JPH09136899A - 天然のコロニー促進因子−１の精製 - Google Patents
天然のコロニー促進因子−１の精製Info
- Publication number
- JPH09136899A JPH09136899A JP7323391A JP32339195A JPH09136899A JP H09136899 A JPH09136899 A JP H09136899A JP 7323391 A JP7323391 A JP 7323391A JP 32339195 A JP32339195 A JP 32339195A JP H09136899 A JPH09136899 A JP H09136899A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gln
- glu
- ser
- leu
- csf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト天然ＣＳＦ−１を提供すること。
【解決手段】以下のＮ−末端配列を有する、精製ヒト天
然ＣＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu。
然ＣＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はタンパクの精製，そ
の精製産物，およびそれから作成されるＤＮＡプローブ
に関するものである。特に，本発明はネズミおよびヒト
のコロニー促進因子-1（CSF-1 ）の精製と配列決定に関
するものである。
の精製産物，およびそれから作成されるＤＮＡプローブ
に関するものである。特に，本発明はネズミおよびヒト
のコロニー促進因子-1（CSF-1 ）の精製と配列決定に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】種々の組織に極めて低濃度で生産される
ある因子の，骨髄の先祖細胞の顆粒球および／またはマ
クロファージへの成長および発達を促進する能力は，こ
の15年間に知られてきた。多くの種の血清，尿サンプ
ル，および組織抽出液中のそのような因子の存在は，半
固体培養培地上に置かれた骨髄細胞によるコロニー形成
の促進を測るインビトロ分析で示される。インビボ分析
は知られていない。これらの因子はそのようなコロニー
の形成を誘導するので，この因子はまとめてコロニー促
進因子（CSF）と呼ばれた。
ある因子の，骨髄の先祖細胞の顆粒球および／またはマ
クロファージへの成長および発達を促進する能力は，こ
の15年間に知られてきた。多くの種の血清，尿サンプ
ル，および組織抽出液中のそのような因子の存在は，半
固体培養培地上に置かれた骨髄細胞によるコロニー形成
の促進を測るインビトロ分析で示される。インビボ分析
は知られていない。これらの因子はそのようなコロニー
の形成を誘導するので，この因子はまとめてコロニー促
進因子（CSF）と呼ばれた。
【０００３】さらに最近，得られるコロニーに見られる
細胞の型により決定されるヒトCSFタンパクに少なくと
も４つのサブクラスがあることが解った。１つのサブク
ラスCSF-1では，主にマクロファージを含むコロニーに
なる。他のサブクラスは中性染色性顆粒球とマクロファ
ージの両方；中性染色性顆粒球のみ；中性染色性顆粒
球，好酸性顆粒球，およびマクロファージ，を含むコロ
ニーを生じる。
細胞の型により決定されるヒトCSFタンパクに少なくと
も４つのサブクラスがあることが解った。１つのサブク
ラスCSF-1では，主にマクロファージを含むコロニーに
なる。他のサブクラスは中性染色性顆粒球とマクロファ
ージの両方；中性染色性顆粒球のみ；中性染色性顆粒
球，好酸性顆粒球，およびマクロファージ，を含むコロ
ニーを生じる。
【０００４】上のヒトCSFの初めの３つに類似のネズミ
因子がある。さらに，IL-3と呼ばれるネズミ因子は，す
べてのこれら細胞型に加え巨核球，赤血球, およびマス
ト細胞を種々組合せで含むネズミ骨髄細胞のコロニーを
誘導する。これらのCSFはDexter, T.M., Nature (1984)
309 : 746,および Vadas, M.A., et al. J. Immunol.
(1983) 130 : 793により総説が発表されている。
因子がある。さらに，IL-3と呼ばれるネズミ因子は，す
べてのこれら細胞型に加え巨核球，赤血球, およびマス
ト細胞を種々組合せで含むネズミ骨髄細胞のコロニーを
誘導する。これらのCSFはDexter, T.M., Nature (1984)
309 : 746,および Vadas, M.A., et al. J. Immunol.
(1983) 130 : 793により総説が発表されている。
【０００５】ここでの発明はこれらサブクラスの最初の
もの，CSF-1の成分であるタンパクの精製に関するもの
である。このサブクラスはさらに特異的ラジオノムノア
ッセイとラジオリセプターアッセイにより性格づけおよ
び特徴づけられる−−例えば, 精製CSF-1に対して生じ
た抗体は，他のサブクラスの生物学的活性に影響するこ
となく，特異的にCSF-1活性を抑えることができ，また
マクロファージ細胞系列J774はCSF-1に特異的に結合す
るリセプターを含む。これらの分析の記述はDas, S.K.,
et al., Blood (1981) 58 : 630 により出版されてい
る。
もの，CSF-1の成分であるタンパクの精製に関するもの
である。このサブクラスはさらに特異的ラジオノムノア
ッセイとラジオリセプターアッセイにより性格づけおよ
び特徴づけられる−−例えば, 精製CSF-1に対して生じ
た抗体は，他のサブクラスの生物学的活性に影響するこ
となく，特異的にCSF-1活性を抑えることができ，また
マクロファージ細胞系列J774はCSF-1に特異的に結合す
るリセプターを含む。これらの分析の記述はDas, S.K.,
et al., Blood (1981) 58 : 630 により出版されてい
る。
【０００６】種々CSF タンパクの精製方法が発表され
た。
た。
【０００７】Stanley, E.R., et al., J Biol Chem (19
77) 252 : 4305, はネズミ L929 細胞のCSFタンパクを
比活性約１×108ユニット／mgに精製し，それは主にマ
クロファージ生産を促進した。Waheed, A., et al., Bl
ood (1982) 60 : 238,はマウスL-細胞のCSF-1をウサギ
抗体カラムを用いてほぼ均一にまで精製し，ネズミ配列
の最初の25アミノ酸を報告した（Ben-Avram, C.M. et a
l, Proc. Natl Acad Sci(USA) (1985) 882 : 4486 ）。
77) 252 : 4305, はネズミ L929 細胞のCSFタンパクを
比活性約１×108ユニット／mgに精製し，それは主にマ
クロファージ生産を促進した。Waheed, A., et al., Bl
ood (1982) 60 : 238,はマウスL-細胞のCSF-1をウサギ
抗体カラムを用いてほぼ均一にまで精製し，ネズミ配列
の最初の25アミノ酸を報告した（Ben-Avram, C.M. et a
l, Proc. Natl Acad Sci(USA) (1985) 882 : 4486 ）。
【０００８】Stanley, E.R., et al., J Biol Chem (19
77) 252 : 4305-4312 はヒト尿からCSF-1 精製手順を開
示し，またDas, S.K., et al, Blood (1981) 58 : 630
: JBiol Chem (1982) 257 : 13679 はヒト尿CSF-1 を
比活性５×107 ユニット／mgで得, それはマクロファー
ジのみを生じた。そして培養マウスL-細胞とヒト尿から
調製したCSF-1 タンパクの糖付加とそれらの活性の関係
の概要を示した。Wang, F.F., et al, J Cell Biochem
（1983) 21 : 263,はヒト尿CSF-1 を比活性 108U／mgで
得た。Waheed, A., et al,は比活性 0.7− 2.3× 107 U
／mgのヒト尿CSF-１をウサギ抗体カラムで得た（Exp He
mat (1984) 12 : 434 ）。
77) 252 : 4305-4312 はヒト尿からCSF-1 精製手順を開
示し，またDas, S.K., et al, Blood (1981) 58 : 630
: JBiol Chem (1982) 257 : 13679 はヒト尿CSF-1 を
比活性５×107 ユニット／mgで得, それはマクロファー
ジのみを生じた。そして培養マウスL-細胞とヒト尿から
調製したCSF-1 タンパクの糖付加とそれらの活性の関係
の概要を示した。Wang, F.F., et al, J Cell Biochem
（1983) 21 : 263,はヒト尿CSF-1 を比活性 108U／mgで
得た。Waheed, A., et al,は比活性 0.7− 2.3× 107 U
／mgのヒト尿CSF-１をウサギ抗体カラムで得た（Exp He
mat (1984) 12 : 434 ）。
【０００９】Wu, M., et al, J Biol Chem (1979) 254
: 6226, は培養ヒトすい臓癌（MIAPaCa ）細胞からCSF
タンパクを精製し，それはネズミ顆粒球とマクロファー
ジコロニーを増殖させたと報告した。得られたタンパク
は約７×107 ユニット／mgの比活性を有していた。
: 6226, は培養ヒトすい臓癌（MIAPaCa ）細胞からCSF
タンパクを精製し，それはネズミ顆粒球とマクロファー
ジコロニーを増殖させたと報告した。得られたタンパク
は約７×107 ユニット／mgの比活性を有していた。
【００１０】種々のCSF の部分精製標品がまた，ヒトお
よびマウスの肺細胞のコンディションドメディウムから
（Fojo, S.S., et al, Biochemistry (1978) 17 : 3109
; Burgess, A.W., et al, J Biol Chem (1977) 252 :
1998) ;ヒトT-リンパ芽球細胞から（Lusis, A.J., et a
l, Blood (1981) 57 : 13 ; U.S. Patent, 4,438,03
2）；ヒト胎盤のコンディションドメディウムから見掛
け上均一にそして比活性７×107 ユニット／mgで（Wu,
M., et al, Biochemistry (1980) 19 : 3846),報告され
た。
よびマウスの肺細胞のコンディションドメディウムから
（Fojo, S.S., et al, Biochemistry (1978) 17 : 3109
; Burgess, A.W., et al, J Biol Chem (1977) 252 :
1998) ;ヒトT-リンパ芽球細胞から（Lusis, A.J., et a
l, Blood (1981) 57 : 13 ; U.S. Patent, 4,438,03
2）；ヒト胎盤のコンディションドメディウムから見掛
け上均一にそして比活性７×107 ユニット／mgで（Wu,
M., et al, Biochemistry (1980) 19 : 3846),報告され
た。
【００１１】出願中の米国特許第 698,358号は, 組換え
ＤＮＡ技術によるヒトおよびネズミのCSF-1のクローニ
ングと発現を述べている。べつのサブクラスのCSF タン
パク,ネズミおよびヒトのGM-CSF，が精製され，そのｃ
ＤＮＡがクローン化された。このタンパクはGough, et
al, Nature (1984) 309 : 763-767により，他のCSF，例
えばCSF-1 と明らかに異なることが示された。ネズミの
IL-3がFung, M.C., etal, Nature (1984) 307 : 233 に
よりクローニングされた。また, Yokota, T.,et al, PN
AS (1984) 81 : 1070-1074 ; Wong, G.G., et al, Scie
nce (1985) 228 : 810-815 ; Lee, F., et al, PNAS (1
985)82 : 4360-4364 ;およびCantrell, M.A., et al, P
NAS (1985) 82 : 6250-6254を参照。
ＤＮＡ技術によるヒトおよびネズミのCSF-1のクローニ
ングと発現を述べている。べつのサブクラスのCSF タン
パク,ネズミおよびヒトのGM-CSF，が精製され，そのｃ
ＤＮＡがクローン化された。このタンパクはGough, et
al, Nature (1984) 309 : 763-767により，他のCSF，例
えばCSF-1 と明らかに異なることが示された。ネズミの
IL-3がFung, M.C., etal, Nature (1984) 307 : 233 に
よりクローニングされた。また, Yokota, T.,et al, PN
AS (1984) 81 : 1070-1074 ; Wong, G.G., et al, Scie
nce (1985) 228 : 810-815 ; Lee, F., et al, PNAS (1
985)82 : 4360-4364 ;およびCantrell, M.A., et al, P
NAS (1985) 82 : 6250-6254を参照。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】１つの観点では，本発
明は，本発明により決定された一次アミノ酸配列を有す
る，精製された天然のヒトおよびネズミCSF-1タンパ
ク，および多量のそのようなタンパクとそのような配列
情報を得る方法に関するものである。精巧な精製技術と
注意深い配列決定はヒトおよびネズミ両型のＮ末端配列
の同定を可能にした。これにより，症状を分析し，そし
て症状に相関したCSF-1タンパクの変化を調べるのに有
用なプローブの作成が可能になる。このプローブはま
た，CSF-1タンパクの組換え操作による生産を行うのに
有用なCSF-1をコードするＤＮＡを得る道具として有用
である。このようにして, 他の観点では，本発明は決定
配列に基づき設計されるプローブに関するものである。
明は，本発明により決定された一次アミノ酸配列を有す
る，精製された天然のヒトおよびネズミCSF-1タンパ
ク，および多量のそのようなタンパクとそのような配列
情報を得る方法に関するものである。精巧な精製技術と
注意深い配列決定はヒトおよびネズミ両型のＮ末端配列
の同定を可能にした。これにより，症状を分析し，そし
て症状に相関したCSF-1タンパクの変化を調べるのに有
用なプローブの作成が可能になる。このプローブはま
た，CSF-1タンパクの組換え操作による生産を行うのに
有用なCSF-1をコードするＤＮＡを得る道具として有用
である。このようにして, 他の観点では，本発明は決定
配列に基づき設計されるプローブに関するものである。
【００１３】ある一面では，本発明は脊椎動物からのCS
F-1精製の改良法に関するものである。これらの方法は,
有効な特異的精製段階を行うためのイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーの利用と次いで混在物を除くた
めの逆相HPLCの使用を含む。モノクローナル抗体がイム
ノアフィニティークロマトグラフィー段階に使われるで
あろう。他の面では，本発明は得られた天然の精製CSF-
1と，精製品から決定されたアミノ酸配列に基づき設計
されるＤＮＡプローブに関するものである。
F-1精製の改良法に関するものである。これらの方法は,
有効な特異的精製段階を行うためのイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーの利用と次いで混在物を除くた
めの逆相HPLCの使用を含む。モノクローナル抗体がイム
ノアフィニティークロマトグラフィー段階に使われるで
あろう。他の面では，本発明は得られた天然の精製CSF-
1と，精製品から決定されたアミノ酸配列に基づき設計
されるＤＮＡプローブに関するものである。
【００１４】
Ａ．定義 “コロニー促進因子-1（CSF-1）”はCSF-1の文献で理解
される活性スペクトル−−すなわち，Metcalf, D., J C
ell Physiol (1970)76 : 89の標準インビトロコロニー
促進分析の適用により，主にマクロファージコロニーを
形成する−−を示すタンパクを指す。この因子はまた，
Moore,R.N., et al, J Immunol (1983)131 : 2374とPry
stowsky, M.B., et al. Am J Pathol (1984) 114 : 149
の骨髄増殖分析で活性がある。このタンパクはいかなる
脊椎動物種，好ましくは哺乳類種，そして最も好ましく
はヒトまたはネズミ検体から単離されるであろう。いく
らか種特異性があるようである：ヒトCSF-1はヒトおよ
びネズミの骨髄細胞の両者に作用する；ネズミCSF-1は
ヒト細胞に活性を示さない。従って，ヒトCSF-1はDas,
S.K., et al, Blood (1981) 58 : 630の特異的ネズミラ
ジオリセプター分析で陽性であるべきで，そしてヒトタ
ンパクの生物学的活性はヒト尿CSF-1の中和抗血清で阻
害される（Das, S.K., et al, 前出）。
される活性スペクトル−−すなわち，Metcalf, D., J C
ell Physiol (1970)76 : 89の標準インビトロコロニー
促進分析の適用により，主にマクロファージコロニーを
形成する−−を示すタンパクを指す。この因子はまた，
Moore,R.N., et al, J Immunol (1983)131 : 2374とPry
stowsky, M.B., et al. Am J Pathol (1984) 114 : 149
の骨髄増殖分析で活性がある。このタンパクはいかなる
脊椎動物種，好ましくは哺乳類種，そして最も好ましく
はヒトまたはネズミ検体から単離されるであろう。いく
らか種特異性があるようである：ヒトCSF-1はヒトおよ
びネズミの骨髄細胞の両者に作用する；ネズミCSF-1は
ヒト細胞に活性を示さない。従って，ヒトCSF-1はDas,
S.K., et al, Blood (1981) 58 : 630の特異的ネズミラ
ジオリセプター分析で陽性であるべきで，そしてヒトタ
ンパクの生物学的活性はヒト尿CSF-1の中和抗血清で阻
害される（Das, S.K., et al, 前出）。
【００１５】CSF-1のある別の性質がごく最近見出さ
れ，それには，成熟マクロファージ（Moore, R., et a
l, Science (1984) 223 : 178 ）からのE プロスタグラ
ンジン系，インターロイキン−１，およびインターフェ
ロンの分泌のこのタンパクによる促進能，そして下に述
べる単球への別の効果が含まれる。後者の活性に対する
機構は現在不明で，そしてここでの定義の為に，定義の
規準を，出発物質として適当な種の骨髄細胞を用いる単
球／マクロファージコロニー形成の促進能とする。（CS
F-1の増殖効果は単核食作用系統の細胞に限定されるこ
と（Stanley, E.R.,The Lymphokines (1981), Stewart,
W.E., II, et al,著，Humana Press, Clifton, NJ
），pp, 102-132）, およびCSF-1のリセプターはこれ
らの細胞系列に限定されること（Byrne, P.V., et al,
Cell Biol (1981) 91 : 848)）が知られている。
れ，それには，成熟マクロファージ（Moore, R., et a
l, Science (1984) 223 : 178 ）からのE プロスタグラ
ンジン系，インターロイキン−１，およびインターフェ
ロンの分泌のこのタンパクによる促進能，そして下に述
べる単球への別の効果が含まれる。後者の活性に対する
機構は現在不明で，そしてここでの定義の為に，定義の
規準を，出発物質として適当な種の骨髄細胞を用いる単
球／マクロファージコロニー形成の促進能とする。（CS
F-1の増殖効果は単核食作用系統の細胞に限定されるこ
と（Stanley, E.R.,The Lymphokines (1981), Stewart,
W.E., II, et al,著，Humana Press, Clifton, NJ
），pp, 102-132）, およびCSF-1のリセプターはこれ
らの細胞系列に限定されること（Byrne, P.V., et al,
Cell Biol (1981) 91 : 848)）が知られている。
【００１６】すべてのタンパクの場合と同様，正確な化
学構造は多数の因子に依存する。イオン化するアミノ基
およびカルボキシル基が分子中にあるので，特定のタン
パクは酸性または塩基性塩，または中性型として得られ
る。適当な環境条件にある時にそれらの活性が維持され
るすべてのそのような標品をこの定義に含む。さらに，
一次アミノ酸配列は，糖成分による誘導体化（糖付
加），または脂肪，リン酸塩，アセチル基などの他の付
加的分子により，より一般的には多糖類との結合によ
り，大きくなるであろう。一次アミノ酸配列はまた，凝
集して複合体，大半は二量体を形成するであろう。実
際，天然のヒト尿CSF-1は45Kdの高度にグリコシル化さ
れた二量体として単離される。このような増大のある面
は，生産宿主の翻訳後のプロセッシングシステムにより
達成される：．他のそのような修飾はインビトロで導入
されるであろう。とにかく，主題のタンパクは，上記特
定したようなタンパク活性が存在する限り，凝集または
誘導体化の状態にかかわらずCSF-1の定義内にある。も
ちろん，そのような修飾は，種々のアッセイにおいてタ
ンパクの活性を高めるまたは低下させることにより，量
的または質的に活性に影響するであろう。
学構造は多数の因子に依存する。イオン化するアミノ基
およびカルボキシル基が分子中にあるので，特定のタン
パクは酸性または塩基性塩，または中性型として得られ
る。適当な環境条件にある時にそれらの活性が維持され
るすべてのそのような標品をこの定義に含む。さらに，
一次アミノ酸配列は，糖成分による誘導体化（糖付
加），または脂肪，リン酸塩，アセチル基などの他の付
加的分子により，より一般的には多糖類との結合によ
り，大きくなるであろう。一次アミノ酸配列はまた，凝
集して複合体，大半は二量体を形成するであろう。実
際，天然のヒト尿CSF-1は45Kdの高度にグリコシル化さ
れた二量体として単離される。このような増大のある面
は，生産宿主の翻訳後のプロセッシングシステムにより
達成される：．他のそのような修飾はインビトロで導入
されるであろう。とにかく，主題のタンパクは，上記特
定したようなタンパク活性が存在する限り，凝集または
誘導体化の状態にかかわらずCSF-1の定義内にある。も
ちろん，そのような修飾は，種々のアッセイにおいてタ
ンパクの活性を高めるまたは低下させることにより，量
的または質的に活性に影響するであろう。
【００１７】さらに，鎖中の個々のアミノ酸残基は，酸
化，還元，またはタンパクレベルでの他の誘導体化によ
り修飾されるであろう。あるいはタンパクは活性断片を
得るために切断されるであろう。活性を損なわないよう
な変換がこの定義中に含まれる。もちろん，異なる脊椎
動物種由来のCSF-1は完全な相同性を示すとは考えられ
ず，これらの変化はこの定義に含まれる。
化，還元，またはタンパクレベルでの他の誘導体化によ
り修飾されるであろう。あるいはタンパクは活性断片を
得るために切断されるであろう。活性を損なわないよう
な変換がこの定義中に含まれる。もちろん，異なる脊椎
動物種由来のCSF-1は完全な相同性を示すとは考えられ
ず，これらの変化はこの定義に含まれる。
【００１８】Ｂ．有用性 本発明のCSF-1タンパクは，幹髄細胞からの単球−前駆
体／マクロファージ細胞生産を促進し，よって免疫シス
テムの効果性を高めること，および成熟マクロファージ
中でのリンホカインの分泌のようなこれらの分化細胞の
機能を促進すること，の両方が可能である。
体／マクロファージ細胞生産を促進し，よって免疫シス
テムの効果性を高めること，および成熟マクロファージ
中でのリンホカインの分泌のようなこれらの分化細胞の
機能を促進すること，の両方が可能である。
【００１９】ある適用においては，これらのタンパクは
化学療法の付属物として有用である。化学療法的治療に
より免疫システムが抑制されることはよく理解されてい
る。それらが向けられる腫瘍細胞を破壊することに成功
しても，化学療法的治療はしばしば，免疫システムの細
胞への化学毒性物質の副作用により，患者を死亡させる
ことがある。CSF-1をこのような患者に投薬すること
は，CSF-1が骨髄−由来前駆体の増殖とマクロファージ
への分化を媒介・促進させることができるため，免疫シ
ステムを再刺激して，この副作用を防ぎ，よって患者が
２次感染を受ける傾向を防ぐことになる。このような治
療により助けられるであろう他の患者としては，白血病
で骨髄移植の治療を受けた人たちが含まれる。彼らはし
ばしば拒絶を防ぐために免疫抑制の状態にある。それら
の患者にとっても，CSF-1の投与により免疫抑制は回復
しうる。
化学療法の付属物として有用である。化学療法的治療に
より免疫システムが抑制されることはよく理解されてい
る。それらが向けられる腫瘍細胞を破壊することに成功
しても，化学療法的治療はしばしば，免疫システムの細
胞への化学毒性物質の副作用により，患者を死亡させる
ことがある。CSF-1をこのような患者に投薬すること
は，CSF-1が骨髄−由来前駆体の増殖とマクロファージ
への分化を媒介・促進させることができるため，免疫シ
ステムを再刺激して，この副作用を防ぎ，よって患者が
２次感染を受ける傾向を防ぐことになる。このような治
療により助けられるであろう他の患者としては，白血病
で骨髄移植の治療を受けた人たちが含まれる。彼らはし
ばしば拒絶を防ぐために免疫抑制の状態にある。それら
の患者にとっても，CSF-1の投与により免疫抑制は回復
しうる。
【００２０】一般に，化学療法，骨髄移植，もしくは病
気のような免疫抑制の他の突発的な形（例えば後天性免
疫欠損症候群）による免疫抑制にかかっているいかなる
被検者も，CSF-1を薬学的に使用できることにより恩恵
を得るであろう。さらに被検者は，生来のシステムのマ
クロファージを補うために，CSF-1で処理した骨髄のイ
ンビトロ培養物または他の適当な調製品により産生され
たすでに分化した増加量のマクロファージの供給を受け
ることができるであろう。これらの調製品には，このよ
うに培養し，局所的または全身的な治療のために戻すこ
とができる患者本人の血液単球の調製品を含む。CSF-1
がマクロファージによるリンホカインの産生を促進する
ことができることにより，腫瘍と感染の治療においても
またCSF-1は直接的に有用となる。
気のような免疫抑制の他の突発的な形（例えば後天性免
疫欠損症候群）による免疫抑制にかかっているいかなる
被検者も，CSF-1を薬学的に使用できることにより恩恵
を得るであろう。さらに被検者は，生来のシステムのマ
クロファージを補うために，CSF-1で処理した骨髄のイ
ンビトロ培養物または他の適当な調製品により産生され
たすでに分化した増加量のマクロファージの供給を受け
ることができるであろう。これらの調製品には，このよ
うに培養し，局所的または全身的な治療のために戻すこ
とができる患者本人の血液単球の調製品を含む。CSF-1
がマクロファージによるリンホカインの産生を促進する
ことができることにより，腫瘍と感染の治療においても
またCSF-1は直接的に有用となる。
【００２１】CSF-1は，ネズミ由来マクロファージによ
るインターフェロンの産生を促進し（Fleit, H.B.,ら，
J Cell Physiol (1981) 108 : 347 ）, そしてMIAPaCa
細胞由来のヒトの部分精製CSF-1は，後述のように，ヒ
ト単球からのインターフェロンとTNFのポリIC誘導され
た産生を促進する。さらに，CSF-1 はヒト血液単球によ
る骨髄CSF の産生を促進する。
るインターフェロンの産生を促進し（Fleit, H.B.,ら，
J Cell Physiol (1981) 108 : 347 ）, そしてMIAPaCa
細胞由来のヒトの部分精製CSF-1は，後述のように，ヒ
ト単球からのインターフェロンとTNFのポリIC誘導され
た産生を促進する。さらに，CSF-1 はヒト血液単球によ
る骨髄CSF の産生を促進する。
【００２２】さらに後述されるものは，（Ｌ細胞条件培
地からの）ネズミCSF-1が，ネズミ肉腫TU5標的を殺すた
めに正常C3H／HeNマウス腹腔マクロファージを刺激でき
る能力,の説明である。この活性はCSF-1が前処理として
エフェクターフェイズ（effector phase ）中に用いら
れる場合に最も効果的である。CSF-1がそれを行う能力
は，他のコロニー促進因子により示されるものよりもず
っと高い。さらに，ネズミ細胞のウイルスを攻撃する能
力はCSF-1により高められる。
地からの）ネズミCSF-1が，ネズミ肉腫TU5標的を殺すた
めに正常C3H／HeNマウス腹腔マクロファージを刺激でき
る能力,の説明である。この活性はCSF-1が前処理として
エフェクターフェイズ（effector phase ）中に用いら
れる場合に最も効果的である。CSF-1がそれを行う能力
は，他のコロニー促進因子により示されるものよりもず
っと高い。さらに，ネズミ細胞のウイルスを攻撃する能
力はCSF-1により高められる。
【００２３】（ネズミCSF-1 は，ネズミマクロファージ
を，P815腫瘍細胞に対し細胞静力学的（cytostatic）と
なるように（Wing, E.J., et al, J Clin Invest (198
2) 69: 270）, もしくは他の白血病標的を殺さないよう
に（Ralph, P. et al, CellImmunol (1983) 76 : 10）,
刺激するという矛盾した報告がされている。Nogawa,
R.T., ら Cell Immunol (1980) 53 : 116 は，CSF-1 が
酵母を取込んで殺すようにマクロファージを刺激しうる
ことを報告している。） よって，免疫抑制それ自身を克服することに加え，マク
ロファージの分泌と活性を促進することにより侵入生物
もしくは悪性細胞を破壊するために，CSF-1を用いるこ
とができる。
を，P815腫瘍細胞に対し細胞静力学的（cytostatic）と
なるように（Wing, E.J., et al, J Clin Invest (198
2) 69: 270）, もしくは他の白血病標的を殺さないよう
に（Ralph, P. et al, CellImmunol (1983) 76 : 10）,
刺激するという矛盾した報告がされている。Nogawa,
R.T., ら Cell Immunol (1980) 53 : 116 は，CSF-1 が
酵母を取込んで殺すようにマクロファージを刺激しうる
ことを報告している。） よって，免疫抑制それ自身を克服することに加え，マク
ロファージの分泌と活性を促進することにより侵入生物
もしくは悪性細胞を破壊するために，CSF-1を用いるこ
とができる。
【００２４】本発明のCSF-1は，タンパク物質の投与に
関する当業者に標準的な従来の方法でフォーミュレーシ
ョンできる。注射による投与が好ましい：フォーミュレ
ーションには，懸濁液，乳濁液，もしくは注射可能なも
のに再構成するための固体組成，の溶液が含まれる。適
当な賦形剤には，例えばリンガー液，ハンク液，水，食
塩水，グリセロール，デキストロース溶液，などが含ま
れる。それに加え，本発明のCSF-1は，適切な反応を促
進するために細胞調製物と前処理してもよく，そして調
製物全体もしくはその上清を被検体に与えることができ
る。この後示すように，CSF-1刺激の反応で種々の型の
血液細胞により産生された物質は所望の標的に対して効
果的であり，侵入ウイルスまたは腫瘍を攻撃するという
これら血液細胞それ自身の性質が増強される。被検体自
身の細胞を抜取ってこのように利用するか，あるいは例
えば，他の和合可能な個人の単球もしくは白血球をその
処理（インキュベーション）に用いることができる。
関する当業者に標準的な従来の方法でフォーミュレーシ
ョンできる。注射による投与が好ましい：フォーミュレ
ーションには，懸濁液，乳濁液，もしくは注射可能なも
のに再構成するための固体組成，の溶液が含まれる。適
当な賦形剤には，例えばリンガー液，ハンク液，水，食
塩水，グリセロール，デキストロース溶液，などが含ま
れる。それに加え，本発明のCSF-1は，適切な反応を促
進するために細胞調製物と前処理してもよく，そして調
製物全体もしくはその上清を被検体に与えることができ
る。この後示すように，CSF-1刺激の反応で種々の型の
血液細胞により産生された物質は所望の標的に対して効
果的であり，侵入ウイルスまたは腫瘍を攻撃するという
これら血液細胞それ自身の性質が増強される。被検体自
身の細胞を抜取ってこのように利用するか，あるいは例
えば，他の和合可能な個人の単球もしくは白血球をその
処理（インキュベーション）に用いることができる。
【００２５】CSF-1と名づけられたある型の活性の存在
がいくらか前から知られているが，配列決定ができるほ
ど十分純粋な形でそれに関連するタンパクの十分な量が
得られてはいず，よって，病気の状態を, リンホカイン
をコードする物質のそれに関連した核酸パターンに基づ
いて，研究するための，ＤＮＡプローブの構築は不可能
であった。本発明はプローブを構築できるほど十分な配
列の情報を提供する。種々の付加的な精製手段により，
ＤＮＡオリゴマープローブの構築を可能とするいくつか
のアミノ酸配列を提供するのに十分な純度のCSF-1が,
ヒト尿，MIAPaCa細胞およびネズミＬ細胞から得られて
いる。そのプローブは，病気の状態を評価することと同
様に，全タンパクのコード配列を得るのに有用である。
もちろん，精製されたタンパクは前記のように治療的に
も有用であり，また診断と治療に用いるための抗体産生
にとっても有用である。
がいくらか前から知られているが，配列決定ができるほ
ど十分純粋な形でそれに関連するタンパクの十分な量が
得られてはいず，よって，病気の状態を, リンホカイン
をコードする物質のそれに関連した核酸パターンに基づ
いて，研究するための，ＤＮＡプローブの構築は不可能
であった。本発明はプローブを構築できるほど十分な配
列の情報を提供する。種々の付加的な精製手段により，
ＤＮＡオリゴマープローブの構築を可能とするいくつか
のアミノ酸配列を提供するのに十分な純度のCSF-1が,
ヒト尿，MIAPaCa細胞およびネズミＬ細胞から得られて
いる。そのプローブは，病気の状態を評価することと同
様に，全タンパクのコード配列を得るのに有用である。
もちろん，精製されたタンパクは前記のように治療的に
も有用であり，また診断と治療に用いるための抗体産生
にとっても有用である。
【００２６】Ｃ．精製 本発明のCSF-1タンパクは，いくつかの方法で，Ｎ末端
配列を得るのに十分な均質性と量で精製された。
配列を得るのに十分な均質性と量で精製された。
【００２７】後述するように，ヒト尿CSF-1はDas, S.
K., et al, Blood (1981) 58 : 630に記載の標準的方法
により部分的に精製され，それに続いて，セファロース
Ｂカラムに取付けたYYG106というネズミCSF-1に対する
ラットのモノクローナル抗体を用いたアフィニティー精
製段階（Stanley, E.R., Methods Enzymol (1985) 116
: 564）を行った。精製の最終段階は0.1％ TFA／30％
アセトニトリル−0.1％TFA／60％アセトニトリルのバッ
ファー系での逆相HPCLであった。
K., et al, Blood (1981) 58 : 630に記載の標準的方法
により部分的に精製され，それに続いて，セファロース
Ｂカラムに取付けたYYG106というネズミCSF-1に対する
ラットのモノクローナル抗体を用いたアフィニティー精
製段階（Stanley, E.R., Methods Enzymol (1985) 116
: 564）を行った。精製の最終段階は0.1％ TFA／30％
アセトニトリル−0.1％TFA／60％アセトニトリルのバッ
ファー系での逆相HPCLであった。
【００２８】フォルボル・ミリスティック酢酸の誘導に
より無血清状態で産生されたMIAPaCa では，細胞上澄液
をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフィ（Das(前出)
に従って）, 続いてレンチルレクチンを用いたアフィニ
ティークロマトグラフィー（DasのConAアフィニティー
段階の代わりに），そして次に，セファロースＢに結合
させたYYG106のモノクローナル抗体を用いたイムノアフ
ィニティー段階，そして逆相HPLCにかけた。
より無血清状態で産生されたMIAPaCa では，細胞上澄液
をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフィ（Das(前出)
に従って）, 続いてレンチルレクチンを用いたアフィニ
ティークロマトグラフィー（DasのConAアフィニティー
段階の代わりに），そして次に，セファロースＢに結合
させたYYG106のモノクローナル抗体を用いたイムノアフ
ィニティー段階，そして逆相HPLCにかけた。
【００２９】ネズミCSF-1をまずStanley, E.R., et al,
J Immunol Meth (1981) 42 : 253-284 の記載に従って
精製し，続いてヒトタンパクに対する前出のイムノアフ
ィニティーカラムにかけ，そして次に逆相HPLCにかけ
た。ネズミCSF-1 も，Ｌ細胞上澄を直接リン酸カルシウ
ムクロマトグラフィーにかけ，次に前述のアフィニティ
ークロマトグラフィー，続いて逆相HPLCを用いた短縮手
順により調製した。
J Immunol Meth (1981) 42 : 253-284 の記載に従って
精製し，続いてヒトタンパクに対する前出のイムノアフ
ィニティーカラムにかけ，そして次に逆相HPLCにかけ
た。ネズミCSF-1 も，Ｌ細胞上澄を直接リン酸カルシウ
ムクロマトグラフィーにかけ，次に前述のアフィニティ
ークロマトグラフィー，続いて逆相HPLCを用いた短縮手
順により調製した。
【００３０】一般に，イムノアフィニティークロマトグ
ラフィー段階，好ましくはモノクローナル抗体調製物を
用いたイムノアフィニティー段階，それに続いて逆相HP
LCを利用した，CSF-1タンパクの精製手順は特に効率的
である。タンパクをさらにSDS-PAGEを用いて分析しても
よい。
ラフィー段階，好ましくはモノクローナル抗体調製物を
用いたイムノアフィニティー段階，それに続いて逆相HP
LCを利用した，CSF-1タンパクの精製手順は特に効率的
である。タンパクをさらにSDS-PAGEを用いて分析しても
よい。
【００３１】イムノアフィニティークロマトグラフィー
には標準的方法の使用が含まれ，これによれば抗体調製
物はセファロース，デキストランまたはポリアクリルア
ミドのような適当なポリマー支持体に，その支持体の性
質に合うような手法で支持される。この段階で使用され
るポリクローナル抗体の調製物は, ヒトの尿またはネズ
ミＬ細胞培地由来のもののような精製タンパクを用いて
被検体, 好ましくはウサギ，マウス，またはラットのよ
うな哺乳動物の被検体を免疫化することにより調製す
る。抗血清をポリクローナル組成物として直接用いても
よく，また免疫化した被検体の脾臓細胞または末梢血液
白血球を例えばKohlerとMilsteinの融合手法を用いて永
久増殖化してもよい。うまく融合した細胞を次に，モノ
クローナル抗体産生系統を得るために，CSF-1に対する
抗体の産生により選別する。不変の組成物が容易に得ら
れるために，もちろんモノクローナル調製物が好まし
い。特に好ましいモノクローナル抗体は，ラットの骨髄
腫系統とネズミＬ細胞CSF-1で免疫化したラットの脾臓
細胞との細胞融合体である，YYG106細胞系統により産生
されたものである。
には標準的方法の使用が含まれ，これによれば抗体調製
物はセファロース，デキストランまたはポリアクリルア
ミドのような適当なポリマー支持体に，その支持体の性
質に合うような手法で支持される。この段階で使用され
るポリクローナル抗体の調製物は, ヒトの尿またはネズ
ミＬ細胞培地由来のもののような精製タンパクを用いて
被検体, 好ましくはウサギ，マウス，またはラットのよ
うな哺乳動物の被検体を免疫化することにより調製す
る。抗血清をポリクローナル組成物として直接用いても
よく，また免疫化した被検体の脾臓細胞または末梢血液
白血球を例えばKohlerとMilsteinの融合手法を用いて永
久増殖化してもよい。うまく融合した細胞を次に，モノ
クローナル抗体産生系統を得るために，CSF-1に対する
抗体の産生により選別する。不変の組成物が容易に得ら
れるために，もちろんモノクローナル調製物が好まし
い。特に好ましいモノクローナル抗体は，ラットの骨髄
腫系統とネズミＬ細胞CSF-1で免疫化したラットの脾臓
細胞との細胞融合体である，YYG106細胞系統により産生
されたものである。
【００３２】逆相HPLCに関しても，標準的な技術を用い
る。アルキル−, アリール−，ルアリール−，またはア
リールアルキル−誘導体化支持体のような，例えばフェ
ニルセファロースまたはフェニルTSKなどのどのような
疎水カラムを用いてもよい。溶出勾配は支持体の選出に
依る。
る。アルキル−, アリール−，ルアリール−，またはア
リールアルキル−誘導体化支持体のような，例えばフェ
ニルセファロースまたはフェニルTSKなどのどのような
疎水カラムを用いてもよい。溶出勾配は支持体の選出に
依る。
【００３３】アミノ酸の組成決定と配列決定は標準的な
手法により行ったが，さらに後述されるように，手法は
入手可能なタンパクにより生じる特殊な問題に適合させ
た。 Ｄ．プローブの構築 前記の精製タンパクから得られた配列の情報を用いて，
標準的な市販の技術を用いてオリゴマーＤＮＡ配列を構
築した。プローブの混合物を用いることにより，または
哺乳動物の発現において望まれるコドンを含む限られた
数の特別なオリゴマーを用いることにより，コドン使用
頻度を考慮に入れる。
手法により行ったが，さらに後述されるように，手法は
入手可能なタンパクにより生じる特殊な問題に適合させ
た。 Ｄ．プローブの構築 前記の精製タンパクから得られた配列の情報を用いて，
標準的な市販の技術を用いてオリゴマーＤＮＡ配列を構
築した。プローブの混合物を用いることにより，または
哺乳動物の発現において望まれるコドンを含む限られた
数の特別なオリゴマーを用いることにより，コドン使用
頻度を考慮に入れる。
【００３４】
Ｅ．実施例 次に述べる実施例は，本発明を説明するものであり，限
定するものではない。 Ｅ．１．天然のヒトCSF-1の精製 ヒトの尿CSF-1を，Das. S.K.,ら Blood (1981) 58 : 63
0, により記述された標準的な方法により部分精製し，
続いてセファロースＢカラムに取付けられたYYG106と呼
ばれるネズミCSF-1 に対するラットのモノクローナル抗
体を用いたアフィニティー精製段階（Stanley, E.R., M
ethods Enzymol (1985) 116 : 564 ）にかけた。精製の
最終段階は 0.1％ TFA／30％アセトニトリル− 0.1％ T
FA／60％アセトニトリルバッファー系による逆相HPLCで
あった。
定するものではない。 Ｅ．１．天然のヒトCSF-1の精製 ヒトの尿CSF-1を，Das. S.K.,ら Blood (1981) 58 : 63
0, により記述された標準的な方法により部分精製し，
続いてセファロースＢカラムに取付けられたYYG106と呼
ばれるネズミCSF-1 に対するラットのモノクローナル抗
体を用いたアフィニティー精製段階（Stanley, E.R., M
ethods Enzymol (1985) 116 : 564 ）にかけた。精製の
最終段階は 0.1％ TFA／30％アセトニトリル− 0.1％ T
FA／60％アセトニトリルバッファー系による逆相HPLCで
あった。
【００３５】フォルボル・ミリスティック酢酸を用いた
誘導により，無血清状態で産生されたMIAPaCaに関して
は，細胞上澄液をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフ
ィー（Das(前出) に従う）にかけ，続いて（Das のConA
アフィニティー段階の代わりに）レンチルレクチンを用
いたアフィニティークロマトグラフィー，そして次にセ
ファロースＢに結合させたYYG106モノクローナル抗体を
用いたイムノアフィニティー段階，そして逆相HPLCにか
けたこの両方は前述の通りである。
誘導により，無血清状態で産生されたMIAPaCaに関して
は，細胞上澄液をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフ
ィー（Das(前出) に従う）にかけ，続いて（Das のConA
アフィニティー段階の代わりに）レンチルレクチンを用
いたアフィニティークロマトグラフィー，そして次にセ
ファロースＢに結合させたYYG106モノクローナル抗体を
用いたイムノアフィニティー段階，そして逆相HPLCにか
けたこの両方は前述の通りである。
【００３６】すでに均質にまで精製されている尿とMIAP
aCaタンパクを, 自動シークエンサーによるエドマン分
解を用いてアミノ酸配列決定にかけた。第３図に示され
るプローブ構築ができるのに十分なヒトCSFのＮ末端配
列を決定した（第１図）。
aCaタンパクを, 自動シークエンサーによるエドマン分
解を用いてアミノ酸配列決定にかけた。第３図に示され
るプローブ構築ができるのに十分なヒトCSFのＮ末端配
列を決定した（第１図）。
【００３７】より詳細には，MIAPaCaと尿の両方のCSF-1
について用いたすべての緩衝液は，3mMのNaN3と0.01ｇ
／ｌのPEG-6000を含む。各々の場合の初期段階は，DEAE
-セルロースクロマトグラフィーである。約100ｌのプー
ルされた尿もしくは，それに匹敵する量のCSF-1活性を
含む量のMIAPaCa 培地をpH7.4に調製し，塩を除去する
ために透析する。透析液を次に30mM Tris-HCl緩衝液，p
H7.4で前平衡化したDEAEセルロースカラム（乾燥重量20
0ｇ，Eastman）にかける。
について用いたすべての緩衝液は，3mMのNaN3と0.01ｇ
／ｌのPEG-6000を含む。各々の場合の初期段階は，DEAE
-セルロースクロマトグラフィーである。約100ｌのプー
ルされた尿もしくは，それに匹敵する量のCSF-1活性を
含む量のMIAPaCa 培地をpH7.4に調製し，塩を除去する
ために透析する。透析液を次に30mM Tris-HCl緩衝液，p
H7.4で前平衡化したDEAEセルロースカラム（乾燥重量20
0ｇ，Eastman）にかける。
【００３８】カラムを40mMNaClを含む同じ緩衝液で洗浄
し，250mMNaClを含む同じ緩衝液で溶出させる。骨髄貫
生決定による分析でCSF-1を含む画分を，イオンを除去
するために透析または限外濾過する。脱イオン化した溶
出液を次にリン酸カルシウムゲル（58ml／ｇタンパク）
で処理し，10ｌの５mMリン酸ナトリウム，pH6.5を用い
たデカンテーションにより，そのゲルを洗浄する。その
スラリーを 2.5ｌに再懸濁し，CSF-1を溶出させるため
に，25mMのリン酸ナトリウム緩衝液，pH6.5に合わせ，1
2,000×ｇ，10分での遠心分離によりゲルから分離し，
さらにDEAEセルロースクロマトグラフィーにかけるため
に50mlに濃縮する。
し，250mMNaClを含む同じ緩衝液で溶出させる。骨髄貫
生決定による分析でCSF-1を含む画分を，イオンを除去
するために透析または限外濾過する。脱イオン化した溶
出液を次にリン酸カルシウムゲル（58ml／ｇタンパク）
で処理し，10ｌの５mMリン酸ナトリウム，pH6.5を用い
たデカンテーションにより，そのゲルを洗浄する。その
スラリーを 2.5ｌに再懸濁し，CSF-1を溶出させるため
に，25mMのリン酸ナトリウム緩衝液，pH6.5に合わせ，1
2,000×ｇ，10分での遠心分離によりゲルから分離し，
さらにDEAEセルロースクロマトグラフィーにかけるため
に50mlに濃縮する。
【００３９】100mM Tris-HCl緩衝液，pH 7.4の溶出CSF-
1を次に同じ緩衝液で前平衡化したDEAEセルロースカラ
ムにかけ，同じ緩衝液でNaClの直線勾配（０−150mM）
を用いて溶出させた。CSF-1は約75−130mMのNaClで溶出
し，それらの画分を透析し，ConAセファロースのアフィ
ニティークロマトグラフィーにかけるため15mlに濃縮す
る。
1を次に同じ緩衝液で前平衡化したDEAEセルロースカラ
ムにかけ，同じ緩衝液でNaClの直線勾配（０−150mM）
を用いて溶出させた。CSF-1は約75−130mMのNaClで溶出
し，それらの画分を透析し，ConAセファロースのアフィ
ニティークロマトグラフィーにかけるため15mlに濃縮す
る。
【００４０】濃縮液を100mM酢酸塩，1M NaCl，10mM MgC
l2，10mM CaCl2，10mM MnCl2，pH6.0（ConA緩衝液）中
に溶解し，ConAセファロースカラム（ファルマシア）に
かける。そのカラムを４℃でConA緩衝液で洗浄し，100m
Mα−メチル−Ｄ−グルコシドを含む同じ緩衝液で溶出
させ，骨髄貫生検定で決定したCSF-1を含む分画をプー
ルし，ゲル濾過のために３mlに濃縮する。
l2，10mM CaCl2，10mM MnCl2，pH6.0（ConA緩衝液）中
に溶解し，ConAセファロースカラム（ファルマシア）に
かける。そのカラムを４℃でConA緩衝液で洗浄し，100m
Mα−メチル−Ｄ−グルコシドを含む同じ緩衝液で溶出
させ，骨髄貫生検定で決定したCSF-1を含む分画をプー
ルし，ゲル濾過のために３mlに濃縮する。
【００４１】CSF-1 を30mM Tris-HCl，pH7.4にして，同
じ緩衝液で平衡化したバイオゲルP-100カラムにかけ
る。活性分画はボイドボリューム中に溶出し，それをプ
ールして50mMリン酸塩，pH6.5で透析する。
じ緩衝液で平衡化したバイオゲルP-100カラムにかけ
る。活性分画はボイドボリューム中に溶出し，それをプ
ールして50mMリン酸塩，pH6.5で透析する。
【００４２】ゲル濾過段階からプールした溶出液をその
後，次のパラグラフに述べるように調製した抗CSF-1モ
ノクローナル抗体に誘導体化させたPABAE-Seph-4Bカラ
ム１mlにつき105UのCSF-1を用いてイムノソルベントク
ロマトグラフィーにかける。
後，次のパラグラフに述べるように調製した抗CSF-1モ
ノクローナル抗体に誘導体化させたPABAE-Seph-4Bカラ
ム１mlにつき105UのCSF-1を用いてイムノソルベントク
ロマトグラフィーにかける。
【００４３】10％FCS-α培地の懸濁培養で維持したハイ
ブリドーマより産生されるモノクローナル抗体YYG106を
用いてカラムを調製した。部分精製したネズミＬ細胞の
CSF-1で免疫化したラットの脾臓：細胞とラット骨髄腫
系統との細胞融合によりハイブリドーマを得た。所望の
モノクローナル抗体産生用の無血清培地を，洗浄した細
胞（105／ml）を HB101培地（Hana Biologics, Berkele
y, CA）中で培養し，細胞生存性が25％に落ちた培地か
ら培地を400×ｇ，15分間の遠心分離により回収するこ
とにより調製する。回収した培地を次に硫酸アンモニウ
ムで50％飽和にし，４℃，1200×ｇで15分間，遠心分離
することにより沈澱を集め，20mMリン酸ナトリウム緩衝
液, pH7.1で透析し，４℃で同じ緩衝液で平衡化したDEA
Eアフィゲルブルー（BioRad Labs, Rockville Center,
NY）カラムにかける。そのカラムを20mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液，pH7.1で洗浄し，この緩衝液の０−0.15M NaC
l勾配を用いて目的のモノクローナル抗体を溶出させ
る。分画の抗体活性を決定し, 活性分画をプールし，限
外濾過により濃縮する。
ブリドーマより産生されるモノクローナル抗体YYG106を
用いてカラムを調製した。部分精製したネズミＬ細胞の
CSF-1で免疫化したラットの脾臓：細胞とラット骨髄腫
系統との細胞融合によりハイブリドーマを得た。所望の
モノクローナル抗体産生用の無血清培地を，洗浄した細
胞（105／ml）を HB101培地（Hana Biologics, Berkele
y, CA）中で培養し，細胞生存性が25％に落ちた培地か
ら培地を400×ｇ，15分間の遠心分離により回収するこ
とにより調製する。回収した培地を次に硫酸アンモニウ
ムで50％飽和にし，４℃，1200×ｇで15分間，遠心分離
することにより沈澱を集め，20mMリン酸ナトリウム緩衝
液, pH7.1で透析し，４℃で同じ緩衝液で平衡化したDEA
Eアフィゲルブルー（BioRad Labs, Rockville Center,
NY）カラムにかける。そのカラムを20mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液，pH7.1で洗浄し，この緩衝液の０−0.15M NaC
l勾配を用いて目的のモノクローナル抗体を溶出させ
る。分画の抗体活性を決定し, 活性分画をプールし，限
外濾過により濃縮する。
【００４４】充填ベッドボリュームのPABAE-Seph（p-ア
ミノベンズアミドエチル誘導体化させたセファロース4
B）を0.5M HCl（冷）で洗浄し，７分間氷上でインキュ
ベートした0.2M NaNO2で処理する。少なくとも２倍量の
氷冷した蒸留水でゲルを３回洗浄し，同量の洗浄したゲ
ルと濃縮モノクローナル抗体（0.2M ホウ酸ナトリウム
緩衝液，pH8.0中で３mg／ml）とを混合し，４℃で16時
間振とうした。その結果生じる誘導体化PABAE-Seph-4B
を次に，５倍量の１％トリエタノールアミンの50mM Tri
s-HCl ，pH8.5，５倍量の6M尿素の 0.1M Tris-HCl，pH
7.4そして0.05M リン酸ナトリウム緩衝液，pH 6.5での
平衡化の前に５倍量の0.4M重炭酸ナトリウムを順番に用
いて洗浄する。） 前述のようにプールしたゲル濾過溶出液を，PABAE-Seph
-4B抗体誘導体化カラムを用いて，105U／ml，４℃で処
理し，カラムに再循環させる。そのカラムを50mMリン酸
ナトリウム緩衝液，pH6.5，次に 4M KSCNを用いて溶出
させる前に100mMグリシン−HCl ，pH2.0，次に0.1Mグリ
シン−HCl ，pH2.0で洗浄し，その最終の溶出液を0.6カ
ラム倍量の1M重炭酸アンモニウムを含む容器に集める。
溶出液を分けて0.01ｇ／ｌPEG-6000に対して透析する。
ミノベンズアミドエチル誘導体化させたセファロース4
B）を0.5M HCl（冷）で洗浄し，７分間氷上でインキュ
ベートした0.2M NaNO2で処理する。少なくとも２倍量の
氷冷した蒸留水でゲルを３回洗浄し，同量の洗浄したゲ
ルと濃縮モノクローナル抗体（0.2M ホウ酸ナトリウム
緩衝液，pH8.0中で３mg／ml）とを混合し，４℃で16時
間振とうした。その結果生じる誘導体化PABAE-Seph-4B
を次に，５倍量の１％トリエタノールアミンの50mM Tri
s-HCl ，pH8.5，５倍量の6M尿素の 0.1M Tris-HCl，pH
7.4そして0.05M リン酸ナトリウム緩衝液，pH 6.5での
平衡化の前に５倍量の0.4M重炭酸ナトリウムを順番に用
いて洗浄する。） 前述のようにプールしたゲル濾過溶出液を，PABAE-Seph
-4B抗体誘導体化カラムを用いて，105U／ml，４℃で処
理し，カラムに再循環させる。そのカラムを50mMリン酸
ナトリウム緩衝液，pH6.5，次に 4M KSCNを用いて溶出
させる前に100mMグリシン−HCl ，pH2.0，次に0.1Mグリ
シン−HCl ，pH2.0で洗浄し，その最終の溶出液を0.6カ
ラム倍量の1M重炭酸アンモニウムを含む容器に集める。
溶出液を分けて0.01ｇ／ｌPEG-6000に対して透析する。
【００４５】得られたヒト尿CSF-1は約８×107U／mgの
比活性をもつ。
比活性をもつ。
【００４６】ヒトの尿またはMIAPaCaのCSF-1を次に，後
述の0.1％TFA／アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLCに
かける。
述の0.1％TFA／アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLCに
かける。
【００４７】無血清培地由来のいくつかのMIAPaCa調製
物については，前出のリン酸カルシウムゲル濾過段階に
より，続いてConAの代わりにレンチルレクチンを用い他
は前出の通りにアフィニティークロマトグラフィーによ
り，続いて前出のイムノアブソルバントクロマトグラフ
ィーとHPLC段階により，精製を行う。
物については，前出のリン酸カルシウムゲル濾過段階に
より，続いてConAの代わりにレンチルレクチンを用い他
は前出の通りにアフィニティークロマトグラフィーによ
り，続いて前出のイムノアブソルバントクロマトグラフ
ィーとHPLC段階により，精製を行う。
【００４８】HPLC溶出液のSDSゲル電気泳動は，ヒトの
尿とMIAPaCaの調製物の両方について均質性を確証す
る。
尿とMIAPaCaの調製物の両方について均質性を確証す
る。
【００４９】（プローブの構築）ヒトCSFの充分なＮ末
端配列を，第３図で示すプローブの構築を行なえるよう
に決定した。精製したMIAPaCaおよび尿のCSF-1のＮ末端
配列は同一である。得られた合成オリゴヌクレオチド
は，ヒトの様々な症状の診断や原因の決定に有用であ
る。
端配列を，第３図で示すプローブの構築を行なえるよう
に決定した。精製したMIAPaCaおよび尿のCSF-1のＮ末端
配列は同一である。得られた合成オリゴヌクレオチド
は，ヒトの様々な症状の診断や原因の決定に有用であ
る。
【００５０】Ｅ．２．ネズミCSF-1 （タンパクの精製）ネズミのCSF-1は，Stanley, E.R.,
et al, J Biol Chem (1977) 252:4305;Stanley,E.R., e
t al, J Immunol Meth(1981)42;253-284，およびWang,
F.F., et al, J Cell Biochem (1983)21:263-275によ
り，開示されているものと同様の標準的な方法により精
製できる。他方では，バッチのリン酸カルシウムゲルク
ロマトグラフィ−段階（Stanley,E.R., J Immun Meth)
（上記））に直接続いてイムノアフィニティークロマト
グラフィーを行うことができる。
et al, J Biol Chem (1977) 252:4305;Stanley,E.R., e
t al, J Immunol Meth(1981)42;253-284，およびWang,
F.F., et al, J Cell Biochem (1983)21:263-275によ
り，開示されているものと同様の標準的な方法により精
製できる。他方では，バッチのリン酸カルシウムゲルク
ロマトグラフィ−段階（Stanley,E.R., J Immun Meth)
（上記））に直接続いてイムノアフィニティークロマト
グラフィーを行うことができる。
【００５１】さらに詳しくは，無血清Ｌ細胞の条件培地
の最初の調製をStanley,E.R., et al, J Immunol Meth
（上記）で述べられているように行い，次いでリン酸カ
ルシウムゲルを無血清Ｌ細胞の条件培地（40ml／ｌ培
地）20−40ｌに加えることによりリン酸カルシウムゲル
クロマトグラフィーに供し，ゲルを繰り返されるバッチ
処理で沈澱させる前に，−20℃で10分間，混合液をかき
まぜる。
の最初の調製をStanley,E.R., et al, J Immunol Meth
（上記）で述べられているように行い，次いでリン酸カ
ルシウムゲルを無血清Ｌ細胞の条件培地（40ml／ｌ培
地）20−40ｌに加えることによりリン酸カルシウムゲル
クロマトグラフィーに供し，ゲルを繰り返されるバッチ
処理で沈澱させる前に，−20℃で10分間，混合液をかき
まぜる。
【００５２】106U／mlで用いる以外は，ヒトのタンパク
と関連して上記で述べたように，YYG106抗体付きのPABA
E-Seph-4Bを用いて，溶出物をアフィニティークロマト
グラフィーに供し，第２の溶出段階は省略する。
と関連して上記で述べたように，YYG106抗体付きのPABA
E-Seph-4Bを用いて，溶出物をアフィニティークロマト
グラフィーに供し，第２の溶出段階は省略する。
【００５３】このように精製したネズミの材料を，上記
で述べたように逆相HPLCおよびTFA/アセトニトリルでの
溶出に供する。精製したネズミの材料の比活性は，約４
−８×107U／mgである。
で述べたように逆相HPLCおよびTFA/アセトニトリルでの
溶出に供する。精製したネズミの材料の比活性は，約４
−８×107U／mgである。
【００５４】ヒトより精製したCSF-1 と同様に，精製し
たネズミのCSF-1は，分子量の40−60％であるアスパラ
ギン結合複合型の糖である，重度に糖化された二量体で
ある。２−メルカプトエタノール存在下でのSDS-PAGE上
で，精製した調製物は70kdと90kdの見かけの分子量を有
し，還元すると70kdと90kdの元の分子量の二量体に由来
する40kdのメージャーバンドと33kdのマイナーバンドに
なった。40kdのサブユニットは33kdのサブユニット以上
により多く糖化されており，また両サブユニットのＮ末
端配列が同一であることは明らかである。
たネズミのCSF-1は，分子量の40−60％であるアスパラ
ギン結合複合型の糖である，重度に糖化された二量体で
ある。２−メルカプトエタノール存在下でのSDS-PAGE上
で，精製した調製物は70kdと90kdの見かけの分子量を有
し，還元すると70kdと90kdの元の分子量の二量体に由来
する40kdのメージャーバンドと33kdのマイナーバンドに
なった。40kdのサブユニットは33kdのサブユニット以上
により多く糖化されており，また両サブユニットのＮ末
端配列が同一であることは明らかである。
【００５５】マウスのタンパクの全組成のデータも以下
に示されているように得た。これらのデータは，良好な
回収を示すそのアミノ酸に対する正確な相対モル％を示
しているが，ヒスチジやシステインは良い収率で得られ
なかったので，数は絶対的ではない。
に示されているように得た。これらのデータは，良好な
回収を示すそのアミノ酸に対する正確な相対モル％を示
しているが，ヒスチジやシステインは良い収率で得られ
なかったので，数は絶対的ではない。
【００５６】
【表１】
【００５７】残基／125への変換は，分子量からの配列
の長さの概算に基づいている。
の長さの概算に基づいている。
【００５８】一次構造の決定は，自動エドマン分解装置
を用い，そして逆相HPLCにより逐次的に分解されたアミ
ノ酸を分析することにより，行なった。従来通りでの配
列決定は，初めの13個のＮ末端アミノ酸配列となった。
10番目にメチオニンが存在し，限られた数のメチオニン
残基が存在するため，CNBr分解したタンパクを，断片の
前分画なしでシークエンサーに負荷し，３つの配列だけ
を得た。これらは，期待したＮ末端配列，すなわち既知
のＮ末端配列に重複してIle-Gly-Asnで始まる配列，お
よび約50％の収率でX-Phe-Lysで始まる配列であった。
後者の２つの断片と最初の既知の配列の量の差により，
限られた数の残基を通じて３断片を同時に配列決定でき
た。
を用い，そして逆相HPLCにより逐次的に分解されたアミ
ノ酸を分析することにより，行なった。従来通りでの配
列決定は，初めの13個のＮ末端アミノ酸配列となった。
10番目にメチオニンが存在し，限られた数のメチオニン
残基が存在するため，CNBr分解したタンパクを，断片の
前分画なしでシークエンサーに負荷し，３つの配列だけ
を得た。これらは，期待したＮ末端配列，すなわち既知
のＮ末端配列に重複してIle-Gly-Asnで始まる配列，お
よび約50％の収率でX-Phe-Lysで始まる配列であった。
後者の２つの断片と最初の既知の配列の量の差により，
限られた数の残基を通じて３断片を同時に配列決定でき
た。
【００５９】次に配列決定を，精製したCNBr内部断片に
関して行なった。このＮ末端のGlu-Phe-Lys ペプチドに
混在する断片を，Ｏ−フタルアルデヒドで処理してＮ末
端にプロリンを持たない断片をブロックすることにより
除去した（内部配列は７番目にプロリンを有する）。配
列決定を続け，内部断片の次の残基をこのように固定し
た。配列決定の結果を第１図に示す。データは，２つの
同一のサブユニットを含む二量体タンパクに，そして単
一のサブユニットの両端に由来するペプチドのCNBrによ
る放出に一致し，これらの末端は残基１−25で，内部の
断片であり，各々はおよその分子量が2.5kdである。
関して行なった。このＮ末端のGlu-Phe-Lys ペプチドに
混在する断片を，Ｏ−フタルアルデヒドで処理してＮ末
端にプロリンを持たない断片をブロックすることにより
除去した（内部配列は７番目にプロリンを有する）。配
列決定を続け，内部断片の次の残基をこのように固定し
た。配列決定の結果を第１図に示す。データは，２つの
同一のサブユニットを含む二量体タンパクに，そして単
一のサブユニットの両端に由来するペプチドのCNBrによ
る放出に一致し，これらの末端は残基１−25で，内部の
断片であり，各々はおよその分子量が2.5kdである。
【００６０】前述のデータは，14.5kdの分子量の非糖化
サブユニットに基づくCSF-1 の配列のおよそ半分を表し
ている。Ｌ−細胞CSF-1は約60重量％が炭水化物で，唯
一の糖化されうる部位（37，38，および39番目の位置）
が同定されているので，分子の残りは重度に糖化された
ものである。
サブユニットに基づくCSF-1 の配列のおよそ半分を表し
ている。Ｌ−細胞CSF-1は約60重量％が炭水化物で，唯
一の糖化されうる部位（37，38，および39番目の位置）
が同定されているので，分子の残りは重度に糖化された
ものである。
【００６１】（プローブの調製）第２図は，得た配列の
情報を基にして調製したネズミのCSF-1に相補的な，一
連のオリゴヌクレオチドプローブを示している。これら
は，コドン重複にあてはまるよう混合プローブであり，
あるいは哺乳動物の優先コドンに好都合となるように設
計されている。
情報を基にして調製したネズミのCSF-1に相補的な，一
連のオリゴヌクレオチドプローブを示している。これら
は，コドン重複にあてはまるよう混合プローブであり，
あるいは哺乳動物の優先コドンに好都合となるように設
計されている。
【００６２】Ｅ．３．生物学的活性 CSF-1の活性に関する付加的なデータは，部分精製したM
IAPaCa CSF-1あるいはネズミのＬ−細胞CSF-1を用いて
得られた。CSF-1が，10倍にまで誘導したヒト単球によ
るインターフェロンや腫瘍壊死因子（TNF)の産生を高め
ることが示された。CSF-1はまた，マクロファージの抗
腫瘍毒性を促進することが示された。
IAPaCa CSF-1あるいはネズミのＬ−細胞CSF-1を用いて
得られた。CSF-1が，10倍にまで誘導したヒト単球によ
るインターフェロンや腫瘍壊死因子（TNF)の産生を高め
ることが示された。CSF-1はまた，マクロファージの抗
腫瘍毒性を促進することが示された。
【００６３】（ヒト単球によるTNF産生の促進）MIAPaCa
CSF-1を，リン酸カルシウム ゲル濾過およびレンチル
レクチンクロマトグラフィーにより上澄液より精製し
た。リンホカイン産生のアッセイ用に，末梢血管付着細
胞を，各107個の細胞を含む重複したフラスコで保温し
た。１つのフラスコを上記で精製した1000U/mlCSF-1で
処理した。３日後，細胞を集め，洗浄し，そして５×10
5/mlの細胞濃度に再懸濁して，24ウェルのプレート0.5m
l／ウェルで蒔いた。ウェルを48時間，10μｇ／ml LPS
および20ng／ml PMAで処理し，上澄液をTNFアッセイ用
に集めた。CSFで処理した細胞は，未処理の細胞の約９
倍高い TNF分泌を示した（162U／mlに対して1500U/m
l）。
CSF-1を，リン酸カルシウム ゲル濾過およびレンチル
レクチンクロマトグラフィーにより上澄液より精製し
た。リンホカイン産生のアッセイ用に，末梢血管付着細
胞を，各107個の細胞を含む重複したフラスコで保温し
た。１つのフラスコを上記で精製した1000U/mlCSF-1で
処理した。３日後，細胞を集め，洗浄し，そして５×10
5/mlの細胞濃度に再懸濁して，24ウェルのプレート0.5m
l／ウェルで蒔いた。ウェルを48時間，10μｇ／ml LPS
および20ng／ml PMAで処理し，上澄液をTNFアッセイ用
に集めた。CSFで処理した細胞は，未処理の細胞の約９
倍高い TNF分泌を示した（162U／mlに対して1500U/m
l）。
【００６４】（ヒト単球によるインターフェロン産生の
促進）インターフェロン産生におけるCSF-1の効果を決
めるための同様の実験において，末梢血管付着細胞を，
上記で述べたように1000U/ml CSF-1の存在下あるいは非
存在下で３日間保温し，集め，５×105/mlとなるよう再
懸濁し，そして上記で述べたように25ウェルのプレート
に蒔いた。種々の量のポリＩＣを加えて，細胞にインタ
ーフェロン産生の誘導をした。上澄液を，VSVの感染し
たGM2504細胞におけるその細胞変性効果により，インタ
ーフェロン産生についてアッセイした。CSF-1促進細胞
は，McCormick, F., et al, Mol Cell Biol (1984）
４：166で述べられているように，50μｇ／mlのポリＩ
Ｃで誘導したときに，100U／mlの産生を示した。これに
対し同等に誘導された未処理細胞は3U／ml以下の産生で
あった。
促進）インターフェロン産生におけるCSF-1の効果を決
めるための同様の実験において，末梢血管付着細胞を，
上記で述べたように1000U/ml CSF-1の存在下あるいは非
存在下で３日間保温し，集め，５×105/mlとなるよう再
懸濁し，そして上記で述べたように25ウェルのプレート
に蒔いた。種々の量のポリＩＣを加えて，細胞にインタ
ーフェロン産生の誘導をした。上澄液を，VSVの感染し
たGM2504細胞におけるその細胞変性効果により，インタ
ーフェロン産生についてアッセイした。CSF-1促進細胞
は，McCormick, F., et al, Mol Cell Biol (1984）
４：166で述べられているように，50μｇ／mlのポリＩ
Ｃで誘導したときに，100U／mlの産生を示した。これに
対し同等に誘導された未処理細胞は3U／ml以下の産生で
あった。
【００６５】（ヒト単球による骨髄CSF産生の促進）単
球を３日間，±CSF-1と保温し，それから表１のように
骨髄CSFの産生を誘導した。示されている３つの代表的
な実験は，異なる供与者由来の血液を用いた。
球を３日間，±CSF-1と保温し，それから表１のように
骨髄CSFの産生を誘導した。示されている３つの代表的
な実験は，異なる供与者由来の血液を用いた。
【００６６】
【表２】
【００６７】それゆえに，CSF-1はCSF-GM生産を促進す
る。
る。
【００６８】（ネズミマクロファージによる腫瘍細胞壊
死の促進：他のコロニー促進因子との比較）マクロファ
ージの刺激をアッセイするために，Ｌ−細胞条件培地よ
り得たネズミCSF-1を肉腫の標的を壊死させるネズミマ
クロファージの能力の促進を示すアッセイで，pcCSF-17
由来の組換えにより産生されたCSF-1 のモデルとして用
いた。このアッセイでは，通常の２時間付着のC3H/HeN
マウス末梢マクロファージを，CSF-1存在下あるいは非
存在下で，１日間，インビトロで保温し，それからガン
マインターフェロンを含む10％v/v conA誘導（10μｇ／
ml）の脾臓リンホカイン（LK）に対して3H−チミジンラ
ベルしたマウス肉腫TU５細胞を20：１の比で混ぜた。続
いて48時間にわたるラベルしたチミジンの放出を，腫瘍
細胞壊死の測定標準として用いた。1200U/mlCSF-1を含
むネズミＬ−細胞条件培地としてCSF-1を加える効果
を，以下の表に示す。
死の促進：他のコロニー促進因子との比較）マクロファ
ージの刺激をアッセイするために，Ｌ−細胞条件培地よ
り得たネズミCSF-1を肉腫の標的を壊死させるネズミマ
クロファージの能力の促進を示すアッセイで，pcCSF-17
由来の組換えにより産生されたCSF-1 のモデルとして用
いた。このアッセイでは，通常の２時間付着のC3H/HeN
マウス末梢マクロファージを，CSF-1存在下あるいは非
存在下で，１日間，インビトロで保温し，それからガン
マインターフェロンを含む10％v/v conA誘導（10μｇ／
ml）の脾臓リンホカイン（LK）に対して3H−チミジンラ
ベルしたマウス肉腫TU５細胞を20：１の比で混ぜた。続
いて48時間にわたるラベルしたチミジンの放出を，腫瘍
細胞壊死の測定標準として用いた。1200U/mlCSF-1を含
むネズミＬ−細胞条件培地としてCSF-1を加える効果
を，以下の表に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】標的細胞を壊死させる能力の増加が，CSF-
1を増殖の予備１日の間か，あるいは誘導期間かのどち
らかに加えるかで，注目された。しかし，最も劇的な効
果は，これら期間中の両方でCSF-1が存在するときに，
観察された。
1を増殖の予備１日の間か，あるいは誘導期間かのどち
らかに加えるかで，注目された。しかし，最も劇的な効
果は，これら期間中の両方でCSF-1が存在するときに，
観察された。
【００７１】単球やマクロファージの刺激の原因として
の，細菌のリポ多糖（LPS)の汚染の可能性を，除外し
た。用いたCSF-1のLPS含量は低かった（＜0.3ng/3000U
CSF-1,カブトガニ遊走細胞の抽出液による）。抗CSF-1
カラムに適用することにより活性を除いた。ポリミキシ
ンＢをLPSを中和させるのに用いた。C3H/HeJマウス由来
のマクロファージはCSF-1に応答するが，LPSには応答し
ない。
の，細菌のリポ多糖（LPS)の汚染の可能性を，除外し
た。用いたCSF-1のLPS含量は低かった（＜0.3ng/3000U
CSF-1,カブトガニ遊走細胞の抽出液による）。抗CSF-1
カラムに適用することにより活性を除いた。ポリミキシ
ンＢをLPSを中和させるのに用いた。C3H/HeJマウス由来
のマクロファージはCSF-1に応答するが，LPSには応答し
ない。
【００７２】CSF-GMを，５μｇLPSのIV投与５時間後に
得た６個のマウス肺より調製した。肺を切り刻み，無血
清培地で３日間保温し，YYG106アフィニティーカラムを
用いて上澄液からCSF-1を枯渇させた（CSF-1含量を270U
／mlから78U／mlにまで減少させた）。CSF-Gを同様に処
理したLDI無血清培地より調製した。CSF-GMおよびCSF-G
の両含量を，コロニー促進アッセイにより，2000U/mlで
アッセイした。
得た６個のマウス肺より調製した。肺を切り刻み，無血
清培地で３日間保温し，YYG106アフィニティーカラムを
用いて上澄液からCSF-1を枯渇させた（CSF-1含量を270U
／mlから78U／mlにまで減少させた）。CSF-Gを同様に処
理したLDI無血清培地より調製した。CSF-GMおよびCSF-G
の両含量を，コロニー促進アッセイにより，2000U/mlで
アッセイした。
【００７３】腹膜マクロファージを，前出の培地のいず
れかの40％か，１日間2000U/mlのCSF-1でアッセイした
Ｌ−細胞培地かの，いずれかで保温し，それから付加的
な培地かLKで48時間保温し，上で述べたようにTU５壊死
をアッセイした。
れかの40％か，１日間2000U/mlのCSF-1でアッセイした
Ｌ−細胞培地かの，いずれかで保温し，それから付加的
な培地かLKで48時間保温し，上で述べたようにTU５壊死
をアッセイした。
【００７４】CSF-1はTU５に対する毒性の顕著な増強を
示したが，CSF-GとCSF-GMのどちらも効果はなかった。
示したが，CSF-GとCSF-GMのどちらも効果はなかった。
【００７５】（ネズミの抗ウィルス活性の促進）付着し
たネズミのチオグリコレート−誘導マクロファージを３
日間CSF-1と保温し，VSVで一晩感染させた。ポリミキシ
ンＢを試験サンプルに加え，インターフェロンのLPS誘
導を阻止した。以下の表は，付着したままの細胞のクリ
スタルバイオレット染色を示している。
たネズミのチオグリコレート−誘導マクロファージを３
日間CSF-1と保温し，VSVで一晩感染させた。ポリミキシ
ンＢを試験サンプルに加え，インターフェロンのLPS誘
導を阻止した。以下の表は，付着したままの細胞のクリ
スタルバイオレット染色を示している。
【００７６】
【表４】
【００７７】以上より，CSF-1処理した細胞はVSVに対す
るマクロファージの保護を示した。 Ｅ．４．CSF-1のフォーミュレーション 組換えにより産生されたヒトCSF-1は，標準的な製薬的
手順を用いて投薬に用いられるよう作成できる。通常の
CSF-1は，注入できる形態で調製されるだろうし，また
単一の活性のある成分として，あるいは他のタンパクま
たは相補するか同様の活性を持つ他の化合物と組合わせ
て用いてもよい。そのような他の化合物には，アドリア
マイシンのような別の抗腫瘍剤あるいはIL−１，−２，
および−３，アルファ−，ベータ−，およびガンマ−イ
ンターフェロンおよび腫瘍壊死因子ようなリンホカイン
が含まれる。CSF-1の活性成分の効果は，そのような付
加的な成分の存在により高められるもしくは改善される
ことがある。上記で述べたように，CSF-1は適当な血液
細胞と有利な方法で相互作用をすることがあり，それゆ
えに本発明の組成物は，CSF-1とそのような細胞との保
温混合液を含む。この場合，付加的なリンホカインは存
在してもしなくてもよい。そのような保温混合液の上澄
液分画か，あるいは細胞も同様に含む完全な混合液かの
どちらかを用いてもよい。
るマクロファージの保護を示した。 Ｅ．４．CSF-1のフォーミュレーション 組換えにより産生されたヒトCSF-1は，標準的な製薬的
手順を用いて投薬に用いられるよう作成できる。通常の
CSF-1は，注入できる形態で調製されるだろうし，また
単一の活性のある成分として，あるいは他のタンパクま
たは相補するか同様の活性を持つ他の化合物と組合わせ
て用いてもよい。そのような他の化合物には，アドリア
マイシンのような別の抗腫瘍剤あるいはIL−１，−２，
および−３，アルファ−，ベータ−，およびガンマ−イ
ンターフェロンおよび腫瘍壊死因子ようなリンホカイン
が含まれる。CSF-1の活性成分の効果は，そのような付
加的な成分の存在により高められるもしくは改善される
ことがある。上記で述べたように，CSF-1は適当な血液
細胞と有利な方法で相互作用をすることがあり，それゆ
えに本発明の組成物は，CSF-1とそのような細胞との保
温混合液を含む。この場合，付加的なリンホカインは存
在してもしなくてもよい。そのような保温混合液の上澄
液分画か，あるいは細胞も同様に含む完全な混合液かの
どちらかを用いてもよい。
【図１】 第１図は精製天然タンパクから決定されたヒ
ト尿およびMIAPaCaおよびネズミL-929細胞のCSF-1の部
分アミノ酸配列を示す。
ト尿およびMIAPaCaおよびネズミL-929細胞のCSF-1の部
分アミノ酸配列を示す。
【図２】 第２図はネズミCSF-1のアミノ酸配列から設
計されたオリゴマープローブの配列を示す。
計されたオリゴマープローブの配列を示す。
【図３】 第３図はヒトCSF-1のアミノ酸配列から設計
されたオリゴマープローブの配列を示す。
されたオリゴマープローブの配列を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ 15/02 ＡＤＹ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 9162−4Ｂ ＺＮＡＡ (71)出願人 595174223 1400 Ｆｉｆｔｙｔｈｉｒｄ Ｓｔｒｅｅ ｔ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏ ｒｎｉａ 94608，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａ ｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (71)出願人 595174234 アルバート アインスタイン カレッジ オブ メディスン Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌ ｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10461 ブロンクス，モリス アベニュー 1300 1300 Ｍｏｒｒｉｓ Ａｖｅｎｕｅ，Ｂｒ ｏｎｘ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 10461 Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒ ｉｃａ (72)発明者 ミカエル ピー． マックグローガン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94706 アルバニー，エヌオー．８，カーティス ストリート 707 (72)発明者 ケネス ウィルソン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94598 ウォルナット クリーク，ローモンド レーン 2249 (72)発明者 ジェームズ イー． ストリクラー アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19083 ハバータウン，ペンシルベニア アベニ ュー 101 (72)発明者 アルバート ブースマン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94523 プレゼント ヒル，ヴェッシング ロー ド 3073 (72)発明者 マリー キム ウォーレン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94577 サン リーンドロ，ジョアキン アベニ ュー (72)発明者 リチャード イー． スタンレー アメリカ合衆国 ニューヨーク 10461 ブロンクス，モリス アベニュー 1300
Claims (11)
- 【請求項１】脊椎動物ＣＳＦ−１の精製法であって、所
望のＣＳＦ−１を含む溶液を、ハイブリドーマＹＹＧ１
０６によって生産される抗体を含有するイムノアフィニ
ティーカラムで処理すること、および得られたＣＳＦ−
１含有画分を続いて逆相ＨＰＬＣにかけることを包含す
るヒト１ＣＳＦ−１の精製法。 - 【請求項２】以下のＮ−末端配列を有する、精製ヒト天
然ＣＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu。 - 【請求項３】単球のインターフェロンの生産を増強する
組成物であって、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒト
天然ＣＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu；を含有する、組成物。 - 【請求項４】単球のＴＮＦの生産を増強する組成物であ
って、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒト天然ＣＳＦ
−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu；の有効量を含有する、組成
物。 - 【請求項５】マクロファージによる標的細胞の壊死を増
強する組成物であって、以下のＮ−末端配列を有する精
製ヒト天然ＣＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu；の有効量を含有する、組成
物。 - 【請求項６】単球のＧＭ−ＣＳＦ生産を増強する組成物
であって、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒト天然Ｃ
ＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu；の有効量を含有する、組成
物。 - 【請求項７】マクロファージにウイルス感染耐性を誘導
する組成物であって、以下のＮ−末端配列を有する精製
ヒト天然ＣＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu；の有効量を含有する、組成
物。 - 【請求項８】哺乳動物の免疫系を増強するための組成物
であって、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒト天然Ｃ
ＳＦ−１： Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Se
r-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-
Gln-Met-Glu-Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-Phe-Va
l-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu；の有効量と少なくとも１つの
付加成分とを混合した状態で含有する、組成物。 - 【請求項９】前記付加成分が製薬賦形剤である、請求項
８に記載の組成物。 - 【請求項１０】前記付加成分が細胞培養物の上清であ
る、請求項８に記載の組成物。 - 【請求項１１】前記付加成分が細胞培養物である、請求
項８に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69835885A | 1985-02-05 | 1985-02-05 | |
| US698,358 | 1985-02-05 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61501090A Division JP2512453B2 (ja) | 1985-02-05 | 1986-02-05 | 天然のコロニ−促進因子―１の精製 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09136899A true JPH09136899A (ja) | 1997-05-27 |
Family
ID=24804907
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61501090A Expired - Lifetime JP2512453B2 (ja) | 1985-02-05 | 1986-02-05 | 天然のコロニ−促進因子―１の精製 |
| JP7323391A Pending JPH09136899A (ja) | 1985-02-05 | 1995-12-12 | 天然のコロニー促進因子−１の精製 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61501090A Expired - Lifetime JP2512453B2 (ja) | 1985-02-05 | 1986-02-05 | 天然のコロニ−促進因子―１の精製 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0211899B1 (ja) |
| JP (2) | JP2512453B2 (ja) |
| AT (1) | ATE80894T1 (ja) |
| AU (1) | AU590543B2 (ja) |
| DE (1) | DE3686794T2 (ja) |
| WO (1) | WO1986004587A1 (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019385A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
| US5422105A (en) * | 1985-02-05 | 1995-06-06 | Cetus Oncology Corporation | Use of recombinant colony stimulating factor 1 |
| US5837229A (en) * | 1985-02-05 | 1998-11-17 | Chiron Corporation | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
| US5556620A (en) * | 1985-02-05 | 1996-09-17 | Cetus Oncology Corporation | Use of recombinant colony stimulating factor-1 to enhance wound healing |
| US6103224A (en) * | 1985-02-05 | 2000-08-15 | Chiron Corporation | N∇2 CSF-1 (short form) and carboxy truncated fragments thereof |
| US5792450A (en) * | 1985-02-05 | 1998-08-11 | Chiron Corporation | Purified human CSF-1 |
| US5104650A (en) * | 1985-02-05 | 1992-04-14 | Cetus Corporation | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
| WO1986004587A1 (en) * | 1985-02-05 | 1986-08-14 | Cetus Corporation | Purification of native colony stimulating factor-1 |
| US5573930A (en) * | 1985-02-05 | 1996-11-12 | Cetus Oncology Corporation | DNA encoding various forms of colony stimulating factor-1 |
| WO1986004607A1 (en) * | 1985-02-05 | 1986-08-14 | Cetus Corporation | Recombinant colony stimulating factor-1 |
| US6156300A (en) * | 1985-02-05 | 2000-12-05 | Chiron Corporation | Point mutants of N∇2 CSF-1 and carboxy truncated fragments thereof |
| JPH0618778B2 (ja) * | 1985-10-04 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 白血球減少症治療剤 |
| AU589731B2 (en) * | 1985-11-27 | 1989-10-19 | Genetics Institute, Llc | Colony stimulating factor for the treatment of aids-type diseases |
| ATE92966T1 (de) * | 1986-05-06 | 1993-08-15 | Genetics Inst | Herstellung von m-csf. |
| GR871067B (en) * | 1986-07-18 | 1987-11-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Process for producing stable pharmaceutical preparation containing granulocyte colony stimulating factor |
| US5650297A (en) * | 1986-09-17 | 1997-07-22 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | DNA encoding human colony-stimulating factors |
| GB8624899D0 (en) * | 1986-10-17 | 1986-11-19 | Sandoz Ltd | Monoclonal antibodies |
| DE3777623D1 (de) * | 1986-12-07 | 1992-04-23 | Morinaga Milk Industry Co Ltd | Kolonie-stimulierender faktor und verfahren zu seiner herstellung. |
| AU8313187A (en) * | 1986-12-31 | 1988-07-07 | Cetus Corporation | Pharmaceutical composition of colony stimulating factor-i and granulocyte colony stimulating factor |
| EP0643972B1 (en) * | 1987-09-22 | 2002-03-06 | Chiron Corporation | Use of recombinant colony stimulating factor-1 for the preparation of a medicament for cytomegalovirus infections |
| JPH0611705B2 (ja) * | 1988-02-10 | 1994-02-16 | 新技術事業団 | 血小板減少症治療剤 |
| JPH0610137B2 (ja) * | 1988-02-29 | 1994-02-09 | 新技術事業団 | ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 |
| US5888495A (en) * | 1988-05-23 | 1999-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method of producing storage stable M-CSF lyophilizates |
| US5171675A (en) * | 1988-07-28 | 1992-12-15 | Cerretti Douglas P | Macrophage colony stimulating factor-γ |
| JPH02225418A (ja) * | 1989-02-28 | 1990-09-07 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 抗悪性腫瘍剤 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63502271A (ja) * | 1985-02-05 | 1988-09-01 | シ−タス コ−ポレ−シヨン | 天然のコロニ−促進因子‐１の精製 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4438032A (en) * | 1981-01-30 | 1984-03-20 | The Regents Of The University Of California | Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom |
| JPS59137417A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-07 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 |
| US4504586A (en) * | 1983-02-03 | 1985-03-12 | Amgen | Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to human colony stimulating factor subclass number 1 |
| AU599572B2 (en) * | 1984-07-06 | 1990-07-26 | Novartis Ag | Lymphokine production and purification |
| AU588819B2 (en) * | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
-
1986
- 1986-02-05 WO PCT/US1986/000251 patent/WO1986004587A1/en active IP Right Grant
- 1986-02-05 JP JP61501090A patent/JP2512453B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-05 AU AU54544/86A patent/AU590543B2/en not_active Ceased
- 1986-02-05 DE DE8686901265T patent/DE3686794T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-05 EP EP86901265A patent/EP0211899B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-05 AT AT86901265T patent/ATE80894T1/de not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-12-12 JP JP7323391A patent/JPH09136899A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63502271A (ja) * | 1985-02-05 | 1988-09-01 | シ−タス コ−ポレ−シヨン | 天然のコロニ−促進因子‐１の精製 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3686794D1 (de) | 1992-10-29 |
| EP0211899A1 (en) | 1987-03-04 |
| DE3686794T2 (de) | 1993-03-04 |
| JP2512453B2 (ja) | 1996-07-03 |
| WO1986004587A1 (en) | 1986-08-14 |
| AU5454486A (en) | 1986-08-26 |
| ATE80894T1 (de) | 1992-10-15 |
| EP0211899B1 (en) | 1992-09-23 |
| JPS63502271A (ja) | 1988-09-01 |
| AU590543B2 (en) | 1989-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2512453B2 (ja) | 天然のコロニ−促進因子―１の精製 | |
| Cebon et al. | Pharmacokinetics of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor using a sensitive immunoassay | |
| CN1027346C (zh) | 制备用于治疗伤口的组合物的方法 | |
| Gospodarowicz et al. | Isolation of brain fibroblast growth factor by heparin-Sepharose affinity chromatography: identity with pituitary fibroblast growth factor. | |
| RU2292352C2 (ru) | Ингибитор и стимулятор пролиферации стволовой клетки и их использование | |
| US7319091B2 (en) | Human derived monocyte attracting purified protein product useful in a method of treating infection and neoplasms in a human body, and the cloning of full length cDNA thereof | |
| US5792450A (en) | Purified human CSF-1 | |
| JP2004002461A (ja) | 表面複合リンホトキシン | |
| US5582822A (en) | Treatment of leukemia using interleukin 2 | |
| US6447766B1 (en) | Method of mobilizing hematopoietic stem cells | |
| EP0876152A1 (en) | Novel administration of thrombopoietin | |
| JP2831012B2 (ja) | 組換えコロニー刺激因子‐１の使用 | |
| US5532144A (en) | Process for preparing human derived monocyte attracting purified peptide products useful in a method of treating infection and neoplasms in a human body | |
| KR19990066997A (ko) | 조혈성 간세포의 이동 방법 | |
| JP4808316B2 (ja) | 多能性造血幹細胞の動員を刺激するためのヒト成長ホルモン | |
| EP0273778A2 (en) | Synergistic behavior of csf-1 and G-csf | |
| Fairchild et al. | T cell-derived glucosteroid response-modifying factor (GRMFT): a unique lymphokine made by normal T lymphocytes and a T cell hybridoma. | |
| JP2799483B2 (ja) | インターロイキン−１β組成物の安定化方法 | |
| JP2006514699A (ja) | 肝疾患に対するｃｃケモカイン変異体の使用 | |
| EP0401379B1 (en) | STABILIZED COMPOSITION OF INTERLEUKIN-1$g(b) | |
| CA1320129C (en) | Synergistic behavior of csf-1 and g-csf | |
| KR20010032511A (ko) | 조혈 간세포를 이동시키는 방법 | |
| KR100490447B1 (ko) | 인터페론-γ의생산을유도하는폴리펩피드,이폴리펩티드에특이적인모노클로날항체및감수성질환체 | |
| KR100619599B1 (ko) | 간세포증식의억제제및자극제및그것들의용도 | |
| JP2753694B2 (ja) | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19980129 |