JPH04355339A - 微量検体採取用具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物学的被検物質、例
えば口腔内の歯周病原性細菌又は口腔内の歯周病原性細
菌に対する特異抗体の検出に使用しうる微量検体採取用
具並びにそれを用いる検体中の生物学的被検物質の測定
方法及び測定用キツトに関する。

【０００２】

【従来の技術及び問題点】歯周病は、歯肉炎と歯周炎に
分けられ、更に、歯周炎には、成人性歯周炎、限局性若
年性歯周炎などがある。これらの歯周病は、歯肉の炎症
、出血、排膿、歯周ポケツトの形成、歯根膜の破壊、歯
槽骨の吸収、歯牙の動揺、歯牙の喪失にまで至る疾患で
ある。

【０００３】しかしながら、現在、歯周病の治療法は、
まだ完全に確立されていないのが現状であり、できるだ
け早期に歯周病を発見し、予防的処置を施すことが最も
重要であると考えられている。上記の歯周病の病巣局所
には、種々の細菌が存在するが、全細菌のうちの３〜４
割がグラム陰性の嫌気性細菌によつて占められていると
言われ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ（以下　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、Ｐｒｅ
ｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（以下　Ｐ．　
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（以
下　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎ
ｓ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（以下
　Ｔ．　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ　ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ（以下　Ｂ．　ｆｏｒｓｙｔｈ
ｕｓ）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ（以下　Ｃ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、Ｆｕ
ｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（以下　
Ｆ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ　ｒ
ｅｃｔａ（以下　Ｗ．　ｒｅｃｔａ）などが歯周病原性
細菌であるとされている。そして、歯周病の病巣局所で
は、これらの歯周病原性細菌の顕著な増加が認められる
。なお、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
　は、従来の　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄ
ｉｕｓ　に相当し、最近の新しい分類（１９９０年の　
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　
ｏｎ　Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　での
　Ｔ．Ｊ．Ｍ．　ｖａｎ　Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ　に
よる）では、このように呼ばれている。

【０００４】そこで、これらの歯周病原性細菌に注目し
、歯周病の診断の補助的手段として、その歯周病原性細
菌の存否及びその多寡を知るために種々の方法が提案さ
れている。

【０００５】例えば、歯周病患者の歯肉溝液や歯肉緑下
プラーク（歯垢）等の歯周ポケツトからの検体に棲息す
る歯周病原性細菌を血液寒天培地で嫌気的条件下で培養
し、得られた種々のコロニーの詳細な生化学的性状を調
べることにより、歯周病原性細菌を検出することが報告
されている（Ｌｏｅｓｃｈｅ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｙｅｄ，Ｓ
．Ａ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．ａｎｄ　Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ，Ｅ．Ｃ．：Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ．５６、４４７
−４５６、１９８５など参照）。

【０００６】また、歯周ポケツトに棲息する歯周病原性
細菌をグラム染色後に顕微鏡下で調べたり、暗視野顕微
鏡によつて調べたり（Ｌｉｓｔｇａｒｔｅｎ，Ｍ．Ａ．
ｅｔ　ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ
．５、１１５−１３２、１９７８参照）、歯周病原性細
菌に対する抗体と蛍光色素を組み合わせて、歯周病原性
細菌を検出することも行われている（Ｚａｍｂｏｎ，Ｊ
．Ｊ．，Ｂｏｃｈａｃｋｉ，Ｖ．ａｎｄ　Ｇｅｎｃｏ，
Ｒ．Ｊ．：Ｏｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１，３９−４４、１９８６参照）。

【０００７】また、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ　法）を用
いて、歯周ポケツトに棲息する歯周病原性細菌を、それ
ぞれの歯周病原性細菌に対する抗体で検出することも行
われている（Ｚａｍｂｏｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｏｃｈａｃｋ
ｉ，Ｖ．ａｎｄ　Ｇｅｎｃｏ，Ｒ．Ｊ．：Ｏｒａｌ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１、３９−４４、
１９８６参照）。

【０００８】また、歯周病原性細菌に非常に特徴的な酵
素に着目し、その酵素活性を指標にして、歯周ポケツト
に棲息する歯周病原性細菌を検出することも報告されて
いる（Ｌｏｅｓｃｈｅ，Ｗ．Ｊ．：Ｏｒａｌ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１、６５−７０、１９８
６参照）。

【０００９】更に、最近では、歯周病原性細菌の遺伝子
に注目し、ＤＮＡ　プローブ法を用いて、歯周ポケツト
に棲息する歯周病原性細菌を検出することも行われてい
る（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
　社）。更に、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａ
ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、極微量の菌体をも
検出することが可能となつてきている。

【００１０】一方、成人性歯周炎患者の歯周病原性細菌
に対する抗体価については、成人性歯周炎患者の歯肉組
織での歯周病原性細菌に対する抗体産生細胞の増加、つ
まり、特異抗体の上昇が、ＥＬＩＳＰＯＴ　法を用いて
報告されている（Ｔｏｍｏｈｉｋｏ　Ｏｇａｗａ　ａｎ
ｄＳｈｉｇｅｙｕｋｉ　Ｈａｍａｄａ：Ｃｌｉｎ．ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７６、１０３−１１０、１９８９
参照）。

【００１１】しかしながら、これらの方法は、いずれも
検出感度が低かつたり、特異性に問題があつたり、長時
間にわたる煩雑な操作と高価で特殊な装置を必要とする
ために、広く普及することは難しく、迅速かつ簡便な歯
周病診断用試薬及び診断方法の開発が望まれている。

【００１２】

【問題を解決するための手段】本発明者は、歯周病を含
むあらゆる疾患において、その診断の指標となる検体中
の生物学的被検物質をそれが極微量であつても効率よく
採取することのできる用具、それを用いて検体中の生物
学的被検物質を直接的かつ迅速、簡便に検出することの
できる測定方法及び測定用キツト等について鋭意研究を
行ない、今回、本発明を完成するに至つた。

【００１３】かくして、本発明は、実質的に水不溶性か
つ透水性の多孔性フイルムでコーテイングされた吸水性
材料からなる生物学的被検物質採取部分を有することを
特徴とする検体中の生物学的被検物質採取用具を提供す
るものである。

【００１４】本発明はまた、ステイツク状又は短冊状の
吸水性材料からなり、該吸水性材料の先端１〜５ｍｍ　
の長さからなる生物学的被検物質採取部分に隣接する少
なくとも検体と接触する可能性のある部分の表面が防水
処理されていることを特徴とする生物学的被検物質採取
用具を提供するものである。

【００１５】本発明はさらに、上記の採取用具の生物学
的被検物質採取部分を検体と接触させた後、該生物学的
被検物質と特異的に結合しうる標識された物質からなる
試薬と接触させ、該採取部分に結合した標識された試薬
を定性的又は定量的に検出することを特徴とする検体中
の生物学的被検物質の測定方法を提供するものである。

【００１６】本発明はさらに、上記の採取用具と、検体
中の検出すべき生物学的被検物質と特異的に結合しうる
標識された物質からなる試薬との組合わせよりなる検体
中の生物学的被検物質の測定用キツトを提供するもので
ある。

【００１７】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【００１８】本発明の採取用具は、対象となる検体の種
類等に応じて種々の形態をとりうるが、一般にはステイ
ツク状（先細りとなつていてもよい細い棒状のもの）や
短冊状（幅の狭いシート状ないしフイルム状のもの）で
あることが望ましい。また、該採取用具は、全体又は少
なくともその生物学的被検物質採取部分が吸水性材料か
ら構成され、その材質は吸水性の高いものであれば、天
然、半合成及び合成のいずれのタイプのものであつても
よく、例えば、高吸水性デンプン系ポリマー、高吸収性
セルロース系ポリマー、デキストラン系ポリマー、高吸
水性合成ポリマー（例えばポリアクリル酸塩系、ポリビ
ニルアルコール系、ポリアクリルアミド系、ポリオキシ
エチレン系のポリマー）などが挙げられ、中でも高吸水
性セルロース系ポリマー及び高吸水性合成ポリマーが好
適である。

【００１９】具体的には、歯科分野において「ペーパー
ポイント」として知られている紙製ステイツク（例えば
紙製コヨリ）が素材として好適であり、また、濾紙を幅
の狭い短冊状にカツトしたものも素材として便利に使用
することができる。

【００２０】本発明の一態様によれば、上記の如き吸収
性材料の少なくとも生物学的被検物質採取部分、例えば
、ステイツク状又は短冊状の吸収性材料の少なくとも先
端部分の表面が、実質的に水不溶性かつ透水性の多孔性
フイルムでコーテイングされる。このように吸水性材料
の表面を実質的に水不溶性かつ透水性の多孔性フイルム
でコーテイングすることにより、検体中の水分を該フイ
ルムの孔を通過して内部の吸水性材料に吸収させると同
時に、検体中の生物学的被検物質を多孔性フイルムコー
テング上に濃縮されながら吸着、固定化させることが可
能となり、後の標識された試薬による検出の際の判定が
極めて容易になるという顕著な作用効果があることが判
明した。

【００２１】従つて、コーテイングされる多孔性フイル
ムの孔径は、検体中の水分の透過は許すが、検出すべき
生物学的被検物質は実質的に通過しない程度の大きさに
設定することが望ましく、例えば、歯周病原性細菌など
の細菌の検出を目的とする場合には、コーテイングされ
た多孔性フイルムの平均孔径は一般に１０ミクロン以下
、特に０．４５〜５．０ミクロン程度とすることが望ま
しい。

【００２２】コーテイングするフイルムの材質としては
、実質的に水不溶性のものであれば特に制限されるもの
ではなく各種のポリマーを使用することができるが、具
体的には例えば、多糖の有機酸又は無機酸エステル（例
えば、セルロースの酢酸、プロピオン酸などの低級脂肪
酸エステル又は硝酸エステル）、多糖の低級アルキルエ
ーテル誘導体（例えば、エチルセルロース、プロピルセ
ルロース、ブチルセルロースなど）、ポリアミド系樹脂
などが挙げられる。

【００２３】前記吸収性材料にかかる材質の多孔性フイ
ルムのコーテイングを形成する方法としては、それ自体
既知の方法を採用することができ、例えば、セルロース
系膜は相分離法で製膜することができ、具体的には、セ
ルロースをアセトンや塩化メチレンなどの良溶媒に溶解
し、更に、これよりも沸点の高いエタノールや水などの
非良溶媒を加え、均一に混合した溶液を作り、その溶液
を支持体の上に流延し、良溶媒と非良溶媒との沸点の差
を利用して、良溶媒を選択的に乾燥除去し、更に、非良
溶媒を乾燥除去することによつて、均一で微細な多孔質
膜を作ることができる。

【００２４】吸収性材料上の多孔性フイルムコーテング
は、少なくとも採取用具の生物学的被検物質採取部分全
体を覆うようにして施すことができ、例えばステイツク
状又は短冊状の吸水性材料の場合には、少なくともその
先端部分を覆うように施され、そのコーテング部分の長
さは先端から少なくとも１ｍｍ　、好ましくは２ｍｍ　
以上とすることができる。

【００２５】また、本発明の採取用具の生物学的被検物
質採取部分は必要以上に大きくする必要はなく、後の検
出操作に支障をきたさない範囲でできるだけ最小限にと
どめることが望ましい。そのための一手段として、採取
用具の生物学的被検物質の採取に必要とされる部分（生
物学的被検物質採取部分）以外の少なくとも検体と接触
する可能性のある部分の表面を防水処理する方法が挙げ
られる。或いはまた別法としてコーテイングが施された
吸水性材料の小片を適当な支持具に固定することも可能
である。これにより、採取具の多孔性フイルムでコーテ
イングされた限られた部分でのみ、検体が集中的に吸収
されるようになるので、その部分における生物学的被検
物質の吸着、固定化がより一層効果的に行なわれ、標識
された試薬による判定がより一層容易になる。

【００２６】防水処理は例えば、コーテイングしたステ
イツク状又は短冊状の吸水材料の先端１〜５ｍｍ　、好
ましくは２〜４ｍｍ　の長さからなる生物学的被検物質
採取部分に隣接する少なくとも検体と接触する可能性の
ある部分の表面に施すことができる。

【００２７】防水処理の方法としては、多孔性フイルム
のコーテングの生物学的被検物質採取部分を除いた部分
を該フイルムを溶解しうる溶剤で処理して該コーテイン
グの孔をふさぐ方法；実質的に水に不溶性かつ非吸水性
のポリマー（例えば、フツ素樹脂、シリコーン樹脂、塩
化ビニル樹脂、メタアクリール樹脂、ポリエステル樹脂
、セルロイド、パラフイン、ゴム、木ろう、牛脂など）
からなる防水コーテイングを施す方法等が挙げられる。

【００２８】以上に述べた本発明の採取用具の一例を添
付の第１図に示す。この図は本発明の採取用具の概略断
面図であり、本図において（１）はステイツク状の吸水
性材料（これは短冊状の吸水性材料であつてもよい）で
あり、その先端部分には、ニトロセルロース、セルロー
スアセテート等の水に実質的に不溶性かつ透水性の多孔
性フイルム（２）がコーテイングされており、そしてさ
らに、先端の所定長さの生物学的被検物質採取部分（３
）を残して、検体と接触する可能性のある部分には防水
処理（４）が施されている。

【００２９】また、本発明の採取用具の別の簡略化した
態様として多孔性フイルムのコーテイングを施すことな
く、単に、ステイツク状又は短冊状の吸水性材料の先端
１〜５ｍｍ　、好ましくは２〜４ｍｍ　の長さからなる
生物学的被検物質採取部分を残し、該吸水性材料のそれ
以外の部分の少なくとも検体と接触する可能性のある部
分に前述した如くして防水コーテイングを施すことによ
り、本発明の採取用具を構成することもできる。

【００３０】この態様の採取用具は、生物学的被検物質
採取部分に、実質的に水不溶性かつ透水性の多孔性フイ
ルムのコーテイングが存在せず、従つて該コーテイング
によつて達成される前述した如き作用効果は享受しえな
いが、しかし、この態様の採取用具にあつても、局限さ
れた先端部でのみ集中的に検体が吸収され、そこに生物
学的被検物質をかなりの濃度で吸着、固定化することが
可能となる。

【００３１】以上に述べた本発明の採取用具を用いれば
、各種の体液、例えば、血液、唾液、涙、汗、鼻水、尿
、便、***、膣分泌液、膿、喀痰などに含まれる血液成
分、血清、各種細胞、サイトカイン、ホルモン、ペプチ
ド、代謝産物、酵素、生理活性物質、腫瘍マーカー、遺
伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、レセプター、抗体、抗原、微
生物、ウイルス等の生物学的被検物質を、極めて簡単な
操作で効率よく採取することができる。例えば歯周病に
関していえば、本発明のステイツク状の採取用具を被検
者の歯と歯の間、歯と歯茎の間、歯周ポケツトなどに挿
入することによつて、歯肉溝液、唾液などから、歯周病
原性細菌又はその特異抗原、或いは歯周病原性細菌又は
その特異抗原に対する抗体を簡単に採取することができ
る。

【００３２】また、検体中の生物学的被検物質を採取す
る場合に、必要に応じて、採取用具を適当な吸引源（又
は真空源）に接続することも可能であり、それにより、
生物学的被検物質の採取をより効果的に行なうことがで
きることもある。

【００３３】次に、本発明の採取用具を用いる検体中の
生物学的被検物質の測定方法について説明する。

【００３４】本発明の採取用具を用いての生物学的被検
物質の採取は、本発明の採取用具の生物学的被検物質採
取部分を前記の如き検体と接触させることにより行なわ
れる。

【００３５】本発明の採取用具を検体と接触させると、
前述したように、その採取部分に生物学的被検物質が濃
縮されて吸着、固定化される。

【００３６】このように生物学的被検物質が吸着、固定
化された採取用具は、次いで検出すべき生物学的被検物
質と特異的に結合しうる標識された物質からなる試薬溶
液と接触させる。

【００３７】生物学的被検物質と特異的に結合する物質
（以下、これを「特異的結合性物質」という）としては
、免疫学的又は化学的に生物学的被検物質と特異的に結
合する抗体、抗原、核酸などが挙げられる。例えば、歯
周病に関していえば、歯周病原性細菌又はその特異抗原
に対する抗体、あるいは歯周病原性細菌の特異抗原など
が挙げられる。

【００３８】これらの特異的結合物質は標識される。標
識用の物質としては、免疫学的測定又は、化学的測定の
分野で屡々使用される各種の標識用物質を使用すること
ができ、例えば、着色物質、着色コロイド粒子、蛍光色
素、放射性同位元素、酵素などが挙げられる。

【００３９】着色物質としては、例えば、無機顔料、有
機顔料などが挙げられる。着色コロイド粒子としては、
例えば、全コロイド粒子などの金属コロイド粒子、着色
されたポリマーラテツクス粒子などのポリマー粒子、着
色したゼラチン粒子などの蛋白系粒子、着色したコロイ
ダルシリカ粒子、着色したコロイダルアルミナ粒子、着
色した多糖粒子などが挙げられ、これら粒子の粒径は一
般に１〜１００ｎｍ　、好ましくは５〜４０ｎｍ　の範
囲内にあることが望ましい。このような金属コロイド粒
子、例えば金コロイド粒子は、通常、塩化金酸（ＨＡｕ
Ｃｌ・２Ｈ２Ｏ）１０ｍｇ　を沸騰超蒸留水１００ｍｌ
に溶かし、調製直後の１％クエン酸３ナトリウム水溶液
を素早く適当量加え、５〜１０分間沸騰すると赤色の透
明な液となり、２〜３分後に緩やかに冷却することによ
り金コロイド粒子を調製することができる。

【００４０】また標識用物質としての蛍光色素としては
、例えばフルオレセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）、
テトラローダミンイソチアネート（ＴＲＩＴＣ）などが
挙げられ、放射性同位元素としては、例えば３Ｈ、１４
Ｃ、３２Ｐ、１２５Ｉなどが包含され、酵素としては、
例えばペルオキシダーゼ、アルカリフオスフアターゼな
どの基質を分解して発色させる酵素が好適である。

【００４１】特に、アルカリフオスフアターゼは、その
基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
フオスフエイト又はｐ−ニトロブル−テトラゾリウムク
ロリドとの組み合わせが挙げられる。これらの基質は無
色透明で水可溶性であるが、酵素の働きにより分解され
、それぞれ固有の色を呈し、水不溶性になり、標識した
物質の存在を知ることができる。

【００４２】このような物質による特異結合性物質の標
識付けの方法には、物理的結合法と化学的結合法とがあ
る。前者は、特異的結合性物質と標識用物質を混合する
だけで物理的に吸着結合させる方法であり、後者は、特
異的結合性物質と標識用物質の各々が有する官能基との
間で直接的に共有結合をするか、又はカルボジイミド、
グルタルアルデヒドなどの二価性試薬を用い、特異的結
合性物質と標識用物質を間接的に共有結合させる方法で
ある。

【００４３】前述した検体と接触させた採取用具を以上
に述べた如き標識された特異結合物質からなる試薬と接
触させ、必要により洗浄して余分の試薬を除去した後、
用いた標識の種類に応じて、目視、デンシトメーター、
比色計、放射線測定装置等により採取用具に結合してい
る標識の量を測定し、そしてさらにその測定結果を必要
に応じて予め作成した標準曲線などと対比することによ
り、検体中の生物学的被検物質の量を定性的又は定量的
に検出することができる。

【００４４】以上に述べた測定系で使用される本発明の
採取用具と、標識された特異結合性物質からなる試薬と
は、組合わせてキツト化することにより、検体中の生物
学的被検物質の測定用キツトとすることができる。

【００４５】以下、本発明の採取用具を用いる検体中の
生物学的被検物質の測定方法を、歯肉溝液、唾液又は歯
垢処理液等の検体中の歯周病原性細菌もしくはその特異
抗原又はそれらに対する抗体等を検出する場合について
さらに詳細に説明する。

【００４６】（１）　歯周病原性細菌の培養歯周病診断
用キツトを調製するために、まず、歯周病原性細菌であ
るとされている　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、例えば
、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株、Ｐ．　ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ　１０２１株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ　ＡＴＣＣ　３３２７７株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ　ＲＢ２２Ｄ−１株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｉｓ　ＲＢ２４Ｍ−２株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　ＲＢ４６Ｄ−１株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　６
／２６株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　Ｗ　１株、Ｐ
．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　Ｗ　５０株、Ｐ．　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ　Ｗ　８３株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｉｓ　ＨＷ１１Ｄ−５株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　ＨＷ２４Ｄ−１株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　Ｂ
Ｈ１８／１０株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　１９Ａ
４株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　２２Ｂ４株、Ｐ．
　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　２３Ａ４株、Ｐ．　ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ　ＨＧ　３７９株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ　ＨＧ　４０５株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　ＯＭＺ　３１４株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　Ｏ
ＭＺ　３６９株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＯＭＺ
　４０９株、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＬＢ１３Ｄ
−３株；または、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、例えば
、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＡＴＣＣ　２５２６１
株、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａＡＴＣＣ　２５６１１
株、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＯＭＺ　２２７株、
Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＯＭＺ　２４８株、Ｐ．
　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａＯＭＺ　２７７株、Ｐ．　ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄｉａ　ＯＭＺ　３１１株、Ｐ．　ｉｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａ　ＯＭＺ　３２６株、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａ　ＯＭＺ　３２７株、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ
ａ　ＢＨ　１８／２３株、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
　ＢＨ　２０／３０株、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　
Ｈ　１８７株、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　Ｍ　１０
７−７４株；または、　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、例えば、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２２
株、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎ
ｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２４株
、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ
　Ｙ　４株、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍ
ｉｔａｎｓ　ＮＣＴＣ　９７０９株、Ａ．　ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＮＣＴＣ　９７１
０株、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａ
ｎｓ　１株、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍ
ｉｔａｎｓ　１５株、Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ
ｃｏｍｉｔａｎｓ　２７株、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　２９株　、Ａ．　ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　３２株、Ａ．　
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　３９株
、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ
　４２株、Ａ．　　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍ
ｉｔａｎｓ　６７株　、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　７５株、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　８５株；または、　Ｔ
．　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、例えば、Ｔ．　ｄｅｎｔｉｃ
ｏｌａ　ＡＴＣＣ　３５４０５；または、Ｂ．　ｆｏｒ
ｓｙｔｈｕｓ、例えば、　Ｂ．　ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ　
ＡＴＣＣ　４３０３７；または、Ｃ．　ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ、例えば、Ｃ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＡＴＣＣ
　３３６２４；または、Ｆ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、例
えば、Ｆ．　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ＡＴＣＣ　２５５８
６；または、Ｗ．　ｒｅｃｔａ、例えば、Ｗ．　ｒｅｃ
ｔａ　ＡＴＣＣ　３３２３８などを、例えば、ＧＡＭ　
ブイヨン、Ｂｒａｉｎ　−　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉ
ｏｎ　ブロスなどにヘミン、メナジオンを添加した培地
、または、Ｔｏｄｄ　−　Ｈｅｗｉｔｔ　ｂｒｏｔｈ　
に酵母エキスを添加した培地などに接種して、嫌気的条
件下で約３７℃で約２０時間培養した後、これらを集菌
して、生理食塩水にて洗浄し、凍結乾燥菌体にする。こ
のようにして得られる菌体を標識物質に結合させるか、
あるいはその特異抗体を得るための免疫抗原として使用
する。

【００４７】（２）　線毛抗原の調製歯周病原性細菌の
特異抗原に対する抗体を得るために、まず、特異抗原の
調製として、特異的抗原性を持つ線毛を有している歯周
病原性細菌、例えば、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　を
、例えば、ＧＡＭ　ブイヨン、Ｂｒａｉｎ　−　Ｈｅａ
ｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ブロスなどにヘミン、メナジ
オンを添加した培地に接種して、嫌気的条件下で約３７
℃で培養すれば、約２０時間またはそれ以後に多数の菌
体が得られる。これを集菌して、ピペツテイングにより
物理的に線毛を剥離する。次に、線毛を硫安分画、イオ
ン交換クロマトグラフイーを経て精製すれば、Ｐ．ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原が得られる。このように
して得られる線毛抗原を標識物質に結合させるか、ある
いはその特異抗体を得るための免疫原として使用する。

【００４８】（３）　多糖抗原の調製歯周病原性細菌、
例えば、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ　を、例えば、Ｔｏｄｄ　−　ＨｅＷｉｔｔ　ｂ
ｒｏｔｈ　に酵母エキスを添加した培地に接種して、嫌
気的条件下で約３７℃で培養すれば約２０時間、または
、それ以後に多数の菌体が得られる。これを集菌して、
凍結乾燥菌体にする。得られた凍結乾燥菌体を生理食塩
水に懸濁した後、オートクレイブにかけ熱抽出し、その
抽出液を例えば、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル
濾過クロマトグラフイーなどで分離、精製して、Ａ．　
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖
抗原を得ることができる。このようにして得られる多糖
抗原を標識物質に結合させるか、あるいはその特異抗体
を得るための免疫原として使用する。

【００４９】（４）　抗体の調製上記のごとくして得ら
れる歯周病原性細菌の凍結乾燥菌体を、種々の動物に免
疫する。例えば、この歯周病原性細菌の凍結乾燥菌体を
フロイントの完全アジユバントと共にウサギ、ヤギなど
の動物の皮下または筋肉内に注射して免疫した後、これ
らの動物の血液からそれ自体既知の方法に従つて歯周病
原性細菌に対する抗血清を得ることができる。更に、必
要に応じて、得られる抗血清を常法に従い硫安分画、イ
オン交換クロマトグラフイーで精製する。

【００５０】一方、上記のごとくして得られる歯周病原
性細菌の凍結乾燥菌体をマウスに免疫し、この脾細胞を
取り出し、マウス骨髄腫瘍細胞とポリエチレングリコー
ル等を用いて細胞融合させ、クローニングした後、歯周
病原性細菌に特異的に反応するモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを選択する。これらのハイブリド
ーマをあらかじめプリスタン処置しておいたマウスの腹
腔内に移植し、その腹水よりモノクローナル抗体を得る
か、またはハイブリドーマを無血清培地で大量培養し、
その培養上清中よりモノクローナル抗体を得ることがで
きる。更に、得られるモノクローナル抗体を常法に従い
、硫安分画、イオン交換クロマトグラフイーで精製する
。

【００５１】また、上記のごとくして得られる　Ｐ．　
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原又は　Ａ．　ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原を
動物に免疫する。例えば、これらの特異抗原をフロイン
トの完全アジユバントと共にウサギ、ヤギなどの動物の
皮下又は筋肉内に注射して免疫した後、これらの動物の
血液からそれ自体既知の方法に従つてＰ．　ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓ　の線毛抗原又は　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原に対する抗血
清を得ることができる。更に、必要に応じて、得られる
抗血清を常法に従い硫安分画、イオン交換クロマトグラ
フイーで精製する。

【００５２】一方、上記のごとくして得られる　Ｐ．　
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原又は　Ａ．　ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原を
マウスに免疫し、この脾細胞を取り出し、マウス骨髄腫
瘍細胞とポリエチレングリコール等を用いて細胞融合さ
せ、クローニングした後、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　の線毛抗原又は　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ
ｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原に特異的に反応するモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択する。 これらのハイブリドーマをあらかじめプリスタン処置し
ておいたマウスの腹腔内に移植し、その腹水よりモノク
ローナル抗体を得るか又はハイブリドーマを無血清培地
で大量培養し、その培養上清中よりモノクローナル抗体
を得ることができる。更に、得られたモノクローナル抗
体を常法に従い硫安分画、イオン交換クロマトグラフイ
ーで精製する。

【００５３】（５）　着色コロイド粒子による抗体の標
識上記のごとくして得られる歯周病原性細菌の全菌体又
はその特異抗原、例えば、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　の線毛抗原、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏ
ｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原などに対する抗血清又はモノ
クローナル抗体に着色コロイド粒子を結合させる。その
ためにはそれ自体既知の方法を用いることができる。

【００５４】一般的には、着色コロイド粒子を　ｐＨ　
７〜９の炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液
又はグリシン緩衝液などに浮遊させ、そこに前記抗体を
加え、室温ないし約３７℃で１５分〜９０分間撹拌し、
着色コロイド粒子で抗体を標識する。次に、着色コロイ
ド粒子で標識した抗体を安定化、保護するために、ウシ
血清アルブミン、ポリエチレングリコール、シヨ糖、塩
化コリンなどを加え、更に、室温ないし約３７℃で１５
分〜９０分間撹拌する。このようにして抗体を着色コロ
イド粒子で標識することができる。これを以下着色コロ
イド標識抗体溶液という。

【００５５】（５′）　酵素による抗体の標識上記のご
とくして得られる歯周病原性細菌の全菌体又はその特異
抗原、例えば、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗
原、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎ
ｓ　の多糖抗原などに対する抗血清又はモノクローナル
抗体に酵素を結合させる。そのためには、それ自体既知
の方法を用いることができる。

【００５６】一般的には、抗体を２０ｍｇ／ｍｌ　にな
るように０．１　Ｍ　リン酸緩衝生理食塩水に溶解する
。この抗体溶液２ｍｌ　に、標識用物質としての酵素、
例えば、アルカリフオスフアターゼ４０ｍｇ　を加えて
よく溶解する。静かに撹拌しながら、１％グルタルアル
デヒド０．１ｍｌ　を滴下する。室温で２時間反応させ
、ゲル濾過により、未結合の抗体及びアルカリフオスフ
アターゼから、アルカリフオスフアターゼ標識抗体を分
離・精製する。このようにして、抗体をアルカリフオス
フアターゼで標識することができる。これを以下、アル
カリフオスフアターゼ標識抗体溶液という。

【００５７】（６）　着色コロイド標識抗体による抗原
の検出歯周病患者の歯肉溝液、唾液又は歯垢処理液を本
発明の採取用具と接触させて、採取用具に検体を採取す
る。次に、この採取用具の生物学的被検物質採取部分を
前述の着色コロイド標識抗体溶液に浸漬し、室温ないし
約３７℃で静置又は撹拌しながら５〜１５分間反応させ
る。しかる後採取用具を取り出して、蒸留水で洗浄した
後に、肉眼又はデンシトメーターなどの測定機器を用い
て判定することができる。歯周病患者の検体が付着して
いたところが着色コロイド粒子の色に染まつていたら、
陽性であると判定する。この時、その色の程度は歯周病
原性細菌の存否並びに多寡と相関しているので菌体の数
を定量することもできる。

【００５８】更に、着色コロイド粒子が金コロイド粒子
の場合、銀染色により感度を増すことができる。

【００５９】（６′）　アルカリフオスフアターゼ標識
抗体による抗原の検出歯周病患者の歯肉溝液、唾液又は
歯垢処理液を本発明の採取用具と接触させて、採取用具
に検体を採取する。次に、この採取用具の生物学的被検
物質採取部分を前述のアルカリフオスフアターゼ標識抗
体溶液に浸漬し、室温ないし約３７℃で、静置又は撹拌
しながら５〜１０分間反応させる。次に　Ｔｗｅｅｎ　
２０を含むリン酸緩衝生理食塩水でよく洗浄した後、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフオスフエイト
を含む基質溶液へ浸漬し、室温ないし約３７℃で、静置
又は撹拌しながら５〜１０分間反応させる。しかる後、
採取用具を取り出して、蒸留水で洗浄した後に、肉眼又
はデンシトメーターなどの測定機器を用いて判定するこ
とができる。歯周病患者の検体が付着していたところが
青色に染まつていたら、陽性であると判定する。この時
、その色の程度は歯周病原性細菌の存否並びに多寡と相
関しているので菌体の数を定量することもできる。

【００６０】（７）　着色コロイド粒子による抗原の標
識上記のごとくして得られる歯周病原性細菌の特異抗原
、例えば、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原、
Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　
の多糖抗原などに着色コロイド粒子を結合させるには、
それ自体既知の方法を用いることができる。

【００６１】一般的には、着色コロイド粒子を　ｐＨ　
７〜９の炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液
又はグリシン緩衝液などに浮遊させ、そこに前記抗原を
加え、室温ないし約３７℃で１５分〜９０分間撹拌し、
着色コロイド粒子で抗原を標識する。次に、着色コロイ
ド粒子で標識した抗原を安定化、保護するために、ウシ
血清アルブミン、ポリエチレングリコール、シヨ糖、塩
化コリンなどを加え、更に、室温ないし約３７℃で１５
分〜９０分間撹拌する。このようにして抗原を着色コロ
イド粒子で標識することができる。これを以下着色コロ
イド標識抗原溶液という。

【００６２】（７′）　酵素による抗原の標識上記のご
とくして得られる歯周病原性細菌の特異抗原、例えば、
Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原、Ａ．　ａｃ
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原
などに酵素を結合させるには、それ自体既知の方法を用
いることができる。

【００６３】一般的には、抗原を２０ｍｇ／ｍｌ　にな
るように０．１　Ｍ　リン酸緩衝生理食塩水に溶解する
。この抗原溶液２ｍｌ　に、標識用物質としての酵素、
例えば、アルカリフオスフアターゼ４０ｍｇ　を加えて
よく溶解する。静かに撹拌しながら、１％グルタルアル
デヒド０．１ｍｌ　を滴下する。室温で２時間反応させ
、ゲル濾過により、未結合の抗原及びアルカリフオスフ
アターゼから、アルカリフオスフアターゼ標識抗原を分
離・精製する。このようにして、抗原をアルカリフオス
フアターゼで標識することができる。これを以下、アル
カリフオスフアターゼ標識抗原溶液という。

【００６４】（８）　着色コロイド標識抗原による抗体
の検出歯周病患者の歯肉溝液、唾液又は歯垢処理液を本
発明の採取用具と接触させて、採取用具に検体を採取す
る。次に、この採取用具の生物学的被検物質採取部分を
前述の着色コロイド標識抗原溶液に浸漬し、室温ないし
約３７℃で静置又は撹拌しながら５〜１０分間反応させ
る。しかる後採取用具を取り出して、蒸留水で洗浄した
後に、肉眼又はデンシトメーターなどの測定機器を用い
て判定することができる。歯周病患者の検体が付着して
いたところが着色コロイド粒子の色に染まつていたら、
陽性であると判定する。この時、その色の程度は歯周病
原性細菌に対する抗体の有無並びに多寡と相関している
ので、菌周病原性細菌に対する抗体価を定量することも
できる。

【００６５】更に、着色コロイド粒子が金コロイド粒子
の場合、銀染色により感度を増すことができる。

【００６６】（８′）　アルカリフオスフアターゼ標識
抗体による抗体の検出歯周病患者の歯肉溝液、唾液又は
歯垢処理液を本発明の採取用具と接触させて、採取用具
に検体を採取する。次に、この採取用具の生物学的被検
物質採取部分を前述のアルカリフオスフアターゼ標識抗
原溶液に浸漬し、室温ないし約３７℃で、静置又は撹拌
しながら５〜１０分間反応させる。次に　Ｔｗｅｅｎ　
２０を含むリン酸緩衝生理食塩水でよく洗浄した後、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフオスフエイト
を含む基質溶液へ浸漬し、室温ないし約３７℃で、静置
又は撹拌しながら５〜１０分間反応させる。しかる後、
採取用具を取り出して、蒸留水で洗浄した後に、肉眼又
はデンシトメーターなどの測定機器を用いて判定するこ
とができる。歯周病患者の検体が付着していたところが
青色に染まつていたら、陽性であると判定する。この時
、その色の程度は歯周病原性細菌に対する抗体の有無並
びに多寡と相関しているので、歯周病原性細菌に対する
抗体価を定量することもできる。

【００６７】（９）　血液などによる汚れの脱色検体採
取の際に採取用具が血液や膿などによつて汚れた場合に
は、過酸化水素水などの酸化剤で脱色した後に、着色コ
ロイド標識抗体溶液又は着色コロイド標識抗原溶液と反
応させることが好ましい。

【００６８】以上に述べた本発明によれば、歯周病の患
者の歯周病巣部における歯周病原性細菌の存否並びに多
寡又は歯周病の患者の歯周病巣部における歯周病原性細
菌に対する特異抗体の有無並びに多寡を、極めて簡単な
操作で迅速に検出可能であり、短時間内に本疾患を診断
しまた病態の程度を把握できる。しかも、歯周病原性細
菌の存否並びに多寡と、歯周病原性細菌に対する特異抗
体の有無並びに多寡を組み合わせて調べることにより、
歯周病の病態の様々な段階や治癒の状態を時間を追つて
知ることができ、治療や再発防止に役立てることが可能
となる。

【００６９】次に、本発明を調製例、試験例及び実施例
によつて更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限
定されるものではない。

【００７０】

【実施例】調製例１ 歯周病原性細菌の凍結乾燥菌体の調製 Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　と　Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍ
ｅｄｉａ　を、ヘミン（５ｍｇ／ｌ）及びメナジオン（
１ｍｇ／ｌ）添加　ＧＡＭ　ブイヨン培地（日水製薬）
に接種し、３７℃、８０％　Ｎ２、１０％　Ｈ２、１０
％　ＣＯ２という嫌気的条件下で大量培養後、遠心分離
により集菌した。また、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　は、Ｔｏｄｄ　−　Ｈｅｗｉｔ
ｔ　ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）に１％酵母エキスを添加した培地で、３７℃、５％
　ＣＯ２という嫌気的条件下で大量培養後、遠心分離に
より集菌した。これらの菌体を生理食塩水にて洗浄した
後、減圧下凍結乾燥した。

【００７１】調製例２Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３
８１株、及び、ＨＷ２４Ｄ−１株からの線毛抗原の調製
Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株、及び、ＨＷ２
４Ｄ−１株を、ヘミン（５ｍｇ／ｌ）及びメナジオン（
１ｍｇ／ｌ）添加　ＧＡＭ　ブイヨン培地（日水製薬）
に接種し、３７℃、８０％　Ｎ２、１０％　Ｈ２、１０
％　ＣＯ２という嫌気的条件下で大量培養後、遠心分離
により集菌した。その菌体を２０　ｍＭ　トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ　７．４）＋０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　＋　１
０ｍＭ　ＭｇＣｌ２に懸濁し、ピペツテイング後、マグ
ネテイツクスターラーで撹拌して、物理的に線毛を剥離
した。

【００７２】遠心分離により菌体を除去し、その上清を
４０％飽和硫安分画し、得られた沈渣を２０ｍＭ　トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ　８．０）に溶解後、透析により脱
塩した。

【００７３】次に、ＤＥＡＥ　−　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグ
ラフイーにより、ＮａＣｌ　の濃度勾配をかけ、０．１
５　Ｍ　　ＮａＣｌ　で溶出してくる画分を線毛抗原と
した。

【００７４】更に、これを　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　
−　５００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゲル濾過ク
ロマトグラフイーにかけ、単一ピークであることを確認
した。

【００７５】調製例３Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４
株、及び、ＮＣＴＣ　９７１０株からの多糖抗原の調製 Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　
ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株、及び、ＮＣＴＣ　
９７１０株を　Ｔｏｄｄ　−　Ｈｅｗｉｔｔ　ｂｒｏｔ
ｈ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に１％酵
母エキスを添加した培地に接種して、３７℃、５％　Ｃ
Ｏ２という嫌気的条件下で大量培養後、遠心分離により
集菌した。得られた菌体を凍結乾燥し、生理食塩水に懸
濁した後、オートクレイブにかけ、熱抽出し、抽出液を
、例えば、ＤＥＡＥ　−　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグ
ラフイーで分画し、その素通り画分をさらに　Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ　Ｓ　−　２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
用いたゲル濾過クロマトグラフイーで精製し、多糖画分
を分取した。

【００７６】調製例４ 歯周病原性細菌　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．　
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　と　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の全菌体、Ｐ．　ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛
抗原、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａ
ｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴ
Ｃ　９７１０株の多糖抗原に対する精製抗血清の調製調
製例１の菌周病原性細菌　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　と　Ａ．　ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の凍結乾燥菌体、
調製例２の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及
び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原、調製例３の　Ａ．　
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣ
Ｃ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴＣ　９７１０
株の多糖抗原の各１ｍｇ　をウサギ１匹当たり１ｍｌ　
のフロイントの完全アジユバントと共に油中水滴型乳剤
として、皮下に３週間おきに合計３回注射して免疫し、
最終追加免疫から７日目に全採血し、常法通り抗血清を
分離した。得られた抗血清の全量の　１／２　容の飽和
硫安を４℃で撹拌しながら加えて、硫安分画（　１／３
　飽和）を行う。遠心分離により、得られた沈渣に　１
／３　飽和硫安を加え撹拌した。この操作を２〜３回繰
り返し、最終的に得られた沈渣をリン酸緩衝液に溶解し
、リン酸緩衝液で透析し脱塩した。次に、ＤＥＡＥ　−
　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ａ　−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を用いたイオン交換クロマトグラフイーで、ＮａＣ
ｌの濃度勾配をかけ、０．０１５　Ｍ　ＮａＣｌ　で溶
出してくる画分を回収し、同様にして　１／３　飽和硫
安分画を行い、歯周病原性細菌の全菌体、Ｐ．　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ　３８１株の線毛抗原、Ａ．　ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　Ｙ　４株の多糖
抗原に対する精製抗血清を得た。

【００７７】調製例５ 歯周病原性細菌　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．　
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　と　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の全菌体、Ｐ．　ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛
抗原、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａ
ｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴ
Ｃ　９７１０株の多糖抗原に対するモノクローナル抗体
の調製調製例１の歯周病原性細菌　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　と　Ａ．　ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の凍結乾
燥菌体、調製例２の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３
８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原、調製例３の
　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ
　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴＣ　
９７１０株の多糖抗原の各１００μｇ　をマウス１匹当
たり０．１ｍｌ　のフロイントの完全アジユバントと共
に油中水滴型乳剤として、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）の
皮下に３週間おきに合計３回注射して免疫し、最終追加
免疫から３日目に　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）から脾細
胞を採取し、Ｅａｇｌｅ′ｓ　ＭＥＭ　で３回洗浄した
。

【００７８】一方、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のミエロー
マ細胞（ＳＰ　２／０）を　Ｅａｇｌｅ′ｓ　ＭＥＭ　
で３回洗浄した。ミエローマ細胞と脾細胞を　Ｅａｇｌ
ｅ′ｓ　ＭＥＭ　中で、１：１０に混合し、１，２００
ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．遠心分離後、上清を除去し沈渣を
よくほぐして、０．５ｍｌ　のポリエチレングリコール
（０．５ｍｌ）＋　Ｅａｇｌｅ′ｓ　ＭＥＭ（０．５ｍ
ｌ）＋ＤＭＳＯ（０．３５ｍｌ）の混合溶液を３７℃下
で沈渣に静かに滴下しながら１分間混合した。

【００７９】次に、Ｅａｇｌｅ′ｓ　ＭＥＭ　１０ｍｌ
　を少しずつ加え、１，２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．遠
心分離し、上清を除去し、その沈渣に１０％ウシ胎児血
清を含む　ＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、５×１０５
　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　位になるように浮遊させ、９６穴
マイクロタイタープレートに１００μｌ　ずつ分注した
。その後、ＨＡＴ　培地、ＨＴ　培地によりハイブリド
ーマを選択し、１５日目頃に調製例１の歯周病原性細菌
　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａ　と　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍ
ｉｔａｎｓ　の凍結乾燥菌体、調製例２のＰ．　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線
毛抗原、調製例３の　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４
株及び　ＮＣＴＣ　９７１０株の多糖抗原をコーテイン
グした９６穴マイクロタイタープレートを用いて、ＥＬ
ＩＳＡ　法により歯周病原性細菌の全菌体、Ｐ．　ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の
線毛抗原、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉ
ｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　Ｎ
ＣＴＣ　９７１０株の多糖抗原に対する抗体産生ハイブ
リドーマをスクリーニングした。

【００８０】スクリーニングしたハイブリドーマは限界
稀釈法によりクローニングした。限界稀釈法は、１０％
ウシ胎児血清を含む　ＲＰＭＩ−１６４０培地に、ハイ
ブリドーマ５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＢＡＬＢ／ｃマウス胸
腺細胞５×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　になるように加
え、９６穴マイクロタイタープレートに０．２ｍｌ　ず
つ分注し、調製例１の歯周病原性細菌　Ｐ　．ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ、Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　と　Ａ．
　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の凍
結乾燥菌体、調製例２の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原、調製例
３の　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａ
ｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴ
Ｃ９７１０株の多糖抗原に反応するモノクローナル抗体
を分泌するコロニーを選び出した。この操作を２回繰り
返しクローニングを終了した。

【００８１】次いで、あらかじめプリスタン処置された
　ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にハイブリドーマを移植
し、その腹水中で増殖させて抗体を採取するか、又は、
ハイブリドーマを無血清培地にて培養し、その培養上清
から抗体を採取することにより目的のモノクローナル抗
体を調製した。

【００８２】得られたモノクローナル抗体を　１／３　
飽和硫安分画を行い、ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグ
ラフイーならびにゲルロ過クロマトグラフイー又はプロ
テインＡカラムで精製した。

【００８３】実施例１ 生物学的被検物質採取用具の作成市販の紙製コヨリ（ペ
ーパーポイント）、例えば、ＺＩＰＰＥＲＥＲ　社製の
　Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ　Ｐａｐｅｒ　Ｐｏｉｎｔｓ（長
さ３０ｍｍ；Ｓｉｚｅ　１５、２５、３５、４５）の先
端から約２０ｍｍ　をニトロセルロース又はセルロース
アセテートの水−有機溶剤混合溶媒溶液に浸漬した後、
溶剤を乾燥除去して、その表面に多孔性フイルムをコー
トした。これらは、１０ミクロン以下の孔径の孔を有す
る。更に、先端部分約２ｍｍ　程はそのまま残し、それ
以外のフイルム表面をアセトン処理してその孔をふさぐ
ことにより、その部分を防水性（非透水性）とした。こ
れにより第１図に示す如き採取用具を作成した。

【００８４】実施例２ 金コロイド標識抗体溶液の調製Ｅ．Ｙ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，　Ｉｎｃ．の金コロイド粒子（Ｇ−２０：粒径
２０ｎｍ）１ｍｌ　に、０．０７　Ｍ　炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ　９．０）を１１１μｌ　加えた。一方、調製例４で
得た各抗血清又は調製例５で得た各モノクローナル抗体
の２０μｇ／ｍｌ　の抗体溶液５００μｌ　に０．０７
Ｍ　炭酸緩衝液（ｐＨ　９．０）を５６μｌ　加えた。 そして、両者を混合し、室温で１５分間撹拌した。

【００８５】次に、ウシ血清アルブミンを１０％、ポリ
エチレングリコールを１％含有する０．００７　Ｍ　炭
酸緩衝液（ｐＨ　９．０）を１８５μｌ　添加し、室温
で１５分間撹拌して、金コロイド標識抗体溶液を得た。

【００８６】試験例１ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　での歯周病原
性細菌の検出１）　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の検
出Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ２
４Ｄ−１株を、ヘミン（５ｍｇ／ｌ　）及びメナジオン
（１ｍｇ／ｌ　）添加　ＧＡＭ　ブイヨン培地（日水製
薬）で、３７℃、８０％　Ｎ２、１０％　Ｈ２、１０％
　ＣＯ２という嫌気的条件下で大量培養後、遠心分離に
より集菌した。この菌体をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁
し、５５０ｎｍ　における吸光度を０．５に合わせ、こ
の菌体浮遊液の菌体濃度をＰＥＴＲＯＦＦ　−　ＨＡＵ
ＳＳＥＲ　ａｎｄ　ＨＥＬＢＥＲＣｏｕｎｔｉｎｇ　ｃ
ｈａｍｂｅｒ（Ｈａｕｓｓｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
　Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ　Ｈｏｒｓｈａｍ　社製）を
用いて求めた。このようにして得られた菌体浮遊液を稀
釈していき、その各稀釈液の２μｌ　を実施例１で作成
した生物学的被検物質採取用具に吸着させた。そこで、
実施例２で得られた金コロイド粒子で標識した　Ｐ．　
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１
株の線毛抗原に対するモノクローナル抗体溶液に浸漬し
、反応させた。 反応終了後、金コロイド粒子の着色が認められる菌体数
を求めた。その結果を表１に示すが、金コロイド粒子で
標識した　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び
　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原に対するモノクローナル
抗体溶液で検出できる　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　
３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の菌体数は２×１０５
個及び１．０×１０５個であつた。

【００８７】

【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表１：Ｐ．　
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の検出　　　　　　　　　　　
　　　──────────────────────
　　　　　　　　　　　　　　　　菌体数（個／テスト
）　　　　　　　　判定　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　───
────────　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３８１　株
　　ＨＷ２４Ｄ−１　株　　　　　　　　　　　　　　
──────────────────────　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２×１０７　
　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　＋＋＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６．４×１０６　
　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　＋＋＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３．２×１０６　
　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　＋＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６×１０６　
　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　＋＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　８．０×１０５　
　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　＋＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０×１０５　
　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０×１０５　
　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０×１０５　
　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０×１０４　
　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　──────────────
────────２）　Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　
の検出　　Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＡＴＣＣ　２
５６１１株を、ヘミン（５ｍｇ／ｌ）及びメナジオン（
１ｍｇ／ｌ）添加　ＧＡＭ　ブイヨン培地（日水製薬）
で、３７℃、８０％　Ｎ２、１０％　Ｈ　　　　　　　
　　　　　　　──────────────────
────２、１０％　ＣＯ２という嫌気的条件下で大量
培養後、遠心分離により集菌した。この菌体をリン酸緩
衝生理食塩水に懸濁し、５５０ｎｍ　における吸光度を
０．５に合わせ、この菌体浮遊液の菌体濃度を　ＰＥＴ
ＲＯＦＦ　−　ＨＡＵＳＳＥＲ　ａｎｄ　ＨＥＬＢＥＲ
　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ，ｃｈａｍｂｅｒ（Ｈａｕｓｓｅｒ
　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ　Ｈ
ｏｒｓｈａｍ　社製）を用いて求めた。このようにして
得られた菌体浮遊液を稀釈していき、その各稀釈液の２
μｌを実施例１で作成した生物学的被検物質採取用具に
吸着させた。そこで、実施例２で得られた金コロイド粒
子で標識した　Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＡＴＣＣ
　２５６１１株の全菌体に対するモノクローナル抗体溶
液に浸漬し、反応させた。反応終了後、金コロイド粒子
の着色が認められる菌体数を求めた。その結果を表２に
示すが、金コロイド粒子で標識した　Ｐ．　ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａ　ＡＴＣＣ　２５６１１株の全菌体に対する
モノクローナル抗体溶液で検出できる　Ｐ．　ｉｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａ　ＡＴＣＣ　２５６１１株の菌体数は２×
１０５個であつた。

【００８８】

【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表２
：Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　の検出　　　　　　　
　　　　　　　　　　　──────────────
──────　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
菌体数（個／テスト）　　　　　　　　　　判定　　　
　　　　　　　　　　　　　　　──────────
──────────　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．２×１０７　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　６．４×１０６　　　　　　　
　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３．２×１０６　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１．６×１０６　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　８．０×１０５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０×１０
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０×
１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．
０×１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−　　　　　　　　　　　　　　　　　　──────
──────────────３）　Ａ．　ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の検出　　Ａ．　
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣ
Ｃ　２９５２３株、Ｙ　４株、及び、ＮＣＴＣ　９７１
０株は、Ｔｏｄｄ　−　Ｈｅｗｉｔｔ　ｂｒｏｔｈ（Ｄ
ｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に１％酵母エキ
スを添加　　　　　　　　　　　　　　　　　　───
────────────────した培地で、３７℃
、５％　ＣＯ２という嫌気的条件下で大量培養後、遠心
分離により集菌した。この菌体をリン酸緩衝生理食塩水
に懸濁し、５５０ｎｍ　における吸光度を０．５に合わ
せ、この菌体浮遊液の菌体濃度をＰＥＴＲＯＦＦ　−　
ＨＡＵＳＳＥＲ　ａｎｄＨＥＬＢＥＲ　Ｃｏｕｎｔｉｎ
ｇ　ｃｈａｍｂｅｒ（Ｈａｕｓｓｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ　Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ　Ｈｏｒｓｈａｍ　社
製）を用いて求めた。 このようにして得られた菌体浮遊液を稀釈していき、そ
の各稀釈液の２μｌ　を実施例１で作成した生物学的被
検物質採取用具に吸着させた。そこで、実施例２で得ら
れた金コロイド粒子で標識した　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓＡＴＣＣ　２９５２３株
、Ｙ　４株及び　ＮＣＴＣ　９７１０株の多糖抗原に対
するモノクローナル抗体溶液に浸漬し、反応させた。反
応終了後、金コロイド粒子の着色が認められる菌体数を
求めた。その結果を表３に示すが、金コロイド粒子で標
識したＡ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａ
ｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴ
Ｃ　９７１０株の多糖抗原に対するモノクローナル抗体
溶液で検出できる　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ
ｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株・Ｙ　４株
及び　ＮＣＴＣ　９７１０株の菌体数はいずれも２×１
０５個であつた。

【００８９】

【表３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　表３：Ａ．　ａｃ
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の検出　　
　　　　─────────────────────
──────────　　　　　　　　菌体数（個／テ
スト）　　　　　　　　　　　　　　　　　判定　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　──
───────────────────　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ　２９５２３　株　　　Ｙ　４　株　　　ＮＣＴＣ　
９７１０　株　　　　　　─────────────
──────────────────　　　　　　　
　　　　　　１．２×１０７　　　　　　　　　　　　
＋＋＋　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　＋＋
＋　　　　　　　　　　　　　６．４×１０６　　　　
　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　＋＋＋　　
　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　　　　３．２
×１０６　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　
　　　　＋＋　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　
　　　　　１．６×１０６　　　　　　　　　　　　　
＋＋　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　＋＋
　　　　　　　　　　　　　８．０×１０５　　　　　
　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　＋＋　　　
　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　　４．０×
１０５　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　
　　　　＋　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　　　２．０×１０５　　　　　　　　　　　　　　
＋　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　＋　
　　　　　　　　　　　　１．０×１０５　　　　　　
　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　−　　　　
　　　　　　−　　　　　　────────────
───────────────────実施例３ 　　金コロイド標識抗原溶液の調製 　　Ｅ．Ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｉｎｃ．の金コ
ロイド粒子（Ｇ−２０：粒径２０ｎｍ）１ｍｌ　に０．
　　　　　　───────────────────
────────────０７　Ｍ　炭酸緩衝液（ｐＨ
　９．０）を１１１μｌ　加えた。 一方、調製例２で得た線毛抗原又は調製例３で得た多糖
抗原各２０μｇ／ｍｌ　の抗原溶液５００μｌ　に０．
０７　Ｍ　炭酸緩衝液（ｐＨ　９．０）を５６μｌ　加
えた。そして、両者を混合し、室温で１５分間撹拌した
。

【００９０】次に、ウシ血清アルブミンを１０％及びポ
リエチレングリコールを１％含有する０．００７　Ｍ　
炭酸緩衝液（ｐＨ　９．０）を１８５μｌ　添加し、室
温で１５分間撹拌して、金コロイド標識抗原溶液を得た
。

【００９１】試験例２ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　での歯周病原
性細菌に対する特異抗体の検出１）　Ｐ．　ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓ　に対する抗体の検出調製例４で得られた　
Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ２４
Ｄ−１株の線毛抗原に対する抗血清の各稀釈液の２μｌ
　を、実施例１で作成した生物学的被検物質採取用具に
吸着させた。そこで、実施例３で得られた金コロイド粒
子で標識した　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株
及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原溶液に浸漬し、反応
させた。反応終了後、金コロイド粒子の着色が認められ
る抗体の稀釈率を求めた。その結果を表４に示すが、金
コロイド粒子で標識した　　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ　３８１株及び　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原溶液で
検出できるＰ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び
　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原に対する抗体の稀釈率は
血清レベルの　１／１０００　であつた。

【００９２】

【表４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　表４：Ｐ．　ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ　に対する抗体の検出　　　　　　
　　　　　　　　─────────────────
───────　　　　　　　　　　　　　　　抗血清
の稀釈率　　　　　　　　　　　　　判定　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　───────────────　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
８１　株　　　　ＨＷ２４Ｄ−１株　　　　　　　　　
　　　　　────────────────────
────　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／
１０　　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　
　＋＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／
１００　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　
　　＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／
１０００　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１／
１００００　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　───────
─────────────────２）　　Ａ．　ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　に対する
抗体の検出調製例４で得られた　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３
株、Ｙ　４株、及び、ＮＣＴＣ　９７１０株の多糖抗原
に対する抗血清の各稀釈液の２μｌ　を、実施例１で作
成した生物学的被検物質採取用具に吸着させた。そこで
、実施例３で得られた金コロイド粒子で標識した　Ａ．
　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴ
ＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴＣ　９７１
０株の多糖抗原溶液に浸漬し、反応させた。反応終了後
、金コロイド粒子の着色が認められる抗体の稀釈率を求
めた。その結果を表５に示すが、金コロイド粒子で標識
した　　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣ
ＴＣ　９７１０株の多糖抗原溶液で検出できる　Ａ．　
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣ
Ｃ　２９５２３株、Ｙ　４株及びＮＣＴＣ　９７１０株
の多糖抗原に対する抗体の稀釈率は血清ラベルの１／１
０００であつた。

【００９３】

【表５】 　　　　　　　　　　　　表５：Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　に対する抗体の検出　
　　　　　────────────────────
───────────　　　　　　　　抗血清の稀釈
率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　判定　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　───
───────────────────　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ　
２９５２３　株　　　　Ｙ　４株　　　　ＮＣＴＣ　９
７１０　株　　　　　　──────────────
─────────────────　　　　　　　　
　　　　１／１０　　　　　　　　　　　　　　＋＋＋
　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　＋
＋＋　　　　　　　　　　　　１／１００　　　　　　
　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　＋＋　
　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　１
／１０００　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　
　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　　　１／１００００　　　　　　　　　
　　　　−　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　
　　　　　　−　　　　　　────────────
───────────────────実施例４ 　　金コロイド標識抗体による成人性歯周炎患者菌肉溝
液中の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の　　　　　　
─────────────────────────
──────検出健常者３名と成人性歯周炎患者６名の
歯肉溝液を、実施例１で作成した生物学的被検物質採取
用具で採取し、まず、実施例２で得た金コロイド粒子で
標識したＰ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株の線毛
抗原に対するモノクローナル抗体溶液に浸漬し、室温で
５〜１５分間反応させた後、採取用具を取り出し、蒸留
水で洗浄した。そこで、採取用具の歯肉溝液が吸着した
部分が、金コロイド粒子の色である赤紫色に染まつた場
合を陽性、染まらなかつた場合を陰性と判定した。次に
、同様にして、実施例２で得た金コロイド粒子で標識し
たＰ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＨＷ２４Ｄ−１株の線
毛抗原に対するモノクローナル抗体溶液と反応させ、判
定した。

【００９４】また、同時に、健常者３名と成人性歯周炎
患者６名の歯肉溝液中の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　の同定を下記のようにして行つた。

【００９５】即ち、市販の紙製コヨリ（ペーパーポイン
ト）に吸収させた歯肉溝液を輸送培地（ＲＴＦ：Ｒｅｄ
ｕｃｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆｌｕｉｄ）に懸濁して
回収し、ウサギ脱繊血、ヘミン及びメナジオンを含む　
ＣＤＣ　培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ　開発）に播種し、嫌気条件下で数日間培養し
た。生育の見られたコロニーのうち、黒色化したコロニ
ーを選び、これを分離し、純培養後、Ｒａｐ　ＩＤ　Ａ
ＮＡ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｃＤＯＮＮＥＬＬ　ＤＯＵＧＬ
ＡＳ社製）により、同定試験を行つた。更に、Ｐ．　ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ　と同定されたものの培養上清をガ
スクロマトグラフイーにかけ、フエニル酢酸の産生を調
べることにより、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　である
ことの再認識を行つた。

【００９６】以下にその結果を示す。表６に示すように
、健常者（３名）の歯肉溝液では、金コロイド粒子によ
る着色は認めず、すべて陰性の結果を示した。また、歯
肉溝液中に存在する細菌の同定試験では　Ｐ．　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ　は認められなかつた。一方、成人性歯
周病患者（６名）の歯肉溝液では、６名中４名に金コロ
イド粒子で標識した　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３
８１株の線毛抗原に対するモノクローナル抗体溶液との
反応が見られ、更に、金コロイド粒子で標識した　Ｐ．
　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原
に対するモノクローナル抗体溶液と反応させるとすべて
の成人性歯周炎患者で、金コロイド粒子による着色が認
められ、すべて陽性の結果を示した。また、歯肉溝液中
に存在する細菌の同定試験では、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ　を認めた。

【００９７】

【表６】 　　　　　　　　　　　　　　表６：歯肉溝液中の　Ｐ
．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の検出　　───────
─────────────────────────
─　　　　被検者Ｎｏ．　　　金コロイド標識抗体との
反応　　　　　　培養法による同定　　　　　　　　　
　　　　　────────────────　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３８１　株　　　ＨＷ
２４Ｄ−１　株　　────────────────
─────────────────　　　　健常者　
　１　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　−　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　無　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　
　　　　　　−　　　　　　　　　　　　−　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　無　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３　　　　　　
　　−　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　無　　　　患者　　　　１　
　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　有　　　　　　　
　　　　　２　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　
　＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　有
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　＋＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　有　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　−　
　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　有　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　
＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　有　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　有　　　　　　　　　　　
　　　　　────────────────────
─────────────実施例５　　 　　金コロイド標識抗体による成人性歯周炎患者歯肉溝
液中の　Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　の　　検出 　　───────────────────────
──────────健常者３名と成人性歯周炎患者６
名の歯肉溝液を、実施例１で得た生物学的被検物質採取
用具で採取し、実施例２で得た金コロイド粒子で標識し
た　Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＡＴＣＣ　２５６１１
株の全菌体に対する抗血清溶液に浸漬し、反応させた。 室温で５〜１５分間反応させた後、採取用具を取り出し
、蒸留水で洗浄した。そこで、採取用具の歯肉溝液が吸
着した部分が、金コロイド粒子の色である赤紫色に染ま
つた場合を陽性、染まらなかつた場合を陰性と判定した
。

【００９８】また、同時に、健常者３名と成人性歯周炎
患者６名の歯肉溝液中の　Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
　の同定を実施例４の　Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の
検出と同様にして行つた。

【００９９】即ち、市販の紙製コヨリ（ペーパーポイン
ト）に吸収させた歯肉溝液を輸送培地（ＲＴＦ：Ｒｅｄ
ｕｃｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆｌｕｉｄ）に懸濁して
回収し、ウサギ脱繊血、ヘミン及びメナジオンを含む　
ＣＤＣ　培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ　開発）に播種し、嫌気条件下で数日間培養し
た。生育の見られたコロニーのうち、黒色化したコロニ
ーを選び、これを分離し、純培養後、Ｒａｐ　ＩＤ　Ａ
ＮＡ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｃＤＯＮＮＥＬＬ　ＤＯＵＧＬ
ＡＳ社製）により、同定試験を行つた。

【０１００】以下にその結果を示す。表７に示すように
、健常者（３名）の歯肉溝液では、金コロイド粒子によ
る着色は認めず、すべて陰性の結果を示した。また、歯
肉溝液中に存在する細菌の同定試験では、Ｐ．　ｉｎｔ
ｅｒｍｅｄｉａ　認められなかつた。一方、成人性歯周
病患者（６名）の歯肉溝液では、金コロイド粒子による
着色が認められ、すべて陽性の結果を示した。また、歯
肉溝液中に存在する細菌の同定試験では、Ｐ．　ｉｎｔ
ｅｒｍｅｄｉａ　を認めた。

【０１０１】

【表７】 　　　　　　　　　　　　　　　　表７：歯肉溝液中の
　Ｐ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　の検出　　─────
─────────────────────────
─　　　　被検者Ｎｏ．　　　金コロイド標識抗体との
反応　　　培養法による同定　　──────────
─────────────────────　　　　
健常者　１　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　無　　　　
　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　　−
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　無　
　　　　　　　　　　３　　　　　　　　　　　　　　
　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　無　　　　患　　者　１　　　　　　　　　　　　　
　　＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　有　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　
　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　有　　　　　　　　　　　３　　　　　　　
　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　有　　　　　　　　　　　４　　　　
　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　有　　　　　　　　　　　５　
　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　有　　　　　　　　　　
　６　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　有　　─────
─────────────────────────
─実施例６　　 　　金コロイド標識抗体による限局性若年性歯周炎患者
歯肉溝液中の　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙ　　ｃｅｔｅｍ
ｃｏｍｉｔａｎｓ　の検出　　───────────
────────────────────健常者３名
と限局性若年性歯周炎患者６名の歯肉溝液を、実施例１
で得た生物学的被検物質採取用具で採取し、実施例２で
得た金コロイド粒子で標識した　Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９５２３株
、Ｙ　４株及び　ＮＣＴＣ　９７１０株の多糖抗原に対
するモノクローナル抗体溶液を混合後、浸漬し、反応さ
せた。室温で５〜１５分間反応させた後、採取用具を取
り出し、蒸留水で洗浄した。そこで、採取用具の歯肉溝
液が吸着した部分が、金コロイド粒子の色である赤紫色
に染まつた場合を陽性、染まらなかつた場合を陰性と判
定した。

【０１０２】また、同時に、健常者３名と限局性若年性
歯周炎患者６名の歯肉溝液中の　Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の同定を実施例４の　Ｐ
．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の検出と同様にして行つた
。

【０１０３】即ち、市販の紙製コヨリ（ペーパーポイン
ト）に吸収させた歯肉溝液を輸送培地（ＲＴＦ：Ｒｅｄ
ｕｃｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆｌｕｉｄ）に懸濁して
回収し、ウサギ脱繊血、ヘミン及びメナジオンを含む　
ＣＤＣ　培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ　開発）に播種し、嫌気条件下で数日間培養し
た。生育の見られたコロニーを選び、これを分離し、純
培養後、Ｒａｐ　ＩＤ　ＡＮＡ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｃＤ
ＯＮＮＥＬＬ　ＤＯＵＧＬＡＳ　社製）により、同定試
験を行つた。

【０１０４】以下にその結果を示す。表８に示すように
、健常者（３名）の歯肉溝液では、金コロイド粒子によ
る着色は認めず、すべて陰性の結果を示した。また、歯
肉溝液中に存在する細菌の同定試験では、Ａ．　ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　は認められな
かつた。一方、限局性若年性歯周病患者（６名）の歯肉
溝液では、金コロイド粒子による着色が認められ、すべ
て陽性の結果を示した。 また、歯肉溝液中に存在する細菌の同定試験では、Ａ．
　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　を認
めた。

【０１０５】

【表８】表８：歯肉溝液中の　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の検出 　　　　─────────────────────
───────────　　　　　　被検者Ｎｏ．　　
　金コロイド標識抗体との反応　　　培養法による同定
　　　　─────────────────────
───────────　　　　　　健常者　１　　　
　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　無　　　　　　　　　　　
　　２　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　無　　　　　
　　　　　　　　３　　　　　　　　　　　　　　　　
−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
無　　　　　　患　　者　１　　　　　　　　　　　　
　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　無　　　　　　　　　　　　　２　　　　　　
　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　有　　　　　　　　　　　　　３
　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　有　　　　　　　　
　　　　　４　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　有　　
　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　有　　　　　　　　　　　　　６　　　　　　　
　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　有　　　　───────────
─────────────────────実施例７
　　 　　金コロイド標識線毛抗原による成人性歯周病患者歯
肉溝液中の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　に対する
抗体の検出 　　　　─────────────────────
───────────健常者３名と成人性歯周炎患者
６名の歯肉溝液を、実施例１で得た生物学的被検物質採
取用具で採取し、実施例３で得た金コロイド粒子で標識
した　Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株及び　ＨＷ
２４Ｄ−１株の線毛抗原溶液を混合後、浸漬し、反応さ
せた。室温で５〜１５分間反応させた後、採取用具を取
り出し、蒸留水で洗浄した。そこで、採取用具の歯肉溝
液が吸着した部分が、金コロイド粒子の色である赤紫色
に染まつた場合を陽性、染まらなかつた場合を陰性と判
定した。

【０１０６】また、同時に、健常者３名と成人性歯周炎
患者６名の歯肉溝液中の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　の線毛抗原に対する抗体の検出を　ＥＬＩＳＡ　法を
用いて、下記のようにして行つた。

【０１０７】まず、炭酸緩衝液（ｐＨ　９．０）に溶解
した　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８１株、及び、
ＨＷ２４Ｄ−１株の線毛抗原を、ＥＬＩＳＡ　用プレー
トの各ウエルに１μｇ　ずつ分注し、４℃で一晩放置し
た。翌日、Ｔｗｅｅｎ　２０を含むリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、１０％ヤギ血清を含む　
ＰＢＳＴ　で、室温、１時間放置し、ブロツキングをし
た。次に、市販の紙製コヨリ（ペーパーポイント）にあ
らかじめ採取しておいた歯肉溝液を、ＰＢＳＴ　に溶か
し出して回収したものを加えた。３７℃で１時間反応さ
せた後、アルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトＩｇ　（
Ｇ＋Ｍ＋Ａ）を加え、３７℃で１時間反応させた。次に
、ＰＢＳＴ　でよく洗浄した後に、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈ
ｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ　を含む基質溶液を加え、
３７℃で３０分間反応させた。 そこで、吸光度を測定し、その発色の程度により、被検
体中の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原に対
する抗体の検出をした。

【０１０８】以下にその結果を示す。表９に示すように
、健常者（３名）の歯肉溝液では、金コロイド粒子によ
る着色は認めず、すべて陰性の結果を示した。また、Ｅ
ＬＩＳＡ法による歯肉溝液中に存在する　Ｐ．　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原に対する抗体の検出では、
Ｐ．　　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原に対する抗
体は認められなかつた。一方、成人性歯周炎患者（６名
）の歯肉溝液では、金コロイド粒子による着色が認めら
れ、すべて陽性の結果を示した。また、ＥＬＩＳＡ　法
による歯肉溝液中に存在する　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｉｓ　の線毛抗原に対する抗体の検出では、Ｐ．　ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ　の線毛抗原に対する抗体を認めた。

【０１０９】

【表９】 　　　　　　　　　　表９：歯肉溝液中の　Ｐ．　ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ　に対する抗体の検出　　　　───
─────────────────────────
──　　　　　　被検者Ｎｏ．　　　金コロイド標識線
毛抗原との反応　　　　ＥＬＩＳＡ　法　　　　───
─────────────────────────
──　　　　　　健常者　１　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　−　　　　　　　　　　　　　２　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　３
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　患　
　者　１　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　
　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＋　　　　　　　　　　　　　３　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　４　　　
　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　
　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　
　　　　　　　　６　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
＋　　　　────────────────────
──────────実施例８ 金コロイド標識多糖抗原による限局性若年性歯周炎患者
歯肉溝液中の　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏ
ｍｉｔａｎｓ　に対する抗対の検出健常者３名と限局性
若年性歯周炎患者６名の歯肉溝液を、実施例１で得た生
物学的被検物質採取用具で採取し、実施例３で得た金コ
ロイド粒子で標識した　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　ＡＴＣＣ２９５２３株、Ｙ　４
株及び　ＮＣＴＣ　９７１０株の多糖抗原溶液を混合後
、浸漬し、反応させた。室温で５〜１５分間反応させた
後、採取用具を取り出し、蒸留水で洗浄した。そこで、
採取用具の歯肉溝液が吸着した部分が、金コロイド粒子
の色である赤紫色に染まつた場合を陽性、染まらなかつ
た場合を陰性と判定した。

【０１１０】また、同時に、健常者３名と限局性若年性
歯周炎患者６名の歯肉溝液中の　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原に対する抗
体の検出を　ＥＬＩＳＡ　法を用いて、下記のようにし
て行つた。

【０１１１】まず、炭酸緩衝液（ｐＨ　９．０）に溶解
した　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａ
ｎｓ　ＡＴＣＣ２９５２３株、Ｙ　４株及び　ＮＣＴＣ
　９７１０株の多糖抗原を、ＥＬＩＳＡ用プレートの各
ウエルに１μｇ　ずつ分注し、４℃で一晩放置した。 翌日、ＰＢＳＴ　で洗浄いた後、１０％ヤギ血清を含む
　ＰＢＳＴ　で、室温、１時間放置し、ブロツキングを
した。次に、市販の紙製コヨリ（ペーパーポイント）に
あらかじめ採取しておいた歯肉溝液を、ＰＢＳＴ　に溶
かし出して回収したものを加えた。３７℃で１時間反応
させた後、アルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトＩｇ（
Ｇ＋Ｍ＋Ａ）を加え、３７℃で１時間反応させた。次に
、ＰＢＳＴ　でよく洗浄した後に、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈ
ｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ　を含む基質溶液を加え、
３７℃で３０分間反応させた。そこで、吸光度を測定し
、その発色の程度により、被検体中の　Ａ．　ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　に対する抗体の
検出をした。

【０１１２】以下にその結果を示す。表１０に示すよう
に、健常者（３名）の歯肉溝液では、金コロイド粒子に
よる着色は認めず、すべて陰性の結果を示した。また、
ＥＬＩＳＡ　法による歯肉溝液中に存在する　Ａ．　ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗
原に対する抗体の検出では、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原に対する抗体は
認められなかつた。一方、限局性若年性歯周炎患者（６
名）の歯肉溝液では、金コロイド粒子による着色が認め
られ、すべて陽性の結果を示した。また、ＥＬＩＳＡ　
法による歯肉溝液中に存在する　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原に対する抗
体の検出では、Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏ
ｍｉｔａｎｓ　の多糖抗原に対する抗体を認めた。

【０１１３】

【表１０】 　　　　表１０：歯肉溝液中の　Ａ．　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　に対する抗体の検出　
　────────────────────────
───────────　　　　　　被検者Ｎｏ．　　
　金コロイド標識多糖抗原との反応　　　　ＥＬＩＳＡ
　法　　─────────────────────
──────────────　　　　　　健常者　１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　
　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　
　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　−　　　　　　　　　　　　　３　　　　　　　　　
　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　−　　　　　　患　　者　１　　　
　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　
　　　　　　　　　　　　３　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　　４　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　
　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　　　　　　　　６　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋　　─────────────────
────────────────── 実施例９ アルカリフオスフアターゼ標識抗体調製例４で得た各抗
血清又は調製例５で得た各モノクロナール抗体を２０ｍ
ｌになるように０．１　Ｍ　リン酸緩衝生理食塩水に溶
解する。この抗体溶液２ｍｌ　に、ＺＹＭＥＤ　社製の
アルカリフオスフアターゼ（ＥＩＡ　Ｇｒａｄｅ：０１
−２２０１）４０ｍｇ　を加えて良く溶解する。静かに
撹拌しながら１％グルタルアルデヒドを０．１ｍｌ　滴
下し、室温で２時間反応させる。次に、飽和硫安を等量
加えて撹拌する。遠心分離により得られた沈澱を最少量
のリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、リン酸緩衝生理食塩
水に透析する。透析終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−
２００を用いてゲル濾過し、アルカリフオスフアターゼ
標識抗体を得た。

【０１１４】実施例１０アルカリフオスフアターゼ標識
抗原による成人性歯周炎患者歯肉溝液中の　Ｐ．　ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ　の検出健常者３名と成人性歯周炎患
者６名の歯肉溝液を、実施例１で作成した生物学的被検
物質採取用具で採取し、まず、実施例９で得たアルカリ
フオスフアターゼで標識した　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｉｓ　３８１株と　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＨＷ
２４Ｄ−１株の線毛抗原に対するモノクロナール抗体溶
液に浸漬し、室温で５〜１５分間反応させた後、採取用
具を取り出し、Ｔｗｅｅｎ　２０を含むリン酸緩衝生理
食塩水で洗浄した。次に、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルフオスフエイトを含む基質溶液に浸漬し、
５〜１５分間反応させた。そこで、採取用具の歯肉溝液
が吸着した部分が、青色に染まつた場合を陽性、染まら
なかつた場合を陰性と判定した。

【０１１５】また、同時に、健常者３名と成人性歯周炎
患者６名の歯肉溝液中の　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　の同定を下記のようにして行つた。

【０１１６】即ち、市販の紙製コヨリ（ペーパーポイン
ト）に吸収させた歯肉溝液を輸送培地（ＲＴＦ：Ｒｅｄ
ｕｃｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆｌｕｉｄ）に懸濁して
回収し、ウサギ脱繊血、ヘミン及びメナジオンを含む　
ＣＤＣ　培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ　開発）に播種し、嫌気条件下で数日間培養し
た。生育の見られたコロニーのうち、黒色化したコロニ
ーを選び、これを分離し、純培養後、Ｒａｐ　ＩＤ　Ａ
ＮＡ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｃＤＯＮＮＥＬＬ　ＤＯＵＧＬ
ＡＳ社製）により、同定試験を行つた。更に、Ｐ．　ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ　と同定されたものの培養上清をガ
スクロマトグラフイーにかけ、フエニル酢酸の産生を調
べることにより、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　である
ことの再認識を行つた。

【０１１７】以下にその結果を示す。表１１に示すよう
に、健常者（３名）の歯肉溝液では、着色は認めず、す
べて陰性の結果を示した。また、歯肉溝液中に存在する
細菌の同定試験では、Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　は
認められなかつた。一方、成人性歯周病患者（６名）の
歯肉溝液では、６名中６名に　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｉｓ　の線毛抗原に対するモノクローナル抗体溶液との
反応が見られ、すべて陽性の結果を示した。また、歯肉
溝液中に存在する細菌の同定試験では、Ｐ．　ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ　を認めた。

【０１１８】

【表１１】 　　　　　　　　　　　　　　　表１１：歯肉溝液中の
　Ｐ．　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　の検出　　　　───
─────────────────────────
───　　　　　　被検者Ｎｏ．　　アルカリフオスフ
アターゼ　　　　培養法による同定　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　標識抗原との反応　　　　　
─────────────────────────
──────　　　　　　健常者　１　　　　　　　　
　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　無　　　　　　　　　　　　　２　　　　
　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　無　　　　　　　　　　　　　３
　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　無　　　　　　患　　者
　１　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　有　　　　　　　　
　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　有　　　　
　　　　　　　　　３　　　　　　　　　　　　　　　
＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　有
　　　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　　
　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　有　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　
　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　有　　　　　　　　　　　　　６　　　
　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　有　　　　─────────
──────────────────────

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の採取用具の一例の概略断面図
である。

【符号の説明】

１　　吸収性材料 ２　　多孔性フイルムコーテイング ３　　生物学的被検物質採取部分 ４　　防水処理部分

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　実質的に水不溶性かつ透水性の多孔性
   フイルムでコーテイングされた吸水性材料からなる生物
   学的被検物質採取部分を有することを特徴とする検体中
   の生物学的被検物質採取用具。
2. 【請求項２】　　少なくとも先端部分が実質的に水不溶
   性かつ透水性の多孔性フイルムでコーテイングされたス
   テイツク状又は短冊状の吸水性材料からなる請求項１記
   載の採取用具。
3. 【請求項３】　　該吸水性材料の生物学的被検物質採取
   部分以外の部分のうち少なくとも検体と接触する可能性
   のある部分の表面が防水処理されている請求項１又は２
   記載の採取用具。
4. 【請求項４】　　吸水性材料が高吸水性セルロース系ポ
   リマー又は高吸水性合成ポリマーよりなるものである請
   求項１〜３のいずれかに記載の採取用具。
5. 【請求項５】　　多孔性フイルムが１０ミクロン以下の
   平均孔径を有するものである請求項１〜４のいずれかに
   記載の採取用具。
6. 【請求項６】　　多孔性フイルムが多糖の有機酸もしく
   は無機酸エステル又は多糖の低級アルキルエーテル誘導
   体からなる請求項１〜５のいずれかに記載の採取用具。
7. 【請求項７】　　ステイツク状又は短冊状の吸水性材料
   からなり、該吸水性材料の先端１〜５ｍｍの長さからな
   る生物学的な被検物質採取部分に隣接する少なくとも検
   体と接触する可能性のある部分の表面が防水処理されて
   いることを特徴とする生物学的被検物質採取用具。
8. 【請求項８】　　検体が歯肉溝液、唾液又は歯垢処理液
   であり、生物学的被検物質が歯周病原性細菌又はそれに
   対する抗体である請求項１〜７のいずれかに記載の採取
   用具。
9. 【請求項９】　　請求項１〜７のいずれかに記載の採取
   用具の生物学的被検物質採取部分を検体と接触させた後
   、該生物学的被検物質と特異的に結合しうる標識された
   物質からなる試薬と接触させ、該採取部分に結合した標
   識された試薬を定性的又は定量的に検出することを特徴
   とする検体中の生物学的被検物質の測定方法。
10. 【請求項１０】　　検体が歯肉溝液、唾液又は歯垢処理
    液であり、生物学的被検物質が歯周病原性細菌又はそれ
    に対する抗体である請求項８記載の方法。
11. 【請求項１１】　　標識された試薬が、着色コロイド粒
    子又は酵素で標識された、歯周病原性細菌の菌体もしく
    はその一部又はそれらに対する抗体である請求項１０記
    載の方法。
12. 【請求項１２】　　着色コロイド粒子が金コロイドであ
    る請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】　　酵素がアルカリフオスフアターゼで
    あり、その基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
    リルフオスフエイトである請求項１１記載の方法。
14. 【請求項１４】　　請求項１〜７のいずれかに記載の採
    取用具と、検体中の検出すべき生物学的被検物質と特異
    的に結合しうる標識された物質からなる試薬との組合わ
    せよりなる検体中の生物学的被検物質の測定用キツト。