PL181579B1

PL181579B1 - Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce, oczyszczony kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych, sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, wydzielone przeciwcialo, koniugat mikobakteryjny i zestaw do wykrywania obecnosci gatunków Mycobacterium PL

Info

Publication number: PL181579B1
Application number: PL95316792A
Authority: PL
Inventors: Jan A Verschoor; Sandra N Bye
Original assignee: Adcock Ingram Ltd
Priority date: 1994-04-14
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2001-08-31
Also published as: GR3032471T3; DK0755517T3; ATE187251T1; US6124105A; PT755517E; EP0755517B1; MXPA96004705A; DE69513649T2; ES2141348T3; EP0755517A1; PL316792A1; CN1150840A; DE69513649D1; AU2220595A; JPH09512101A; AU695968B2; BR9507389A; CA2187779A1; WO1995028642A1; US6458367B1

Abstract

1 Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce biologicznej zwierzecia, znam ienna tym, ze k ontaktuje sie próbke biologiczna z przeciwcialem specyficznym dla co najmniej jednego wewnatrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu gatunku mikobakteryjnego zawierajacego kwas mikolowy lub mieszanine kwasów mikolowych; i wykrywa sie tworzenie sie kompleksu przeciwciala z antygenem w próbce. 6 Oczyszczony z mieszaniny wyekstrahowanych kwasów mikolowych i zanieczyszczen kwas mikolowy lub mieszanina kwasów miko- lowych o wzorze ogólnym. 7. Sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, z mieszaniny wyekstrahowanych mikobakteryjnych kwasów mikolowych i zanie- czyszczen poekstrakcyjnych, mikobakteryjnych kwasów mikolowych o ogólnym wzorze znamienny tym, ze rozpuszcza sie mieszanine kwasów mikolowych w dwufazowym ukladzie rozpuszczalnikowym i poddaje sie mie- szanine rozdzialowi metoda podzialu przeciwpradowego 16 Wydzielone przeciwcialo wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w sciankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym- 20. Koniugat mikobakteryjny wewnatrzkomórkowy antygen/nosnik, znam ienny tym, ze wewnatrzkomórkowy antygen jest oczysz- czonym mikobakteryjnym kwasem mikolowym lub mieszanina kwasów mikolowych i jest skoniugowany z nosnikiem. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce, oczyszczony kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych, sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, wydzielone przeciwciało, koniugat mikobakteryjny i zestaw do wykrywania obecności gatunków Mycobacterium.

Różne znane gatunki Mycobacterium są przyczyną chorób zakaźnych u ludzi i zwierząt. Jeden z takich gatunków Mycobacterium, Mycobacterium tuberculosis, wywołują gruźlicę u ludzi.

Gruźlicę uważa się za główną chorobę zakaźną w większości świata. Pomimo wielkich postępów nauk medycznych i ilości skutecznych leków, co na pewien czas stworzyło wrażenie całkowitego pokonania choroby, i pomimo zorganizowanych międzynarodowych akcji, gruźlica pozostaje światowym problemem zdrowotnym zaskakujących rozmiarów. Tylko w 1990 roku stwierdzono ponad 8 milionów nowych przypadków na całym świecie i ponad 3 miliony przypadków śmierci (snider, 1994). Prognozy Światowej Organizacji Zdrowia wskazują, że w okolicach 2000 roku roczne liczby wzrosną do 10,2 milionów nowych przypadków i 3,5 milionów ofiar, przy czym Azja i Afryka Zasaharyjska będą najbardziej zaatakowanymi kontynentami (Dolin, Raviglione i Koch, 1994). Globalny rozkład szacowanej liczby przypadków gruźlicy dla obecnej dekady i szacowanej liczby ofiar śmiertelnych dla tegoż okresu przedstawiono odpowiednio na fig. 1 i 2 (Dolin, Raviglione i Koch, 1994).

Udokumentowany ścisły związek pomiędzy gruźlicą i AIDS, a także częste jednoczesne występowanie obu tych chorób zwiększa powagę sytuacji (Torres i in., 1990; De Cock, 1994; Cantwell i Binkin, 1994; Murray, 1994). Wytworzenie oporności na wiele leków w szczepach Mycobacterium tuberculosis i innych typowych prątkach powiększyło i tak gigantyczny problem (Blumberg, Miller i Koomhof, 1994; Morse, 1994).

Pewne i wczesne wykrywanie gruźlicy i innych mikobakteryjnych chorób jest jednym z ważnych warunków opracownia skuteczniejszej globalnej strategii zwalczania tych chorób.

Tradycyjne laboratoryjne sposoby wykrywania mają poważne wady, polegające albo na niezdolności odróżnienia żywych i martwych bakterii (szybka i prosta metoda barwienia Ziehl-Neelsena) lub, jeśli już sposoby potwierdzają obecność żywych bakterii (bezpośrednia hodowla), konieczne jest wiele tygodni na ukończenie prób laboratoryjnych. Może to z kolei opóźnić rozpoczęcie leczenia i prowadzić do dalszego rozprzestrzeniania choroby.

Najnowsze sposoby podejścia są oparte na wykrywaniu odpowiedzi pacjenta na infekcję metodą testów serologicznych, odpowiedzi namnażania limfocytów na miko bakteryjne antygeny lub określanie poziomu deaminazy adenozyny, albo też na wykrywaniu mikobakteryjnych antygenów i składników w testach immunologicznych’takich jak ELISA, chromatografia gazowa i cieczowa lub spektrofotometria masowa. Najnowsze, moleculame podejścia obejmująreakcję łańcuchową polimerazy (PCR), sondy DNA lub fingerprinting DNA (Musial i in., 1988;

Godfrey-Faussett, 1994).

181 579

Mason i in., 1993 (Tubercle and Lung Disease) opisują sposób identyfikacji i analizy gatunków prątków z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał między innymi skierowany na mikobakteryjny lipoarabinomannan i niewymienione glikolipidy.

Wiker i in., 1991 (Journal of General Microbiology) opisująsposób analizy i identyfikacji gatunków prątków hodowanych w kulturze przez wykrywanie charakterystycznych białkowych antygenów prątków.

Hamid i in., 1993 (Journal of General Biology) opisują sposób rozróżniania prątków od innych bakterii przez wytrącanie kwasów mikolowych i wykonywanie ich analizy TLC.

Young, 1980 (Journal of General Biology) opisuje sposób ekstrahowania i analizy kwasów mikolowych prątków metodąTLC i wykazuje różnicę w profilu kwasów mikolowych pomiędzy Mycobacterium leprae i innych bakterii w biopsjach trądowych.

Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 0407605 podaje sposób wykrywania przeciwciał w surowicy pacjenta bakterii Nacardia poprzez wykrywanie przeciwciał na nikardialne kwasy mikolowe.

Jednak żaden ze sposobów wymienionych powyżej nie spełnia wszystkich warunków, prostej i wiarygodnej próby zdolnej do odróżnienia żywych i martwych komórek prątków.

Celowym byłoby zatem wykonane odpowiedniej próby oraz odpowiedniego zestawu, za pomocą których można by odróżnić żywe i martwe prątki.

Przedmiotem wynalazku jest próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce bilogicznej zwierzęcia, polegająca na tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałem specyficznym dla co najmniej jednego wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu gatunku mikobakteryjnego zawierającego kwas mikolowy lub mieszanie kwasów mikolowych; i wykrywa się tworzenie się kompleksu przeciwciała z antygenem w próbce. Korzystnie, próba diagnostyczna obejmuje etap lizy co najmniej niektórych mikobakteryjnych komórek obecnych w próbce przed zetknięciem próbki z przeciwciałem. Bardziej korzystnie, próba diagnostyczna obejmuje także etap przetwarzania biologicznej próbki dla uwolnienia mikobakteryjnych komórek od resztek organicznych, w których mogą być zawarte i usunięcia zanieczyszczeń biologicznych próbki od niepożądanych mikroorganizmów.

Próba diagnostyczna według wynalazku może także obejmować etap zatężania wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu w próbce w procedurze powinowactwa z unieruchomionym przeciwciałem przed zetknięciem ze znakowanym przeciwciałem.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, próba diagnostyczna jako wewnątrzkomórkowy mikobakteryjny antygen posiada kwas mikolowy lub mieszaninę kwasów mikolowych znajdujących się w ściankach komórek gatunków Mycobacterium, o następującym wzorze ogólnym:

β a

CH₃ - (CH₂)_X - CH·OH - CH - COOH (CH₂)_y

CH₃

Przedmiotem wynalazku jest także oczyszczony z mieszaniny wyekstrahowanych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych o wzorze ogólnym:

181 579 β α

CH₃ - (CH₂)_x - CH·OH - CH - COOH (CH₂)_y

I

CH₃

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, z mieszaniny wyekstrahowanych mikobakteryjnych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń poekstrakcyjnych, mikobakteryjnych kwasów mikolowych o ogólnym wzorze:

β a

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH

I (CH₂)_y

CH₃ polegający na tym, że rozpuszcza się mieszaninę kwasów mikolowych w rozpuszczalniku dwufazowym i poddaje się mieszaninę rozdziałowi metodąpodziału przeciwprądowego. W sposobie według wynalazku korzystnie oczyszczone kwasy mikolowe nie podlegają późniejszej chemicznej derywatyzacji. Również korzystnie jako dwufazowy układ rozpuszczalnikowy stosuje się układ zawierający fazę górna i fazę dolną.

Korzystnie fazę góma i fazę dolna można mieszać i równoważyć.

Dwufazowy układ rozpuszczalnikowy może zawierać chloroform, metanol i wodę.

Bardziej korzystnie, skład fazy górnej stanowi 12-18% chloroformu, 45-55% metanolu i 20-40% wody.

Inny korzystny skład fazy górnej obejmuje 15% chloroformu, 52% metanolu i 33% wody. Korzystnie skład fazy dolnej wynosi 50-80% chloroformu, 15-40% metanolu i 2-8% wody, oraz bardziej korzystnie 68% chloroformu, 27% metanolu i 5% wody.

Następnym przedmiotem wynalazku jest wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:

β a

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH (CH₂)_y

CH₃ .

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:

181 579 β α

CH₃ - (CH₂)_X - CH-OH - CH - COOH

I (CH₂)_y

CH₃ przy czym każdy kwas mikolowy skoniugowany jest z nośnikiem.

Korzystnie wydzielone przeciwciało charakteryzuje się tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne, a bardziej korzystnie poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego.

Przedmiotem wynalazku jest też koniugat mikobakteryjny wewnątrzkomórkowy antygen/nośnik, charakteryzujący się tym, że wewnątrzkomórkowy antygen jest oczyszczonym mikrobakteryjnym kwasem mikolowym lub mieszaninąkwasów mikolowych i jest skoniugowany z nośnikiem.

Korzystnie w koniugacie według wynalazku jako nośnik stosuje się białko, a bardziej korzystnie jako nośnik stosuje się żelatynę lub albuminę surowicy bydlęcej.

Można też korzystnie jako nośnik stosować hemocyjaninę pijawki.

Najbardziej korzystnie w koniugacie według wynalazku jako wewnątrzkomórkowy antygen stosuje się mieszaninę kwasów mikolowych, przy czym każdy ma wzór ogólny:

β a

CH₃ - (CH₂)_X - CH-OH - CH - COOH

I (CH₂)_y

I

CH₃

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do wykrywania obecności gatunków Mycobacterium w biologicznej próbce obejmujący przeciwciało i stałe podłoże, charakteryzujący się tym, że obejmuje wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego kwasu mikolowego lub kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:

β a

CH₃ - (CH₂)_X - CH-OH - CH - COOH (CH₂)_y

CH₃

181 579 ewentualnie skoniugowane z nośnikiem, korzystnie z nośnikiem białkowym oraz stałe podłoże pokryte częściowo koniugatem kwas mikolowy-żelatyna.

Korzystnie w zestawie według wynalazku jako przeciwciało znajduje się przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne. Bardziej korzystna odmiana zestawu według wynalazku zawiera poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego, a jako nośnik zawiera żelatynę lub albuminy surowicy bydlęcej.

Korzystnie zestaw według wynalazku jako nośnik zawiera hemocyjaninę pijawki oraz unieruchomione przeciwciało wobec oczyszczonego kwasu mikołowego lub mieszaniny kwasów mikolowych.

Szczegółowy opis wynalazku

Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie diagnostycznej próby na potwierdzenie obecności prątków w próbkach biologicznych pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, takich j ak plowocina, płyn mózgowo-rdzeniowy, krew, mocz, odchody, próbki tkanki, produkt płukania żołądka, ślina, wymaz z gardła lub wysięk z ran skóry.

Próba jest oparta na immunologicznym wykrywaniu jednego lub więcej komórkowych antygenów/kwasów mikolowych pochodzących z prątków. Próba może być oparta na zastosowaniu przeciwciał znakowanych eiizymem, barwnikiem fluorescencyjnym, cząstkami lateksu łub innymi odpowiednimi znacznikami.

Kwasy mikolowe sąa-hydroksylowymi tłuszczowymi kwasami o dużej masie cząsteczkowej, które maja względnie długie alifatyczne łańcuchy w pozycji a.

Ponieważ wiadomo, że każdy gatunek rodzaju Mycobacterium charakteryzuje się unikalnym rodzajem kwasów mikolowych (Butler, Jost i kilbum, 1991; Butler i Kilbum, 1988), powinno być możliwe rozróżnienie pomiędzy różnymi członkami rodzaju przy pomocy specyficznych przeciwciał dostarczanych w teście.

Przykład 1

Badania, które stanowiły podstawę wynalazku, dającego sposób wykrywania i identyfikacji różnych gatunków w próbce biologicznej, obejmowały następujące etapy:

Etap 1. Sprowadzenie szczepów Mycobacterium. Kultury nabyto w American Type Culture Cołlection (ATCC);

Etap 2. Wydzielenie kwasów mikolowych z kultur Mycobacterium, identyfikacja kwasów mikolowych metodą analizy HPLC i ich oczyszczanie;

Etap 3. Wytwarzanie koniugatów kwasów mikolowych z użyciem BSA, KLH i żelatyny jako cząsteczek nośnika;

Etap 4. Immunizacja zwierząt doświadczalnych i wytworzenie przeciwciał specyficznych dla kwasów mikolowych. Zbadanie przeciwciał;

Etap 5. Proponowane rozwijanie diagnostycznego testu/próby (nadawanie wykrywalności reakcji antygen/przeciwciało);

Etap 6. Dalsza ocena diagnostycznego testu/próby: potwierdzenie specyficzności i wrażliwości testu, testy połowę, porównanie z istniejącymi testami/próbami;

Materiały (w tym zwierzęta doświadczalne), sposoby i wyniki badań opisano poniżej.

MATERIAŁY

Kultura

W eksperymentach zastosowano Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294 - zjadliwy szczep oryginalne wydzielony z zainfekowanego ludzkiego płuca.

Kulturę nabyto w postaci liofilizowanej z American Type Culture Cołlection (ATCC), Maryland, USA.

Pożywki

W hodowli M. tuberculosis użyto następujących pożywek:

Ciekła pożywka: bulion Dubosa

Stałe pożywki: pożywka Lówenstein-Jensena (LJ) pożywka Middlebrook 7H-10

Szczegółowy zestaw składników koniecznych do wytwarzania tych pożywek, oraz warunki zalecane do ich sterylizacji, podano w Laboratory Manuał of Tuberculosis Methods, Tubercu10

181 579 losis Research Institute ofthe S.A. Medical Research CounciI (1980, rozdz. 6, str. 83-105; wyd. 2, przejrzane przez E. E. Nela, H.H. Kleeberga i E. M.S. Gatnera).

Pożywki wytworzył Departament of Medical Microbiology z Institute for Pathology of the University of Pretoria.

Reagenty

Poniższe reagenty zastosowano do zmydlania, ekstrakcji, derywatyzacji i wysokowydajnej cieczowej chromatografii (HPLC) w analizie kwasów mikolowych

Reagent A: 5% wodorotlenek potasu (czysty do analizy) rozpuszczony w mieszaninie metanol-woda (1:1), 62,5 g wodorotlenku potasu rozpuszczono w 125 ml wody i dodano 125 ml metanolu (BDH, chromatograficznie czysty).

Reagent B: Stężony kwas chlorowodorowy (BDH, czysty do analizy) rozcieńczono wodą 1:1.

Reagent C: 2% wodorowęglanu potasu (BDH, czysty do analizy) rozpuszczono w mieszaninie metanol-woda (1:1) 10 g wodorowęglanu potasu rozpuszczono w 250 ml wody i dodano 250 ml metanolu.

Reagent D: bromek para-bromofenacyłu w eterze koronowym (Pierce Chemical Co, nr kat 48391) rozdzielono w porcjach 500 μΐ do małych brunatnego koloru fiołek z zakrętami i powlekanymi Teflonem (znak handlowy zastrzeżony) przegrodami. Zakrętki dokręcono i fiolki owinięto Parafilmem (znak handlowy zastrzeżony). Reagent D przechowywano w temperaturze 4°C.

Reagent E: Reagent E wytworzono mieszając reagent B 1:1 z metanolem.

Wzorzec HPLC:

Wzorzec wewnętrzny o dużej masie cząsteczkowej (C-110) z Ribi ImmunoChem Research Company, nr kat. R-50). Wzorzec, 1 mg, umieszczono w zawiesinie w 2,0 ml chlorku metylenu (BDH, chromatograficznie czysty), rozdzielono w porcjach 350 μΐ do małych fiolek z zakrętkami i powlekanymi Teflonem (znak handlowy zastrzeżony) przegrodami. Fiolki owinięto Parafilmem (znak handlowy zastrzeżony) i przechowywano w temperaturze 4°C.

W celu ograniczenia odparowania chlorku metylenu porcje wzorca HPLC trzymano na lodzie w czasie manipulacji. Chloroform (Associated Chemical Enterprises, chemicznie czysty)

Chlorek metylenu (BDH, chromatograficznie czysty)

Reagenty A, B, C i E wytworzono świeżo przed eksperymentami, z zachowaniem koniecznych zasad bezpieczeństwa.

Do wytwarzania reagentów stosowano podwójnie destylowaną dejonizowaną wodę.

Następujące reagenty zastosowano do oczyszczania ekstrahowanych kwasów mikolowych: Chloroform (Saarchem, czysty do analizy) Metanol (Merck, chemicznie czysty) Poniższe reagent zastosowano do immunizacji zwierząt doświadczalnych: Albumina surowicy bydlęcej (BSA) - Sigma partia 11 HI 040 Koniugaty kwasy mikolowe-BSA

Hemocyjanina pijawki - KLH Sigma Immuno Chemicals

Koniugaty kwasy mikolowe - KLH

Niekompletna pożywka Freunda (FIA)

Modulator immunologiczny AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony (Pierce Chemical Company, ne kat. 77138)

Sterylna solanka - 0,85% roztwór chlorku sodu w podwójnie destylowanej wodzie.

Poniższe reagenty zastosowano do rozwijania w teście ELISA do wykrywania przeciwciał specyficznych dla kwasów mikolowych:

Albumina surowicy bydlęcej (BSA) - Sigma partia 11 HI040

ŻelatynaServa, partia 22151, Reinst technicznie czysty)

Koniugat żelatyna-MA

PBS - solanka buforowana fosforanem (pH 7,4) zawierająca:

Chlorek sodu (Unilab, chemicznie czysty, partia 28159)

Dodekahydrat wodorofosforanu sodu (Merck, chemicznie czysty, partia 7468715)

Chlorek potasu (Merck, chemicznie czysty, partia 6420150)

181 579

Dwuwodorofosforan potasu (Merck, chemicznie czysty, partia 6332422)

Bufor cytrynianowy (pH 4,5) zawierający:

0,1 M kwas cytrynowy (Merck, partia 775A)

0,1 M cytrynian disodowy (Merck, partia 8333833)

Kazeina (Merck, partia 0100 336 V279342) o-Fenylenodiamina (dichlorowodorek) Sigma partia 59F-5021)

Metanol (Saarchem, czysty do analizy, partia 31260)

Koniugat kozie anty-mysie monoklonalne przeciwciało-peroksydaza (Cappel, partia 37081)

Substrat: 8 mg wodoroperoksydazy mocznika mg o-fenylenodiaminy w 10 ml 0,1 M bufora cytrynianowego

W eksperymencie zastosowano próbki surowic z 5 immunizowanych i 3 kontrolnych myszy.

Zwierzęta doświadczalne

Sześciotygodniowe samice myszy Balb-C zastosowano w doświadczeniach immunizacyjnych. Myszy wyhodowano w Animal Centre w South African Institute for Medical Research w Johannesburgu.

Płytki ELISA

Do testów ELISA zastosowano Nunc Immunoplates (Maxisorp).

Przeciwprądowy aparat rozdzielający

W czasie badań stosowano przeciwprądowy aparat produkcji H O POST, Instrument Company Inc., Middle Village, New York.

METODY

W pracach doświadczalnych zastosowano następujące metody:

Hodowla szczepu bakteryjnego

Bakterie hodowano w temperaturze 37°C stosując:

Bulion Dubosa

Pożywkę Lowenstein-Jensena (skośna hodowla), oraz

Pożywkę agarową Middlebrook 7H-10 (skośna hodowla).

Wytwarzanie kwasów mikolowych z próbek bakterii

Wytwarzanie próbek bakterii składało się z trzech etapów:

zbierania komórek prątków;

zmydlania oraz ekstrakcji kwasów mikolowych

Zmydlanie, ekstrakcję i derywatyzację kwasów mikolowych prowadzono zgodnie z opisem Butlera, Josta i Kilbuma (1991), z niewielkim modyfikacjami i opisano pod odpowiednimi nagłówkami.

Szkło stosowane do ekstrakcji, derywatyzacji i analiz HPLC kwasów mikolowych przemyto 2% (objętościowo) Contradem (Merck), przepłukano wodą następnie chloroformem, wodą etanolem technicznie czystym, wodą i na koniec podwójnie destylowaną dejonizowaną wodą. Przemyto szkło osuszono ciepłym powietrzem w piecu.

Zbioru dokonano zdrapując narośnięte bakterie z powierzchni skosów pożywki (przy pomocy sterylnych pętli z tworzywa sztucznego). Homogenne zawiesiny w reagencie A bakterii wytworzono wytrząsając lub odwracając zebrane komórki ze sterylnymi szklanymi kulkami.

Zmydlanie prątków w reagencie A prowadzono w autoklawie w temperaturze 121 °C, przez godzinę.

Ekstrakcja kwasów mikolowych obejmowała następujące czynności:

Próbki pozostawiono do ochłodzenia i wprowadzono 1,3 ml reagentu B do każdej próbki.

Po odwracaniu każdej próbki sprawdzono i w razie potrzeby ustawiono na pH 1 reagentem B.

Następnie do każdej próbki dodano 2,0 ml chloroformu i odwracano przez 30 s. Warstwy pozostawiono do rozdzielenia. Dolne warstwy usunięto pipetami Pasteura, przeniesiono do fiolek WISP i odparowano do suchej masy w temperaturze 85°C w odparowalniku blokowym pod strumieniem azotu. W celu neutralizacji przywleczonych śladów kwasu dodano do każdej próbki

181 579

100 μΐ reagentu C i ciecz odparowano do suchej masy w temperaturze 85°C w odparowalniku blokowym pod strumieniem azotu.

Derywatyzacja kwasów mikolowych do analizy HPLC

Ekstrahowane kwasy mikolowe dery waty zowano jak następuje:

Do każdej ochłodzonej próbki wprowadzono 1,0 ml chloroformu, a następnie 50 μΐ reagentu D. Zamknięte próbki odwracano przez 30 s i ogrzewano przez 20 minut w temperaturze 85°C w odparowalniku blokowym. Następnie próbki ochłodzono i dodano 1,0 ml reagentu E. Próbki odwracano przez 30 s i warstwy pozostawiono do rozdzielenia. Dolne warstwy usunięto pipetami Pasteura i przeniesiono do fiolek WISP. Fiolki umieszczono w odparowalniku blokowym i ich zawartość odparowano do suchej masy w temperaturze 85° stosując strumień azotu.

Pozostałości umieszczono w zawiesinie w 0,212 g (co odpowiada 160 μΐ chlorku metylenu, zamknięto i odwracano. Każdą uzupełnionąpróbkę, do której wprowadzono 5 μΐ HPLC wewnętrznego wzorca, przesączono przez 0,45 pm przeponowy filtr do brunatnego koloru fiolki WISP. Ponownie zatkane fiolki trzymano w temperaturze 4°C do analiz HPLC.

Analiza HPLC i ilościowe oznaczenie kwasów mikolowych

Dla celów analizy HPLC zanalizowano 25 pl każdej próbki (trzymanej na lodzie w czasie manipulacji). Próbki kontrolne, to jest 23pl przesączonego chlorku metylene, przepuszczano przed analizą każdego analizowanego zestawu próbek. Jeśli analizowano wiele próbek, w celu sprawdzenia rzetelności aparatu HPLC, kontrolne próbki przepuszczano po każdych trzech lub czterech testowych.

Analizy HPLC z odwróconymi fazami prowadzono stosując aparat Beckman System Gold High Perforamance Liąuid Chromatography złożony z pomp (Beckman 110 B Solvent Delivery Module);

detektora (programmable detector module 166 lub 168);

kolumny (Nova-Pack Cl 8 4 pm 3,9 χ 150 mm) i zestaw końcowego łącznika dla stalowej kolumny wkładowej.

Warunki pracy:

Faza ruchoma:

Rozpuszczalnik A: chromatograficznie czysty metanol

Rozpuszczalnik B: chromatograficznie czysty chlorek metylenu

Natężenie przepływu: 2,5 ml/min.

Temperatura kolumny: 30°C

Detektor ustawiono na 260 nm.

Gradient HPLC początkowo zawierał 98% (objętościowo) metanolu (rozpuszczalnik A) i 2% (objętościowo) chlorku metylenu (rozpuszczalnik B). Gradient podwyższano liniowo do 80% A i 20% B po 1 minucie; 35% A i 65% B po 10 minutach utrzymywane przez 30 s i zmniejszano następnie przez 30 s z powrotem do 98% A i 2% B. Stosunek ten utrzymywano przez 4 minuty dla stabilizacji systemu przed wstrzyknięciem nastęOpnej próbki.

Matematyczne ilościowe oznaczenie kwasów mikolowych prowadzono porównując połączone pola pod pikami badanych próbek z polami pod pikami wprowadzonej ilości wzorca wewnętrznego HPLC o dużej masie cząsteczkowej.

Oczyszczanie kwasów mikolowych i grupowe oddzielanie innych kwasów tłuszczowych

W eksperymencie zastosowano przeciwprądowy ciąg rozdzielający składający się z 25 probówek, ponumerowanych 0-24. Do buforowego zbiornika wprowadzono około 900 ml górnej fazy.

Do probówki numer 0 wprowadzono próbki surowego komórkowego ekstraktu M. tuberculosis otrzymane z wielkoskalowego eksperymentu ekstrakcji (30-150 mg), rozpuszczono w ml dolnej fazy i 10 ml górnej fazy. Do pozostałych 24 probówek wprowadzono porcje 10 ml dolnej fazy. Górną fazę, w ilości 10 ml na cykl, automatycznie usuwano do probówki numer 0, wielokrotnie przez 25 cykli dających operację trwającą około lógodzin. Tak więc przeprowadzono 25 przeciwprądowych cykli, przy czym każdy cykl składał się z 20 ruchów mieszania i 40 minut czasu rozdzielania faz.

181 579

Przy każdym przeniesieniu, każdą substancję rozpuszczoną pochodzącą z próbki i znajdującą się w górnej fazie przenosi się do kolejnej probówki. Po zakończeniu 25 przenoszeń oddzielone frakcje rozpuszczone będą rozłożone wzdłuż ciągu 25 probówek.

W celu ustalenia rozkładu kwasów tłuszczowych pomiędzy 25 probówkami obserwowano wzory emulgowania w górnych i dolnych fazach w ciągu probówek i odpowiednio określano frakcje.

Oddzielony przeciwprądowo materiał usuwano następnie z probówek stosując 50 ml szklaną strzykawkę z rurką z Teflonu (znak handlowy zastrzeżony). Materiał łączono w 7 frakcji, suszono indywidualnie pod zmniejszonym ciśnieniem w odparowalniku Buchi w temperaturze 70°C, osuszony materiał rozpuszczano w chloroformie, metanolu lub wodzie (około 5 ml), przenoszono do brunatnego koloru fiolek WISP i przechowywano w temperaturze 4°C aż do wykorzystania.

Wydajność kwasówmikolowych oczyszczonych metoda przeciwprądowego rozdzielania

W celu obliczenia przybliżonej wydajności oczy szczania/rozdzielania, zważoną ilość kwasów mikolowych z próbek po przeciwprądowym oczyszczaniu/rozdzielaniu porównano z ilością tych związków w surowym ekstrakcie komórkowym wprowadzanym do aparatu przeciwprądowego, obliczoną ze względnych powierzchni pików grupy kwasów mikolowych i powierzchni pików wzorca na chromatogramie HPLC surowego ekstraktu komórkowego.

Przeciwprądowe oczyszczanie kwasów mikolowych

Materiał ekstrahowany z M, tuberculosis, zgodnie ze sposobem proponowanym przez Butlera, Josta i Kilbuma (1991) wydzielania kwasów mikolowych, okazał się zawierać mniej niż 10% kwasów mikolowych (tablica 1). W celu nadania kwasom mikolowym immunogenności, konieczne jest związanie oczyszczonego materiału z cząsteczkami nośnika, takimi jak albumina surowicy bydlęcej. Ważnym wymaganiem tej procedury jest rozpuszczalność kwasu mikolowego w odpowiednim rozpuszczalniku.

Przeciwprądowe oczyszczanie ekstraktu surowych kwasów mikolowych z M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 z użyciem fazowego układu opisanego powyżej, wykonywano w ciągu 25 cykli.

Po zmieszaniu końcowych faz w ciągu probówek i pozostawieniu do osiadania przez kilka minut można było zaobserwować wzór emulgacji, wskazujący dokładnie, jak materiał rozkładał się wzdłuż ciągu probówek.

Frakcje 1,2,3,4 i 5 zanalizowano metoda HPLC, która ujawniła charakter kwasu mikolowego pików 1 i 2, i charakter krótkołańcuchowego kwasu tłuszczowego pików 4 i 5 (wykres 1).

Profile HPLC surowego ekstraktu komórkowego, frakcji 1 i frakcji 4 przedstawiono na wykresie 1.

Frakcji 6 i 7 nie można zanalizować metodą HPLC wskutek faktu, że nie rozpuszczają się w chloroformie.

Wzór rozkładu masy (tabela 1) wskazuje, że osiągnięto oddzielenie linii podstawowej kwasów mikolowych od ich bardziej polarnych zanieczyszczeń, a wydajność 8% korelowała z teoretyczną wydajnością kwasów mikolowych z surowego ekstraktu w granicach błędu doświadczalnego.

181 579

Tablica 1

Profil HPLC pierwszej frakcji z przeciwprądowo oczyszczonego materiału

9	Łącznie: 35, 1 *) Kd=-^U-
r-	23 24 ।	i'1	V£> r-H	brak	ni ekrystal. związek organ i c z ny	1 50% metanol- : woda
lo r-4			20 21 22	9 '91	5, 5	brak	cukier krystaliczny	1 50% metanolwoda
vn m cn	—	lD	12 13 14 15 16 17 18 19	13, 3	1,26	górna faza 1 .. .	mydło (zmydlone kwasy tłuszczowe)	r chloroform:metanol (3:7 obj.)
8 1,3 2,7 — □□ o ΕΞΞΙ	<r	8 9 10 11	o »-♦	dolna faza
rn	5 6 7	o	1	brak	brak	1
CXI	2 3 4	0/ 5	1 0, 08	dolna faza . ______	kwasy mikolowe	chloroform
	l 0	o cn
50 40 % rozkład 30 masy 20 10	Numer frakcji	Numer probówki	Wydajność (mg)	Scala dystrybucji Kd*)	Wzór emulgacj i	Natura fizyczna	Rozpuszczalne w

181 579

Wytwarzanie koniugatu kwasy mikolowe-BSA (albumina surowicy bydlęcej)

Wytworzono roztwór BSA zawierający 5 mg w 500 μΐ 0,1 N NaHCO₃ (pH 8,3). Próbki oczyszczonego przeciwprądowo kwasu mikolowego (4,5 mg) rozpuszczono w 450 μΐ chloroformu. Roztwór BSA dodano powoli do porcji 200 μΐ roztworu kwasów mikolowych w czasie 1 min. 20 s, w temperaturze pokojowej. W czasie procesu mieszaninę zawracano. Po dodatkowym zawróceniu przez 30 s, próbki umieszczono na lodzie na 15 minut. Wprowadzono następnie ochłodzony lodem aceton (2 ml) w czasie 2 minut, ciągle trzymając próbki na lodzie. Mieszaninę odstawiono na godzinę.

Po usunięciu czwartej części roztworu do innej fiolki do analizy HPLC (0,5 mg), próbkę odwirowano w trzech krótkich 10 s impulsach i granulkę przemyto dwukrotnie acetonem. Granulkę przeniesiono następnie znów do fiolki WISP, osuszono na powietrzu i trzymano w temperaturze 4°C przez noc. Próbkę pobraną do analizy HPLC osuszono ogrzewaniem blokowym.

Dodawanie adiuwanta prowadzono w następujący sposób:

Próbkę modulatora immunologicznego AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony) (10 mg) zmielono szklanąbagietkąi dodano próbki koniugatu kwasy mikolowe-BSA (1 mg), osuszonego ogrzewaniem blokowym. Proszki zmielono ze sobą z wytworzeniem jednorodnego proszku, z którego odważono 1 mg i rozpuszczono w 1 ml sterylnej solanki, resztę mieszaniny AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony) /BSA-kwasy mikolowe zatopiono pod zmniejszonym ciśnieniem, zawinięto w folie i przechowywano w temperaturze 4°C.

Roztwór solanki poddano sonikacji stosując Branson Sonifier - Celi disruptor B-30 przez dziesięć 10 s cykli impulsów z przerwami 10 s, a następnie jeden 30 s cykl impulsów, co dało jednorodną dyspersję cząstek. W czasie sonikacji próbkę trzymano na lodzie. Zgodnie z instrukcją producenta roztwór solanki pozostawiono w temperaturze 4°C na 4 godziny przed użyciem do immunizacji.

Po usunięciu immunogenu koniecznego do immunizacji dodano znaczny nadmiar oziębionego lodem acetonu do pozostałego roztworu solanki, w celu wytrącenia białek. Osad przemyto dwukrotnie zimnym acetonem i przechowywano w folii pod acetonem w temperaturze 4°C.

Wytwarzanie koniugatu kwasy mikolowe-żelatyna

Wytworzono roztwór żelatyny zawierający 5 mg żelatyny w 2 ml 0,1 N NaHCO₃ (pH 8,3). Próbkę 500 μΐ roztworu dodano do 600 μΐ metanolu i zmieszano. Mieszaninę dodano następnie stopniowo do 2 mg kwasów mikolowych rozpuszczonych w 50 μΐ chloroformu w czasie 1 min. 20 s z odwracaniem. Próbkę odwracano następnie przez 30 s i umieszczono na lodzie na 15 minut.

Próbkę przeniesiono do 100 ml kolby Schotta i dodano 80 ml oziębionego lodem acetonu. Kolbę Schotta z zawartościąpozostawiono na lodzie przez 30 min. Osad zawierający kwasy mikolowe adsorbowane na żelatynie przemyto dwukrotnie acetonem i próbki przechowywano pod acetonem w temperaturze 4°Ć.

Immunizacja myszy

Immunizację myszy prowadzi się zgodnie z następującym protokołem:

Czas Rodzaj manipulacji Miejsce manipulacji

Dzień 1	pierwsza immunizacja	poduszka stopy
Dzień 14	druga immunizacja	podskórnie
Dzień 21	pierwsze pobieranie krwi	żyła ogonowa
Dzień 28	trzecia immunizacja	podskórnie
Dzień 35	drugie pobieranie krwi	żyła ogonowa
Dzień 49	trzecia immunizacja	podskórnie
Dzień 59	trzecie pobieranie krwi	żyła ogonowa

Każdej z procedur immunizacji towarzyszył kontrolny eksperyment, w którym grupie dwu myszy wstrzykiwano tylko cząsteczki nośnika i odpowiedni adiuwant, w identyczny sposób.

W czasie pierwszej immunizacji, pięciu samicom myszy Balb-C wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap porcjami mieszaniny koniugatu kwasów mikolowych i adiuwanta. Do stopy wstrzyknięto około 50 μΐ mieszaniny. W czasie dalszych immunizacji wstrzyknięto podskórnie tę samą objętość mieszaniny koniugatu kwasów mikolowych i adiuwanta.

181 579

Przy pierwszym i następnych i pobieraniach krwi kilka kropli pobierano z żyły ogonowej każdej myszy, w tym kontrolnej.

Monitorowane wytwarzania przeciwciał

Wytwarzanie surowicy

W celu monitorowania przeciwciał pobrano kilka kropli krwi z żyły ogonowej każdej myszy. W czasie pierwszego pobierania krwi z pięciu immunizowanych myszy i trzech kontrolnych zebrano i wprowadzono do dwu oddzielnych probówek Eppendorffa (Eppendorff to zastrzeżony znak handlowy), zmieszano i pozostawiono do skrzepnięcia. Surowicę oddzielono do erytrocytów przez odwirowanie w wirówce Eppendorffa (Eppendorff to zastrzeżony znak handlowy) przez 10 min. Zebrane supernatanty surowic trzymano w temperaturze 4°C. Przy następnych pobieraniach próbki krwi zbierano i miareczkowano oddzielnie.

Wytwarzanie płytek ELISA

Płytki ELISA powlekano roztworami powlekającymi zawierającymi BSA lub koniugat kwasy mikolowe-żelatyna w stężeniu 10 pg/ml w buforze PBS (pH 7,4).

Porcje 50 pl roztworów powlekających BSA lub kwasów mikolowych-żelatyny wprowadzono do indywidualnych studzienek i płytki ELISA inkubowano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej.

Płytki ELISA zablokowano następnie 200 pl 0,5% kazeiny w buforze PBS (pH 7,4) na studzienkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Blokujący roztwór usunięto przez otrząśnięcie i płytki osuszono.

Miareczkowanie surowicy

Osocza otrzymane z immunizowanych myszy rozcieńczono 0,5% kazeiną w buforze PBS (pH 7,4) i załadowano na płytkę ELISA potrójnie. Osocza od myszy kontrolnych, to jest myszy immunizowanych BSA AdjuPrime (znak handlowy zastrzeżony) i nie immunizowanych, podobnie rozcieńczono 0,5% kazeinąw buforze PBS (pH 7,4) i załadowano na płytkę ELISA potrójnie, w ilości 50 pl na studzienkę.

Bezpośrednie miareczkowanie surowicy otrzymanego z myszy immunizowanych koniugatem BSA-kwas mikolowy połączono z testem inhibicji, w celu potwierdzenia specyficzności przeciwciała. Dla celów eksperymentów inhibitacji koniugat BSA-kwasy mikolowe wprowadzono jako współzawodniczący antygen w stężeniu 0,32 mg/ml do surowic odpornościowych w czasie inkubacji na płytce ELISA.

Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę na wytrząsalniku do płytek. Po tym okresie surowice usunięto i płytkę przemyto 3 x 0,5% kazeiny w buforze PBS (pH 7,4) w Anthos Autowash.

Koniugat kozie anty-mysie monoklonalne przeciwciało-peroksydaza rozcieńczono 1:4000 wprowadzono na płytki ELISA (50 μΐ na studzienkę) i płytki pozostawiono na 60 min w temperaturze pokojowej na wytrząsalniku do płytek. Roztwór konigatu peroksydazy strząśnięto i płytki przemyto 3 x 0,3% kazeiną w buforze PBS (pH 7,4) aby usunąć wszelki nadmiar koniugatu. Substrat zmieszano i pipetowano do studzienek w ilości 50 pl na studzienkę.

Absorbancję w indywidualnych studzienkach prowadzono przez 1,3 godziny stosując czytnik ELISA SLT 340 ATC.

Wyniki i dyskusja eksperymentów immunizacji ELISA

Wykres z fig. 3 wskazuje na odpowiedź przeciwciała otrzymaną przez immunizację myszy koniugatem kwasy mikolowe-BSA. Ciągłe słupki reprezentują odczyty absorbancji (pomnożone przez czynnik 10³) ze wskazaniem standardowego odchylenia dla każdego zestawu potrójnych rozcieńczeń. Otrzymano silne odpowiedzi na nośnik BSA (prawa kolumna) i słabsze na kwasy mikolowe (lewa kolumna).

Po 59 dniach programu immunizacji dwie z pięciu immunizowanych myszy wytworzyło surowice odpornościowe o aktywności przeciwciała specyficznie wobec kwasów mikolowych, na co wskazuje 24% inhibitacji sygnału ELISA przy 1:50 rozcieńczeniu surowicy odpornościowej zmieszanej z 0,32 mg/ml rozpuszczalnymkoniugatem BSA-kwasy mikolowe. Inhibicję prowadzi się blokując miejsca wiązania specyficzne dla przeciwciał kwasów mikolowych kwasami

181 579 mikolowymi związanymi z BSA w roztworze, obniżając tak ilość przeciwciał specyficznych dla kwasów mikolowych wiążących się z płytą ELISA.

Gdy jako powlekający antygen stosowano BSA, otrzymano silne sygnały ELISA wskazujące na wysoki stopień immunizacji aktywnych myszy. Nie uzyskano sygnału rozcieńczenia 1:50 surowicy odpornościowej otrzymanej z myszy wykazującej aktywność anty-kwasu mikolowego przy inkubacji surowicy odpornościowej z 0,32 mg/ml rozpuszczalnego koniugatu BSA-kwasy mikolowe. Było tak prawdopodobnie wskutek wysokiego stężenia obecnych przeciwciał anty-BSA, przesuwających inhibicję przeciwciał anty-nośnik BSA poza zakres wrażliwości.

Odpowiedź immunologiczna anty-kwasy mikolowe wymaga dłuższego okresu immunizacji dla uzyskania odpowiedniego stanu dojrzenia odpowiedzi, prowadzącej do wzrostu stężenia przeciwciał i/lub zwiększenia powinowactwa do przeciwciał. Alternatywnie, można stosować myszy do wytwarzania monoklonalnych przeciwciał monospecyficznych wobec kwasów mikolowych.

Odnośniki

Blumberg, L., B. Miller i H.J. Koomhof 1994. Multiple drag resistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis - Towards 2000. Book of Abstracts: A sceintific conference a workshops on the short-term futurę of tuberculosis in the developing world, with particulsr emphasis on Africa, Pretoria, South Africa, 13-17 marca 1994, str. 9.

Butter, W.R. i J.O. Kilbum, 1988. Identification of Major Slowly Growing Pathogenic Mycobacteria and Mycobacterium gordonae by High-Performance Liquid Chromatography of Their Mycolic Acids. J. Clin. Microbiol., 26, (1), 50-53.

Butler, W.R., K.C. Jost i J.O. Kilbum, 1991. Identyfication of Mycobacteria by HighPerformance Liquid Chromatography. J. Clin. Microbiol., 29, (11), 2468-2472.

Cantwell, M.C. i N.J. Binkin, 1994. Tuberculosis and HIV in sub-Saharan Africa: Can a good tuberculosis control program make a difference Tuberculosis - Towards 2000. Book of Abs-tracts: A scientific conference a workshops on the short-term futurę of tuberculosis in the developing world, with particulsr emphasis on Africa, Pretoria, South Africa, 13-17 marca 1994, str. 8.

De Cock, K.M., 1994. Impact of Interaction with HIV, In:Tuberculosis: Back to the Futurę, str. 35-52. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Mc Adam. Opublikował: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore.

Dolin, P.J., M,C. Raviglione i A. Koch, 1994. Global gruźlicę incidence and mortality during 1990-2000. Bulletin of the World Health Organization, 72, (2), 213-220.

Godfery-Faussett, P., 1994. Of molecules and men: the detection of tuberculosis, past, present and futurę. W: Tuberculosisi;Backtothe Futurę, str. 79-98. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Mc Adam. Opublikował: John Wiley &, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore.

Laboratory Manuał of Tuberculosis Methods, Tuberculosis Research Institute of the SA Medical Research Council (1980, rozdz. 6, str. 83-103: wyd. 2, przejrzał E.E. Nel, H.H. Kleeberg i E.M.S. Gatner.

Morse, D.L., 1994. Multidrug resistance - the New York experience. W: Tuberculosis: Back to the Futurę, str. 225-237. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Mc Adam. Opublikował: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore

Murray, D.B., 1994. Update on Mycobacterial issues for the Acquired Immune Deficiency Syndrome Era. J. Of Intravenous Nursing, 17 (4), 217-219.

Musial, C.E., L.S. Tice, L. Stockman i G.D. Roberts, 1988. Identyficationof Mycobacteria from Culture by using the Gen-Probe Rapid Diagnostic Systems for Mycobacterium avium Complex and Mycobacterium tubelculosis Complex. J. Clin. Microbiol., 26, 2120-2123.

Sinder, D.E., 1994. Tuberculosis: the world situation. History of the disease i efforts to combat it. W: Tuberculosis: Back to the Futurę, str. 13-33. Wyd. J.D.H. Porter i K.P.W.J. Ac Adam.

Opublikował: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore.

Torres, R. A., Mani, J. Altholz i P. W. Brickner, 1990. Humań Immunodeficiency Virus Infection Among Homeless Men in a New York City Shelter. Arch. Intern. Med., 150, 2030-2036.

181 579

Powlekający antygen

<wasy mikolowe - żelatyna

SurowićS odoornościowa

BSA bez inhibicji

109 i------1

Mysz 1

2438

106 H inhibicja

2452

142 Γ bez inhibicji

2316

154 b~|

Mysz 2

inhibicja

4 h

2205

2189 bez inhibicji

Mysz 3 inhibicja

2223

2 1

| 761-

B6

2289 bez inhibicji

Mysz 4 inhibicja

2231

bez ihibicji Mysz 5 inhibicja	es	____.2186
4 b		___________ __2oj
_______________64 ¹	_____________________1S67
Β Η		________________________68 F]

2000

100

1000

Fig·. 3

Sygnał Odpowiedzi wego - BSA przez ELISA

ELISA X 10³ (przy 450nm) immunologiczne u myszy wobec kwasu mikolopo 59 dniach programu immunizacji, zmierzone

181 579

Μ (Π

0-4

Ο (D £ Ν υ rM

Φ ίΰ £ ο υ

Ν ω

Ό

Φ rM ,Μ

Ν Ο Μ

Φ ,Ώ

Ο £η Ή IX

ΟΊ ΟΊ ΟΊ

I Ο cn cn 'Ν □

Μ

Cn χί ο >1 £

Φ

-υ Μ

Φ

181 579

CD £ N O (V rH >1

N U

-H

Φ £ cd 3 O O 03 N 03

T3 rH

N O M

Cn •H Eli

CU CU CU

I o CU CU u •H 'N

Li tn & N M CU

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Próba diagnostyczna do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium w próbce biologicznej zwierzęcia, znamienna tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałem specyficznym dla co najmniej jednego wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu gatunku mikobakteryjnego zawierającego kwas mikolowy lub mieszaninę kwasów mikolowych; i wykrywa się tworzenie się kompleksu przeciwciała z antygenem w próbce.
2. Próba diagnostyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje etap lizy co najmniej niektórych mikobakteryjnych komórek obecnych w próbce przed zetknięciem próbki z przeciwciałem.
3. Próba diagnostyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że obejmuje także etap przetwarzania biologicznej próbki dla uwolnienia mikobakteryjnych komórek od reszetek organicznych, w których mogą być zawarte i usunięcia zanieczyszczeń biologicznych próbki od niepożądanych mikroorganizmów.
4. Próba diagnostyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje także etap zatężania wewnątrzkomórkowego mikobakteryjnego antygenu w procedurze powinowactwa z unieruchomionym przeciwciałem przed zetknięciem ze znakowanym przeciwciałem.
5. Próba diagnostyczna według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienna tym, że jako wewnątrzkomórkowy mikobakteryjny antygen stosuje się kwas mikolowy lub mieszaninę kwasów mikolowych znajdujących się w ściankach Komórek gatunków Mycobacterium, o następującym wzorze ogólnym: β _α

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH (CH₂)_y

CH₃
6. Oczyszczony z mieszaniny wyekstrahowanych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń kwas mikolowy lub mieszanina kwasów mikolowych o wzorze ogólnym:

β a

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH

I (CH₂)_y

I

CH₃

181 579
7. Sposób grupowego rozdzielania i oczyszczania, z mieszaniny wyekstrahowanych mikobakteryjnych kwasów mikolowych i zanieczyszczeń poekstrakcyjnych, mikobakteryjnych kwasów mikolowych o ogólnym wzorze:

β a

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH

I (CH₂)_y

I ch₃ znamienny tym, że rozpuszcza się mieszaninę kwasów mikolowych w dwufazowym układzie rozpuszczalnikowym i poddaje się mieszaninę rozdziałowi metodą podziału przeciwprądowego.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że oczyszczone kwasy mikolowe nie podlegają późniejszej chemicznej derywatyzacji.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dwufazowy rozpuszczalnik zawiera fazę górna i fazę dolną.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że także miesza się i równoważy fazę górną i dolną.
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dwufazowy układ rozpuszczalnikowy zawiera chloroform, metanol i wodę.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że skład fazy górnej stanowi 12-18% chloroformu, 45-55% metanolu i 20-40% wody.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że skład fazy górnej stanowi 15% chloroformu, 52% metanolu i 33% wody.
14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że skład fazy dolnej stanowi 50-80% chloroformu, 15-40% metanolu i 2-8% wody.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że skład fazy dolnej stanowi 68% chloroformu, 27% metanolu i 5% wody.
16. Wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:

β a

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH

I (CH₂)_y

CH₃
17. Wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego mikobakteryjnego kwasu mikolowego lub mieszaniny kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobakterium, o wzorze ogólnym:

181 579 β α

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH (CH₂)_y

CH₃ przy czym każdy kwas mikolowy skoniugowany jest z nośnikiem.
18. Wydzielone przeciwciało według zastrz. 16, znamienne tym, że stanowi go przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne.
19. Wydzielone przeciwciało według zastrz. 18, znamienne tym, że stanowi go poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego.
20. Koniugat mikobakteryjny wewnątrzkomórkowy antygen/nośnik, znamienny tym, że wewnątrzkomórkowy antygen jest oczyszczonym mikobakteryjnym kwasem mikolowym lub mieszaniną kwasów mikolowych i jest skoniugowany z nośnikiem.
21. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się białko.
22. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się żelatynę lub albuminę surowicy bydlęcej.
23. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się hemocyjaninę pijawki.
24. Koniugat według zastrz. 20 albo 21, albo 22 albo 23, znamienny tym, że jako wewnątrzkomórkowy antygen stosuje się mieszaninę kwasów mikolowych, przy czym każdy ma wzór ogólny:

β a

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH (CH₂)_y

CH₃
25. Zestaw do wykrywania obecności gatunków Mycobacterium w biologicznej próbce obejmujący przeciwciało i stałe podłoże, znamienny tym, że jako przeciwciało zawiera wydzielone przeciwciało wobec oczyszczonego kwasu mikolowego lub kwasów mikolowych obecnych w ściankach komórek Mycobacterium, o wzorze ogólnym:

β a

CH₃ - (CH₂)_x - CH-OH - CH - COOH

I (CH₂)_y

I

CH₃

181 579
26. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, że przeciwciało jest skoniugowane z nośnikiem, korzystnie z nośnikiem białkowym.
27. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, żejako przeciwciało zawiera przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne.
28. Zestaw według zastrz. 27, znamienny tym, że zawiera poliklonalne przeciwciało pochodzenia zwierzęcego.
29. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, żejako nośnik zawiera żelatynę lub albuminy surowicy bydlęcej.
30. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, że jako nośnik zawiera hemocyjaninę pijawki.
31. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, że przeciwciało jest unieruchomione na podłożu.

* * *