ES2206488T3 - Preparacion de l-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada. - Google Patents

Preparacion de l-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada.

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ES2206488T3 ES95905043T ES95905043T ES2206488T3 ES 2206488 T3 ES2206488 T3 ES 2206488T3 ES 95905043 T ES95905043 T ES 95905043T ES 95905043 T ES95905043 T ES 95905043T ES 2206488 T3 ES2206488 T3 ES 2206488T3
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Abstract

LA INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION MICROBIANA DE L-ISOLEUCINA. PARA ESTO, SE CAMBIAN IN VITRO UNA O DOS BASES DE LA REGION DE UN GEN QUE CODIFICA LOS DOMINIOS ALOSTERICOS DE LA ENZIMA TREONINA DEHIDRATASA DE TAL MANERA, QUE AL MENOS SE CAMBIA UN AMINOACIDO POR OTRO EN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LOS DOMINIOS ALOSTERICOS DE LA ENZIMA, POR LO QUE LA ENZIMA YA NO ESTA INHIBIDA POR EL SERVOMECANISMO DE LA LISOLEUCINA. AUN MAS, LOS CAMBIOS DE AMINOACIDOS CONCRETOS EN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS SE EFECTUAN EN UN GEN IN VITRO DE LA TREONINA DEHIDRATASA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM POR INTERCAMBIO DE BASES, TANTO FUERA COMO DENTRO Y FUERA DE LA REGION DEL GEN QUE CODIFICA LOS DOMINIOS ALOSTERICOS DE LA ENZIMA, POR TANTO DESPUES DE LA TRANSFORMACION DE ESTOS GENES MUTADOS DE TREONINA DEHIDRATASA EN UNA CELULA HUESPED QUE PRODUCE TREONINA O L-ISOLEUCINA, DESPUES SOLO VA A PRODUCIR LISOLEUCINA.

Description

Preparación de L-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada.
El invento se refiere a procedimientos para la preparación por vía microbiana de L-isoleucina de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, a genes de treonina deshidratasas de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 12, a vectores de acuerdo con las reivindicaciones 13 y 14, a células transformadas de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 21, así como a treonina deshidratasas de acuerdo con las reivindicaciones 22 y 23.
El aminoácido L-isoleucina es esencial para seres humanos y animales. Éste encuentra una amplia utilización en alimentos dietéticos así como en calidad de componente de diferentes mezclas nutritivas con un destino medicinal. También se usa L-isoleucina como aditivo o como reactivo en las industrias farmacéuticas y químicas.
Para la obtención de la L-isoleucina se emplean microorganismos, que segregan este aminoácido dentro del medio de fermentación. En este caso la formación de la L-isoleucina se efectúa de acuerdo con la ruta de biosíntesis representada en la Figura 1. Como asimismo se demuestra en la Figura 1, hay en la biosíntesis de la L-isoleucina enzimas claves, y concretamente la aspartato cinasa, la homoserina deshidrogenasa y la treonina deshidratasa. La actividad de la aspartato cinasa y de la homoserina deshidrogenasa es inhibida en retroacción por el aminoácido L-treonina, asimismo formado en el marco de la biosíntesis de la L-isoleucina, mientras que la enzima clave treonina deshidratasa, que es específica para la síntesis de L-isoleucina, es inhibida en retroacción por el producto final de la cadena de biosíntesis, L-isoleucina.
Con el fin de aumentar la formación de L-isoleucina, se intentó en el pasado constantemente de manera renovada, obtener mutantes de organismos productores de L-isoleucina, que formen L-isoleucina en cantidad aumentada en comparación con los tipos salvajes.
Para la obtención de tales mutantes, se llevaron a cabo exclusivamente mutagénesis in vitro, es decir se hizo actuar un agente mutágeno sobre todo el genoma. Acerca de la resistencia frente a compuestos análogos a aminoácidos, se seleccionaron los microorganismos mutados, cuyas enzimas claves, antes mencionadas, ya no estaban sujetas a ninguna inhibición en retroacción.
Así, por ejemplo, en el documento de patente de los EE.UU. US-PS 4.329.427 se describe una mutación, que conduce a una resistencia frente al \alpha-amino-butirato o al isoleucina-hidroxamato, según la cual los microorganismos producen ciertamente L-isoleucina en una cantidad aumentada, pero quedaba sin aclarar cuales enzimas ya no eran inhibidas en retroacción.
En los documentos US-PS 4.442.208 y 4.602.983 se describe que después de una mutagénesis in vivo se podía aislar un fragmento de ADN - no definido con mayor exactitud - que confiere resistencia frente al ácido \alpha-amino-hidroxi-valeriánico. Después de una transferencia de este fragmento a una cepa de Corynebacterium o bien de Brevibacterium, éstas cepas producían L-isoleucina en una cantidad aumentada.
También se describen procedimientos, en los que por síntesis en exceso de enzimas clave, todavía reguladas en retroacción, se puede formar L-isoleucina en una cantidad aumentada (compárense por ejemplo los documentos de publicación de solicitud de patente alemana DE-OS 3.942.947 y de solicitud de patente europea EP-OS 0.137.348).
A partir del documento de solicitud de patente europea EP-A-0.436.886 se conoce el aislamiento de un gen mutado de treonina deshidratasa procedente de Corynebacterium glutamicum.
A partir de la cita de "Gene, 63, 1988, 245-252, Taillon, B. E. y colaboradores" se conocen la secuencia de un gen de tipo salvaje de Tda procedente de E. coli K12, así como la secuencia de Tda de dos mutantes, que ya no son inhibidos en retroacción por isoleucina.
Considerados en conjunto, todos los procedimientos descritos hasta ahora, para la elevación de la producción de L-isoleucina, tienen en común la característica de que las mutaciones conducían más bien accidentalmente a enzimas claves desreguladas, que no están sujetas a ninguna inhibición en retroacción, y además de ello se aumentaba la síntesis de aminoácidos.
Es misión del invento, proporcionar procedimientos para la preparación por vía microbiana de L-isoleucina, mediante el cual se modifique deliberadamente mediante mutaciones definidas la enzima clave de la biosíntesis de L-isoleucina -la treonina deshidratasa-, de tal manera que ya no se efectúe una inhibición en retroacción por la L-isoleucina.
El problema planteado por la misión que constituye el fundamento del invento, se resuelve mediante el recurso de que en un gen de una treonina deshidratasa, presente in vitro, se intercambian por mutación una o varias bases en la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, de tal manera que por lo menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos del dominio alostérico de la enzima se reemplace por otro aminoácido, de tal manera que la enzima ya no sea inhibida en retroacción por la L-isoleucina. La expresión "gen presente in vitro" significa aquí que el gen de treonina deshidratasa, antes de la mutación, es clonado, es decir que por lo tanto es aislado e incorporado en un vector. La realización de la mutagénesis mediante uno o varios intercambio(s) de bases se efectúa de acuerdo con un método conocido, por ejemplo de acuerdo con el método de Ito y colaboradores (Gene 102 (1991) 67-70). Después de una transformación de los genes de treonina deshidratasas, mutados de tal manera, en el seno de una célula hospedante productora de treonina o L-isoleucina, ésta forma L-isoleucina en una cantidad aumentada.
En principio, un gen de treonina deshidratasa, clonado o bien presente in vitro, puede proceder de una bacteria arbitraria. Puesto que la Corynebacterium glutamicum se cuenta entre las "clásicas" productoras de aminoácidos, el gen procede preferiblemente de este microorganismo, en particular de la cepa ATCC 13032. La secuencia de ADN del gen de treonina deshidratasa procedente de esta cepa de Corynebacterium glutamicum ya es conocida (compárese la cita de Möckel y colaboradores, J. Bacteriol., 174 (1992) 8065-8072). Después del intercambio de bases en la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, se obtienen por ejemplo las secuencias de ADN que se exponen en la Tabla 1 (que corresponde a Seq ID No. 1), en la Tabla 2 (que corresponde a Seq ID No. 3) y en la Tabla 3 (que corresponde a Seq ID No. 5). En las tablas, la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima está subrayada y los sitios de los intercambios de bases se hacen reconocibles por un subrayado adicional.
Después de haber llevado a cabo la mutagénesis, los genes mutados in vitro se incorporan en un plásmido, en el que se puede inducir la expresión del gen de treonina deshidratasa. Como plásmidos se adecuan por ejemplo los pVC 19 o pKK 223-3 (Amman y colaboradores, Gene 25, 167). Después de la incorporación de los genes mutados en un plásmido apropiado, éstos se transforman en el seno de una cepa bacteriana apropiada.
Con el fin de obtener los clones, que realmente contienen también los plásmidos con los genes mutados de treonina deshidratasas, los deseados transformantes se pueden aislar acerca de la resistencia a compuestos análogos a aminoácidos, entrando en consideración como compuestos análogos, por ejemplo, \beta-metil-norleucina, isoleucina-hidroxamato o hidroxi-isoleucina.
Un aislamiento más sencillo y más planificado se consigue, sin embargo, mediante el recurso de que los genes modificados de treonina deshidratasas se transforman en el seno de un microorganismo, cuya actividad de acetohidroxiácido sintasa se puede inhibir mediante L-valina. Como transformantes se adecuan p.ej. cepas de Escherichia coli K 12, de modo preferido las cepas JM 109 o DH 5. Los transformantes se llevan a continuación a un medio sólido, que contiene L-isoleucina para la inhibición de la treonina deshidratasa y L-valina para la metabolización del cetobutirato por la acetohidroxiácido sintasa (Umbarger: Escherichia coli and Salmonella typhimurium [Escherichia coli y Salmonella typhimurium], 1 (1987) 352-367). Al medio se le añaden adicionalmente de modo preferente una sustancia destinada a la inducción del gen de treonina deshidratasa, así como L-treonina como substrato para la deshidratasa. Como sustancia destinada a la inducción del gen de treonina deshidratasa se utiliza preferiblemente IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido), de manera tal que, delante del gen modificado de treonina deshidratasa, se dispone en el vector un promotor inducible por IPTG. Los clones, que contienen una treonina deshidratasa desregulada, convierten a la L-treonina de una manera no inhibida en cetobutirato. Puesto que la conversión ulterior del cetobutirato mediante la acetohidroxiácido sintasa es inhibida por la L-valina añadida, se acumula cetobutirato, lo cual tiene como consecuencia que los clones, que contienen una treonina deshidratasa desregulada, crecen peor a causa de la conocida toxicidad del cetobutirato (La Rossa y Schloss, J. Biol. Chem. 259 (1984) 8753-8757). El peor crecimiento se exterioriza en la formación de colonias de menor tamaño, de colonias más traslúcidas o de colonias con un contorno quebrado de colonia. Estas colonias se pueden evacuar con facilidad por inoculación y por lo tanto se pueden aislar fácilmente clones con una deshidratasa desregulada.
Este método de aislamiento se puede aplicar evidentemente también en los transformantes que contienen un gen clonado de treonina deshidratasa, que ha sido modificado por otros tipos de mutaciones, distintas de las realizadas por intercambio de bases, de tal manera que la correspondiente enzima ya no está sujeta a ninguna inhibición por retroacción.
Una alternativa conforme al invento para la resolución del problema planteado por la mencionada misión, consiste en que en un gen, presente in vitro, de una treonina deshidratasa procedente de Corynebacterium glutamicum, mediante intercambio de bases fuera de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el aminoácido alanina situado en la posición 257 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido glicina (Tabla 4 y respectivamente Seq ID No. 8) o el aminoácido metionina situado en la posición 199 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido valina (Tabla 5 y respectivamente Seq ID No. 10), después de lo cual, tras una transformación de los genes de treonina deshidratasas, que se han mutado de esta manera, en el seno de una célula hospedante productora de treonina o de L-isoleucina, ésta forma L-isoleucina en una cantidad aumentada.
Una alternativa adicional a la resolución del problema planteado, consiste en que en un gen de una treonina deshidratasa procedente de Corynebacterium glutamicum, mediante intercambio de bases fuera de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el aminoácido histidina situado en la posición 278 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido arginina, y dentro de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el aminoácido leucina situado en la posición 351 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido serina (Tabla 6 y respectivamente Seq ID No. 12), después de lo cual, tras una transformación de un gen de treonina deshidratasa, que se ha mutado de esta manera, en el seno de una célula hospedante productora de treonina o de L-isoleucina, ésta forma asimismo L-isoleucina en una cantidad aumentada.
Como célula hospedante para la transformación de un gen mutado de treonina deshidratasa, o bien como cepa productora, se adecua preferiblemente Corynebacterium glutamicum, y en particular la cepa depositada en la DSM bajo el número 8890. Como transformantes son obtenibles por ejemplo las cepas depositadas en la DSM bajo los números 8885 y 8891, que segregan L-isoleucina en cantidad aumentada dentro del medio de fermentación. También es útil utilizar como cepas productoras o respectivamente células hospedantes para la transformación, aquellas que ya no sintetizan la treonina deshidratasa de tipo salvaje todavía regulada por L-isoleucina, de tal manera que en las células solamente una treonina deshidratasa desregulada cataliza la conversión de L-treonina.
Ejemplos de realización 1. Producción de enzimas mutadas que ya no están sometidas a ninguna inhibición en retroacción 1.1 Selección de las enzimas deseadas
El conocido plásmido pBMi/ExoB, que codifica la treonina deshidratasa regulada del tipo salvaje de Corynebacterium glutamicum (Möckel y colaboradores, J. Bacteriol., 174 (1992) 8065-8072), se aisló de acuerdo con procedimientos conocidos (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Handbook [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press). A continuación se digirió con la enzima de restricción EcoR1 y se aisló el fragmento con un tamaño de 1.573 pares de bases, que contenía el gen de treonina deshidratasa. Este fragmento se ligó en el sitio de corte con EcoR1 del conocido vector pUC19 (Vieira y Messing, Gene 19 (1976) 259-268), y con ello se obtuvo el plásmido pBM20 (Figura 2), en el que seguidamente se presenta el gen de treonina deshidratasa procedente de C. glutamicum, que por sí mismo no es expresado en E. coli (Cordes y colaboradores, Gene 112 (1992) 113-115), en la cepa de laboratorio patrón E. coli JM109 bajo el control del promotor lacZ, inducible por isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido, del vector original pUC19.
Para la introducción de las mutaciones no dirigidas en el dominio alostérico de la treonina deshidratasa, se sintetizaron de una manera conocida dos cebadores de ADN:
1
El cebador en 5' es homólogo con respecto al sitio de corte con NcoI (subrayado) en el gen de treonina deshidratasa. El cebador en 3' es homólogo con respecto al sitio de reconocimiento por HindIII (subrayado) del sitio de clonación múltiple del vector de partida pUC19.
Con ambos cebadores se llevó a cabo seguidamente una reacción en cadena de polimerasa (PCA, de Polymerase Chain Reaction) (Tindall y Kunkel, Biochemistry 27 (1988) 6008-6013) en el que por medio de la reacción inespecífica de la polimerasa Tag (Leung y colaboradores, Technique 1 (1989) 11-15) se forman nuevos fragmentos de ADN que contienen mutaciones. La tanda de reacción contenía en un volumen final de 100 \mul: 20 \mul del cebador en 5' (25 \mug/ml), 20 \mul del cebador en 3' (25 \mug/ml), 1 ng de un molde (pBM20), 100 \muM de ATP (adenina-trifosfato), 100 \muM de una mezcla de los dNTP (nucleótido-trifosfatos), 10 \mul de 10 x tampón de Taq (100 mM de Tris, 15 mM de MgCl_{2}, 500 mM de KCl, gelatina 1 mg/ml, de pH 8,3), 0,5 U (unidades) de la polimerasa Tag (5 U/\mul), 0,5 mM de MnCl_{2}. Como condiciones de reacción se ajustaron una Time Delay File (fila de retardo en el tiempo) de 94ºC (durante 3 min), una Thermo Cycle File (fila de ciclo térmico) de 94ºC (durante 1 min), de 55ºC (durante 2 min), de 72ºC (durante 3 min), una Soak File (fila de empapamiento) de 4ºC, una Segment Extension (prolongación de segmento) de 10 s (segundos) con un número de 30 ciclos. Después de la reacción, los fragmentos de ADN se purificaron (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press), se digirieron con NcoI y con HindIII, y se ligaron con pBM20, desde el que previamente se había separado por corte el correspondiente fragmento de NcoI -HindIII con 743 pares de bases, que codifica el dominio alostérico de la treonina deshidratasa del tipo salvaje.
Con estos productos de ligación, generados in vitro, que también contenían genes mutados de treonina deshidratasas, se transformó seguidamente E. coli JM109 de acuerdo con procedimientos conocidos (Hanahan, Techniques for Transformation of E. coli (1985) DNA cloning [Técnicas para la transformación de E. coli (1986) clonación de ADN], Volumen 1, páginas 109-136, IRL Press Oxford), y se obtuvieron clones que contenían aproximadamente 10.000 plásmidos en un medio de Luria - Bertani (LB) (Lennox, Virology [Virología] 1 (1955) 190-206)), que contenía 50 \mug/ml de ampicilina.
Con la finalidad de identificar entonces los clones, que codifican una treonina deshidratasa que ya no se puede inhibir por retroacción, se preparó un medio de Luria - Bertani (LB), que adicionalmente contenía 40 mM de L-treonina como substrato de la treonina deshidratasa, así como 1 mM de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido para la inducción de la expresión, condicionada por lacZ, del gen de treonina deshidratasa. Tal como es conocido, el medio de Luria - Bertani ya contiene suficiente cantidad de L-valina para la inhibición de la actividad de acetohidroxiácido sintasa en E. coli (Umbarger: Biosynthesis of branched-chain amino acids (1987) Escherichia coli and Salmonella typhimurium [Biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada (1987) Escherichia coli y Salmonella typhimurium], volumen 1, páginas 352-367, American Society for Microbiology [Sociedad Americana de Microbiología], Washington DC), para conseguir con ello en el procedimiento aquí descrito una acumulación lo más alta que sea posible de \alpha-cetobutirato. Junto al medio de Luria - Bertani, que contenía treonina e isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido, para el testigo de control se utilizó el mismo medio sin isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido, en donde por lo tanto no se efectúa ninguna inducción de la treonina deshidratasa. A continuación, los clones de E. coli JM109, que contenían los derivados de pBM20 que se habían de probar, se estamparon sobre estas placas de una manera convencional, y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. A continuación de ello, se pudieron identificar en el medio, que contenía isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido, 60 colonias que crecían anormalmente, las cuales se distinguían por un menor crecimiento, o por una colonia más pálida, o por un borde quebrado de colonia, pero que crecían normalmente en el medio testigo sin isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido. Estos clones se sometieron individualmente a un ensayo de repaso idéntico, y finalmente 6 de los clones con un retraso máximamente pronunciado se sometieron a un ensayo bioquímico para efectuar la caracterización de la regulación de las treonina deshidratasas que ellos contenían.
1.2 Caracterización de la inhibición de las enzimas
Seis de los clones recombinantes de E. coli JM109, así obtenidos, se inocularon en 100 ml de un medio líquido LB, que contenía adicionalmente 50 \mug de ampicilina/ml, y se incubaron a 37ºC. La densidad óptica (OD_{500 \ nm}) se vigiló, y al alcanzarse la OD de 0,5, se añadió isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido en una concentración final de 0,5 mM. Después de una incubación durante una hora más a 37ºC, las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron una vez con un tampón de pH 7,0 (0,1 M de fosfato de potasio, 0,5 mM de L-isoleucina, 0,2 mM de fosfato de piridoxal), se recogieron en 1 ml del mismo tampón, y se desintegraron mediante tratamiento con ultrasonidos en el aparato Branson-Sonifier W250 (durante 3 minutos, pulsado con un intervalo de 20%, potencia disponible de 2). Con el fin de separar los desperdicios celulares, el material homogeneizado se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm (revoluciones por minuto) y a 4ºC en una centrífuga refrigerada de Sigma, y después de ello el resultante material sobrenadante transparente (extracto bruto) se usó en el ensayo enzimático para la determinación y la regulación de la actividad de treonina deshidratas.
El sistema de ensayo enzimático contenía, en un volumen final de 0,8 ml, 0,1 M de fosfato de potasio (de pH 8,2), 1 mM de fosfato de piridoxal, 40 mM de L-treonina, y un extracto bruto. La tanda se incubó a 30ºC y se sacaron muestras de 200 \mul después de 0 y 30 minutos. La reacción de treonina deshidratasa se hizo terminar en cada caso por adición de 1 ml de un reactivo. Éste constaba de 1 g de una semicarbazida más 0,9 g de acetato de sodio en 100 ml de agua. Después de una incubación durante 15 minutos a 30ºC, se añadieron a ello 3 ml de agua, y la extinción a 254 nm se determinó en el fotómetro espectral PM6 de Zeiss. Los valores testigos y de calibración con 0 a 1,5 \mumol de cetobutirato se trataron de una manera idéntica, y a partir de una curva de calibración se averiguó la cantidad de cetobutirato, realmente formada en el ensayo enzimático por la treonina deshidratasa. Paralelamente a ello, se llevó a cabo el tratamiento de tandas idénticas, que para efectuar la comprobación en cuanto a la inhibición de la treonina deshidratasa contenían 5 mM de L-isoleucina. Independientemente de esta determinación, se determinó, tal como se ha descrito (por Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254), el contenido en proteínas de los extractos brutos. Las actividades específicas obtenidas y el grado de la inhibición pueden observarse a partir de la Tabla 7.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 7
2
Puede observarse directamente que las enzimas mutadas 38 y 14 se presentan sin ninguna inhibición alostérica por L-isoleucina. La enzima de la mutante 31 tiene, en presencia de L-isoleucina, todavía un 30% de actividad restante, al contrario de lo cual la enzima del tipo salvaje tiene, en estas condiciones, solamente un 15% de actividad restante.
1.3 Caracterización del sitio con mutación de las enzimas
Con el fin de determinar las mutaciones en las enzimas producidas, los plásmidos que codifican treonina deshidratasas se aislaron a partir de los clones en E. coli JM109 de acuerdo con procedimientos clásicos. La secuenciación de la región mutada del gen de treonina deshidratasa se efectuó con ayuda del método de terminación con didesoxinucleótidos de acuerdo con Sanger y colaboradores (Sanger y colaboradores. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA [Actuaciones de la Academia Nacional de las Ciencias, EE.UU.] (1977) 5463-5467). Como cebadores se sintetizaron nucleótidos específicos para secuencias, marcados con fluoresceína, de acuerdo con la correspondiente prescripción de la entidad Pharmacia (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Estos cebadores se purificaron mediante cromatografía de líquido a alta presión (HPLC) con un gradiente de 5-30% de acetonitrilo en 100 mM de acetato de trietil-amina de pH 7,0 y el Pep-S de 5 \mum Super Pac® de Pharmacia. Los cebadores se emplearon en una reacción de secuenciación patrón y durante la electroforesis los productos de la reacción se detectaron automáticamente por detección de la fluorescencia en el secuenciador A.L.F. Sequencer (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y se anotó la secuencia resultante.
Cebadores utilizados para la secuenciación. La posición de las bases se refiere a la secuencia reseñada en la Figura 3 en la cita de Möckel y colaboradores, J. Bacteriol., 174 (1992) 8065-8072.
Bases 957-958: 5'fluoresceína-d(GGTCAGGGCACCGTGGCTGCTG)-3'
Bases 1.172-1.191: 5'fluoresceína-d(GGAGACTGGTTGATCCCTTTG)-3'
Bases 1.381-1.400: 5'fluoresceína-d(CCTTGCACCTGGTTCTGTC)-3'
Bases 1.586-1.607: 5'fluoresceína-d(CCTCAAGCGCAACAACCGTGAG)-3'
La secuencia comprobada con ello de los genes de treonina deshidratasas individuales se comparó con la conocida del gen de tipo salvaje (Möckel y colaboradores, J. Bacteriol., 174 (1992) 8065-8072). Los intercambios individuales de bases de los genes de treonina deshidratasas, caracterizados por vía bioquímica, se reproducen en la Tabla 8. Los codones modificados se tradujeron en los correspondientes aminoácidos con ayuda del código genético universal y los intercambios de aminoácidos comprobados con ello, que conducen a la regulación modificada de la treonina deshidratasa, se reseñan asimismo en la Tabla 8. Se obtuvieron mutaciones con un fenotipo desregulado a lo largo de toda la zona, que se había empleado para la mutación. En la mutante 14 se presenta una doble mutación, lo cual muestra que también varios intercambios de aminoácidos en una enzima pueden conducir al deseado fenotipo desregulado.
TABLA 8
3
2. Determinación de la segregación de isoleucina por enzimas desreguladas
Los alelos obtenidos se cambiaron de clon (transclonaron) en vectores de lanzadera (shuttle) E. coli/C. glutamicum, para poder expresarlos de esta manera en una cepa productora de treonina de C. glutamicum.
Para ello se produjo en primer lugar el vector de lanzadera (shuttle) E. coli/C. glutamicum pKW0 de acuerdo con procedimientos conocidos de clonación (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press). El vector resultante se representa en la Figura 3. Éste tiene un tamaño de 9,5 kb, y contiene (i) el replicón pGA2 en C. glutamicum (Sonnen, Molekulargenetische Charakterisierung von Phagen-Wirt-Beziehungen bei coryneformen Aminosäure - Produzenten [Caracterización genética molecular de relaciones entre un fago y un hospedante en productoras corineformes de aminoácidos], Tesis Doctoral, Escuela Técnica Superior de Darmstadt, 1991), que conduce a un número solamente pequeño de copias en C. glutamicum, (ii) el replicón en E. coli procedente de pOU71 (Larsen y colaboradores, Gene 28 (1984) 45-54), que conduce a una copia por célula a 30ºC, pero a hasta 1.000 copias por célula a 42ºC, (iii) la resistencia a tetraciclina procedente de pHY163 (Ishiwa y Shibahara, Jpn. J. Genet. 60 (1985) 485-498)), y (iv) el sitio cos procedente de pBTI-1 (Boehringer, Mannheim). Los alelos 14, 16 y 18 de ilvA, así como el alelo de tipo salvaje se aislaron como fragmentos en EcoRI a partir de los derivados de pBM20 preparados bajo el apartado 1.1, y se ligaron con el vector pKW0 restringido con EcoRI, para proporcionar los pKW0ilvA, pKW0ilvA14, pKW0ilvA16, y pKW0ilvA38. Con estos plásmidos se transformó mediante electroporación (Liebl y colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 65 (1985) 299-304) la productora de treonina MH20-22B::pSUR5-DR1 (Reinscheid y colaboradores, Appl. Env. Microbiol. 1994, 60, 126 - 132). La MH20-22B se ha depositado en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen [ColecciónAlemana de Microorganismos] bajo el número DSM 6870, al igual que las MH20-22B::pSUR5-DR1 (DSM 8890) y MH20-22B::pSUR5-DR1 pKW0ilvA16 (DSM 8889). Estas cepas se cultivaron en el medio mínimo CGXII como se ha descrito (por Keilhauer y colaboradores, J. Bacteriol. 175 (1993) 5595-5603), y después de una incubación durante 72 horas se determinaron los aminoácidos acumulados en el medio de cultivo. A partir de la Tabla 9 se pone de manifiesto el inequívoco aumento de la formación de L-isoleucina por los alelos de las mutantes.
TABLA 9
4
En un experimento adicional el alelo de tipo salvaje y el de la mutante 38 se integraron en el vector en péndulo con alto número de copias (high copy) pECM3 (A. Schäfer, Trabajo para Diplomatura, 1991, Universidad de Bielefeld). Los fragmentos se aislaron de nuevo como fragmentos de EcoRI a partir de los derivados de pBM20 preparados bajo el apartado 1.1, y se ligaron con el vector restringido con EcoRI, para proporcionar los pECM3ilvA y pECM3ilvA38. Con estos plásmidos se transformó mediante electroporación (Liebl y colaboradores, FEMS Microbiol. Lett. 65 (1985) 299-304) la productora de treonina MH20-22B::pSUR5-DR1 (Reinscheid y colaboradores, Appl. Env. Microbiol. 1994, 60, 126 - 132). La MH20-22B se ha depositado en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen [Colección Alemana de Microorganismos] bajo el número DSM 6870, al igual que las MH20-22B::pSUR5-DR1 (DSM 8890) y MH20-22B::pSUR5-DR1 pECM3ilvA38 (DSM 8891). Estas cepas se cultivaron en el medio mínimo de MH20-22B tal como se ha descrito (por Schrumpf y colaboradores Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 566-571), y después de una incubación durante 72 horas se determinó la cantidad acumulada de aminoácidos. A partir de la Tabla 10 se desprende de nuevo el inequívoco aumento de la formación de L-isoleucina por el respectivo alelo de mutante.
TABLA 10
5 
\newpage
TABLA 1
Mutante 38
6 
\newpage
TABLA 2
Mutante 16
7 
\newpage
TABLA 3
Mutante 31
8 
\newpage
TABLA 4
Mutante 50
9 
\newpage
TABLA 5
Mutante 54
10 
\newpage
TABLA 6
Mutante 14
11
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Forschungszentrum Juelich
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Apartado de Correos 1913
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
LOCALIDAD: Juelich
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 52428
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DEL INVENTO: Preparación de L-isoleucina mediante microorganismos recombinantes con una treonina deshidratasa desregulada
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 12
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Tipo de medio: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE:
PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum 
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 38
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cm
producto "treonina deshidratasa"/ 
\hskip6cm
gen = "ilvA" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
12
13
14 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
15
16
17 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum 
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 16
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cm
producto "treonina deshidratasa"/ 
\hskip6cm
gen = "ilvA" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
21
22 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum 
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 31
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: / número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cm
producto "treonina deshidratasa"/ 
\hskip6cm
gen = "ilvA" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
23
24
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
26
27 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum 
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 50
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: / número _EC = 4.2.1.16 /
\hskip6cm
producto "treonina deshidratasa" / 
\hskip6cm
gen = "ilvA" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
28
29
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
31
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum 
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 54
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cm
producto "treonina deshidratasa"/ 
\hskip6cm
gen = "ilvA" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
33
34
35 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
36
37 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.925 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPÓTESIS: NO HAY
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Corynebacterium glutamicum 
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: Mutante 14
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN; 432...1742
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /número _EC = 4.2.1.16/
\hskip6cm
producto "treonina deshidratasa"/ 
\hskip6cm
gen = "ilvA" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
38
39
40 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 436 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
41
42
43

Claims (23)

1. Procedimiento para la producción por vía microbiana de L-isoleucina, en el que en un gen, presente in vitro, de una treonina deshidratasa - que participa en la síntesis microbiana de la L-isoleucina como enzima clave -, se intercambian por mutación una o varias bases en la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, de tal manera que por lo menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos del dominio alostérico de la enzima se reemplace por otro aminoácido, de tal manera que la enzima ya no sea inhibida en retroacción por la L-isoleucina, tras de lo cual después de una transformación del gen de treonina deshidratasa, mutado de tal manera, en el seno de una célula hospedante productora de treonina o L-isoleucina, ésta forma L-isoleucina en una cantidad aumentada.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque
el gen de treonina deshidratasa, presente in vitro para la mutagénesis, procede de Corynebacterium glutamicum.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque
para el aislamiento de clones con una treonina deshidratasa desregulada, es decir que no está sujeta a ninguna inhibición en retroacción por L-isoleucina, los genes de treonina deshidratasa, modificados por mutación, se transforman en el seno de un microorganismo, cuya actividad de treonina deshidratasa puede ser inhibida por L-valina, después de lo cual, tras un crecimiento de los transformantes en un medio sólido que contiene L-isoleucina y L-valina, los clones que contienen una treonina deshidratasa desregulada se obtienen evacuando por inoculación las colonias con una morfología modificada por acumulación de cetobutirato.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizado porque
el medio contiene adicionalmente una sustancia destinada a la inducción del gen de treonina deshidratasa.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4,
caracterizado porque
la sustancia destinada a la inducción del gen de treonina deshidratasa es IPTG.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5,
caracterizado porque
el medio contiene adicionalmente L-treonina en calidad de substrato para la treonina deshidratasa.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las la reivindicaciones 3 a 6,
caracterizado porque
los genes de treonina deshidratasas, modificados por mutación, se transforman en el seno de Escherichia coli K 12.
8. Procedimiento para la producción por vía microbiana de L-isoleucina, en el que en un gen, presente in vitro, de una treonina deshidratasa - que participa en la síntesis microbiana de la L-isoleucina como enzima clave - procedente de Corynebacterium glutamicum, mediante intercambio de bases fuera de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el aminoácido alanina situado en la posición 257 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido glicina (Tabla 4 y respectivamente Seq ID No.8) o el aminoácido metionina situado en la posición 199 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido valina (Tabla 5 y respectivamente Seq ID No.10), después de lo cual, tras una transformación de los genes de treonina deshidratasas, que se han mutado de esta manera, en el seno de una célula hospedante productora de treonina o de L-isoleucina, ésta forma L-isoleucina en una cantidad aumentada.
9. Procedimiento para la producción por vía microbiana de L-isoleucina, en el que en un gen, presente in vitro, de una treonina deshidratasa - que participa en la síntesis microbiana de la L-isoleucina como enzima clave - procedente de Corynebacterium glutamicum, mediante intercambio de bases fuera de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el aminoácido histidina situado en la posición 278 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido arginina, y dentro de la región del gen que codifica el dominio alostérico de la enzima, el aminoácido leucina situado en la posición 351 de la secuencia de aminoácidos de la enzima se reemplaza por el aminoácido serina (Tabla 6 y respectivamente Seq ID No.12), después de lo cual, tras una transformación de un gen de treonina deshidratasa, que se ha mutado de esta manera, en el seno de una célula hospedante productora de treonina o de L-isoleucina, ésta forma L-isoleucina en una cantidad aumentada.
10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque
la célula hospedante para la transformación de un gen mutado de treonina deshidratasa es Corynebacterium glutamicum.
11. Gen de treonina deshidratasa con una región de gen que codifica el dominio alostérico de la treonina deshidratasa, que ha sido modificada por un intercambio de bases,
caracterizado por
una secuencia de ADN según una de las secuencias de nucleótidos representadas en las Seq ID No. 1, 3 y 5 (o en las Tablas 1, 2 y 3), siendo las Seq ID No. 1, 3 y 5 partes integrantes de la reivindicación.
12. Gen de treonina deshidratasa con una región de gen que codifica eldominio alostérico de la treonina deshidratasa, que ha sido modificada por uno o dos intercambios de bases,
caracterizado por
una secuencia de ADN según una de las secuencias de nucleótidos representadas en las Seq ID No. 7, 9 y 11 (o en las Tablas 4, 5 y 6), siendo las Seq ID No. 7, 9 y 11 partes integrantes de la reivindicación.
13. Vector, que contiene un gen de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 a 12.
14. Vector de acuerdo con la reivindicación 13 con un promotor inducible por IPTG, dispuesto delante del gen.
15. Célula transformada, que contiene un gen de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 a 12.
16. Célula transformada, que contiene un vector de acuerdo con la reivindicación 13.
17. Célula transformada, que contiene un vector de acuerdo con la reivindicación 14.
18. Célula transformada de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17 con una actividad de acetohidroxiácido sintasa que se puede inhibir por L-valina.
19. Célula transformada de acuerdo con la reivindicación 18,
caracterizada porque
es Escherichia coli K 12.
20. Célula transformada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16
caracterizada porque
es Corynebacterium glutamicum.
21. Célula transformada de acuerdo con la reivindicación 15, 16 ó 20,
caracterizada porque
ya no sintetiza la treonina deshidratasa de tipo salvaje.
22. Treonina deshidratasa con un dominio alostérico modificado por un intercambio de aminoácidos,
caracterizado por
una secuencia de aminoácidos según una de las secuencias representadas en las Seq ID No. 2, 4 y 6 (o en las Tablas 1, 2 y 3), siendo las Seq ID No. 2, 4 y 6 partes integrantes de la reivindicación.
\newpage
23. Treonina deshidratasa con un dominio alostérico modificado por uno o dos intercambios de aminoácidos,
caracterizado por
una secuencia de aminoácidos según una de las secuencias representadas en las Seq ID No. 8, 10 y 12 (o en las Tablas 4, 5 y 6) siendo las Seq ID No. 8, 10 y 12 partes integrantes de la reivindicación.
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