JPH09508011A - 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるl−イソロイシンの生成方法 - Google Patents
非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるl−イソロイシンの生成方法Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.L- イソロイシンの微生物による生成方法に於て、試験管内に存在する─L - イソロイシンの微生物による合成に鍵酵素として関与する─スレオニンデヒド ラターゼ遺伝子中で酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域中で 突然変異することによって、1種又はそれ以上の塩基を交換するが、 その際酵素のアロステリックドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸少なくとも 1個を、酵素がL- イソロイシンによってもはやフィードバック阻害されない様 に別のアミノ酸に置き換え、それによってスレオニン又はL- イソロイシンを産 生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形 質転換後、これが繰り返しL- イソロイシンを生じることを特徴とする、上記方 法。 2.突然変異生成に関して試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子 が、コリネバクテリウムグルタミクムから由来する、請求の範囲1記載の方法。 3.クローンを非調節の、すなわちL- イソロイシンによるフィードハック阻害 を受けないスレオニンデヒドラターゼを用いて単離し、突然変異によって変化さ れたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を微生物中で形質転換し、そのアセトヒド ロキシ酸合成- 活性をL- バリンによって阻害することができ、それによってL - イソロイシン及びL- バリンを含有する固形培地中上で形質転換体の増殖後、 調節されたスレオニンデヒドラターゼを含有するクローンが、ケトブチラートの 蓄積によってひき起される、変化した形態学を有するコロニーの採取して得られ る、請求の範囲1又は2記載の方法。 4.培地が更にスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を誘発するための物質を含有す る、請求の範囲3記載の方法。 5.物質がスレオニンデヒドラターゼ遺伝子IPTGを誘発するための物質であ る、請求の範囲4記載の方法。 6.培地が更にL- スレオニンデヒドラターゼをスレオニンデヒドラターゼの基 質として含有する、請求の範囲3ないし5のいずれかに記載の方法。 7.突然変異によって変化されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を大腸菌K1 2によって形質転換する、請求の範囲3ないし6のいずれかに記載の方法。 8.L- イソロイシンの微生物による生成方法に於て、コリネバクテリウムグル タミクムから得られる試験管内に存在する─L- イソロイシンの微生物による合 成で鍵酵素として関与する─スレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で、酵素のアロ ステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって 、酵素のアミノ酸配列の位置257のアミノ酸アラニンをアミノ酸グリシン(表 4)に又は酵素のアミノ酸配列の位置199のアミノ酸メチオニンをアミノ酸バ リンに(表5)置き換え、それによってスレオニン又はL- イソロイシンを産生 する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質 転換後、これが繰り返しL- イソロイシンを生じることを特徴とする上記方法。 9.L- イソロイシンの微生物による生成方法に於て、コリネバクテリウムグリ タミクムから得られる─L- イソロイシンの微生物による合成で鍵酵素として関 与する─スレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で、酵素のアロステリックドメイン をコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって酵素のアミノ酸配列 の位置278のアミノ酸ヒスチジンをアミノ酸アルギニンに及び酵素のアロステ リックドメインに対して暗号化された遺伝子領域の内側で酵素のアミノ酸配列の 位置351のアミノ酸ロイシンをアミノ酸セリンに置き換え(表6)、それによ ってスレオニン又はL- イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異 したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しL- イソロ イシンを生じることを特徴とする上記方法。 10.突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換に対する宿主細胞 がコリネバクテリウムグルタミクムである、請求の範囲1〜9のいずれかに記載 の方法。 11.1種又はそれ以上の塩基交換によって任意に変化されたスレオニンデヒドラ ターゼのアロステリックドメインに対して暗号化された遺伝子領域を有する、ス レオニンデヒドラクターゼ。 12.表1ないし3のいずれかのDNA- 配列を有し、その表1ないし3はこの請 求の範囲の構成要素である、請求の範囲11記載のスレオニンデヒドラクター ゼ。 14.請求の範囲11ないし13のいずれかに記載の遺伝子を含有する、遺伝子構 造。 15.請求の範囲14記載の遺伝子構造を有するベクター。 16.遺伝子に前もって連結された、IPTGによって誘発されたプロモターを有 する、請求の範囲15記載のベクター。 17.請求の範囲14記載の遺伝子構造を有する形質転換された細胞。 18.請求の範囲15記載のベクターを有する形質転換された細胞。 19.請求の範囲16記載のベクターを有する形質転換された細胞。 20.L- バリンによって阻害可能なアセトヒドロキシ酸合成酵素- 活性を有する 、請求の範囲18又は19記載の形質転換された細胞。 21.大腸菌K12である、請求の範囲20記載の形質転換された細胞。 22.コリネバクテリウムグルタミクムである、請求の範囲17又は18記載の形 質転換された細胞。 23.野性型- スレオニンデヒドラターゼをもはや合成しない、請求の範囲17, 18又は22記載の形質転換された細胞。
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