JP2512453B2 - 天然のコロニ−促進因子―１の精製 - Google Patents
天然のコロニ−促進因子―１の精製Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術的分野 本発明はタンパクの精製，その精製産物，およびそれ
から作成されるDNAプローブに関するものである。特
に，本発明はネズミおよびヒトのコロニー促進因子−１
（CSF−１）の精製と配列決定に関するものである。
から作成されるDNAプローブに関するものである。特
に，本発明はネズミおよびヒトのコロニー促進因子−１
（CSF−１）の精製と配列決定に関するものである。
背景の文献 種々の組織に極めて低濃度で生産されるある因子の，
骨髄の先祖細胞の顆粒球および／またはマクロファージ
への成長および発達の促進する能力は，この15年間に知
られてきた。多くの種の血清，尿サンプル，および組織
抽出液中のそのような因子の存在は，半固体培養培地上
に置かれた骨髄細胞によるコロニー形成の促進を測るイ
ンビトロ分析で示される。インビボ分析は知られていな
い。これらの因子はそのようなコロニーの形成を誘導す
るので，この因子はまとめてコロニー促進因子（CSF）
と呼ばれた。
骨髄の先祖細胞の顆粒球および／またはマクロファージ
への成長および発達の促進する能力は，この15年間に知
られてきた。多くの種の血清，尿サンプル，および組織
抽出液中のそのような因子の存在は，半固体培養培地上
に置かれた骨髄細胞によるコロニー形成の促進を測るイ
ンビトロ分析で示される。インビボ分析は知られていな
い。これらの因子はそのようなコロニーの形成を誘導す
るので，この因子はまとめてコロニー促進因子（CSF）
と呼ばれた。
さらに最近，得られるコロニーに見られる細胞の型に
より決定されるヒトCSFタンパクに少なくとも４つのサ
ブクラスがあることが解った。１つのサブクラスCSF−
１では，主にマクロファージを含むコロニーになる。他
のサブクラスは中性染色性顆粒球とマクロファージの両
方；中性染色性顆粒球のみ；中性染色性顆粒球，好酸性
顆粒球，およびマクロファージ，を含むコロニーを生じ
る。
より決定されるヒトCSFタンパクに少なくとも４つのサ
ブクラスがあることが解った。１つのサブクラスCSF−
１では，主にマクロファージを含むコロニーになる。他
のサブクラスは中性染色性顆粒球とマクロファージの両
方；中性染色性顆粒球のみ；中性染色性顆粒球，好酸性
顆粒球，およびマクロファージ，を含むコロニーを生じ
る。
上のヒトCSFの初めの３つに類似のネズミ因子があ
る。さらに,IL−３と呼ばれるネズミ因子は，すべての
これら細胞型に加え巨核球，赤血球，およびマスト細胞
を種々組合せで含むネズミ骨髄細胞のコロニーを誘導す
る。これらのCSFはDexter,T.M.,Nature（1984）309:74
6,およびVadas,M.A.,etal.J.Immunol.（1983）130:793
により総説が発表されている。
る。さらに,IL−３と呼ばれるネズミ因子は，すべての
これら細胞型に加え巨核球，赤血球，およびマスト細胞
を種々組合せで含むネズミ骨髄細胞のコロニーを誘導す
る。これらのCSFはDexter,T.M.,Nature（1984）309:74
6,およびVadas,M.A.,etal.J.Immunol.（1983）130:793
により総説が発表されている。
ここでの発明はこれらサブクラスの最初のもの,CSF−
１の成分であるタンパクの精製に関するものである。こ
のサブクラスはさらに特異的ラジオノムノアッセイとラ
ジオリセプターアッセイにより性格づけおよび特徴づけ
られる−−例えば，精製CSF−１に対して生じた抗体
は，他のサブクラスの生物学的活性に影響することな
く，特異的にCSF−１活性を抑えることができ，またマ
クロファージ細胞系列J774はCSF−１に特異的に結合す
るリセプターを含む。これらの分析の記述はDas,S.K.,e
t al.,Blood（1981）58:630により出版されている。
１の成分であるタンパクの精製に関するものである。こ
のサブクラスはさらに特異的ラジオノムノアッセイとラ
ジオリセプターアッセイにより性格づけおよび特徴づけ
られる−−例えば，精製CSF−１に対して生じた抗体
は，他のサブクラスの生物学的活性に影響することな
く，特異的にCSF−１活性を抑えることができ，またマ
クロファージ細胞系列J774はCSF−１に特異的に結合す
るリセプターを含む。これらの分析の記述はDas,S.K.,e
t al.,Blood（1981）58:630により出版されている。
種々CSFタンパクの精製方法が発表された。
Stanley,E.R.,et al.,J Biol Chem（1977）252:4305,
はネズミL929細胞のCSFタンパクを比活性約１×108ユニ
ット/mgに精製し，それは主にマクロファージ生産を促
進した。Waheed,A.,et al.,Blood（1982）60:238,はマ
ウスＬ−細胞のCSF−１をウサギ抗体カラムを用いてほ
ぼ均一にまで精製し，ネズミ配列の最初の25アミノ酸を
報告した（Ben−Avram,C.M.et al,Proc.Natl Acad Sci
（USA）（1985）882:4486）。
はネズミL929細胞のCSFタンパクを比活性約１×108ユニ
ット/mgに精製し，それは主にマクロファージ生産を促
進した。Waheed,A.,et al.,Blood（1982）60:238,はマ
ウスＬ−細胞のCSF−１をウサギ抗体カラムを用いてほ
ぼ均一にまで精製し，ネズミ配列の最初の25アミノ酸を
報告した（Ben−Avram,C.M.et al,Proc.Natl Acad Sci
（USA）（1985）882:4486）。
Stanley,E.R.,et al.,J Biol Chem（1977）252:4305
−4312はヒト尿からCSF−１精製手順を開示し，またDa
s,S.K.,et al,Blood（1981）58:630:J Biol Chem（198
2）257:13679はヒト尿CSF−１を比活性５×107ユニット
/mgで得，それはマクロファージのみを生じた。そして
培養マウスＬ−細胞とヒト尿から調製したCSF−１タン
パクの糖付加とそれらの活性の関係の概要を示した。Wa
ng,F.F.,et al,J Cell Biochem（1983）21:263,はヒト
尿CSF−１を比活性108U/mgで得た。Waheed,A.,et al,は
比活性0.7−2.3×107U/mgのヒト尿CSF−１をウサギ抗体
カラムで得た（Exp Hemat（1984）12:434）。
−4312はヒト尿からCSF−１精製手順を開示し，またDa
s,S.K.,et al,Blood（1981）58:630:J Biol Chem（198
2）257:13679はヒト尿CSF−１を比活性５×107ユニット
/mgで得，それはマクロファージのみを生じた。そして
培養マウスＬ−細胞とヒト尿から調製したCSF−１タン
パクの糖付加とそれらの活性の関係の概要を示した。Wa
ng,F.F.,et al,J Cell Biochem（1983）21:263,はヒト
尿CSF−１を比活性108U/mgで得た。Waheed,A.,et al,は
比活性0.7−2.3×107U/mgのヒト尿CSF−１をウサギ抗体
カラムで得た（Exp Hemat（1984）12:434）。
Wu,M.,et al,J Biol Chem（1979）254:6226,は培養ヒ
トすい臓癌（MIAPaCa）細胞からCSFタンパクを精製し，
それはネズミ顆粒球とマクロファージコロニーを増殖さ
せたと報告した。得られたタンパクは約７×107ユニッ
ト/mgの比活性を有していた。
トすい臓癌（MIAPaCa）細胞からCSFタンパクを精製し，
それはネズミ顆粒球とマクロファージコロニーを増殖さ
せたと報告した。得られたタンパクは約７×107ユニッ
ト/mgの比活性を有していた。
種々のCSFの部分精製標品がまた，ヒトおよびマウス
の肺細胞のコンディションドメディウムから（Fojo,S.
S.,et al,Biochemistry（1978）17:3109;Burgess,A.W.,
et al,J Biol Chem（1977）252:1998）；ヒトＴ−リン
パ芽球細胞から（Lusis,A.J.,et al,Blood（1981）57:1
3;U.S.Patent,4,438,032）：ヒト胎盤のコンディション
ドメディウムから見掛け上均一にそして比活性７×107
ユニット/mgで（Wu,M.,et al,Biochemistry（1980）19:
3846），報告された。
の肺細胞のコンディションドメディウムから（Fojo,S.
S.,et al,Biochemistry（1978）17:3109;Burgess,A.W.,
et al,J Biol Chem（1977）252:1998）；ヒトＴ−リン
パ芽球細胞から（Lusis,A.J.,et al,Blood（1981）57:1
3;U.S.Patent,4,438,032）：ヒト胎盤のコンディション
ドメディウムから見掛け上均一にそして比活性７×107
ユニット/mgで（Wu,M.,et al,Biochemistry（1980）19:
3846），報告された。
出願中の米国特許第698,358号は、組換えDNA技術によ
るヒトおよびネズミのCSF−１のクローニングと発現を
述べている。べつのサブクラスのCSFタンパク，ネズミ
およびヒトのGM−CSF,が精製され，そのcDNAがクローン
化された。このタンパクはGough,et al,Nature（1984）
309:763−767により，他のCSF,例えばCSF−１と明らか
に異なることが示された。ネズミのIL−３がFung,M.C.,
et al,Nature（1984）307:233によりクローニングされ
た。また、Yokota,T.,et al,PNAS（1984）81:1070−107
4;Wong,G.G.,et al,Science（1985）228:810−815;Lee,
F.,et al,PNAS（1985）82:8360−4364;およびCantrell,
M.A.,et al,PNAS（1985）82:6250−6254を参照。
るヒトおよびネズミのCSF−１のクローニングと発現を
述べている。べつのサブクラスのCSFタンパク，ネズミ
およびヒトのGM−CSF,が精製され，そのcDNAがクローン
化された。このタンパクはGough,et al,Nature（1984）
309:763−767により，他のCSF,例えばCSF−１と明らか
に異なることが示された。ネズミのIL−３がFung,M.C.,
et al,Nature（1984）307:233によりクローニングされ
た。また、Yokota,T.,et al,PNAS（1984）81:1070−107
4;Wong,G.G.,et al,Science（1985）228:810−815;Lee,
F.,et al,PNAS（1985）82:8360−4364;およびCantrell,
M.A.,et al,PNAS（1985）82:6250−6254を参照。
本発明の開示 １つの観点では，本発明は，本発明により決定された
一次アミノ酸配列を有する，精製された天然のヒトおよ
びネズミCSF−１タンパク，および多量のそのようなタ
ンパクとそのような配列情報を得る方法に関するもので
ある。精巧な精製技術と注意深い配列決定はヒトおよび
ネズミ両型のＮ末端配列の同定を可能にした。これによ
り，症状を分析し，そして症状を相関したCSF−１タン
パクの変化を調べるのに有用なプローブの作成が可能に
なる。このプローブはまた,CSF−１タンパクの組換え操
作による生産を行うのに有用なCSF−１をコードするDNA
を得る道具として有用である。このようにして，他の観
点では，本発明は決定配列に基づき設計されるプローブ
に関するものである。
一次アミノ酸配列を有する，精製された天然のヒトおよ
びネズミCSF−１タンパク，および多量のそのようなタ
ンパクとそのような配列情報を得る方法に関するもので
ある。精巧な精製技術と注意深い配列決定はヒトおよび
ネズミ両型のＮ末端配列の同定を可能にした。これによ
り，症状を分析し，そして症状を相関したCSF−１タン
パクの変化を調べるのに有用なプローブの作成が可能に
なる。このプローブはまた,CSF−１タンパクの組換え操
作による生産を行うのに有用なCSF−１をコードするDNA
を得る道具として有用である。このようにして，他の観
点では，本発明は決定配列に基づき設計されるプローブ
に関するものである。
ある一面では，本発明は脊椎動物からのCSF−１精製
の改良法に関するものである。これらの方法は，有効な
特異的精製段階を行うためのイムノアフィニティークロ
マトグラフィーの利用と次いで混在物を除くための逆相
HPLCの使用を含む。モノクローナル抗体がイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー段階に使われるであろう。
他の面では，本発明は得られた天然の精製CSF−１と，
精製品から決定されたアミノ酸配列に基づき設計される
DNAプローブに関するものである。
の改良法に関するものである。これらの方法は，有効な
特異的精製段階を行うためのイムノアフィニティークロ
マトグラフィーの利用と次いで混在物を除くための逆相
HPLCの使用を含む。モノクローナル抗体がイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー段階に使われるであろう。
他の面では，本発明は得られた天然の精製CSF−１と，
精製品から決定されたアミノ酸配列に基づき設計される
DNAプローブに関するものである。
図の簡単な説明 第１図は精製天然タンパクから決定されたヒト尿およ
びMIAPaCaおよびネズミＬ−929細胞のCSF−１の部分ア
ミノ酸配列を示す。
びMIAPaCaおよびネズミＬ−929細胞のCSF−１の部分ア
ミノ酸配列を示す。
第２図はネズミCSF−１のアミノ酸配列から設計され
たオリゴマープローブの配列を示す。
たオリゴマープローブの配列を示す。
第３図はヒトCSF−１のアミノ酸配列から設計された
オリゴマープローブの配列を示す。
オリゴマープローブの配列を示す。
本発明の実施態様 A.定義 “コロニー促進因子−１（CSF−１）”はCSF−１の文
献で理解される活性スペクトル−−すなわち,Metcalf,
D.,J Cell Physiol（1970）76:89の標準インビトロ コ
ロニー促進分析の適用により，主にマクロファージコロ
ニーを形成する−−を示すタンパクを指す。この因子は
また,Moore,R.N.,et al,J Immunol（1983）131:2374とP
rystowsky,M.B.,et al.Am J Pathol（1984）114:149の
骨髄増殖分析で活性がある。このタンパクはいかなる脊
椎動物種，好ましくは哺乳類種，そして最も好ましくは
ヒトまたはネズミ検体から単離されるであろう。いくら
か種特異性があるようである：ヒトCSF−１はヒトおよ
びネズミの骨髄細胞の両者に作用する；ネズミCSF−１
はヒト細胞に活性を示さない。従って，ヒトCSF−１はD
as,S.K.,et al,Blood（1981）58:630の特異的ネズミ
ラジオリセプター分析で陽性であるべきで，そしてヒト
タンパクの生物学的活性はヒト尿CSF−１の中和抗血清
で阻害される（Das,S.K.,et al,前出）。
献で理解される活性スペクトル−−すなわち,Metcalf,
D.,J Cell Physiol（1970）76:89の標準インビトロ コ
ロニー促進分析の適用により，主にマクロファージコロ
ニーを形成する−−を示すタンパクを指す。この因子は
また,Moore,R.N.,et al,J Immunol（1983）131:2374とP
rystowsky,M.B.,et al.Am J Pathol（1984）114:149の
骨髄増殖分析で活性がある。このタンパクはいかなる脊
椎動物種，好ましくは哺乳類種，そして最も好ましくは
ヒトまたはネズミ検体から単離されるであろう。いくら
か種特異性があるようである：ヒトCSF−１はヒトおよ
びネズミの骨髄細胞の両者に作用する；ネズミCSF−１
はヒト細胞に活性を示さない。従って，ヒトCSF−１はD
as,S.K.,et al,Blood（1981）58:630の特異的ネズミ
ラジオリセプター分析で陽性であるべきで，そしてヒト
タンパクの生物学的活性はヒト尿CSF−１の中和抗血清
で阻害される（Das,S.K.,et al,前出）。
CSF−１のある別の性質がごく最近見出され，それに
は，成熟マクロファージ（Moore,R.,et al,Science（19
84）223:178）からのＥプロスタグランジン系，インタ
ーロイキン−1,およびインターフェロンの分泌のこのタ
ンパクによる促進能，そして下に述べる単球への別の効
果が含まれる。後者の活性に対する機構は現在不明で，
そしてここでの定義の為に，定義の規準を，出発物質と
して適当な種の骨髄細胞を用いる単球／マクロファージ
コロニー形成の促進能とする。（CSF−１の増殖効果は
単核食作用系統の細胞に限定されること（Stanley,E.
R.,The Lymphokines（1981）,Stewart,W.E.,II,et al,
著,Humana Press,Clifton,NJ）,pp,102−132），および
CSF−１のリセプターはこれらの細胞系列に限定される
こと（Byrne,P.V.,et al,Cell Biol（1981）91:848））
が知られている。
は，成熟マクロファージ（Moore,R.,et al,Science（19
84）223:178）からのＥプロスタグランジン系，インタ
ーロイキン−1,およびインターフェロンの分泌のこのタ
ンパクによる促進能，そして下に述べる単球への別の効
果が含まれる。後者の活性に対する機構は現在不明で，
そしてここでの定義の為に，定義の規準を，出発物質と
して適当な種の骨髄細胞を用いる単球／マクロファージ
コロニー形成の促進能とする。（CSF−１の増殖効果は
単核食作用系統の細胞に限定されること（Stanley,E.
R.,The Lymphokines（1981）,Stewart,W.E.,II,et al,
著,Humana Press,Clifton,NJ）,pp,102−132），および
CSF−１のリセプターはこれらの細胞系列に限定される
こと（Byrne,P.V.,et al,Cell Biol（1981）91:848））
が知られている。
すべてのタンパクの場合と同様，正確な化学構造は多
数の因子に依存する。イオン化するアミノ基およびカル
ボキシル基が分子中にあるので，特定のタンパクは酸性
または塩基性塩，または中性型として得られる。適当な
環境条件にある時にそれらの活性が維持されるすべての
そのような標品をこの定義に含む。さらに，一次アミノ
酸配列は，糖成分による誘導体化（糖付加），または脂
肪，リン酸塩，アセチル基などの他の付加的分子によ
り，より一般的には多糖類との結合により，大きくなる
であろう。一次アミノ酸配列はまた，凝集して複合体，
大半は二量体を形成するであろう。実際，天然のヒト尿
CSF−１は45 Kdの高度にグリコシル化された二量体と
して単離される。このような増大のある面は，生産宿主
の翻訳後のプロセッシングシステムにより達成される:.
他のそのような修飾はインビトロで導入されるであろ
う。とにかく，主題のタンパクは，上記特定したような
タンパク活性が存在する限り，凝週または誘導体化の状
態にかかわらずCSF−１の定義内にある。もちろん，そ
のような修飾は，種々のアッセイにおいてタンパクの活
性を高めるまたは低下させることにより，量的または質
的に活性に影響するであろう。
数の因子に依存する。イオン化するアミノ基およびカル
ボキシル基が分子中にあるので，特定のタンパクは酸性
または塩基性塩，または中性型として得られる。適当な
環境条件にある時にそれらの活性が維持されるすべての
そのような標品をこの定義に含む。さらに，一次アミノ
酸配列は，糖成分による誘導体化（糖付加），または脂
肪，リン酸塩，アセチル基などの他の付加的分子によ
り，より一般的には多糖類との結合により，大きくなる
であろう。一次アミノ酸配列はまた，凝集して複合体，
大半は二量体を形成するであろう。実際，天然のヒト尿
CSF−１は45 Kdの高度にグリコシル化された二量体と
して単離される。このような増大のある面は，生産宿主
の翻訳後のプロセッシングシステムにより達成される:.
他のそのような修飾はインビトロで導入されるであろ
う。とにかく，主題のタンパクは，上記特定したような
タンパク活性が存在する限り，凝週または誘導体化の状
態にかかわらずCSF−１の定義内にある。もちろん，そ
のような修飾は，種々のアッセイにおいてタンパクの活
性を高めるまたは低下させることにより，量的または質
的に活性に影響するであろう。
さらに，鎖中の個々のアミノ酸残基は，酸化，還元，
またはタンパクレベルでの他の誘導体化により修飾され
るであろう。あるいはタンパクは活性断片を得るために
切断されるであろう。活性を損なわないような変換がこ
の定義中に含まれる。もちろん，異なる脊椎動物種由来
のCSF−１は完全な相同性を示すとは考えられず，これ
らの変化はこの定義に含まれる。
またはタンパクレベルでの他の誘導体化により修飾され
るであろう。あるいはタンパクは活性断片を得るために
切断されるであろう。活性を損なわないような変換がこ
の定義中に含まれる。もちろん，異なる脊椎動物種由来
のCSF−１は完全な相同性を示すとは考えられず，これ
らの変化はこの定義に含まれる。
B.有用性 本発明のCSF−１タンパクは，幹髄細胞からの単球−
前駆体／マクロファージ細胞生産を促進し，よって免疫
システムの効果性を高めること，および成熟マクロファ
ージ中でのリンホカインの分泌のようなこれらの分化細
胞の機能を促進すること，の両方が可能である。
前駆体／マクロファージ細胞生産を促進し，よって免疫
システムの効果性を高めること，および成熟マクロファ
ージ中でのリンホカインの分泌のようなこれらの分化細
胞の機能を促進すること，の両方が可能である。
ある適用においては，これらのタンパクは化学療法の
付属物として有用である。化学療法的治療により免疫シ
ステムが抑制されることはよく理解されている。それら
が向けられる腫瘍細胞を破壊することに成功しても，化
学療法的治療はしばしば，免疫システムの細胞への化学
毒性物質の副作用により，患者を死亡させることがあ
る。CSF−１をこのような患者に投薬することは,CSF−
１が骨髄−由来前駆体の増殖とマクロファージへの分化
を媒介・促進させることができるため，免疫システムを
再刺激して，この副作用を防ぎ，よって患者が２次感染
を受ける傾向を防ぐことになる。このような治療により
助けられるであろう他の患者としては，白血病で骨髄移
植の治療を受けた人たちが含まれる。彼らはしばしば拒
絶を防ぐために免疫抑制の状態にある。それらの患者に
とっても,CSF−１の投与により免疫抑制は回復しうる。
付属物として有用である。化学療法的治療により免疫シ
ステムが抑制されることはよく理解されている。それら
が向けられる腫瘍細胞を破壊することに成功しても，化
学療法的治療はしばしば，免疫システムの細胞への化学
毒性物質の副作用により，患者を死亡させることがあ
る。CSF−１をこのような患者に投薬することは,CSF−
１が骨髄−由来前駆体の増殖とマクロファージへの分化
を媒介・促進させることができるため，免疫システムを
再刺激して，この副作用を防ぎ，よって患者が２次感染
を受ける傾向を防ぐことになる。このような治療により
助けられるであろう他の患者としては，白血病で骨髄移
植の治療を受けた人たちが含まれる。彼らはしばしば拒
絶を防ぐために免疫抑制の状態にある。それらの患者に
とっても,CSF−１の投与により免疫抑制は回復しうる。
一般に，化学療法，骨髄移植，もしくは病気のような
免疫抑制の他の突発的な形（例えば後天性免疫欠損症候
群）による免疫抑制にかかっているいかなる被検者も,C
SF−１を薬学的に使用できることにより恩恵を得るであ
ろう。さらに被検者は，生来のシステムのマクロファー
ジを補うために,CSF−１で処理した骨髄のインビトロ培
養物または他の適当な調製品により産生されたすでに分
化した増加量のマクロファージの供給を受けることがで
きるであろう。これらの調製品には，このように培養
し，局所的または全身的な治療のために戻すことができ
る患者本人の血液単球の調製品を含む。CSF−１がマク
ロファージによるリンホカインの産生を促進することが
できることにより，腫瘍と感染の治療においてもまたCS
F−１は直接的に有用となる。
免疫抑制の他の突発的な形（例えば後天性免疫欠損症候
群）による免疫抑制にかかっているいかなる被検者も,C
SF−１を薬学的に使用できることにより恩恵を得るであ
ろう。さらに被検者は，生来のシステムのマクロファー
ジを補うために,CSF−１で処理した骨髄のインビトロ培
養物または他の適当な調製品により産生されたすでに分
化した増加量のマクロファージの供給を受けることがで
きるであろう。これらの調製品には，このように培養
し，局所的または全身的な治療のために戻すことができ
る患者本人の血液単球の調製品を含む。CSF−１がマク
ロファージによるリンホカインの産生を促進することが
できることにより，腫瘍と感染の治療においてもまたCS
F−１は直接的に有用となる。
CSF−１は，ネズミ由来マクロファージによるインタ
ーフェロンの産生を促進し（Fleit,H.B.,ら,J Cell Phy
siol（1981）108:347），そしてMIAPaCa細胞由来のヒト
の部分精製CSF−１は，後述のように，ヒト単球からの
インターフェロンとTNFのポリIC誘導された産生を促進
する。さらに,CSF−１はヒト血液単球による骨髄CSFの
産生を促進する。
ーフェロンの産生を促進し（Fleit,H.B.,ら,J Cell Phy
siol（1981）108:347），そしてMIAPaCa細胞由来のヒト
の部分精製CSF−１は，後述のように，ヒト単球からの
インターフェロンとTNFのポリIC誘導された産生を促進
する。さらに,CSF−１はヒト血液単球による骨髄CSFの
産生を促進する。
さらに後述されるものは，（Ｌ細胞条件培地からの）
ネズミCSF−１が，ネズミ肉腫TU5標的を殺すために正常
C3H/HeNマウス腹腔マクロファージを刺激できる能力，
の説明である。この活性はCSF−１が前処理としてエフ
ェクターフェイズ（effectorphase）中に用いられる場
合に最も効果的である。CSF−１がそれを行う能力は，
他のコロニー促進因子により示されるものよりもずっと
高い。さらに，ネズミ細胞のウイルスを攻撃する能力は
CSF−１により高められる。
ネズミCSF−１が，ネズミ肉腫TU5標的を殺すために正常
C3H/HeNマウス腹腔マクロファージを刺激できる能力，
の説明である。この活性はCSF−１が前処理としてエフ
ェクターフェイズ（effectorphase）中に用いられる場
合に最も効果的である。CSF−１がそれを行う能力は，
他のコロニー促進因子により示されるものよりもずっと
高い。さらに，ネズミ細胞のウイルスを攻撃する能力は
CSF−１により高められる。
（ネズミCSF−１は，ネズミマクロファージを,P815腫瘍
細胞に対し細胞静力学的（cytostatic）となるように
（Wing,E.J.,et al,J Clin Invest（1982）69:270），
もしくは他の白血病標的を殺さないように（Ralph,P.et
al,Cell Immunol（1983）76:10），刺激するという矛
盾した報告がされている。Nogawa,R.T.,らCell Immunol
（1980）53:116は,CSF−１が酵母を取込んで殺すように
マクロファージを刺激しうることを報告している。） よって，免疫抑制それ自身を克服することに加え，マ
クロファージの分泌と活性を促進することにより侵入生
物もしくは悪性細胞を破壊するために,CSF−１を用いる
ことができる。
細胞に対し細胞静力学的（cytostatic）となるように
（Wing,E.J.,et al,J Clin Invest（1982）69:270），
もしくは他の白血病標的を殺さないように（Ralph,P.et
al,Cell Immunol（1983）76:10），刺激するという矛
盾した報告がされている。Nogawa,R.T.,らCell Immunol
（1980）53:116は,CSF−１が酵母を取込んで殺すように
マクロファージを刺激しうることを報告している。） よって，免疫抑制それ自身を克服することに加え，マ
クロファージの分泌と活性を促進することにより侵入生
物もしくは悪性細胞を破壊するために,CSF−１を用いる
ことができる。
本発明のCSF−１は，タンパク物質の投与に関する当
業者に標準的な従来の方法でフォーミュレーションでき
る。注射による投与が好ましい：フォーミュレーション
には，懸濁液，乳濁液，もしくは注射可能なものに再構
成するための固体組成，の溶液が含まれる。適当な賦形
剤には，例えばリンガー液，ハンク液，水，食塩水，グ
リセロール，デキストロース溶液，などが含まれる。そ
れに加え，本発明のCSF−１は，適切な反応を促進する
ために細胞調製物と前処理してもよく，そして調製物全
体もしくはその上清を被検体に与えることができる。こ
の後示すように,CSF−１刺激の反応で種々の型の血液細
胞により産生された物質は所望の標的に対して効果的で
あり，侵入ウイルスまたは腫瘍を攻撃するというこれら
血液細胞それ自身の性質が増強される。被検体自身の細
胞を抜取ってこのように利用するか，あるいは例えば，
他の和合可能な個人の単球もしくは白血球をその処理
（インキュベーション）に用いることができる。
業者に標準的な従来の方法でフォーミュレーションでき
る。注射による投与が好ましい：フォーミュレーション
には，懸濁液，乳濁液，もしくは注射可能なものに再構
成するための固体組成，の溶液が含まれる。適当な賦形
剤には，例えばリンガー液，ハンク液，水，食塩水，グ
リセロール，デキストロース溶液，などが含まれる。そ
れに加え，本発明のCSF−１は，適切な反応を促進する
ために細胞調製物と前処理してもよく，そして調製物全
体もしくはその上清を被検体に与えることができる。こ
の後示すように,CSF−１刺激の反応で種々の型の血液細
胞により産生された物質は所望の標的に対して効果的で
あり，侵入ウイルスまたは腫瘍を攻撃するというこれら
血液細胞それ自身の性質が増強される。被検体自身の細
胞を抜取ってこのように利用するか，あるいは例えば，
他の和合可能な個人の単球もしくは白血球をその処理
（インキュベーション）に用いることができる。
CSF−１と名づけられたある型の活性の存在がいくら
か前から知られているが，配列決定ができるほど十分純
粋な形でそれに関連するタンパクの十分な量が得られて
はいず，よって，病気の状態を，リンホカインをコード
する物質のそれに関連した核酸パターンに基づいて，研
究するための,DNAプローブの構築は不可能であった。本
発明はプローブを構築できるほど十分な配列の情報を提
供する。種々の付加的な精製手段により,DNAオリゴマー
プローブの構築を可能とするいくつかのアミノ酸配列を
提供するのに十分な純度のCSF−１が，ヒト尿,MIAPaCa
細胞およびネズミＬ細胞から得られている。そのプロー
ブは，病気の状態を評価することと同様に，全タンパク
のコード配列を得るのに有用である。もちろん，精製さ
れたタンパクは前記のように治療的にも有用であり，ま
た診断と治療に用いるための抗体産生にとっても有用で
ある。
か前から知られているが，配列決定ができるほど十分純
粋な形でそれに関連するタンパクの十分な量が得られて
はいず，よって，病気の状態を，リンホカインをコード
する物質のそれに関連した核酸パターンに基づいて，研
究するための,DNAプローブの構築は不可能であった。本
発明はプローブを構築できるほど十分な配列の情報を提
供する。種々の付加的な精製手段により,DNAオリゴマー
プローブの構築を可能とするいくつかのアミノ酸配列を
提供するのに十分な純度のCSF−１が，ヒト尿,MIAPaCa
細胞およびネズミＬ細胞から得られている。そのプロー
ブは，病気の状態を評価することと同様に，全タンパク
のコード配列を得るのに有用である。もちろん，精製さ
れたタンパクは前記のように治療的にも有用であり，ま
た診断と治療に用いるための抗体産生にとっても有用で
ある。
C.精製 本発明のCSF−１タンパクは，いくつかの方法で,N末
端配列を得るのに十分な均質性と量で精製された。
端配列を得るのに十分な均質性と量で精製された。
後述するように，ヒト尿CSF−１はDas,S.K.,et al,Bl
ood（1981）58:630に記載の標準的方法により部分的に
精製され，それに続いて，セファロースＢカラムに取付
けたYYG106というネズミCSF−１に対するラットのモノ
クローナル抗体を用いたアフィニティー精製段階（Stan
ley,E.R.,Methods Enzymol（1985）116:564）を行っ
た。精製の最終段階は0.1％TFA/30％アセトニトリル−
0.1％TFA/60％アセトニトリルのバッファー系での逆相H
PCLであった。
ood（1981）58:630に記載の標準的方法により部分的に
精製され，それに続いて，セファロースＢカラムに取付
けたYYG106というネズミCSF−１に対するラットのモノ
クローナル抗体を用いたアフィニティー精製段階（Stan
ley,E.R.,Methods Enzymol（1985）116:564）を行っ
た。精製の最終段階は0.1％TFA/30％アセトニトリル−
0.1％TFA/60％アセトニトリルのバッファー系での逆相H
PCLであった。
フォルボル・ミリスティック酢酸の誘導により無血清
状態で産生されたMIAPaCaでは，細胞上澄液をリン酸カ
ルシウムゲルクロマトグラフィ（Das（前出）に従っ
て），続いてレンチルレクチンを用いたアフィニティー
クロマトグラフィー（DasのConAアフィニティー段階の
代わりに），そして次に，セファロースＢに結合させた
YYG106のモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニテ
ィー段階，そして逆相HPLCにかけた。
状態で産生されたMIAPaCaでは，細胞上澄液をリン酸カ
ルシウムゲルクロマトグラフィ（Das（前出）に従っ
て），続いてレンチルレクチンを用いたアフィニティー
クロマトグラフィー（DasのConAアフィニティー段階の
代わりに），そして次に，セファロースＢに結合させた
YYG106のモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニテ
ィー段階，そして逆相HPLCにかけた。
ネズミCSF−１をまずStanley,E.R.,et al,J Immunol
Meth（1981）42:253−284の記載に従って精製し，続い
てヒトタンパクに対する前出のイムノアフィニティーカ
ラムにかけ，そして次に逆相HPLCにかけた。ネズミCSF
−１も,L細胞上澄を直接リン酸カルシウムクロマトグラ
フィーにかけ，次に前述のアフィニティークロマトグラ
フィー，続いて逆相HPLCを用いた短縮手順により調製し
た。
Meth（1981）42:253−284の記載に従って精製し，続い
てヒトタンパクに対する前出のイムノアフィニティーカ
ラムにかけ，そして次に逆相HPLCにかけた。ネズミCSF
−１も,L細胞上澄を直接リン酸カルシウムクロマトグラ
フィーにかけ，次に前述のアフィニティークロマトグラ
フィー，続いて逆相HPLCを用いた短縮手順により調製し
た。
一般に，イムノアフィニティークロマトグラフィー段
階，好ましくはモノクローナル抗体調製物を用いたイム
ノアフィニティー段階，それに続いて逆相HPLCを利用し
た,CSF−１タンパクの精製手順は特に効率的である。タ
ンパクをさらにSDS−PAGEを用いて分析してもよい。
階，好ましくはモノクローナル抗体調製物を用いたイム
ノアフィニティー段階，それに続いて逆相HPLCを利用し
た,CSF−１タンパクの精製手順は特に効率的である。タ
ンパクをさらにSDS−PAGEを用いて分析してもよい。
イムノアフィニティークロマトグラフィーには標準的
方法の使用が含まれ，これによれば抗体調製物はセファ
ロース，デキストランまたはポリアクリルアミドのよう
な適当なポリマー支持体に，その支持体の性質に合うよ
うな手法で支持される。この段階で使用されるポリクロ
ーナル抗体の調製物は，ヒトの尿またはネズミＬ細胞培
地由来のもののような精製タンパクを用いて被検体，好
ましくはウサギ，マウス，またはラットのような哺乳動
物の被検体を免疫化することにより調製する。抗血清を
ポリクローナル組成物として直接用いてもよく，また免
疫化した被検体の脾臓細胞または末梢血液白血球を例え
ばKohlerとMilsteinの融合手法を用いて永久増殖化して
もよい。うまく融合した細胞を次に，モノクローナル抗
体産生系統を得るために,CSF−１に対する抗体の産生に
より選別する。不変の組成物が容易に得られるために，
もちろんモノクローナル調製物が好ましい。特に好まし
いモノクローナル抗体は，ラットの骨髄腫系統とネズミ
Ｌ細胞CSF−１で免疫化したラットの脾臓細胞との細胞
融合体である,YYG106細胞系統により産生されたもので
ある。細胞系列YYG106は,1986年２月５日付で,American
Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rock
ville,MD 20852,U.S.A.に，受理番号HB9014で寄託され
た。
方法の使用が含まれ，これによれば抗体調製物はセファ
ロース，デキストランまたはポリアクリルアミドのよう
な適当なポリマー支持体に，その支持体の性質に合うよ
うな手法で支持される。この段階で使用されるポリクロ
ーナル抗体の調製物は，ヒトの尿またはネズミＬ細胞培
地由来のもののような精製タンパクを用いて被検体，好
ましくはウサギ，マウス，またはラットのような哺乳動
物の被検体を免疫化することにより調製する。抗血清を
ポリクローナル組成物として直接用いてもよく，また免
疫化した被検体の脾臓細胞または末梢血液白血球を例え
ばKohlerとMilsteinの融合手法を用いて永久増殖化して
もよい。うまく融合した細胞を次に，モノクローナル抗
体産生系統を得るために,CSF−１に対する抗体の産生に
より選別する。不変の組成物が容易に得られるために，
もちろんモノクローナル調製物が好ましい。特に好まし
いモノクローナル抗体は，ラットの骨髄腫系統とネズミ
Ｌ細胞CSF−１で免疫化したラットの脾臓細胞との細胞
融合体である,YYG106細胞系統により産生されたもので
ある。細胞系列YYG106は,1986年２月５日付で,American
Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rock
ville,MD 20852,U.S.A.に，受理番号HB9014で寄託され
た。
逆相HPLCに関しても，標準的な技術を用いる。アルキ
ル−，アリール−，ルアリール−，またはアリールアル
キル−誘導体化支持体のような，例えばフェニルセファ
ロースまたはフェニルTSKなどのどのような疎水カラム
を用いてもよい。溶出勾配は支持体の選出に依る。
ル−，アリール−，ルアリール−，またはアリールアル
キル−誘導体化支持体のような，例えばフェニルセファ
ロースまたはフェニルTSKなどのどのような疎水カラム
を用いてもよい。溶出勾配は支持体の選出に依る。
アミノ酸の組成決定と配列決定は標準的な手法により
行ったが，さらに後述されるように，手法は入手可能な
タンパクにより生じる特殊な問題に適合させた。
行ったが，さらに後述されるように，手法は入手可能な
タンパクにより生じる特殊な問題に適合させた。
D.プローブの構築 前記の精製タンパクから得られた配列の情報を用い
て，標準的な市販の技術を用いてオリゴマーDNA配列を
構築した。プローブの混合物を用いることにより，また
は哺乳動物の発現において望まれるコドンを含む限られ
た数の特別なオリゴマーを用いることにより，コドン使
用頻度を考慮に入れる。
て，標準的な市販の技術を用いてオリゴマーDNA配列を
構築した。プローブの混合物を用いることにより，また
は哺乳動物の発現において望まれるコドンを含む限られ
た数の特別なオリゴマーを用いることにより，コドン使
用頻度を考慮に入れる。
E.実施例 次に述べる実施例は，本発明を説明するものであり，
限定するものではない。
限定するものではない。
E.1.天然のヒトCSF−１の精製 ヒトの尿CSF−１を,Das.S.K.,らBlood（1981）58:63
0,により記述された標準的な方法により部分精製し，続
いてセファロースＢカラムに取付けられたYYG106と呼ば
れるネズミCSF−１に対するラットのモノクローナル抗
体を用いたアフィニティー精製段階（Stanley,E.R.,Met
hods Enzymol（1985）116:564）にかけた。精製の最終
段階は0.1％TFA/30％アセトニトリル−0.1％TFA/60％ア
セトニトリルバッファー系による逆相HPLCであった。
0,により記述された標準的な方法により部分精製し，続
いてセファロースＢカラムに取付けられたYYG106と呼ば
れるネズミCSF−１に対するラットのモノクローナル抗
体を用いたアフィニティー精製段階（Stanley,E.R.,Met
hods Enzymol（1985）116:564）にかけた。精製の最終
段階は0.1％TFA/30％アセトニトリル−0.1％TFA/60％ア
セトニトリルバッファー系による逆相HPLCであった。
フォルボル・ミリスティック酢酸を用いた誘導によ
り，無血清状態で産生されたMIAPaCaに関しては，細胞
上澄液をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフィー（Da
s（前出）に従う）にかけ，続いて（DasのConAアフィニ
ティー段階の代わりに）レンチルレクチンを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー，そして次にセファロー
スＢに結合させたYYG106モノクローナル抗体を用いたイ
ムノアフィニティー段階，そして逆相HPLCにかけたこの
両方は前述の通りである。
り，無血清状態で産生されたMIAPaCaに関しては，細胞
上澄液をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフィー（Da
s（前出）に従う）にかけ，続いて（DasのConAアフィニ
ティー段階の代わりに）レンチルレクチンを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィー，そして次にセファロー
スＢに結合させたYYG106モノクローナル抗体を用いたイ
ムノアフィニティー段階，そして逆相HPLCにかけたこの
両方は前述の通りである。
すでに均質にまで精製されている尿とMIAPaCaタンパ
クを，自動シークエンサーによるエドマン分解を用いて
アミノ酸配列決定にかけた。第３図に示されるプローブ
構築ができるのに十分なヒトCSFのＮ末端配列を決定し
た（第１図）。
クを，自動シークエンサーによるエドマン分解を用いて
アミノ酸配列決定にかけた。第３図に示されるプローブ
構築ができるのに十分なヒトCSFのＮ末端配列を決定し
た（第１図）。
より詳細には,MIAPaCaと尿の両方のCSF−１について
用いたすべての緩衝液は,3mMのNaN3と0.01g/のPEG−6
000を含む。各々の場合の初期段階は,DEAE−セルロース
クロマトグラフィーである。約100のプールされた尿
もしくは，それに匹敵する量のCSF−１活性を含む量のM
IAPaCa培地をpH7.4に調製し，塩を除去するために透析
する。透析液を次に30mM Tris−HCl緩衝液,pH7.4で前平
衡化したDEAEセルロースカラム（乾燥重量200g,Eastma
n）にかける。
用いたすべての緩衝液は,3mMのNaN3と0.01g/のPEG−6
000を含む。各々の場合の初期段階は,DEAE−セルロース
クロマトグラフィーである。約100のプールされた尿
もしくは，それに匹敵する量のCSF−１活性を含む量のM
IAPaCa培地をpH7.4に調製し，塩を除去するために透析
する。透析液を次に30mM Tris−HCl緩衝液,pH7.4で前平
衡化したDEAEセルロースカラム（乾燥重量200g,Eastma
n）にかける。
カラムを40mMNaClを含む同じ緩衝液で洗浄し,250mMNa
Clを含む同じ緩衝液で溶出させる。骨髄貫生決定による
分析でCSF−１を含む画分を，イオンを除去するために
透析または限外濾過する。脱イオン化した溶出液を次に
リン酸カルシウムゲル（58ml/gタンパク）で処理し,10
の5mMリン酸ナトリウム,pH6.5を用いたデカンテーシ
ョンにより，そのゲルを洗浄する。そのスラリーを2.5
に再懸濁し,CSF−１を溶出させるために,25mMのリン
酸ナトリウム緩衝液,pH6.5に合わせ,12,000×g,10分で
の遠心分離によりゲルから分離し，さらにDEAEセルロー
スクロマトグラフィーにかけるために50mlに濃縮する。
Clを含む同じ緩衝液で溶出させる。骨髄貫生決定による
分析でCSF−１を含む画分を，イオンを除去するために
透析または限外濾過する。脱イオン化した溶出液を次に
リン酸カルシウムゲル（58ml/gタンパク）で処理し,10
の5mMリン酸ナトリウム,pH6.5を用いたデカンテーシ
ョンにより，そのゲルを洗浄する。そのスラリーを2.5
に再懸濁し,CSF−１を溶出させるために,25mMのリン
酸ナトリウム緩衝液,pH6.5に合わせ,12,000×g,10分で
の遠心分離によりゲルから分離し，さらにDEAEセルロー
スクロマトグラフィーにかけるために50mlに濃縮する。
100mM Tris−HCl緩衝液,pH7.4の溶出CSF−１を次に同
じ緩衝液で前平衡化したDEAEセルロースカラムにかけ，
同じ緩衝液でNaClの直線勾配（０−150mM）を用いて溶
出させた。CSF−１は約75−130mMのNaClで溶出し，それ
らの画分を透析し,ConAセファロースのアフィニティー
クロマトグラフィーにかけるため15mlに濃縮する。
じ緩衝液で前平衡化したDEAEセルロースカラムにかけ，
同じ緩衝液でNaClの直線勾配（０−150mM）を用いて溶
出させた。CSF−１は約75−130mMのNaClで溶出し，それ
らの画分を透析し,ConAセファロースのアフィニティー
クロマトグラフィーにかけるため15mlに濃縮する。
濃縮液を100mM酢酸塩,1M NaCl,10mM MgCl2,10mM CaCl
2,10mM MnCl2,pH6.0（ConA緩衝液）中に溶解し,ConAセ
ファロースカラム（ファルマシア）にかける。そのカラ
ムを４℃でCanA緩衝液で洗浄し,100mMα−メチル−Ｄ−
グルコシドを含む同じ緩衝液で溶出させ，骨髄貫生検定
で決定したCSF−１を含む分画をプールし，ゲル濾過の
ために3mlに濃縮する。
2,10mM MnCl2,pH6.0（ConA緩衝液）中に溶解し,ConAセ
ファロースカラム（ファルマシア）にかける。そのカラ
ムを４℃でCanA緩衝液で洗浄し,100mMα−メチル−Ｄ−
グルコシドを含む同じ緩衝液で溶出させ，骨髄貫生検定
で決定したCSF−１を含む分画をプールし，ゲル濾過の
ために3mlに濃縮する。
CSF−１を30mM Tris−HCl,pH7.4にして，同じ緩衝液
で平衡化したバイオゲルＰ−100カラムにかける。活性
分画はボイドボリューム中に溶出し，それをプールして
50mMリン酸塩,pH6.5で透析する。
で平衡化したバイオゲルＰ−100カラムにかける。活性
分画はボイドボリューム中に溶出し，それをプールして
50mMリン酸塩,pH6.5で透析する。
ゲル濾過段階からプールした溶出液をその後，次のパ
ラグラフに述べるように調製した抗CSF−１モノクロー
ナル抗体に誘導体化させたPABAE−Seph−4Bカラム1mlに
つき105UのCSF−１を用いてイムノソルベントクロマト
グラフィーにかける。
ラグラフに述べるように調製した抗CSF−１モノクロー
ナル抗体に誘導体化させたPABAE−Seph−4Bカラム1mlに
つき105UのCSF−１を用いてイムノソルベントクロマト
グラフィーにかける。
10％FSC−α倍地の懸濁培養で維持したハイブリドー
マより産生されるモノクローナル抗体YYG106を用いてカ
ラムを調製した。部分精製したネズミＬ細胞のCSF−１
で免疫化したラットの脾臓：細胞とラット骨髄腫系統と
の細胞融合によりハイブリドーマを得た。所望のモノク
ローナル抗体産生用の無血清培地を，洗浄した細胞（10
5/ml）をHB101培地（Hana Biologics,Berkeley,CA）中
で培養し，細胞生存性が25％に落ちた培地から培地を40
0×g,15分間の遠心分離により回収することにより調製
する。回収した培地を次に硫酸アンモニウムで50％飽和
にし,4℃,1200×ｇで15分間，遠心分離することにより
沈澱を集め,20mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.1で透析
し,4℃で同じ緩衝液で平衡化したDEAEアフィゲルブルー
（BioRad Labs,Rockville Center,NY）カラムにかけ
る。そのカラムを20mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.1で
洗浄し，この緩衝液の０−0.05M NaCl勾配を用いて目的
のモノクローナル抗体を溶出させる。分画の抗体活性を
決定し，活性分画をプールし，限外濾過により濃縮す
る。
マより産生されるモノクローナル抗体YYG106を用いてカ
ラムを調製した。部分精製したネズミＬ細胞のCSF−１
で免疫化したラットの脾臓：細胞とラット骨髄腫系統と
の細胞融合によりハイブリドーマを得た。所望のモノク
ローナル抗体産生用の無血清培地を，洗浄した細胞（10
5/ml）をHB101培地（Hana Biologics,Berkeley,CA）中
で培養し，細胞生存性が25％に落ちた培地から培地を40
0×g,15分間の遠心分離により回収することにより調製
する。回収した培地を次に硫酸アンモニウムで50％飽和
にし,4℃,1200×ｇで15分間，遠心分離することにより
沈澱を集め,20mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.1で透析
し,4℃で同じ緩衝液で平衡化したDEAEアフィゲルブルー
（BioRad Labs,Rockville Center,NY）カラムにかけ
る。そのカラムを20mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.1で
洗浄し，この緩衝液の０−0.05M NaCl勾配を用いて目的
のモノクローナル抗体を溶出させる。分画の抗体活性を
決定し，活性分画をプールし，限外濾過により濃縮す
る。
充填ベッドボリュームのPABAE−Seph（ｐ−アミノベ
ンズアミドエチル誘導体化させたセファロース4B）を0.
5M HCl（冷）で洗浄し,7分間氷上でインキュベートした
0.2M NaNO2で処理する。少なくとも２倍量の氷冷した蒸
留水でゲルを３回洗浄し，同量の洗浄したゲルと濃縮モ
ノクローナル抗体（0.2Mホウ酸ナトリウム緩衝液,pH8.0
中で3mg/ml）とを混合し,4℃で16時間振とうした。その
結果生じる誘導体化PABAE−Seph−4Bを次に,5倍量の１
％トリエタノールアミンの50mM Tris−HCl,pH8.5,5倍量
の6M尿素の0.1M Tris−HCl,pH7.4そして0.05Mリン酸ナ
トリウム緩衝液,pH6.5での平衡化の前に５倍量の0.4M重
炭酸ナトリウムを順番に用いて洗浄する。） 前述のようにプールしたゲル濾過溶出液を,PABAE−Se
ph−4B抗体誘導体化カラムを用いて,105U/ml,4℃で処理
し，カラムに再循環させる。そのカラムを50mMリン酸ナ
トリウム緩衝液,pH6.5,次に4M KSCNを用いて溶出させる
前に100mMグリシン−HCl,pH2.0,次に0.1Mグリシン−HC
l,pH2.0で洗浄し，その最終の溶出液を0.6カラム倍量の
1M重炭酸アンモニウムを含む容器に集める。溶出液を分
けて0.01g/ PEG−6000に対して透析する。
ンズアミドエチル誘導体化させたセファロース4B）を0.
5M HCl（冷）で洗浄し,7分間氷上でインキュベートした
0.2M NaNO2で処理する。少なくとも２倍量の氷冷した蒸
留水でゲルを３回洗浄し，同量の洗浄したゲルと濃縮モ
ノクローナル抗体（0.2Mホウ酸ナトリウム緩衝液,pH8.0
中で3mg/ml）とを混合し,4℃で16時間振とうした。その
結果生じる誘導体化PABAE−Seph−4Bを次に,5倍量の１
％トリエタノールアミンの50mM Tris−HCl,pH8.5,5倍量
の6M尿素の0.1M Tris−HCl,pH7.4そして0.05Mリン酸ナ
トリウム緩衝液,pH6.5での平衡化の前に５倍量の0.4M重
炭酸ナトリウムを順番に用いて洗浄する。） 前述のようにプールしたゲル濾過溶出液を,PABAE−Se
ph−4B抗体誘導体化カラムを用いて,105U/ml,4℃で処理
し，カラムに再循環させる。そのカラムを50mMリン酸ナ
トリウム緩衝液,pH6.5,次に4M KSCNを用いて溶出させる
前に100mMグリシン−HCl,pH2.0,次に0.1Mグリシン−HC
l,pH2.0で洗浄し，その最終の溶出液を0.6カラム倍量の
1M重炭酸アンモニウムを含む容器に集める。溶出液を分
けて0.01g/ PEG−6000に対して透析する。
得られたヒト尿CSF−１は約８×107U/mgの比活性をも
つ。
つ。
ヒトの尿またはMIAPaCaのCSF−１を次に，後述の0.1
％TFA/アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLCにかける。
％TFA/アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLCにかける。
無血清培地由来のいくつかのMIAPaCa調製物について
は，前出のリン酸カルシウムゲル濾過段階により，続い
てConAの代わりにレンチルレクチンを用い他は前出の通
りにアフィニティークロマトグラフィーにより，続いて
前出のイムノアブソルバントクロマトグラフィーとHPLC
段階により，精製を行う。
は，前出のリン酸カルシウムゲル濾過段階により，続い
てConAの代わりにレンチルレクチンを用い他は前出の通
りにアフィニティークロマトグラフィーにより，続いて
前出のイムノアブソルバントクロマトグラフィーとHPLC
段階により，精製を行う。
HPLC溶出液のSDSゲル電気泳動は，ヒトの尿とMIAPaCa
の調製物の両方について均質性を確証する。
の調製物の両方について均質性を確証する。
プローブの構築 ヒトCSFの充分なＮ末端配列を，第３図で示すプロー
ブの構築を行なえるように決定した。精製したMIAPaCa
および尿のCSF−１のＮ末端配列は同一である。得られ
た合成オリゴヌクレオチドは，ヒトの様々な症状の診断
や原因の決定に有用である。
ブの構築を行なえるように決定した。精製したMIAPaCa
および尿のCSF−１のＮ末端配列は同一である。得られ
た合成オリゴヌクレオチドは，ヒトの様々な症状の診断
や原因の決定に有用である。
E.2.ネズミCSF−１ タンパクの精製 ネズミのCSF−１は,Stanley,E.R.,et al,J Biol Chem
（1977）252:4305;Stanley,E.R.,et al,J Immunol Meth
（1981）42253−284,およびWang,F.F.,et al,J Cell Bi
ochem（1983）21:263−275により，開示されているもの
と同様の標準的な方法により精製できる。他方では，バ
ッチのリン酸カルシウムゲルクロマトグラフィー段階
（Stanley,E.R.,J Immun Meth）（上記））に直接続い
てイムノアフィニティークロマトグラフィーを行うこと
ができる。
（1977）252:4305;Stanley,E.R.,et al,J Immunol Meth
（1981）42253−284,およびWang,F.F.,et al,J Cell Bi
ochem（1983）21:263−275により，開示されているもの
と同様の標準的な方法により精製できる。他方では，バ
ッチのリン酸カルシウムゲルクロマトグラフィー段階
（Stanley,E.R.,J Immun Meth）（上記））に直接続い
てイムノアフィニティークロマトグラフィーを行うこと
ができる。
さらに詳しくは，無血清Ｌ細胞の条件培地の最初の調
製をStanley,E.R.,et al,J Immunol Meth（上記）で述
べられているように行い，次いでリン酸カルシウムゲル
を無血清Ｌ細胞を条件培地（40ml/培地）20−40に
加えることによりリン酸カルシウムゲルクロマトグラフ
ィーに供し，ゲルを繰り返されるバッチ処理で沈澱させ
る前に， −20℃で10分間，混合液をかきまぜる。
製をStanley,E.R.,et al,J Immunol Meth（上記）で述
べられているように行い，次いでリン酸カルシウムゲル
を無血清Ｌ細胞を条件培地（40ml/培地）20−40に
加えることによりリン酸カルシウムゲルクロマトグラフ
ィーに供し，ゲルを繰り返されるバッチ処理で沈澱させ
る前に， −20℃で10分間，混合液をかきまぜる。
106U/mlで用いる以外は，ヒトのタンパクと関連して
上記で述べたように,YYG106抗体付きのPABAE−Seph−4B
を用いて，溶出物をアフィニティークロマトグラフィー
に供し，第２の溶出段階は省略する。
上記で述べたように,YYG106抗体付きのPABAE−Seph−4B
を用いて，溶出物をアフィニティークロマトグラフィー
に供し，第２の溶出段階は省略する。
このように精製したネズミの材料を，上記で述べたよ
うに逆相HPLCおよびTFA/アセトニトリルでの溶出に供す
る。精製したネズミの材料の比活性は，約４−８×107U
/mgである。
うに逆相HPLCおよびTFA/アセトニトリルでの溶出に供す
る。精製したネズミの材料の比活性は，約４−８×107U
/mgである。
ヒトより精製したCSF−１と同様に，精製したネズミ
のCSF−１は，分子量の40−60％であるアスパラギン結
合複合型の糖である，重度に糖化された二量体である。
２−メルカプトエタノール存在下でのSDS−PAGE上で，
精製した調製物は70kdと90kdの見かけの分子量を有し，
還元すると70kdと90kdの元の分子量の二量体に由来する
40kdのメージャーバンドと33kdのマイナーバンドになっ
た。40kdのサブユニットは33kdのサブユニット以上によ
り多く糖化されており，また両サブユニットのＮ末端配
列が同一であることは明らかである。
のCSF−１は，分子量の40−60％であるアスパラギン結
合複合型の糖である，重度に糖化された二量体である。
２−メルカプトエタノール存在下でのSDS−PAGE上で，
精製した調製物は70kdと90kdの見かけの分子量を有し，
還元すると70kdと90kdの元の分子量の二量体に由来する
40kdのメージャーバンドと33kdのマイナーバンドになっ
た。40kdのサブユニットは33kdのサブユニット以上によ
り多く糖化されており，また両サブユニットのＮ末端配
列が同一であることは明らかである。
マウスのタンパクの全組成のデータも以下に示されて
いるように得た。これらのデータは，良好な回収を示す
そのアミノ酸に対する正確な相対モル％を示している
が，ヒスチジやシステインは良い収率で得られなかった
ので，数は絶対的ではない。アミノ酸 モル％ 残基/125 Asp 20.1 25.1 Glu 20.0 25.0 His − − Ser 6.0 7.5 Thr 5.9 7.4 Gly 5.4 6.8 Ala 6.8 8.5 Arg 3.0 3.8 Pro 6.7 8.4 Val 5.3 6.6 Met 1.1 1.4 Ile 3.9 4.9 Leu 8.5 10.6 Phe 6.0 7.5 Lys 3.5 4.4 Tyr 4.1 5.1 残基/125への変換は，分子量からの配列の長さの概算
に基づいている。
いるように得た。これらのデータは，良好な回収を示す
そのアミノ酸に対する正確な相対モル％を示している
が，ヒスチジやシステインは良い収率で得られなかった
ので，数は絶対的ではない。アミノ酸 モル％ 残基/125 Asp 20.1 25.1 Glu 20.0 25.0 His − − Ser 6.0 7.5 Thr 5.9 7.4 Gly 5.4 6.8 Ala 6.8 8.5 Arg 3.0 3.8 Pro 6.7 8.4 Val 5.3 6.6 Met 1.1 1.4 Ile 3.9 4.9 Leu 8.5 10.6 Phe 6.0 7.5 Lys 3.5 4.4 Tyr 4.1 5.1 残基/125への変換は，分子量からの配列の長さの概算
に基づいている。
一次構造の決定は，自動エドマン分解装置を用い，そ
して逆相HPLCにより逐次的に分解されたアミノ酸を分析
することにより，行なった。従来通りでの配列決定は，
初めの13個のＮ末端アミノ酸配列となった。10番目にメ
チオニンが存在し，限られた数のメチオニン残基が存在
するため,CNBr分解したタンパクを，断片の前分画なし
でシークエンサーに負荷し,3つの配列だけを得た。これ
らは，期待したＮ末端配列，すなわち既知のＮ末端配列
に重複してIle−Gly−Asnで始まる配列，および約50％
の収率でＸ−Phe−Lysで始まる配列であった。後者の２
つの断片と最初の既知の配列の量の差により，限られた
数の残基を通じて３断片を同時に配列決定できた。
して逆相HPLCにより逐次的に分解されたアミノ酸を分析
することにより，行なった。従来通りでの配列決定は，
初めの13個のＮ末端アミノ酸配列となった。10番目にメ
チオニンが存在し，限られた数のメチオニン残基が存在
するため,CNBr分解したタンパクを，断片の前分画なし
でシークエンサーに負荷し,3つの配列だけを得た。これ
らは，期待したＮ末端配列，すなわち既知のＮ末端配列
に重複してIle−Gly−Asnで始まる配列，および約50％
の収率でＸ−Phe−Lysで始まる配列であった。後者の２
つの断片と最初の既知の配列の量の差により，限られた
数の残基を通じて３断片を同時に配列決定できた。
次に配列決定を，精製したCNBr内部断片に関して行な
った。このＮ末端のGlu−Phe−Lysペプチドに混在する
断片を,O−フタルアルデヒドで処理してＮ末端にプロリ
ンを持たない断片をブロックすることにより除去した
（内部配列は７番目にプロリンを有する）。配列決定を
続け，内部断片の次の残基をこのように固定した。配列
決定の結果を第１図に示す。データは,2つの同一のサブ
ユニットを含む二量体タンパクに，そして単一のサブユ
ニットの両端に由来するペプチドのCNBrによる放出に一
致し，これらの末端は残基１−25で，内部の断片であ
り，各々はおよその分子量が2.5kdである。
った。このＮ末端のGlu−Phe−Lysペプチドに混在する
断片を,O−フタルアルデヒドで処理してＮ末端にプロリ
ンを持たない断片をブロックすることにより除去した
（内部配列は７番目にプロリンを有する）。配列決定を
続け，内部断片の次の残基をこのように固定した。配列
決定の結果を第１図に示す。データは,2つの同一のサブ
ユニットを含む二量体タンパクに，そして単一のサブユ
ニットの両端に由来するペプチドのCNBrによる放出に一
致し，これらの末端は残基１−25で，内部の断片であ
り，各々はおよその分子量が2.5kdである。
前述のデータは,14.5kdの分子量の非糖化サブユニッ
トに基づくCSF−１の配列のおよそ半分を表している。
Ｌ−細胞CSF−１は約60重量％が炭水化物で，唯一の糖
化されうる部位（37,38,および39番目の位置）が同定さ
れているので，分子の残りは重度に糖化されたものであ
る。
トに基づくCSF−１の配列のおよそ半分を表している。
Ｌ−細胞CSF−１は約60重量％が炭水化物で，唯一の糖
化されうる部位（37,38,および39番目の位置）が同定さ
れているので，分子の残りは重度に糖化されたものであ
る。
プローブの調製 第２図は，得た配列の情報を基にして調製したネズミ
のCSF−１に相補的な，一連のオリゴヌクレオチド プ
ローブを示している。これらは，コドン重複にあてはま
るよう混合プローブであり，あるいは哺乳動物の優先コ
ドンに好都合となるように設計されている。
のCSF−１に相補的な，一連のオリゴヌクレオチド プ
ローブを示している。これらは，コドン重複にあてはま
るよう混合プローブであり，あるいは哺乳動物の優先コ
ドンに好都合となるように設計されている。
E.3.生物学的活性 CSF−１の活性に関する付加的なデータは，部分精製
したMIAPaCa CSF−１あるいはネズミのＬ−細胞CSF−１
を用いて得られた。CSF−１が,10倍にまで誘導したヒト
単球によるインターフェロンや腫瘍壊死因子（TNF）の
産生を高めることが示された。CSF−１はまた，マクロ
ファージの抗腫瘍毒性を促進することが示された。
したMIAPaCa CSF−１あるいはネズミのＬ−細胞CSF−１
を用いて得られた。CSF−１が,10倍にまで誘導したヒト
単球によるインターフェロンや腫瘍壊死因子（TNF）の
産生を高めることが示された。CSF−１はまた，マクロ
ファージの抗腫瘍毒性を促進することが示された。
ヒト単球によるTNF産生の促進 MIAPaCa CSF−１を，リン酸カルシウム ゲル濾過お
よびレンチルレクチン クロマトグラフィーにより上澄
液より精製した。リンホカイン産生のアッセイ用に，末
梢血管付着細胞を，各107個の細胞を含む重複したフラ
スコで保温した。１つのフラスコを上記で精製した1000
U/mlCSF−１で処理した。３日後，細胞を集め，洗浄
し，そして５×105/mlの細胞濃度に再懸濁して,24ウェ
ルのプレート0.5ml/ウェルで蒔いた。ウェルを48時間,1
0μg/ml LPSおよび20ng/ml PMAで処理し，上澄液をTNF
アッセイ用に集めた。CSFで処理した細胞は，未処理の
細胞の約９倍高いTNF分泌を示した（162U/mlに対して15
00U/ml）。
よびレンチルレクチン クロマトグラフィーにより上澄
液より精製した。リンホカイン産生のアッセイ用に，末
梢血管付着細胞を，各107個の細胞を含む重複したフラ
スコで保温した。１つのフラスコを上記で精製した1000
U/mlCSF−１で処理した。３日後，細胞を集め，洗浄
し，そして５×105/mlの細胞濃度に再懸濁して,24ウェ
ルのプレート0.5ml/ウェルで蒔いた。ウェルを48時間,1
0μg/ml LPSおよび20ng/ml PMAで処理し，上澄液をTNF
アッセイ用に集めた。CSFで処理した細胞は，未処理の
細胞の約９倍高いTNF分泌を示した（162U/mlに対して15
00U/ml）。
ヒト単球によるインターフェロン産生の促進 インターフェロン産生におけるCSF−１の効果を決め
るための同様の実験において，末梢血管付着細胞を，上
記で述べたように1000U/ml CSF−１の存在下あるいは非
存在下で３日間保温し，集め,5×105/mlとなるよう再懸
濁し，そして上記で述べたように25ウェルのプレートに
蒔いた。種々の量のポリICを加えて，細胞にインターフ
ェロン産生の誘導をした。上澄液を,VSVの感染したGM25
04細胞におけるその細胞変性効果により，インターフェ
ロン産生についてアッセイした。CSF−１促進細胞は,Mc
Cormick,F.,et al,Mol Cell Biol（1984）４:166で述べ
られているように,50μg/mlのポリICで誘導したときに,
100U/mlの産生を示した。これに対し同等に誘導された
未処理細胞は3U/ml以下の産生であった。
るための同様の実験において，末梢血管付着細胞を，上
記で述べたように1000U/ml CSF−１の存在下あるいは非
存在下で３日間保温し，集め,5×105/mlとなるよう再懸
濁し，そして上記で述べたように25ウェルのプレートに
蒔いた。種々の量のポリICを加えて，細胞にインターフ
ェロン産生の誘導をした。上澄液を,VSVの感染したGM25
04細胞におけるその細胞変性効果により，インターフェ
ロン産生についてアッセイした。CSF−１促進細胞は,Mc
Cormick,F.,et al,Mol Cell Biol（1984）４:166で述べ
られているように,50μg/mlのポリICで誘導したときに,
100U/mlの産生を示した。これに対し同等に誘導された
未処理細胞は3U/ml以下の産生であった。
ヒト単球による骨髄CSF産生の促進 単球を３日間，±CSF−１と保温し，それから表１の
ように骨髄CSFの産生を誘導した。示されている３つの
代表的な実験は，異なる供与者由来の血液を用いた。
ように骨髄CSFの産生を誘導した。示されている３つの
代表的な実験は，異なる供与者由来の血液を用いた。
それゆえに,CSF−１はCSF−GM生産を促進する。
ネズミマクロファージによる腫瘍細胞壊死の促進： 他のコロニー促進因子との比較 マクロファージの刺激をアッセイするために,L−細胞
条件培地より得たネズミCSF−１を肉腫の標的を壊死さ
せるネズミマクロファージの能力の促進を示すアッセイ
で,pcCSF−17由来の組換えにより産生されたCSF−１の
モデルとして用いた。このアッセイでは，通常の２時間
付着のC3H/HeNマウス末梢マクロファージを,CSF−１存
在下あるいは非存在下で,1日間，インビトロで保温し，
それからガンマ インターフェロンを含む10％v/v conA
誘導（10μg/ml）の脾臓リンホカイン（LK）に対して3H
−チミジンラベルしたマウス肉腫TU5細胞を20:1の比で
混ぜた。続いて48時間にわたるラベルしたチミジンの放
出を，腫瘍細胞壊死の測定標準として用いた。1200U/ml
CSF−１を含むネズミＬ−細胞条件培地としてCSF−１を
加える効果を，以下の表に示す。
条件培地より得たネズミCSF−１を肉腫の標的を壊死さ
せるネズミマクロファージの能力の促進を示すアッセイ
で,pcCSF−17由来の組換えにより産生されたCSF−１の
モデルとして用いた。このアッセイでは，通常の２時間
付着のC3H/HeNマウス末梢マクロファージを,CSF−１存
在下あるいは非存在下で,1日間，インビトロで保温し，
それからガンマ インターフェロンを含む10％v/v conA
誘導（10μg/ml）の脾臓リンホカイン（LK）に対して3H
−チミジンラベルしたマウス肉腫TU5細胞を20:1の比で
混ぜた。続いて48時間にわたるラベルしたチミジンの放
出を，腫瘍細胞壊死の測定標準として用いた。1200U/ml
CSF−１を含むネズミＬ−細胞条件培地としてCSF−１を
加える効果を，以下の表に示す。
標的細胞を壊死させる能力の増加が,CSF−１を増殖の
予備１日の間か，あるいは誘導期間かのどちらかに加え
るかで，注目された。しかし，最も劇的な効果は，これ
ら期間中の両方でCSF−１が存在するときに，観察され
た。
予備１日の間か，あるいは誘導期間かのどちらかに加え
るかで，注目された。しかし，最も劇的な効果は，これ
ら期間中の両方でCSF−１が存在するときに，観察され
た。
単球やマクロファージの刺激を原因としての，細菌の
リポ多糖（LPS）の汚染の可能性を，除外した。用いたC
SF−１のLPS含量は低かった（＜0.3ng/3000U CSF−1,カ
ブトガニ遊走細胞の抽出液による）。抗CSF−１カラム
に適用することにより活性を除いた。ポリミキシンＢを
LPSを中和させるのに用いた。C3H/HeJマウス由来のマク
ロファージはCSF−１に応答するが,LPSには応答しな
い。
リポ多糖（LPS）の汚染の可能性を，除外した。用いたC
SF−１のLPS含量は低かった（＜0.3ng/3000U CSF−1,カ
ブトガニ遊走細胞の抽出液による）。抗CSF−１カラム
に適用することにより活性を除いた。ポリミキシンＢを
LPSを中和させるのに用いた。C3H/HeJマウス由来のマク
ロファージはCSF−１に応答するが,LPSには応答しな
い。
CSF−GMを,5μgLPSのIV投与５時間後に得た６個のマ
ウス肺より調製した。肺を切り刻み，無血清培地で３日
間保温し,YYG106アフィニティーカラムを用いて上澄液
からCSF−１を枯渇させた（CSF−１含量を270U/mlから7
8U/mlにまで減少させた）。CSF−Ｇを同様に処理したLD
I無血清培地より調製した。CSF−GMおよびCSF−Ｇの両
含量を，コロニー促進アッセイにより,2000U/mlでアッ
セイした。
ウス肺より調製した。肺を切り刻み，無血清培地で３日
間保温し,YYG106アフィニティーカラムを用いて上澄液
からCSF−１を枯渇させた（CSF−１含量を270U/mlから7
8U/mlにまで減少させた）。CSF−Ｇを同様に処理したLD
I無血清培地より調製した。CSF−GMおよびCSF−Ｇの両
含量を，コロニー促進アッセイにより,2000U/mlでアッ
セイした。
腹膜マクロファージを，前出の培地のいずれかの40％
か,1日間2000U/mlのCSF−１でアッセイしたＬ−細胞培
地かの，いずれかで保温し，それから付加的な培地かLK
で48時間保温し，上で述べたようにTU5壊死をアッセイ
した。
か,1日間2000U/mlのCSF−１でアッセイしたＬ−細胞培
地かの，いずれかで保温し，それから付加的な培地かLK
で48時間保温し，上で述べたようにTU5壊死をアッセイ
した。
結果を第６図に示す。CSF−１はTU5に対する毒性の顕
著な増強を示したが,CSF−ＧとCSF−GMのどちらも効果
はなかった。
著な増強を示したが,CSF−ＧとCSF−GMのどちらも効果
はなかった。
ネズミの抗ウィルス活性の促進 付着したネズミのチオグリコレート−誘導マクロファ
ージを３日間CSF−１と保温し,VSVで一晩感染させた。
ポリミキシンＢを試験サンプルに加え，インターフェロ
ンのLPS誘導を阻止した。以下の表は，付着したままの
細胞のクリスタルバイオレット染色を示している。
ージを３日間CSF−１と保温し,VSVで一晩感染させた。
ポリミキシンＢを試験サンプルに加え，インターフェロ
ンのLPS誘導を阻止した。以下の表は，付着したままの
細胞のクリスタルバイオレット染色を示している。
以上より,CSF−１処理した細胞はVSVに対するマクロ
ファージの保護を示した。
ファージの保護を示した。
E.4.CSF−１のフォーミュレーション 組換えにうより産生されたヒトCSF−１は，標準的な
製薬的手順を用いて投薬に用いられるよう作成できる。
通常のCSF−１は，注入できる形態で調製されるだろう
し，また単一の活性のある部分として，あるいは他のタ
ンパクまたは相補するか同様の活性を持つ他の化合物と
組合わせて用いてもよい。そのような他の化合物には，
アドリアマイシンのような別の抗腫瘍剤あるいはIL−1,
−2,および−3,アルファ−，ベータ−，およびガンマ−
インターフェロンおよび腫瘍壊死因子ようなリンホカイ
ンが含まれる。CSF−１の活性成分の効果は，そのよう
な付加的な成分の存在により高められるもしくは改善さ
れることがある。上記で述べたように,CSF−１は適当な
血液細胞と有利な方法で相互作用をすることがあり，そ
れゆえに本発明の組成物は,CSF−１とそのような細胞と
の保温混合液を含む。この場合，付加的なリンホカイン
は存在してもしなくてもよい。そのような保温混合液の
上澄液分画か，あるいは細胞も同様に含む完全な混合液
かのどちらかを用いてもよい。
製薬的手順を用いて投薬に用いられるよう作成できる。
通常のCSF−１は，注入できる形態で調製されるだろう
し，また単一の活性のある部分として，あるいは他のタ
ンパクまたは相補するか同様の活性を持つ他の化合物と
組合わせて用いてもよい。そのような他の化合物には，
アドリアマイシンのような別の抗腫瘍剤あるいはIL−1,
−2,および−3,アルファ−，ベータ−，およびガンマ−
インターフェロンおよび腫瘍壊死因子ようなリンホカイ
ンが含まれる。CSF−１の活性成分の効果は，そのよう
な付加的な成分の存在により高められるもしくは改善さ
れることがある。上記で述べたように,CSF−１は適当な
血液細胞と有利な方法で相互作用をすることがあり，そ
れゆえに本発明の組成物は,CSF−１とそのような細胞と
の保温混合液を含む。この場合，付加的なリンホカイン
は存在してもしなくてもよい。そのような保温混合液の
上澄液分画か，あるいは細胞も同様に含む完全な混合液
かのどちらかを用いてもよい。
フロントページの続き (72)発明者 ウィルソン，ケネス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94598 ウォルナット クリーク，ロー モンド レーン 2249 (72)発明者 ストリクラー，ジェームズ イー アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19083 ハバータウン，ペンシルベニア アベニュー 101 (72)発明者 ブースマン，アルバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 94523 プレゼント ヒル，ヴェッシン グ ロード 3073 (72)発明者 ウォーレン，マリー キム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94577 サン リーンドロ，ジョアキン アベニュー 486 (72)発明者 スタンレー，リチャード イー アメリカ合衆国 ニューヨーク 10461 ブロンクス，モリス アベニュー 1300 (56)参考文献 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ Ｖｏｌ．97Ｎｏ．９ａｂｓｔｒａｃ ｔ70635ｎ（1982−８−30)
Claims (11)
- 【請求項１】ヒトCSF−１の精製法であって、所望のCSF
−１を含む溶液を、ハイブリドーマYYG106によって生産
される抗体を含有するイムノアフィニティーカラムで処
理すること、および得られたCSF−１含有画分を続いて
逆相HPLCにかけることを包含する、ヒトCSF−１の精製
法。 - 【請求項２】以下のＮ−末端配列を有する、精製ヒトCS
F−1: - 【請求項３】単球のインターフェロンの生産を増強する
組成物であって、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒト
CSF−1: を含有する、組成物。 - 【請求項４】単球のTNFの生産を増強する組成物であっ
て、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒトCSF−1: を有効量を含有する、組成物。 - 【請求項５】マクロファージによる標的細胞の壊死を増
強する組成物であって、以下のＮ−末端配列を有する精
製ヒトCSF−1: の有効量を含有する、組成物。 - 【請求項６】単球のGM−CSF生産を増強する組成物であ
って、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒトCSF−1: の有効量を含有する、組成物。 - 【請求項７】マクロファージにウイルス感染耐性を誘導
する組成物であって、以下のＮ−末端配列を有する精製
ヒトCSF−1: の有効量を含有する、組成物。 - 【請求項８】哺乳動物の免疫系を増強するための組成物
であって、以下のＮ−末端配列を有する精製ヒトCSF−
1: の有効量と少なくとも１つの付加成分とを混合した状態
で含有する、組成物。 - 【請求項９】前記付加成分が製薬賦形剤である、請求項
８に記載の組成物。 - 【請求項１０】前記付加成分が細胞培養物の上清であ
る、請求項８に記載の組成物。 - 【請求項１１】前記付加成分が細胞培養物である、請求
項８に記載の組成物。
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