JP4471402B2 - 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるｌ−イソロイシンの生成方法 - Google Patents
非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるｌ−イソロイシンの生成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4471402B2 JP4471402B2 JP51876495A JP51876495A JP4471402B2 JP 4471402 B2 JP4471402 B2 JP 4471402B2 JP 51876495 A JP51876495 A JP 51876495A JP 51876495 A JP51876495 A JP 51876495A JP 4471402 B2 JP4471402 B2 JP 4471402B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- gene
- threonine
- enzyme
- isoleucine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
本発明は請求の範囲１ないし１０によるＬ-イソロイシンの微生物による生成方法、請求の範囲１１ないし１３によるスレオニンデヒドラターゼ遺伝子、請求の範囲１４による遺伝子構築物、請求の範囲１５及び１６によるベクター、並びに請求の範囲１７ないし２３による形質転換された細胞に関する。
アミノ酸Ｌ-イソロイシンは、ヒト及び動物にとって必須である。これはダイエットに係る食料品中に及び医療目的の種々の栄養食品の成分としてすでに使用されている。更にＬ-イソロイシンは添加物として又は試剤として医薬及び化学工業で使用される。
Ｌ-イソロイシンの生成に関して、このアミノ酸発酵培地中に分泌する微生物を使用する。その際Ｌ-イソロイシンの生成は図１に記載されたバイオ合成法によって行われる。図１に例示されている様に、Ｌ-イソロイシンのバイオ合成で鍵酵素、すなわちアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ及びスレオニンデヒドラターゼがある。アスパルトキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼの活性は、同様にＬ-イソロイシンのバイオ合成の範囲内で生成されるアミノ酸Ｌ-スレオニンによってフィードバック阻害される。一方Ｌ-イソロイシン合成に対して特定の鍵酵素スレオニンデヒドラターゼは、バイオ合成工程の最終生成物Ｌ-イソロイシンによってフィードバック阻害される。
Ｌ-イソロイシン生成の増加のために、Ｌ-イソロイシン-産生の突然変異体――これは野性型に比して繰り返しＬ-イソロイシンを産生する――が過去に於て何度も調べられている。
この様な突然変異体の産生のために主に生体内で突然変異生成を行う、すなわち突然変異原を全ゲノム上に作用させる。アミノ酸同族体に耐性である点でこの様な突然変異微生物が選択され、その上述の鍵酵素はフィードバック阻害をもはや受けない。
したがってたとえばα-アミノブチラート又はイソロイシンヒドロキサマートに対して耐性である突然変異が米国特許第４３２９４２７号明細書に記載されている。それによれば微生物は増加されたＬ-イソロイシンを産生するが、どの酵素がフィードバック阻害されないか不明瞭である。
米国特許第４，４４２，２０８号及び第４，６０１，９８３号明細書中に、生体内での突然変異生成後――正確に定義されていない――ＤＮＡ-フラグメントを単離することができ、α-アミノヒドロキシバレリアン酸に対する耐性を促進することが開示されている。コリネバクテリウム（Corynebacterium）-又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）-株にこのフラグメントを感染させた後、これは増加されたＬ-イソロイシンを産生する。
過剰合成によって更にフィードバック調節された鍵酵素は繰り返しＬ-イソロイシンを生成することができるという方法も記載されている（たとえばドイツ特許出願公開第３９４２９４７号公報、ヨーロッパ特許公開第０１３７３４８号公報参照）。
全体としてＬ-イソロイシン生成の従来すべての方法に於ては、突然変異がむしろ偶発的にフィードバック阻害をもはや受けない非調節鍵酵素を生じ、そのためにアミノ酸合成を増加することが共通することである。
本発明の課題は、限定された突然変異によってＬ-イソロイシンバイオ合成の鍵酵素――スレオニンデヒドラターゼ――を、フィードバック阻害がＬ-イソロイシンによってもはや行われない様に適切に変化させることによってＬ-イソロイシンの微生物による生成方法をもたらすことである。
本発明に於て主となる課題は、１種又はそれ以上の塩基を、試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域中で突然変異することによって次の様に交換することで解決される。すなわち酵素のアロステリックドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸少なくとも１個を、酵素がＬ-イソロイシンによってもはやフィードバック阻害されない様に別のアミノ酸に代えることである。ここで“試験管内に存在する遺伝子”なる表現は、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子が突然変異生成前にクローン化、すなわち単離され、ベクター中に組み込まれることを意味する。塩基交換による突然変異生成の実施は、公知の方法に従って、たとえばＩｔｏ等の方法（Gene 102（1991）60−70）に従って行われる。スレオニン又はＬ-イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ-イソロイシンを生じる。
原則的にクローン化された又は試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子は任意のバクテリアから由来する。コリネバクテリウムグルタミクム（glutamicum）が“古典的な”アミノ酸産生物に属しているので、遺伝子はこの微生物から、特にＡＴＣＣ１３０３２株から導かれる。このコリネバクテリウムグルタミクム-株からのスレオニンデヒドラターゼ遺伝子のＤＮＡ-配列はすでに公知である（Mockel等、J．Bacteriol．174（1992）8065−8072）。酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域中で塩基交換後、たとえば表１ないし３に示したＤＮＡ-配列が得られる。表中、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域は下線が引かれ、塩基交換の位置は更に下線によって目立たせた。
突然変異生成の実施の後に、試験管内で突然変異した遺伝子をプラスミド中に組み込む。このプラスミド中でスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の発現が誘発される。プラスミドとしてたとえばｐＶＣ１９又はｐＫＫ２２３−３（Amman等、Gene 25，167）が適する。適するプラスミド中に突然変異した遺伝子を組み込んだ後、これを適当な菌株に形質転換する。
突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドも実際上含有する様なクローンを得るために、所望の形質転換細胞をアミノ酸同族体の耐性に関して通常の方法に従って単離する。この際同族体としてはたとえばβ-メチルノルロイシン、イソロイシンヒドロキサマート又はヒドロキシイソロイシンが挙げられる。
しかし、改変されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を微生物中で形質転換し、そのアセトヒドロキシ酸合成-活性がＬ-バリンによって阻害されることによって簡単かつ適切な単離は達成される。形質転換細胞として、たとえば大腸菌Ｋ１２-株、好ましくは株ＪＭ１０９又はＤＨ５が適する。次いで形質転換細胞を固形培地上に取り、この培地はスレオニンデヒドラターゼを阻害するＬ-イソロイシンを、アセトヒドロキシ酸合成によるケトブチラートの物質代謝を阻害するＬ-バリン（Umbarger：Escherichia Coli and Salmonella typhimuroum，1（1987）352-367）を含有する。培地に更にスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の誘発のための物質及びデヒドラターゼに対する基質としてのＬ-スレオニンを添加するのが好ましい。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子の誘発のための物質としてはＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイド）を使用するのが好ましい。その結果として改変されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子にベクター中でＩＰＴＧ-誘発可能なプロモーターが連結される。非調節スレオニンデヒドラターゼを含有するこの様なクローンはＬ-スレオニンを阻害することなくケトブチラートに変換する。アセトヒドロキシ酸合成によるケトブチラートの別の変換は添加されるＬ-バリンによって阻害されるので、ケトブチラートが蓄積する。このことは非調節スレオニンデヒドラターゼを含有するクローンがケトブチラートの公知の毒性によって（LaRossa及びSchloss，J．Biol．Chem.259（1984）8753-8757）より一層悪い増殖を行うという事実を有する。より一層悪い増殖とはより小さいクローンの形成、より半透明のコロニー又は亀裂のあるコロニー辺縁を有するコロニーの形成として現われる。これらのコロニーは容易に採集され、したがって非調節デヒドラターゼを有するクローンを容易に単離することができる。
この単離法は、クローン化されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を含有する形質転換細胞に於ても当然使用することができる。上記遺伝子は、対応する酵素がもはやフィードバック阻害を受けない様に塩基交換と異なる突然変異法によって変化されている。
上記課題を解決するための本発明による別の方法は、コリネバクテリウムグルタミクムから得られる試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼの遺伝子中で、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって、酵素のアミノ酸配列の位置２５７のアミノ酸アラニンをアミノ酸グリシン（表４）に又は酵素のアミノ酸配列の位置１９９のアミノ酸メチオニンをアミノ酸バリンに（表５）置き換えることにある。それによってスレオニン又はＬ-イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ-イソロイシンを生じる。
本発明の課題を解決するためのまた別の方法は、コリネバクテリウムグルタミクムから得られるスレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって酵素のアミノ酸配列の位置２７８のアミノ酸ヒスチジンをアミノ酸アルギニンに及び酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の内側で酵素のアミノ酸配列の位置３５１のアミノ酸ロイシンをアミノ酸セリンに置き換える（表６）ことにある。それによってスレオニン又はＬ-イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ-イソロイシンを生じる。
突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換に対する宿主細胞として又は産生株としてコリネバクテリウムグルタミクム及び特に寄託されたＤＳＭ-株８８９０が適する。形質転換細胞として、たとえばＤＳＭでナンバー８８８９及び８８９１の寄託株が得られる。この株は増加したＬ-イソロイシンを発酵培地中に分泌する。産生株又は形質転換に対する宿主細胞として、まだＬ-イソロイシンによって調節された野性型-スレオニンデヒドラターゼをもはや合成しないものを使用するのも有益である。その結果として細胞中で非調節されたスレオニンデヒドラーゼがＬ-スレオニンの変換を触媒するにほかならない。
実施例：
１．もはやフィードバック阻害を受けない、突然変異した酵素の生成
１．１ 所望の酵素の選択
公知プラスミドｐＢＭ１／Ｅｘｏ８――これはコリネバクテリウムグルタミクムの野生型の調節されたスレオニンデヒドラターゼをコードする（Mockel等、J Bacteriol 174（1992）8065-8072）――を、公知方法（Sambrook等、Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）に従って単離する。次いで制限酵素ＥｃｏＲ１で消化し、１５７３塩基対サイズ、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子を含有するフラグメントを単離する。このフラグメントを公知のベクターｐＵＣ１９のＥｃｏＲ１切断部位（Vieira及びMessing，Gene 19（1976）259-268）中に連結し、それによってプラスミドｐＢＭ２０が得られる（図２）。これ中でＣ．グルタミクムからのスレオニンデヒドラターゼ遺伝子――これはそれ自体大腸菌中で発現しない（Cordes等、Gene 112（1992）113-116）――がスタンダード-レーバー株大腸菌ＪＭ１０９中でイソプロピル-Ｄ-チオガラクトピラノサイドによって誘発されうる原ベクターｐＵＣ１９のｌａｃＺプロモターのコントロール下に存在する。
スレオニンデヒドラターゼのアロステリックドメイン中に指示されていない突然変異を伝達するために、公知方法の別々の処理で２つのＤＮＡ-プライマーを合成する：
５’-プライマー：ＣＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡ
３’-プライマー：ＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ
５’-プライマーは、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子中でＮｃｏｌ-切断部位（下線）に類似する。３’-プライマーは出発ベクターｐＵＣ１９のマルチプル-クローニング部位のＨｉｎｄIII認識部位（下線）に類似する。
２つのプライマーを用いて、ポリメラーゼ-鎖反応を実施する（Tindall及びKunkel，Biochemistry 27（1988）6008-6013）。この際Ｔａｇポリメラーゼの非特異性反応（Leung等、Technique １（1989）11-15）によって、突然変異を含有する新しいＤＮＡ-フラグメントが生じる。反応混合物は、最終容量１００μｌ中に２０μｌ ５’−プライマー（２５μｇ／ｍｌ）、２０μｌ３’-プライマー（２５μｇ／ｍｌ）、１ｎｇ鋳型（ｐＢＭ２０）、１００μＭ ＡＴＰ、１００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ，１０μｌ Ｔａｑ １０×緩衝液（１００ｍＭトリス、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＫＣｌ、ゼラチン１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．３）、０．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ2を含有する。反応条件として、時間遅延ファイル（Time Delay File）９４℃（３分）、熱循環ファイル（Thermo Cycle File）９４℃（１分）、５５℃（２分）、７２℃（３分）、浸透ファイル（Soak File）４℃、セグメントエクステンション１０秒を３０循環数で調製する。反応の後、ＤＮＡ-フラグメントを精製し、（Sambrook等、Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＢＭ２０で連結し、これから前もって対応する７４３塩基対ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII-フラグメントを切断する。このフラグメントは原株-スレオニンデヒトラターゼのアロステリッドメインをコードする。
この試験間内で生成された連結生成物――これは変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子も含有する――を用いて大腸菌ＪＭ１０９を公知方法に従って形質転換し（Hanahan，Techniques for Transformation of E.Coli（1985）DNA cloning、第１巻、第109−136頁、IRL Press Oxford）、次いで約１００００のプラスミドを含有するクローンがLuria-Bertani培地（Lennox，Virology １（1955）190-206）、――これはアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有する――上に得られる。もはやフィードバック阻害しないスレオニンデヒドラターゼをコードするクローンを同定するために、Luria-Bertani培地を調製する。この培地は更にスレオニンデヒドラターゼの基質として４０ｍＭ Ｌ-スレオニン、並びにスレオニンデヒドラターゼ遺伝子のｌａｃＺ条件つき発現を誘発するために１ｍＭイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを含有する。知られている様に、Luria-Bertani培地は大腸菌中でアセトヒドロキシ酸合成活性の阻害に十分なＬ-バリンをすでに含有する（Umbarger，Biosynthesis of branched-Chainamino acids（1987）Escherichia coli and Salmonella typhimurium Vol 1,第352-367頁、American Society for Microbiology，ワシントンDC）これによってここに示した方法で可能な限り高いα-ケトブチラートの蓄積が得られる。スレオニン及びイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを含有するLuria-Bertani培地と共に、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド不含の同一培地を調製する。そこでスレオニンデヒドラターゼの誘発は行われない。次いで大腸菌ＪＭ１０９のクローン――これは試験すべきｐＢＭ２０誘導体を含有する――をこのプレート上に常法で塗布し、２４時間３７℃でインキュベートする。その後、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを含有する培地上で６０の変則的に増殖したコロニーを同定する。これはより僅か増殖、又はより淡色のコロニー又は亀裂のあるコロニー辺縁の点で優れているが、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイド不含コントロール培地上で正常に増殖する。このクローンは個々に同一の反復テスト（Nachtest）に付し、最後に最も際立った増殖遅れのクローンのうちの６つはこれらを含有するスレオニンデヒドラターゼの調節を確認するための生化学テストに付す。
１．２ 酵素の阻害の確認
大腸菌ＪＭ１０９の得られた組換えクローン６つを、ＬＢ液体培地１００ｍｌ――これは更に５０μｇアンピシリン／ｍｌを含有する――中に植菌し、３７℃でインキュベートする。光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）を追跡し、ＯＤ０．５の達成と同時にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを最終濃度ＯＤ０．５で添加する。もう１時間３７℃でインキュベーションした後、細胞を遠心分離によって集め、緩衝液ｐＨ７．０（０．１Ｍリン酸カリウム、０．５ｍＭ Ｌ-イソロイシン、０．２ｍＭリン酸ピリドキサール）で１回洗滌し、同一緩衝液中に取り、Branson-Sonifier Ｗ２５０中で超音波処理して（３分、２０％の間隔で拍動、出力２）分解する。細胞破片を分離するために、ホモジナートを１０分間１３０００ＵｐＭ及び４℃でSigma冷却遠心分離機中で遠心分離し、その後生じた澄明上澄液（粗抽出物）をスレオニンデヒドラターゼ活性及び−調節の測定のための酵素テストに使用する。
酵素テストは０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８．２）０．８ｍｌ、１ｍＭピリドオキザルホスフアート、４０ｍＭ Ｌ-スレオニン及び粗抽出物の最終容量で行われる。混合物を３０℃でインキュベートし、試料２００μｌを０〜３０分後に取り出す。スレオニンデヒドラターゼ反応を、夫々試剤１ｍｌの添加によって終了する。これは水１００ｍｌ中にセミカルバシド１ｇと酢酸ナトリウム０．９ｇを有する。３０℃で１５分のインキュベーション後、水３ｍｌを加え、吸光を２５４ｎｍでツァイス（Zeiss）スペクトルフォトメーターＰＭ６で測定する。コントロール及び０〜１．５μｍｏｌケトブチラートの標準値を同様に処理し、検量線から具体的に酵素テストで生じるスレオニンデヒドラターゼにより得られるケトブチラート量を算出する。平行して同一の試みを実施するが、これはスレオニンデヒドラターゼの阻害に関する試験のために５ｍＭ Ｌ-イソロイシンを含有する。この測定と無関係に、（Bradford，Anal Biochem 72（1976（248-254）に記載されている様に粗抽出物のたん白質含有量を測定する。得られた比活性及び阻害の度合は、表７から明らかである。
表７：突然変異したスレオニンデヒドラターゼ及びその阻害可能性をＬ-イソロイシンによって確認
突然変異した酵素３８及び１４は、夫々Ｌ-イソロイシンによるアロステリック阻害がないことを明らかに示す。突然変異３１の酵素は、Ｌ-イソロイシンの存在下でまだ３０％残存活性を示し、これに対して野性型の酵素はこの条件下でほんの１５％残存活性を有するにすぎない。
１．３ 酵素の突然変異種類の確認
生成された酵素中で突然変異を測定するために、スレオニンデヒドラターゼをコードするプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９クローンから標準法に従って単離する。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子の突然変異領域の配列は、Sanger等によるジデスオキシヌクレオチド-終結法（Sanger等、Proceedings of the National Academy of Sciences，米国（1977）5463-5467）によって行われる。プライマーとして蛍光標識された配列特異的ヌクレオチドをファルマシア（Pharmacia）の対応する確実な指示に従って生成する（Pharmacia，Uppsala、スウェーデン）。このプライマーを１００ｍＭ酢酸トリメチルアミンｐＨ７．０中で５−３０％アセトニトリルの勾配を有する高圧液体クロマトグラフィーによって及びPharmacia SuperPacRPep-S,.5μｍによって精製する。プライマーを標準-配列化反応中で使用し、A.L.F．Sequencer（Pharmacia，Uppsala，スウェーデン）で蛍光検出による反応生成物の電気泳動の間及び自動的に検出し、生じる配列を記録する。
配列化に使用されるプライマー。塩基の位置は、Mockel等、J Bacteriol 174（1992）8065-8072による図３の配列に関連する。
塩基９５７−９５８：５’蛍光-ｄ（ＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧ）-３-
塩基１１７２−１１９１：５’蛍光-ｄ（ＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧ）-３-
塩基１３８１−１４００：５’蛍光-ｄ（ＣＣＴＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＴＣ）-３-
塩基１５８６−１６０７：５’蛍光-ｄ（ＣＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＧ）-３-
これによって確認された個々のスレオニンデヒドラターゼ遺伝子配列を公知の野性型遺伝子（Mockel等、J Bacteriol 174（1992）8065-8072）と比較する。生化学的に確認されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の個々の塩基交換を表８に示す。改変されたコドンを対応するアミノ酸中に普遍的な遺伝子暗号を用いて翻訳し、これを用いて確認されたアミノ酸交換――これはスレオニンデヒドラターゼの変化された調節を生じる――を同様に表８に示す。全領域にわたって非調節の表現型――これは突然変異に使用される――が得られる。突然変異体１４中に二重突然変異があり、これは酵素中で数種のアミノ酸交換が所望の非調節表現型を生じうることも示す。
２．非調節酵素によるイソロイシン分離の確認
得られた対立遺伝子を大腸菌／Ｃ．グルタミクムシャトルベクター中で再クローン化し、これをＣ．グルタミクムのスレオニン生成物中で発現することができる。
これに先ず大腸菌／Ｃ．グルタミクムシャトルベクターｐＫＷＯを公知のクローン化法（Sambrook等、Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）に従って製造する。生じるベクターを図３に示す。大きさ９．５ｋｂであり、（ｉ）Ｃ．グルタクムレプリコンｐＧＡ２（Sonnen，Molekulargenetische Charakterisierung von Phagen-Beziehungenbei coryneformen Aminosaure-Produzenten，Dissertation，Technische Hochschule Darmstadt，1991）――これはＣ．グルタミクム中に低いコピー数しか生じない――、（ii）ｐＯＵ７１から大腸菌レプリコン（Larsen等、Gene 28（1984）45-54）――これは３０℃で１個のコピー／細胞を生じるが、４２℃で１０００個までのコピー／細胞を生じる――、（iii）ｐＨＹ１６３からテトラサイクリン耐性（Ishiwa及びShibahara，Jpn J Genet 60（1985）485-498）及び（iv）ｐＢＴＩ-１からｃｏｓ-部位（ベーリンガー・マンハイム）を含有する。ｉＩｖＡ対立遺伝子１４．１６及び１８並びに野性型対立遺伝子を１．１で製造されたｐＢＭ２０誘導体からＥｃｏＲＩ-フラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩで収縮されたベクターｐＫＷＯを連結し、ｐＫＷＯｉＩｖＡ、ｐＫＷＯｉＩｖＡ１４、ｐＫＷＯｉＩｖＡ１６、及びｐＫＷＯｉｌｖＡ３８を生じる。このプラスミドを用いてエレクトロポレーション（liebl等，FEMS Microbiol Lett 65（1985）299-304）によってスレオニン産生ＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１（Reinscheid et al.，Appl Evn Microbiol形質転換細胞として（1994）、in press）を形質転換する。ＭＨ２０−２２Ｂは、微生物に関するドイツ寄託機関にナンバーＤＳＭ６８７０で寄託されている。更にＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１（ＤＳＭ８８９０）及びＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１ ｐＫＷＯｉｌｖＡ１６はＤＳＭ８８８９である。これらの菌株を最小培地ＣＧＸＩＩ中で文献（Keilhauer等、J Bacteriol 175（1993）5595-5603）に記載されている様に培養し、７２時間のインキュベーション後培養培地中に蓄積されたアミノ酸を測定する。表９からＬ-イソロイシン生成の明らかな増加が突然変異対立遺伝子によって生じる。
他の実験で、野性型対立遺伝子及び突然変異体３８を高いコピーペンデル（Pendel）ベクターｐＥＣＭ３（A．Schater，Diplomarbeit，1991，Bielefeld大学）中に組み込む。フラグメントを更に１．１で製造されたｐＢＭ２０誘導体からＥｃｏＲＩ-フラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩで収縮されたベクターに連結し、ｐＥＣＭ３ｉｌｖＡ及びｐＥＣＭ３ｉｌｖＡ３８を生じる。このプラスミドを用いてエレクトロポレーション（Liebl et al.，FEMS Microbiol Lett 65（1985）299-304）によってスレニオン産生ＭＨ２０−２２Ｂ：：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１（Reinscheid et al.，Appl Env Microbiol（1994），in press）を形質転換する。ＭＨ２０−２２Ｂは、微生物に関するドイツ寄託機関にナンバーＤＳＭ６８７０で寄託されている。更にＭＨ２０−２２Ｂ：：ｐＳＵＲ５−ＤＲ一（ＤＳＭ８８９０）及びＭＨ２０−２２Ｂ：：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１ ｐＥＣＭ３ｉｌｖＡ３８（ＤＳＭ８８９１）である。これらの菌株をＭＨ２０−２２Ｂ-最小培地中で文献（Schrumpf et al．Appl Microbiol Biotechnol 37（1992）566-571）に記載されている様に培養し、７２時間のインキュベーション後培養培地中に蓄積されたアミノ酸を測定する。表１０からＬ-イソロイシン生成の明らかな増加が夫々の突然変異対立遺伝子によって生じる。
アミノ酸Ｌ-イソロイシンは、ヒト及び動物にとって必須である。これはダイエットに係る食料品中に及び医療目的の種々の栄養食品の成分としてすでに使用されている。更にＬ-イソロイシンは添加物として又は試剤として医薬及び化学工業で使用される。
Ｌ-イソロイシンの生成に関して、このアミノ酸発酵培地中に分泌する微生物を使用する。その際Ｌ-イソロイシンの生成は図１に記載されたバイオ合成法によって行われる。図１に例示されている様に、Ｌ-イソロイシンのバイオ合成で鍵酵素、すなわちアスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ及びスレオニンデヒドラターゼがある。アスパルトキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼの活性は、同様にＬ-イソロイシンのバイオ合成の範囲内で生成されるアミノ酸Ｌ-スレオニンによってフィードバック阻害される。一方Ｌ-イソロイシン合成に対して特定の鍵酵素スレオニンデヒドラターゼは、バイオ合成工程の最終生成物Ｌ-イソロイシンによってフィードバック阻害される。
Ｌ-イソロイシン生成の増加のために、Ｌ-イソロイシン-産生の突然変異体――これは野性型に比して繰り返しＬ-イソロイシンを産生する――が過去に於て何度も調べられている。
この様な突然変異体の産生のために主に生体内で突然変異生成を行う、すなわち突然変異原を全ゲノム上に作用させる。アミノ酸同族体に耐性である点でこの様な突然変異微生物が選択され、その上述の鍵酵素はフィードバック阻害をもはや受けない。
したがってたとえばα-アミノブチラート又はイソロイシンヒドロキサマートに対して耐性である突然変異が米国特許第４３２９４２７号明細書に記載されている。それによれば微生物は増加されたＬ-イソロイシンを産生するが、どの酵素がフィードバック阻害されないか不明瞭である。
米国特許第４，４４２，２０８号及び第４，６０１，９８３号明細書中に、生体内での突然変異生成後――正確に定義されていない――ＤＮＡ-フラグメントを単離することができ、α-アミノヒドロキシバレリアン酸に対する耐性を促進することが開示されている。コリネバクテリウム（Corynebacterium）-又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）-株にこのフラグメントを感染させた後、これは増加されたＬ-イソロイシンを産生する。
過剰合成によって更にフィードバック調節された鍵酵素は繰り返しＬ-イソロイシンを生成することができるという方法も記載されている（たとえばドイツ特許出願公開第３９４２９４７号公報、ヨーロッパ特許公開第０１３７３４８号公報参照）。
全体としてＬ-イソロイシン生成の従来すべての方法に於ては、突然変異がむしろ偶発的にフィードバック阻害をもはや受けない非調節鍵酵素を生じ、そのためにアミノ酸合成を増加することが共通することである。
本発明の課題は、限定された突然変異によってＬ-イソロイシンバイオ合成の鍵酵素――スレオニンデヒドラターゼ――を、フィードバック阻害がＬ-イソロイシンによってもはや行われない様に適切に変化させることによってＬ-イソロイシンの微生物による生成方法をもたらすことである。
本発明に於て主となる課題は、１種又はそれ以上の塩基を、試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域中で突然変異することによって次の様に交換することで解決される。すなわち酵素のアロステリックドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸少なくとも１個を、酵素がＬ-イソロイシンによってもはやフィードバック阻害されない様に別のアミノ酸に代えることである。ここで“試験管内に存在する遺伝子”なる表現は、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子が突然変異生成前にクローン化、すなわち単離され、ベクター中に組み込まれることを意味する。塩基交換による突然変異生成の実施は、公知の方法に従って、たとえばＩｔｏ等の方法（Gene 102（1991）60−70）に従って行われる。スレオニン又はＬ-イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ-イソロイシンを生じる。
原則的にクローン化された又は試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子は任意のバクテリアから由来する。コリネバクテリウムグルタミクム（glutamicum）が“古典的な”アミノ酸産生物に属しているので、遺伝子はこの微生物から、特にＡＴＣＣ１３０３２株から導かれる。このコリネバクテリウムグルタミクム-株からのスレオニンデヒドラターゼ遺伝子のＤＮＡ-配列はすでに公知である（Mockel等、J．Bacteriol．174（1992）8065−8072）。酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域中で塩基交換後、たとえば表１ないし３に示したＤＮＡ-配列が得られる。表中、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域は下線が引かれ、塩基交換の位置は更に下線によって目立たせた。
突然変異生成の実施の後に、試験管内で突然変異した遺伝子をプラスミド中に組み込む。このプラスミド中でスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の発現が誘発される。プラスミドとしてたとえばｐＶＣ１９又はｐＫＫ２２３−３（Amman等、Gene 25，167）が適する。適するプラスミド中に突然変異した遺伝子を組み込んだ後、これを適当な菌株に形質転換する。
突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドも実際上含有する様なクローンを得るために、所望の形質転換細胞をアミノ酸同族体の耐性に関して通常の方法に従って単離する。この際同族体としてはたとえばβ-メチルノルロイシン、イソロイシンヒドロキサマート又はヒドロキシイソロイシンが挙げられる。
しかし、改変されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を微生物中で形質転換し、そのアセトヒドロキシ酸合成-活性がＬ-バリンによって阻害されることによって簡単かつ適切な単離は達成される。形質転換細胞として、たとえば大腸菌Ｋ１２-株、好ましくは株ＪＭ１０９又はＤＨ５が適する。次いで形質転換細胞を固形培地上に取り、この培地はスレオニンデヒドラターゼを阻害するＬ-イソロイシンを、アセトヒドロキシ酸合成によるケトブチラートの物質代謝を阻害するＬ-バリン（Umbarger：Escherichia Coli and Salmonella typhimuroum，1（1987）352-367）を含有する。培地に更にスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の誘発のための物質及びデヒドラターゼに対する基質としてのＬ-スレオニンを添加するのが好ましい。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子の誘発のための物質としてはＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイド）を使用するのが好ましい。その結果として改変されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子にベクター中でＩＰＴＧ-誘発可能なプロモーターが連結される。非調節スレオニンデヒドラターゼを含有するこの様なクローンはＬ-スレオニンを阻害することなくケトブチラートに変換する。アセトヒドロキシ酸合成によるケトブチラートの別の変換は添加されるＬ-バリンによって阻害されるので、ケトブチラートが蓄積する。このことは非調節スレオニンデヒドラターゼを含有するクローンがケトブチラートの公知の毒性によって（LaRossa及びSchloss，J．Biol．Chem.259（1984）8753-8757）より一層悪い増殖を行うという事実を有する。より一層悪い増殖とはより小さいクローンの形成、より半透明のコロニー又は亀裂のあるコロニー辺縁を有するコロニーの形成として現われる。これらのコロニーは容易に採集され、したがって非調節デヒドラターゼを有するクローンを容易に単離することができる。
この単離法は、クローン化されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を含有する形質転換細胞に於ても当然使用することができる。上記遺伝子は、対応する酵素がもはやフィードバック阻害を受けない様に塩基交換と異なる突然変異法によって変化されている。
上記課題を解決するための本発明による別の方法は、コリネバクテリウムグルタミクムから得られる試験管内に存在するスレオニンデヒドラターゼの遺伝子中で、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって、酵素のアミノ酸配列の位置２５７のアミノ酸アラニンをアミノ酸グリシン（表４）に又は酵素のアミノ酸配列の位置１９９のアミノ酸メチオニンをアミノ酸バリンに（表５）置き換えることにある。それによってスレオニン又はＬ-イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ-イソロイシンを生じる。
本発明の課題を解決するためのまた別の方法は、コリネバクテリウムグルタミクムから得られるスレオニンデヒドラターゼ遺伝子中で、酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって酵素のアミノ酸配列の位置２７８のアミノ酸ヒスチジンをアミノ酸アルギニンに及び酵素のアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の内側で酵素のアミノ酸配列の位置３５１のアミノ酸ロイシンをアミノ酸セリンに置き換える（表６）ことにある。それによってスレオニン又はＬ-イソロイシンを産生する宿主細胞中でこの様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換後、これが繰り返しＬ-イソロイシンを生じる。
突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換に対する宿主細胞として又は産生株としてコリネバクテリウムグルタミクム及び特に寄託されたＤＳＭ-株８８９０が適する。形質転換細胞として、たとえばＤＳＭでナンバー８８８９及び８８９１の寄託株が得られる。この株は増加したＬ-イソロイシンを発酵培地中に分泌する。産生株又は形質転換に対する宿主細胞として、まだＬ-イソロイシンによって調節された野性型-スレオニンデヒドラターゼをもはや合成しないものを使用するのも有益である。その結果として細胞中で非調節されたスレオニンデヒドラーゼがＬ-スレオニンの変換を触媒するにほかならない。
実施例：
１．もはやフィードバック阻害を受けない、突然変異した酵素の生成
１．１ 所望の酵素の選択
公知プラスミドｐＢＭ１／Ｅｘｏ８――これはコリネバクテリウムグルタミクムの野生型の調節されたスレオニンデヒドラターゼをコードする（Mockel等、J Bacteriol 174（1992）8065-8072）――を、公知方法（Sambrook等、Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）に従って単離する。次いで制限酵素ＥｃｏＲ１で消化し、１５７３塩基対サイズ、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子を含有するフラグメントを単離する。このフラグメントを公知のベクターｐＵＣ１９のＥｃｏＲ１切断部位（Vieira及びMessing，Gene 19（1976）259-268）中に連結し、それによってプラスミドｐＢＭ２０が得られる（図２）。これ中でＣ．グルタミクムからのスレオニンデヒドラターゼ遺伝子――これはそれ自体大腸菌中で発現しない（Cordes等、Gene 112（1992）113-116）――がスタンダード-レーバー株大腸菌ＪＭ１０９中でイソプロピル-Ｄ-チオガラクトピラノサイドによって誘発されうる原ベクターｐＵＣ１９のｌａｃＺプロモターのコントロール下に存在する。
スレオニンデヒドラターゼのアロステリックドメイン中に指示されていない突然変異を伝達するために、公知方法の別々の処理で２つのＤＮＡ-プライマーを合成する：
５’-プライマー：ＣＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＡＧＡ
３’-プライマー：ＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ
５’-プライマーは、スレオニンデヒドラターゼ遺伝子中でＮｃｏｌ-切断部位（下線）に類似する。３’-プライマーは出発ベクターｐＵＣ１９のマルチプル-クローニング部位のＨｉｎｄIII認識部位（下線）に類似する。
２つのプライマーを用いて、ポリメラーゼ-鎖反応を実施する（Tindall及びKunkel，Biochemistry 27（1988）6008-6013）。この際Ｔａｇポリメラーゼの非特異性反応（Leung等、Technique １（1989）11-15）によって、突然変異を含有する新しいＤＮＡ-フラグメントが生じる。反応混合物は、最終容量１００μｌ中に２０μｌ ５’−プライマー（２５μｇ／ｍｌ）、２０μｌ３’-プライマー（２５μｇ／ｍｌ）、１ｎｇ鋳型（ｐＢＭ２０）、１００μＭ ＡＴＰ、１００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ，１０μｌ Ｔａｑ １０×緩衝液（１００ｍＭトリス、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＫＣｌ、ゼラチン１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．３）、０．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ2を含有する。反応条件として、時間遅延ファイル（Time Delay File）９４℃（３分）、熱循環ファイル（Thermo Cycle File）９４℃（１分）、５５℃（２分）、７２℃（３分）、浸透ファイル（Soak File）４℃、セグメントエクステンション１０秒を３０循環数で調製する。反応の後、ＤＮＡ-フラグメントを精製し、（Sambrook等、Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＢＭ２０で連結し、これから前もって対応する７４３塩基対ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII-フラグメントを切断する。このフラグメントは原株-スレオニンデヒトラターゼのアロステリッドメインをコードする。
この試験間内で生成された連結生成物――これは変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子も含有する――を用いて大腸菌ＪＭ１０９を公知方法に従って形質転換し（Hanahan，Techniques for Transformation of E.Coli（1985）DNA cloning、第１巻、第109−136頁、IRL Press Oxford）、次いで約１００００のプラスミドを含有するクローンがLuria-Bertani培地（Lennox，Virology １（1955）190-206）、――これはアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有する――上に得られる。もはやフィードバック阻害しないスレオニンデヒドラターゼをコードするクローンを同定するために、Luria-Bertani培地を調製する。この培地は更にスレオニンデヒドラターゼの基質として４０ｍＭ Ｌ-スレオニン、並びにスレオニンデヒドラターゼ遺伝子のｌａｃＺ条件つき発現を誘発するために１ｍＭイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを含有する。知られている様に、Luria-Bertani培地は大腸菌中でアセトヒドロキシ酸合成活性の阻害に十分なＬ-バリンをすでに含有する（Umbarger，Biosynthesis of branched-Chainamino acids（1987）Escherichia coli and Salmonella typhimurium Vol 1,第352-367頁、American Society for Microbiology，ワシントンDC）これによってここに示した方法で可能な限り高いα-ケトブチラートの蓄積が得られる。スレオニン及びイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを含有するLuria-Bertani培地と共に、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド不含の同一培地を調製する。そこでスレオニンデヒドラターゼの誘発は行われない。次いで大腸菌ＪＭ１０９のクローン――これは試験すべきｐＢＭ２０誘導体を含有する――をこのプレート上に常法で塗布し、２４時間３７℃でインキュベートする。その後、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを含有する培地上で６０の変則的に増殖したコロニーを同定する。これはより僅か増殖、又はより淡色のコロニー又は亀裂のあるコロニー辺縁の点で優れているが、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイド不含コントロール培地上で正常に増殖する。このクローンは個々に同一の反復テスト（Nachtest）に付し、最後に最も際立った増殖遅れのクローンのうちの６つはこれらを含有するスレオニンデヒドラターゼの調節を確認するための生化学テストに付す。
１．２ 酵素の阻害の確認
大腸菌ＪＭ１０９の得られた組換えクローン６つを、ＬＢ液体培地１００ｍｌ――これは更に５０μｇアンピシリン／ｍｌを含有する――中に植菌し、３７℃でインキュベートする。光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）を追跡し、ＯＤ０．５の達成と同時にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノサイドを最終濃度ＯＤ０．５で添加する。もう１時間３７℃でインキュベーションした後、細胞を遠心分離によって集め、緩衝液ｐＨ７．０（０．１Ｍリン酸カリウム、０．５ｍＭ Ｌ-イソロイシン、０．２ｍＭリン酸ピリドキサール）で１回洗滌し、同一緩衝液中に取り、Branson-Sonifier Ｗ２５０中で超音波処理して（３分、２０％の間隔で拍動、出力２）分解する。細胞破片を分離するために、ホモジナートを１０分間１３０００ＵｐＭ及び４℃でSigma冷却遠心分離機中で遠心分離し、その後生じた澄明上澄液（粗抽出物）をスレオニンデヒドラターゼ活性及び−調節の測定のための酵素テストに使用する。
酵素テストは０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８．２）０．８ｍｌ、１ｍＭピリドオキザルホスフアート、４０ｍＭ Ｌ-スレオニン及び粗抽出物の最終容量で行われる。混合物を３０℃でインキュベートし、試料２００μｌを０〜３０分後に取り出す。スレオニンデヒドラターゼ反応を、夫々試剤１ｍｌの添加によって終了する。これは水１００ｍｌ中にセミカルバシド１ｇと酢酸ナトリウム０．９ｇを有する。３０℃で１５分のインキュベーション後、水３ｍｌを加え、吸光を２５４ｎｍでツァイス（Zeiss）スペクトルフォトメーターＰＭ６で測定する。コントロール及び０〜１．５μｍｏｌケトブチラートの標準値を同様に処理し、検量線から具体的に酵素テストで生じるスレオニンデヒドラターゼにより得られるケトブチラート量を算出する。平行して同一の試みを実施するが、これはスレオニンデヒドラターゼの阻害に関する試験のために５ｍＭ Ｌ-イソロイシンを含有する。この測定と無関係に、（Bradford，Anal Biochem 72（1976（248-254）に記載されている様に粗抽出物のたん白質含有量を測定する。得られた比活性及び阻害の度合は、表７から明らかである。
表７：突然変異したスレオニンデヒドラターゼ及びその阻害可能性をＬ-イソロイシンによって確認
１．３ 酵素の突然変異種類の確認
生成された酵素中で突然変異を測定するために、スレオニンデヒドラターゼをコードするプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９クローンから標準法に従って単離する。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子の突然変異領域の配列は、Sanger等によるジデスオキシヌクレオチド-終結法（Sanger等、Proceedings of the National Academy of Sciences，米国（1977）5463-5467）によって行われる。プライマーとして蛍光標識された配列特異的ヌクレオチドをファルマシア（Pharmacia）の対応する確実な指示に従って生成する（Pharmacia，Uppsala、スウェーデン）。このプライマーを１００ｍＭ酢酸トリメチルアミンｐＨ７．０中で５−３０％アセトニトリルの勾配を有する高圧液体クロマトグラフィーによって及びPharmacia SuperPacRPep-S,.5μｍによって精製する。プライマーを標準-配列化反応中で使用し、A.L.F．Sequencer（Pharmacia，Uppsala，スウェーデン）で蛍光検出による反応生成物の電気泳動の間及び自動的に検出し、生じる配列を記録する。
配列化に使用されるプライマー。塩基の位置は、Mockel等、J Bacteriol 174（1992）8065-8072による図３の配列に関連する。
塩基９５７−９５８：５’蛍光-ｄ（ＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧ）-３-
塩基１１７２−１１９１：５’蛍光-ｄ（ＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧ）-３-
塩基１３８１−１４００：５’蛍光-ｄ（ＣＣＴＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＴＣ）-３-
塩基１５８６−１６０７：５’蛍光-ｄ（ＣＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＧ）-３-
これによって確認された個々のスレオニンデヒドラターゼ遺伝子配列を公知の野性型遺伝子（Mockel等、J Bacteriol 174（1992）8065-8072）と比較する。生化学的に確認されたスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の個々の塩基交換を表８に示す。改変されたコドンを対応するアミノ酸中に普遍的な遺伝子暗号を用いて翻訳し、これを用いて確認されたアミノ酸交換――これはスレオニンデヒドラターゼの変化された調節を生じる――を同様に表８に示す。全領域にわたって非調節の表現型――これは突然変異に使用される――が得られる。突然変異体１４中に二重突然変異があり、これは酵素中で数種のアミノ酸交換が所望の非調節表現型を生じうることも示す。
得られた対立遺伝子を大腸菌／Ｃ．グルタミクムシャトルベクター中で再クローン化し、これをＣ．グルタミクムのスレオニン生成物中で発現することができる。
これに先ず大腸菌／Ｃ．グルタミクムシャトルベクターｐＫＷＯを公知のクローン化法（Sambrook等、Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，1989，Cold Spring Harbour Laboratory Press）に従って製造する。生じるベクターを図３に示す。大きさ９．５ｋｂであり、（ｉ）Ｃ．グルタクムレプリコンｐＧＡ２（Sonnen，Molekulargenetische Charakterisierung von Phagen-Beziehungenbei coryneformen Aminosaure-Produzenten，Dissertation，Technische Hochschule Darmstadt，1991）――これはＣ．グルタミクム中に低いコピー数しか生じない――、（ii）ｐＯＵ７１から大腸菌レプリコン（Larsen等、Gene 28（1984）45-54）――これは３０℃で１個のコピー／細胞を生じるが、４２℃で１０００個までのコピー／細胞を生じる――、（iii）ｐＨＹ１６３からテトラサイクリン耐性（Ishiwa及びShibahara，Jpn J Genet 60（1985）485-498）及び（iv）ｐＢＴＩ-１からｃｏｓ-部位（ベーリンガー・マンハイム）を含有する。ｉＩｖＡ対立遺伝子１４．１６及び１８並びに野性型対立遺伝子を１．１で製造されたｐＢＭ２０誘導体からＥｃｏＲＩ-フラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩで収縮されたベクターｐＫＷＯを連結し、ｐＫＷＯｉＩｖＡ、ｐＫＷＯｉＩｖＡ１４、ｐＫＷＯｉＩｖＡ１６、及びｐＫＷＯｉｌｖＡ３８を生じる。このプラスミドを用いてエレクトロポレーション（liebl等，FEMS Microbiol Lett 65（1985）299-304）によってスレオニン産生ＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１（Reinscheid et al.，Appl Evn Microbiol形質転換細胞として（1994）、in press）を形質転換する。ＭＨ２０−２２Ｂは、微生物に関するドイツ寄託機関にナンバーＤＳＭ６８７０で寄託されている。更にＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１（ＤＳＭ８８９０）及びＭＨ２０−２２Ｂ：ｐＳＵＲ５−ＤＲ１ ｐＫＷＯｉｌｖＡ１６はＤＳＭ８８８９である。これらの菌株を最小培地ＣＧＸＩＩ中で文献（Keilhauer等、J Bacteriol 175（1993）5595-5603）に記載されている様に培養し、７２時間のインキュベーション後培養培地中に蓄積されたアミノ酸を測定する。表９からＬ-イソロイシン生成の明らかな増加が突然変異対立遺伝子によって生じる。
Claims (14)
- Ｌ−イソロイシンの微生物による生成方法において、コリネバクテリウム グルタミクムから得られるインビトロで存在するスレオニンデヒドラターゼの遺伝子中で、上記酵素のアミノ酸配列の位置３１９のアミノ酸アラニンから上記酵素のアミノ酸配列の位置４３６のアミノ酸スレオニンまでのアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の内側で塩基交換することによって、上記酵素のアミノ酸配列の位置３２３のバリンをアラニンで置換するか（突然変異体３８）、又は位置３７７のアスパラギン酸をグリシンで置換し（突然変異体１６）、この様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子により、スレオニン又はＬ−イソロイシンを産生する宿主細胞を形質転換して形質転換体を得、この得られた形質転換体を培養することによりＬ−イソロイシンを生成する、上記生成方法。
- Ｌ−イソロイシンの微生物による生成方法において、コリネバクテリウム グルタミクムから得られるスレオニンデヒドラターゼのインビトロで存在する遺伝子中で、上記酵素のアミノ酸配列の位置３１９のアミノ酸アラニンから上記酵素のアミノ酸配列の位置４３６のアミノ酸スレオニンまでのアロステリックドメインをコードする遺伝子領域の外側で塩基交換することによって、上記酵素のアミノ酸配列の位置２７８のヒスチジンをアルギニンで置換し、及び上記アロステリックドメインをコードする遺伝子領域の内側で位置３５１のロイシンをセリンで置換し（突然変異体１４）、この様に突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子により、スレオニン又はＬ−イソロイシンを産生する宿主細胞を形質転換して形質転換体を得、この得られた形質転換体を培養することによりＬ−イソロイシンを生成する、上記生成方法。
- 突然変異したスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の形質転換に対する宿主細胞が、コリネバクテリウム グルタミクムである、請求項１又は２記載の方法。
- スレオニンデヒドラターゼ酵素のアミノ酸配列の位置３１９のアミノ酸アラニンから上記酵素のアミノ酸配列の位置４３６のアミノ酸スレオニンまでのアロステリックドメインをコードする遺伝子領域を有するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子において、この遺伝子が、位置３２３のバリンをアラニンで置換しているか、又は位置３７７のアスパラギン酸をグリシンで置換しているか、又は位置３８３のフェニルアラニンをシステインで置換したコリネバクテリウム グルタミクムに由来するスレオニンデヒドラターゼをコードする、上記スレオニンデヒドラターゼ遺伝子。
- スレオニンデヒドラターゼ酵素のアミノ酸配列の位置３１９のアミノ酸アラニンから上記酵素のアミノ酸配列の位置４３６のアミノ酸スレオニンまでのアロステリックドメインをコードする遺伝子領域を有するスレオニンデヒドラターゼ遺伝子において、この遺伝子が、位置２５７のアラニンをグリシンで置換しているか、又は位置１９９のメチオニンをバリンで置換しているか、又は位置２７８のヒスチジンをアルギニンで、及び位置３５１のロイシンをセリンで置換したコリネバクテリウム グルタミクムに由来するスレオニンデヒドラターゼをコードする、上記スレオニンデヒドラターゼ遺伝子。
- 請求項４又は５記載のスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を有するベクター。
- 遺伝子に前もって連結された、ＩＰＴＧによって誘発されるプロモーターを有する、請求項６記載のベクター
- 請求項４又は５記載のスレオニンデヒドラターゼ遺伝子を有する、形質転換された細胞。
- 請求項６記載のベクターを有する、形質転換された細胞。
- 請求項７記載のベクターを有する、形質転換された細胞。
- Ｌ−バリンによって阻害可能なアセトヒドロキシ酸合成酵素−活性を有する、請求項９又は１０記載の形質転換された細胞。
- 大腸菌Ｋ１２である、請求項１１記載の形質転換された細胞。
- コリネバクテリウム グルタミクムである、請求項８又は９記載の形質転換された細胞。
- 野性型−スレオニンデヒドラターゼをもはや合成しない、請求項８、９又は１３記載の形質転換された細胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4400926.7 | 1994-01-14 | ||
| DE4400926A DE4400926C1 (de) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Herstellung von L-Isoleucin mittels rekombinanter Mikroorganismen mit deregulierter Threonindehydratase |
| PCT/DE1995/000017 WO1995019442A1 (de) | 1994-01-14 | 1995-01-09 | Herstellung von l-isoleucin mittels rekombinanter mikroorganismen mit deregulierter threonindehydratase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09508011A JPH09508011A (ja) | 1997-08-19 |
| JP4471402B2 true JP4471402B2 (ja) | 2010-06-02 |
Family
ID=6507920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51876495A Active JP4471402B2 (ja) | 1994-01-14 | 1995-01-09 | 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるｌ−イソロイシンの生成方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6107063A (ja) |
| EP (1) | EP0739417B1 (ja) |
| JP (1) | JP4471402B2 (ja) |
| AT (1) | ATE248921T1 (ja) |
| DE (2) | DE4400926C1 (ja) |
| DK (1) | DK0739417T3 (ja) |
| ES (1) | ES2206488T3 (ja) |
| PT (1) | PT739417E (ja) |
| WO (1) | WO1995019442A1 (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6696561B1 (en) | 1909-07-09 | 2004-02-24 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| DE19548222A1 (de) * | 1995-12-22 | 1997-06-26 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern |
| US5959179A (en) * | 1996-03-13 | 1999-09-28 | Monsanto Company | Method for transforming soybeans |
| US6946588B2 (en) | 1996-03-13 | 2005-09-20 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use |
| US5958745A (en) * | 1996-03-13 | 1999-09-28 | Monsanto Company | Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants |
| CA2296759A1 (en) * | 1997-07-10 | 1999-01-21 | Purdue Research Foundation | Methods and compositions for producing plants and microorganisms that express feedback insensitive threonine dehydratase/deaminase |
| DE19907567B4 (de) * | 1999-02-22 | 2007-08-09 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin |
| KR100834991B1 (ko) | 1999-06-25 | 2008-06-05 | 백광산업 주식회사 | 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자 |
| US7270984B1 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-18 | Basf Aktiengesellschaft | Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum |
| US6884614B1 (en) | 1999-07-01 | 2005-04-26 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| DE19953206A1 (de) | 1999-11-05 | 2001-05-10 | Degussa | Plasmide aus Corynebacterium glutamicum und deren Verwendung |
| KR100451299B1 (ko) * | 2002-03-21 | 2004-10-06 | 씨제이 주식회사 | Ｌ―쓰레오닌의 제조방법 |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
| US7078234B2 (en) | 2002-12-18 | 2006-07-18 | Monsanto Technology Llc | Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof |
| EP2116606B1 (en) | 2003-03-28 | 2012-12-19 | Monsanto Technology, LLC | Novel plant promoters for use in early seed development |
| KR100498971B1 (ko) * | 2003-04-04 | 2005-07-04 | 씨제이 주식회사 | 염색체 내 ｔｄｃＢＣ 및 ｐｃｋＡ 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 제조하는 방법 |
| AU2003258886A1 (en) * | 2003-09-06 | 2005-03-29 | Cj Corporation | A method for producing l-threonine |
| EP1856264B1 (en) | 2005-02-26 | 2014-07-23 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| CA2606220A1 (en) | 2005-04-19 | 2006-12-21 | Basf Plant Science Gmbh | Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants |
| EP2151498A3 (en) | 2005-04-20 | 2010-12-15 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| AU2006245701B2 (en) | 2005-05-10 | 2011-04-28 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| DE102006050489A1 (de) | 2006-10-26 | 2008-04-30 | Evonik Degussa Gmbh | Allele des prpD1-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US20110035840A1 (en) | 2007-02-16 | 2011-02-10 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledoneous plants |
| WO2010118477A1 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof |
| WO2011003901A1 (en) | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants |
| AU2010325720A1 (en) | 2009-12-03 | 2012-07-19 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for embryo-specific expression in plants |
| CN106701853B (zh) * | 2016-12-02 | 2019-09-20 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种产l-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌发酵培养基及培养方法 |
| US11639512B2 (en) | 2017-03-21 | 2023-05-02 | Wuhan Grand Hoyo Co., Ltd. | Corynebacterium constitutive expression vector promoter screened on the basis of transcriptome sequencing, screening method thereof, and applications thereof |
| CN111321178B (zh) * | 2020-03-02 | 2023-07-28 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 一种l-2-氨基丁酰胺的制备方法 |
| KR102363913B1 (ko) * | 2020-06-26 | 2022-02-18 | 씨제이제일제당 (주) | L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 신규 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산 방법 |
| CN114540335A (zh) * | 2020-11-25 | 2022-05-27 | 湖南引航生物科技有限公司 | 固定化经修饰的苏氨酸转醛酶及其应用 |
| CN113430219B (zh) * | 2021-06-25 | 2022-06-07 | 新泰市佳禾生物科技有限公司 | 水稻色氨酸脱羧酶及其生产方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0245497A4 (en) * | 1985-11-12 | 1989-06-27 | American Biogenetics Corp | BIOGENETIC CASSETTE. |
| DE3942947A1 (de) * | 1989-12-23 | 1991-06-27 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin und dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
-
1994
- 1994-01-14 DE DE4400926A patent/DE4400926C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-01-09 EP EP95905043A patent/EP0739417B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-09 DE DE59510787T patent/DE59510787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-09 DK DK95905043T patent/DK0739417T3/da active
- 1995-01-09 AT AT95905043T patent/ATE248921T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-01-09 JP JP51876495A patent/JP4471402B2/ja active Active
- 1995-01-09 WO PCT/DE1995/000017 patent/WO1995019442A1/de active IP Right Grant
- 1995-01-09 ES ES95905043T patent/ES2206488T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-09 PT PT95905043T patent/PT739417E/pt unknown
- 1995-01-09 US US08/669,378 patent/US6107063A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT739417E (pt) | 2004-02-27 |
| DK0739417T3 (da) | 2004-01-05 |
| JPH09508011A (ja) | 1997-08-19 |
| EP0739417A1 (de) | 1996-10-30 |
| EP0739417B1 (de) | 2003-09-03 |
| US6107063A (en) | 2000-08-22 |
| DE4400926C1 (de) | 1995-06-01 |
| WO1995019442A1 (de) | 1995-07-20 |
| ATE248921T1 (de) | 2003-09-15 |
| ES2206488T3 (es) | 2004-05-16 |
| DE59510787D1 (de) | 2003-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4471402B2 (ja) | 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるｌ−イソロイシンの生成方法 | |
| Eichler et al. | Molecular characterization of the cai operon necessary for carnitine metabolism in Escherichia coii | |
| JP5486029B2 (ja) | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 | |
| Green et al. | Characterization and sequence of Escherichia coli pabC, the gene encoding aminodeoxychorismate lyase, a pyridoxal phosphate-containing enzyme | |
| JP4548864B2 (ja) | 直接発酵手段によるｄ―アミノ酸の調製 | |
| EP0620853B1 (en) | Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products | |
| JP6940690B2 (ja) | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| JP6935584B2 (ja) | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| KR101947959B1 (ko) | 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 | |
| JPWO2006035831A1 (ja) | Ｌ−アルギニン、ｌ−オルニチンまたはｌ−シトルリンの製造法 | |
| JP6997327B2 (ja) | Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ－アミノ酸の製造方法 | |
| JP4695855B2 (ja) | Ｌ−セリンによる阻害の減少を示す３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの変異体およびそれをコードする遺伝子、ならびにその使用 | |
| Eichler et al. | Cloning, nucleotide sequence, and expression of the Escherichia coli gene encoding carnitine dehydratase | |
| WO2005056776A1 (en) | E.coli mutant containing mutant genes related with tryptophan biosynthesis and production method of tryptophan by using the same | |
| KR20150115009A (ko) | 아코니트산수화 효소 유전자와(또는) 그 조절요소를 개조한 세균 발효를 통한 l-리신 생산방법 | |
| US5856148A (en) | Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products | |
| CN109790557B (zh) | 控制生物膜分散以产生氨基酸或氨基酸衍生产物 | |
| CN111770993A (zh) | 调节csr***以生产赖氨酸和赖氨酸衍生产物 | |
| EP4230723A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid | |
| EP1249494B1 (en) | Process for the biological production of l-pipecolic acid | |
| WO2001083787A1 (fr) | Nouveaux promoteurs et methode d'expression genique reposant sur l'utilisation desdits promoteurs | |
| CN111471631A (zh) | 发酵产生l-赖氨酸的方法 | |
| RU2268941C2 (ru) | Способ производства l-аминокислот посредством ферментации | |
| BRPI0715815A2 (pt) | micro-organismo cuja atividade de aspartato semialdeÍdo deidrogenase É reforÇada e o processo para produzir l-treonina usando o micro-organismo | |
| CN108456669B (zh) | 一种核糖体结合位点、重组表达质粒、转化子及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040824 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20041124 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050117 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050224 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050412 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050607 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20051118 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090915 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090925 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091015 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091022 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091113 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091124 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091204 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100302 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |