagnetic seperation |
WO2014184768A1 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-20 | University Of Pretoria | A method of diagnosing tuberculosis |
CN104897894A (zh) * | 2015-06-15 | 2015-09-09 | 长春理工大学 | 一种检测胞内分枝杆菌的elisa检测方法 |
CN105651996A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-06-08 | 丹娜(天津)生物科技有限公司 | 一种新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL71683A0 (en) * | 1984-04-27 | 1984-09-30 | Yeda Res & Dev | Pharmaceutical compositions for treating arthritis type diseases comprising fractions obtained from mycobacteria |
US5591632A (en) * | 1987-03-02 | 1997-01-07 | Beth Israel Hospital | Recombinant BCG |
WO1990008323A1 (en) * | 1989-01-18 | 1990-07-26 | Sawai Pharmaceutical Co., Ltd. | Reagent for detecting antibody corresponding to acid-fast bacterium antigen and application thereof |
DK0751780T3 (da) * | 1993-06-21 | 2003-10-13 | Brigham & Womens Hospital | Fremgangsmåder til isolering af CD1-fremviste antigener, vacciner, som omfatter CD1-fremviste antigener, og cellelinier til anvendelse i nævnte fremgangsmåder |
EP1170592A1 (en) * | 1994-10-13 | 2002-01-09 | Brigham And Women's Hospital | Presentation of hydrophobic antigens to T-cells by CD1 molecules |
-
1995
- 1995-04-13 WO PCT/GB1995/000856 patent/WO1995028642A1/en active IP Right Grant
- 1995-04-13 MX MXPA96004705A patent/MXPA96004705A/es unknown
- 1995-04-13 US US08/722,055 patent/US6124105A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-13 PL PL95316792A patent/PL181579B1/pl unknown
- 1995-04-13 BR BR9507389A patent/BR9507389A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-04-13 JP JP7526812A patent/JPH09512101A/ja active Pending
- 1995-04-13 ES ES95915263T patent/ES2141348T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-13 NZ NZ283784A patent/NZ283784A/xx unknown
- 1995-04-13 CN CN95193609A patent/CN1150840A/zh active Pending
- 1995-04-13 AT AT95915263T patent/ATE187251T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-13 CA CA002187779A patent/CA2187779A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-13 DK DK95915263T patent/DK0755517T3/da active
- 1995-04-13 PT PT95915263T patent/PT755517E/pt unknown
- 1995-04-13 DE DE69513649T patent/DE69513649T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-13 EP EP95915263A patent/EP0755517B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-05-04 US US09/304,893 patent/US6458367B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-25 GR GR20000400165T patent/GR3032471T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GR3032471T3 (en) | 2000-05-31 |
DK0755517T3 (da) | 2000-05-01 |
ATE187251T1 (de) | 1999-12-15 |
US6124105A (en) | 2000-09-26 |
PT755517E (pt) | 2000-05-31 |
EP0755517B1 (en) | 1999-12-01 |
MXPA96004705A (es) | 2004-08-19 |
DE69513649T2 (de) | 2000-04-06 |
ES2141348T3 (es) | 2000-03-16 |
EP0755517A1 (en) | 1997-01-29 |
PL316792A1 (en) | 1997-02-17 |
CN1150840A (zh) | 1997-05-28 |
DE69513649D1 (de) | 2000-01-05 |
AU2220595A (en) | 1995-11-10 |
JPH09512101A (ja) | 1997-12-02 |
AU695968B2 (en) | 1998-08-27 |
BR9507389A (pt) | 1997-09-16 |
CA2187779A1 (en) | 1995-10-26 |
WO1995028642A1 (en) | 1995-10-26 |
US6458367B1 (en) | 2002-10-01 |
NZ283784A (en) | 1998-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL181579B1 (pl) | Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce, oczyszczony kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych, sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, wydzielone przeciwcialo, koniugat mikobakteryjny i zestaw do wykrywania obecnosci gatunków Mycobacterium PL | |
KR100968848B1 (ko) | 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인항체 및 이를 포함하는 열대열 말라리아와 삼일열말라리아의 중복 감염 진단 키트 | |
US20060127406A1 (en) | Enriched antibody for detecting mycobacterial infection, methods of use and diagnostic test employing same | |
JP2002523030A5 (pl) | ||
US20020058031A1 (en) | Methods for preparing diagnostic reagents using antibody preparation | |
KR100951057B1 (ko) | 면역특이단백질 항원을 사용하는 우결핵 특이 효소면역진단키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법 | |
Chen et al. | An evaluation of Pasteurella pestis fraction-1-specific antibody for the confirmation of plague infections | |
CN1866023B (zh) | 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 | |
Boyden et al. | Agglutination of normal erythrocytes in mixtures of antibody and antigen, and haemolysis in the presence of complement | |
CN101433824B (zh) | 自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂 | |
KR100968069B1 (ko) | 우결핵균 특이단백질 및 그 정제방법 | |
AU695968C (en) | A method for detecting the presence of a mycobacterium species and a kit and antibodies for use therein | |
JP3309984B2 (ja) | 汚染された組織からのシガトキシンの迅速な抽出方法 | |
CN108623662A (zh) | 植物病原菌抗原复合物、抗体、检测试剂盒及其应用 | |
WO1993003365A1 (fr) | Dosage immunologique, anticorps monoclonal et hybridome | |
JPH11500906A (ja) | 脂質細胞壁成分の単離および精製法 | |
EA027858B1 (ru) | Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения | |
JPH11108931A (ja) | 結核菌検出法および結核菌検出用キット | |
CN1117283C (zh) | 用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂及其制备方法 | |
JPH07110332A (ja) | 結核菌の検査試薬及び検出方法 | |
US20230080865A1 (en) | Chimeric recombinant protein encoding epitopes with identity to bacterial, fungal, parasite and human metabolic enzymes involved in pathogenesis during sexually transmitted infections | |
JP3036545B2 (ja) | モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法 | |
Al-Rubae | THE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY: A NEW METHOD FOR THE ANALYSIS OF PESTICIDE RESIDUES. | |
CN108196045A (zh) | 杂交瘤细胞株、抗孔雀石绿单克隆抗体和孔雀石绿检测方法及应用和产品 | |
CN118275673A (zh) | 一种流感病毒抗原免疫层析检测试纸及其制备方法 |