JPH0898686A - 変異型セファロスポリンｃアシラーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 新規な変異型セファロスポリンＣアシラー
ゼ、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する発
現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換体およ
び該形質転換体を培養することによる変異型セファロス
ポリンＣアシラーゼの製造法。上記形質転換体の培養物
またはその処理物を用いる式： 【化１】 （Ｒ1 はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素。) で示さ
れる化合物またはその塩の製造法。 【効果】 高いＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性を有する
変異型セファロスポリンＣアシラーゼ、該酵素を高収率
発現する発現系、並びに該酵素の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規セファロスポリン
Ｃアシラーゼ（以下、ＣＣアシラーゼという）に関す
る。より詳細には、新規な変異型ＣＣアシラーゼ、それ
をコードする遺伝子、その遺伝子を含有する発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された微生物及び変異型
ＣＣアシラーゼの製造法に関する。更に、本発明は上記
形質転換体の培養物またはその処理物を用いたセファロ
スポリン化合物の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＣアシラーゼは、一般にセファロスポ
リンＣを７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）
に加水分解する酵素である。今まで、ＣＣアシラーゼと
して分類される酵素としては、セファロスポリンＣアシ
ラーゼＳＥ８３、Ｎ１７６及びＶ２２の三酵素が見つか
っており、それらのアミノ酸配列は、Journal of Ferme
ntation and Bioengineering, Vol.72, p232-243 (199
1) に開示されている。この文献では、ＣＣアシラーゼ
のアミノ酸配列の番号表記はそのＮ末端部位のＭｅｔ基
から始まっている。

【０００３】しかし、本明細書においてはＣＣアシラー
ゼのアミノ酸配列の番号表記はＮ末端部のＭｅｔ基に隣
接するＴｈｒ基から始まる（配列表配列番号１参照）。
これは原核生物中でＣＣアシラーゼ遺伝子を発現するこ
とによって得られる成熟ＣＣアシラーゼのα−サブユニ
ットのＮ末端部のＭｅｔは、通常、宿主細胞の酵素（例
えば、アミノペプチダーゼなど）によって脱離して、Ｎ
末端アミノ酸としてＴｈｒ基をもつ成熟ＣＣアシラーゼ
となるからである。

【０００４】上記文献は、組換えＤＮＡ技術による天然
型ＣＣアシラーゼが、ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性
〔７−β−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロ
スポラン酸から７−アミノセファロスポラン酸を生成す
る酵素活性をいう。〕を有していることについても開示
するものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な変異型ＣＣアシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含む発現ベクター、該ベクターを導入した形質
転換体、及び該形質転換体を培養することによる変異型
ＣＣアシラーゼの製造方法を提供することである。ま
た、本発明の他の目的は、上記形質転換体の培養物また
はその処理物を用いたセファロスポリン化合物の製造法
を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高い酵素
活性、特にＧＬ−７ＡＣＡに対して高い酵素活性を有す
るＣＣアシラーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果、か
かる望ましい性質を持つ新規ＣＣアシラーゼの製造に成
功し、本発明を完成した。

【０００７】即ち本発明は、下記の特徴を有する新規な
変異型ＣＣアシラーゼに関するものである。天然型ＣＣ
アシラーゼのアミノ酸配列１７０位のＬｙｓが他のアミ
ノ酸で置換されてなる変異型ＣＣアシラーゼ。言い換え
ると、本発明の変異型ＣＣアシラーゼは、α−サブユニ
ットとβ−サブユニットとにプロセッシングされる前の
前駆体形として次式で示すことができる。 Ａ1-169 −Ｘ1 −Ａ171-773 （式中、Ａ1-169 は、天然型ＣＣアシラーゼのＴｈｒ1
からＰｈｅ169 までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配
列を示す。Ａ171-773 は、天然型ＣＣアシラーゼのＬｅ
ｕ171 からＡｌａ773 までのアミノ酸配列と同一のアミ
ノ酸配列を示す。Ｘ1 は、Ｌｙｓ以外のアミノ酸であ
る。） また本発明は、上記式中、Ｘ1 がＧｌｎである変異型Ｃ
Ｃアシラーゼに関する。

【０００８】なお、本明細書で用いる下記アルファベッ
ト三文字は、天然Ｌ−アミノ酸を意味する：（Ｇｌｙ）
グリシン、（Ａｌａ）アラニン、（Ｖａｌ）バリン、
（Ｌｅｕ）ロイシン、（Ｉｌｅ）イソロイシン、（Ｓｅ
ｒ）セリン、（Ｔｈｒ）スレオニン、（Ａｓｐ）アスパ
ラギン酸、（Ｇｌｕ）グルタミン酸、（Ａｓｎ）アスパ
ラギン、（Ｇｌｎ）グルタミン、（Ｌｙｓ）リジン、
（Ａｒｇ）アルギニン、（Ｃｙｓ）システイン、（Ｍｅ
ｔ）メチオニン、（Ｐｈｅ）フェニルアラニン、（Ｔｙ
ｒ）チロシン、（Ｔｒｐ）トリプトファン、（Ｈｉｓ）
ヒスチジン、（Ｐｒｏ）プロリン。

【０００９】この明細書では、個々の変異型ＣＣアシラ
ーゼの命名について、この分野の学会で広く用いられて
いる次のような命名法を便宜的に採用する。即ち、天然
型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の１７０位のＬｙｓ残
基をＧｌｎで置換した変異型ＣＣアシラーゼは変異型Ｃ
ＣアシラーゼＫ１７０Ｑと命名され、ここでＫは置換さ
れるＬｙｓ残基の一文字記号を意味し、１７０は天然型
ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の置換位置を意味し、Ｑ
は前記Ｌｙｓ残基を置換したＧｌｎの一文字記号を意味
する。

【００１０】かかる特徴を有する本発明の変異型ＣＣア
シラーゼのアミノ酸配列、ならびにそれをコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列の具体例を後記配列表に記す。
配列番号１は、プラスミドｐＣＫＫ１７０Ｑで発現され
得る、変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑの前駆体をコー
ドするＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれから推定し
たアミノ酸配列を示す。

【００１１】本発明の変異型ＣＣアシラーゼは、組換え
ＤＮＡ技術やポリペプチド合成法等の当業者が通常用い
る方法を用いることにより調製することができる。

【００１２】組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、本発
明の変異型ＣＣアシラーゼは、そのアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された宿主
細胞を培地中で培養し、該培養物から変異型ＣＣアシラ
ーゼを採取することによって調製することができる。

【００１３】この過程について、その詳細を以下に詳し
く説明する。宿主細胞としては、微生物〔細菌（例え
ば、Escherichia coli，Bacillus subtilis など）、酵
母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiaeなど）、動物
細胞系および培養植物細胞など〕が挙げられる。微生物
として好適には、細菌、特にEscherichia 属に属する菌
株（例えば E. coli JM109 ATCC 53323, E. coli HB101
ATCC 33694, E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. col
i 294 ATCC 31446 など）、酵母、特にSaccharomyces
属に属する菌株（例えば、Saccharomyces cerevisiae A
H22 ）、動物細胞（例えばマウスＬ９２９細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）などが挙げ
られる。

【００１４】細菌、特に E. coliを宿主細胞として用い
る場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター
−オペレーター領域、開始コドン、変異型ＣＣアシラー
ゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン、タ
ーミネーター領域および複製可能単位から構成される。
酵母または動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現
ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シ
グナルペプチドおよび変異型ＣＣアシラーゼのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ、及び終止コドンを含んでいる
ことが好ましい。エンハンサー配列、変異型ＣＣアシラ
ーゼの５’側及び３’側の非翻訳領域、スプライシング
接合部、ポリアデニレーション部位及び複製可能単位も
また発現ベクターに組み込むことが可能である。

【００１５】プロモーター−オペレーター領域は、プロ
モーター、オペレーター及び Shine-Dalgarno(SD) 配列
（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。好ましく
はプロモーター−オペレーター領域は、常套的に用いら
れるプロモーター−オペレーター領域（例えば、E. col
i のＰＬ−プロモーター及びｔｒｐ−プロモーター）及
びＣＣアシラーゼ Ｎ−１７６染色体遺伝子のプロモー
ターを含んでいてもよい。

【００１６】酵母中で変異型ＣＣアシラーゼを発現させ
るためのプロモーターとしては、S.cerevisiae の場
合、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨＩＩ遺伝
子、および酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のプロ
モーターが挙げられる。および哺乳動物細胞中で変異型
ＣＣアシラーゼを発現させるためのプロモーターとして
は、ＳＶ４０初期プロモーターまたは後期プロモータ
ー、ＨＴＬＶ−ＬＴＲ−プロモーター、マウスメタロチ
オネインＩ（ＭＭＴ）−プロモーター、ワクシニア−プ
ロモーターなどが含まれる。

【００１７】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が含まれる。

【００１８】シグナルペプチドとしては、一般に使用さ
れる他の酵素のシグナルペプチド（天然型ｔ−ＰＡのシ
グナルペプチド、天然型プラスミノーゲンのシグナルペ
プチド）などが含まれる。

【００１９】本発明の変異型ＣＣアシラーゼのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡは、従来の方法で調製すること
ができる。例えば、ＤＮＡ合成機を用いて一部のまたは
全てのＤＮＡを合成したり、および／または形質転換体
〔例えば、 E. coli JM109（ｐＣＣＮ１７６−２） FER
M BP-3047 〕から得られる適切なベクター（例えば、ｐ
ＣＣＮ１７６−２）に挿入された天然型ＣＣアシラーゼ
をコードする完全なＤＮＡ配列を適切な方法、例えば適
切な酵素（例えば、制限酵素、アルカリホスファター
ゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮ
Ａポリメラーゼなど）での処理に加えて、常套の変異方
法（例えば、カセット変異法〔徳永，Ｔら、Eur. J. Bi
ochem. Vol.153, p445-449 (1985) 参照〕、ＰＣＲ変異
法〔樋口，Ｒら、Nucleic Acids Res. Vol.16, p7351-7
367 (1988)参照〕、クンケル法〔Kunkel, T. Aら. ，Me
thods Enzymol. Vol. 154, p367 (1987)など参照〕）の
ような適切な方法で処理することによって調製すること
ができる。

【００２０】終止コドンとしては、常用の終止コドン
（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が含まれる。

【００２１】ターミネーター領域としては、天然または
合成のターミネーター（例えば、合成ｆｄファージター
ミネーターなど）が含まれる。

【００２２】複製可能単位とは、宿主細胞中においてそ
の全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮ
Ａ化合物をいい、天然のプラスミド、人工的に修飾され
たプラスミド（例えば、天然のプラスミドから調製され
たＤＮＡフラグメント）および合成プラスミドが含まれ
る。好適なプラスミドとしては、 E. coliではプラスミ
ドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３
２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグ
メント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵
母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミド p
RSVneo ATCC 37198 、プラスミド pSV2dhfr ATCC 3714
5、プラスミド pdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミド
pSV2neo ATCC 37149 などが挙げられる。

【００２３】エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエ
ンハンサー配列（７２b.p.）が含まれる。

【００２４】ポリアデニレーション部位としては、ＳＶ
４０のポリアデニレーション部位が含まれる。

【００２５】スプライシング接合部位としては、ＳＶ４
０のスプライシング接合部位が含まれる。

【００２６】プロモーター、開始コドン、本発明の変異
型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
終止コドンおよびターミネーター領域は、連続的かつ環
状に適当な複製可能単位（プラスミド）に連結させるこ
とができ、この際所望により、常法（例えば、制限酵素
での消化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーショ
ン）で適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、
他のレストリクションサイトなど）を用いることによ
り、発現ベクターが得られる。

【００２７】宿主細胞は、上述の発現ベクターを用いて
形質転換（形質移入）される。形質転換（形質移入）は
従来の方法（例えば、 E. coliは Kushner法、哺乳動物
細胞はリン酸カルシウム法、マイクロインジェクション
など）を用いて行うことができ、形質転換体（形質移入
体）が得られる。

【００２８】本発明の工程で変異型ＣＣアシラーゼを製
造するために、かくして得られた上記発現ベクターを含
む形質転換体は、栄養培養水溶液中で培養される。

【００２９】栄養培地は、炭素源（例えば、グルコー
ス、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクト
ースなど）および無機窒素もしくは有機窒素源（例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水
分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプト
ン、ビーフ抽出物など）を含んでいてもよい。所望によ
り、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナ
トリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ1 ）、抗生物
質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など〕を培
地中に添加してもよい。哺乳動物細胞を培養するため
に、胎児ウシ血清および抗生物質を配合した Dulbecco'
s Modified Eagle's Minimum Essenntial Medium (DME
M) がしばしば用いられる。

【００３０】形質転換体（形質移入体）の培養は、通常
ｐＨ５．５〜８．５（好適にはｐＨ７〜７．５）、１８
〜４０℃（好適には２０〜３０℃）で５〜５０時間実施
される。

【００３１】かくして製造された変異型ＣＣアシラーゼ
が培養液中に存在する場合は、その培養物を濾過または
遠心することにより、培養濾液（上清）を得る。変異型
ＣＣアシラーゼは、該培養濾液から、天然または合成蛋
白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法
（例えば、透析、ゲル濾過、抗ＣＣアシラーゼモノクロ
ーナル抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラ
フィー、適当な吸着材上でのカラムクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィーなど）を用いて精製す
ることができる。

【００３２】製造された変異型ＣＣアシラーゼが、培養
された形質転換体のペリプラズムおよび細胞質内に存在
する場合は、細胞を濾過および遠心により集め、当該細
胞の細胞壁および／または細胞膜を、例えば超音波およ
び／またはライソザイムで処理して、細胞破片を得る。
該細胞破片を適当な水溶液（例えば、８Ｍ尿素水溶液、
６Ｍグアニジウム塩水溶液）に溶解する。変異型ＣＣア
シラーゼは、該水溶液から先に例示したような常法によ
り精製することができる。

【００３３】本発明は更に、式：

【００３４】

【化３】

【００３５】（式中、Ｒ1 はアセトキシ、ヒドロキシま
たは水素を示す。Ｒ2 はカルボン酸アシルを示す。）で
示される化合物(II)またはその塩を、本発明の変異型Ｃ
ＣアシラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで
形質転換された微生物の培養物またはその処理物と接触
させて、式：

【００３６】

【化４】

【００３７】（式中、Ｒ1 は前記と同意義である。）で
示される化合物(I) またはその塩の製造方法を提供する
ものである。

【００３８】Ｒ2 で示されるカルボキン酸アシルとして
は、脂肪族、芳香族または複素環カルボン酸アシルが挙
げられ、その適切な例としては、アミノ基、カルボキシ
基、Ｃ１〜Ｃ６のアルカノイルアミノ基、ベンズアミド
基およびチエニル基等からなる群から選択される１つも
しくは２つの適当な置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ
６のアルカノイルが挙げられる。

【００３９】化合物（Ｉ）および化合物（II）の適当な
塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、
カリウム塩、リチウム塩）が挙げられる。

【００４０】ＣＣアシラーゼ活性が通常形質転換細胞内
に存在するなら、培養物を処理して得られる物質（以
下、処理物という）としては、以下のものが例示され
る。

【００４１】（１）生細胞；濾過または遠心等の常法に
て培養物から分離される。 （２）乾燥細胞；上記(1) の生細胞を凍結乾燥または真
空乾燥等の常法により乾燥させることにより得られる。 （３）無細胞抽出物；上記(1) の生細胞または上記(2)
の乾燥細胞を常法（例えば、有機溶媒を用いた細胞の自
己消化、アルミナ、海砂などを用いた細胞の粉砕、また
は超音波にて細胞を処理すること）により破壊すること
により得られる。 （４）酵素溶液；上記(3) の無細胞抽出物を常法（例え
ば、カラムクロマトグラフィー）により精製または部分
精製することによって得られる。 （５）固定化細胞または酵素；上記(1) もしくは(2) の
細胞または上記(4) の酵素を常法（例えば、アクリルア
ミド、グラスビーズ、イオン交換樹脂などを用いた方
法）により固定化することにより調製される。

【００４２】本発明の化合物（II）を酵素と接触させる
ことからなる反応は、水または緩衝液のような水性媒質
中で実施することができる。即ち、通常、化合物（II）
を含む水または緩衝液のような水性媒質中に、培養物ま
たはその処理物を溶解または懸濁することによって行わ
れる。

【００４３】該反応混液の好適なｐＨ、化合物（II）の
濃度、反応時間および反応温度は、用いられる培養物ま
たはその処理物の性質によって変わりうる。一般に、該
反応はｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９、５〜４０
℃、好ましくは５〜３７℃で０．５〜５０時間実施され
る。

【００４４】反応混液中、基質としての化合物（II）の
濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で好適に選択する
ことができる。

【００４５】このようにして製造された化合物（Ｉ）
は、上記反応混液から慣用の方法で精製、単離される。

【００４６】以下の実施例において、プラスミド、制限
酵素のような酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、及び他の物質
は市販のものであり、常法に従って使用された。ＤＮＡ
のクローニング、宿主細胞の形質転換、形質転換体の培
養、該培養物からのＣＣアシラーゼの採取などに用いら
れた操作は、当業者によく知られているものであるか、
もしくは文献から採用できるものである。

【００４７】

【実施例】以下の実施例は、本発明をより具体的に説明
することを目的として挙げられているものであり、本発
明はこれらにより何ら限定されるものではない。

【００４８】実施例１ ｔｒｐプロモーター制御下での
天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６の発現ベクターの調製 （１）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のアンピシリン耐
性発現ベクターであるｐＣＣ００２Ａの構築： （ｉ）ｐＣＣ００１Ａの構築：プラスミドｐＣＣＮ１７
６−３（１．０μｇ）〔JOURNAL OF FERMENTATION AND
BIOENGINEERING, Vol. 72, p235 (1991)に、プラスミド
ｐＣＣＮ１７６−２（これは、常法により E. coli JM1
09 (ｐＣＣＮ１７６−２）ＦＥＲＭ ＢＰ−３０４７か
ら入手可能である）からこのプラスミドを調製する方法
が記載されている〕を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で
消化し、ＣＣアシラーゼＮ１７６の全てのコーディング
領域を担持する２．９ｋｂフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動によって単離した。一方、変異型ｔ−ＰＡの
発現ベクターであるｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ（１．０μ
ｇ）、〔これは、常法により形質転換体であるＥ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１−１６（ｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ）ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１８７０から得ることができる。その調製方
法については、欧州特許出願公開明細書第３０２４５６
号に記載されている〕をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で
消化した。得られたｔｒｐプロモーター、ｔ−ＰＡコー
ディング領域の一部分（Ｃｙｓ92からＴｒｐ113 ）、及
びｆｄファージセントラルターミネーターの複写配列を
担持する４．３ｋｂＤＮＡを単離した。５０ｍＭのトリ
ス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイ
トール及び１ｍＭ ＡＴＰからなるライゲーション緩衝
液４０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット、
宝酒造製）の存在下、先に得られた２．９ｋｂのＤＮＡ
フラグメントと当該４．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを
混合して、１６℃、５時間かけて結合させた。該結合物
を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。ア
ンピシリン耐性の形質転換体の一つからｐＣＣ００１Ａ
と命名する所望のプラスミドを取得し、制限酵素マッピ
ングにより、その特性を調べた。

【００４９】（ii）ｐＣＣ００２Ａの構築 (i) で得られたプラスミドｐＣＣ００１Ａは、ｔｒｐプ
ロモーターとアシラーゼ遺伝子との間のｔ−ＰＡ遺伝子
の一部分（Ｃｙｓ92からＴｒｐ113 ）を含む。この領域
を除去するために、ｐＣＣ００１Ａ（１．０μｇ）をＣ
ｌａＩ及びＭｌｕＩで消化し、得られる６．１ｋｂのＤ
ＮＡフラグメントを単離した。一方、ｐＣＣＮ１７６−
３（１μｇ）をＭｌｕＩおよびＳａｕ３ＡＩで消化し、
アシラーゼのＡｓｐ7 からＡｒｇ71間をコードする１８
９ｂｐのＤＮＡを単離した。合成ＤＮＡオリゴマー００
２ａ及び００２ｂ（各々０．５ｎｍｏｌ、表１参照）
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１．５ユニット、
宝酒造製）を用いて、緩衝液（キネーション緩衝液；５
０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤ
ＴＴ、１．０ｍＭ ＡＴＰ）中、３７℃、１時間でリン
酸化し、該反応混合物を５５℃で２０分間加熱して酵素
を不活性化させた。その結果得られた混合物を、ライゲ
ーション緩衝液２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在
下、１５℃、３時間、先に得られた１８９ｂｐのＳａｕ
３ＡＩ／ＭｌｕＩ ＤＮＡフラグメントと混合して結合
させた。得られた結合物に、６．１ｋｂ ＣｌａＩ／Ｍ
ｌｕＩＤＮＡフラグメントを添加し、その混合物を更に
追加したＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）の存在
下で４℃、１６時間インキュベーションした。その結果
得られた結合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形
質転換した。これらの形質転換体の一つから、ＣＣアシ
ラーゼＮ１７６の発現ベクターである所望のプラスミド
ｐＣＣ００２Ａを単離して、制限酵素マッピングにより
その特性を調べた。

【００５０】

【表１】

【００５１】（２）カナマイシン耐性ＣＣアシラーゼＮ
１７６の発現ベクターであるｐＣＫ００２の構築 プラスミドｐＣＣ００２ＡをＤｒａＩ（東洋紡績（株）
製）で消化した。その結果得られた混合液をフェノール
で処理して酵素を除去し、エタノールで沈澱させた。回
収されたＤＮＡをライゲーション緩衝液２０μｌに懸濁
し、リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカー（２μｇ、ファ
ルマシア製）と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユ
ニット）とともに４℃で１６時間インキュベーションし
た。該反応混合物をフェノールで抽出し、エタノールで
沈澱させた。回収したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そ
の結果得られたアンピシリン耐性遺伝子を欠失した５．
６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって単離
した。一方、プラスミドｐＡ０９７（１μｇ）〔これ
は、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＡＯ９７）
ＦＥＲＭ ＢＰ−３７７２から常法により得ることがで
きる。〕をＥｃｏＲＩで消化し、その結果カナマイシン
耐性遺伝子である１．２ｋｂＤＮＡを単離した。ライゲ
ーション緩衝液５０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３０
０ユニット）を用いて、当該１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡを１６℃、２時間反応させ、５．６ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡに結合させた。該結合物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９を形質転換し、抗生物質マーカーとして
カナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプラスミドｐ
ＣＫ００２を得た。

【００５２】実施例２ ＣＣアシラーゼＮ１７６の高発
現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築 （１）ｐＣＣ０１３Ａの構築 （ｉ）ｐＣＣ００７Ａの構築 実施例１（１）(i) で得られたプラスミドｐＣＣ００１
ＡをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩで消化し、その結果得ら
れた６．４ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル
電気泳動により単離した。回収されたＤＮＡを、予めリ
ン酸化しておいた合成ＤＮＡオリゴマー００７ａ及び０
０７ｂ（各々０．５μｇ、表２参照）に、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（３００ユニット）を用いて１６℃、５時間処理
し、結合させた。得られた混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドｐＣＣ００
７Ａを得た。

【００５３】（ii）ｐＣＣＮｔ０１３の構築 プラスミドｐＣＣ００７Ａ（１．０μｇ）をＣｌａＩと
ＢａｍＨＩで消化し、得られた６．１ｋｂのＤＮＡを５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。該
ＤＮＡを合成オリゴマー０１３ａと０１３ｂ（各々０．
５μｇ、それらの各々はリン酸化されている。表２参
照）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を用い
て、結合した。該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ
１０９を形質転換し、所望のプラスミドｐＣＣＮｔ０１
３をアンピシリン耐性形質転換体から単離した。

【００５４】

【表２】

【００５５】（iii) ｐＣＣ０１３Ａの構築 プラスミドｐＣＣＮｔ０１３をＢａｍＨＩとＭｌｕＩで
消化し、その結果得られる６．１ｋｂのＤＮＡを単離し
た。一方、実施例１（１）(ii)で得られたｐＣＣ００２
Ａ（１．０μｇ）をＭｌｕＩとＳａｕ３ＡＩで消化して
１８９ｂｐのＤＮＡフラグメントを取得した。得られた
ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を用い
て、６．１ｋｂのＢａｍＨＩ／ＭｌｕＩのＤＮＡフラグ
メントに結合し、該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換
体の一つから、ＡＴリッチなＮＨ₂ 末端側ＤＮＡ配列
（天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のアミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列をコードする）をもつ所望のプラスミド
ｐＣＣ０１３Ａを単離した。

【００５６】（２）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のカ
ナマイシン耐性発現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築 （ｉ）ｐΔＮ１７６の構築 実施例１（２）で得られたプラスミドｐＣＫ００２
（１．０μｇ）をＡａｔII（東洋紡績（株）製）で消化
し、得られたＤＮＡを自己結合させる為にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（１５０ユニット）で処理した。かかる結合混合
物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、ユニ
ークなＡａｔII制限酵素切断部位を担持する所望のプラ
スミドｐΔＮ１７６を取得した。

【００５７】（ii）ｐＣＫ０１３の構築 プラスミドｐΔＮ１７６（１．０μｇ）をＡａｔIIで消
化し、直線化したＤＮＡを細菌由来のアルカリホスファ
ターゼ（１ユニット、宝酒造製）で、１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、４２℃にて１時間処理し
た。その脱リン酸化されたＤＮＡを単離して、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いてｐＣＣ０１３Ａ由来の２．５ｋｂの
ＡａｔII ＤＮＡフラグメントに結合した。該結合混合
物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、マー
カーとしてカナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプ
ラスミドｐＣＫ０１３を取得した。

【００５８】実施例３ ＣＣアシラーゼＮ１７６をコー
ドするＤＮＡのクンケル法によるポイントミューテーシ
ョン （１）ＣＣアシラーゼＮ１７６をコードするＤＮＡのＭ
１３ファージへのサブクローニング （ｉ）ｍｐ１８ｐ１８３の調製 実施例２（１）(iii) で得られたプラスミドｐＣＣ０１
３ＡをＨｐａＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで消化し、ＣＣ
アシラーゼＮ１７６のＴｈｒ1からＡｌａ374までをコー
ドする１１６２ｂｐのＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、
ＨｉｎｃＩＩで消化されたＭ１３ｍｐ１８に、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結し、該結合混合物を用いてＥ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。プラークのうちの
一つから、所望のＲＦ ＤＮＡ ｍｐ１８ｐ１８３を単
離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。一
方、菌体を除いた培地画分（ファージ粒子を含む）から
ファージ溶液を調製し、得られたファージ溶液は使用す
るまで４℃で保存した。

【００５９】（ii）一本鎖Ｕ−ｍｐ１８ｐ１８３−ＳＳ
の調製（Kunkel, T.A. et al., Methods Enzyml. 154,
367 参照) ：Ｅ．ｃｏｌｉＣＪ２３６（ｄｕｔ−，ｕｎ
ｇ−，Ｆ’）（バイオ・ラッドラボラトリーズ製）のシ
ングルコロニーをクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍ
ｌ）を含有する２ＸＴＹブロス２ｍｌ中で３７℃、１６
時間培養した。細胞（０．１ｍｌ）を３０μｇ／ｍｌク
ロラムフェニコールを含有する新鮮な２ＸＴＹブロス
（５０ｍｌ）に移し、３７℃で培養を継続した。６００
ｎｍでの吸光度が０．３に達したとき、該培養物にｍｐ
１８ｐ１８３のファージ溶液（ＭＯＩ＜０．２）を添加
し、さらに５時間培養を続けた。得られた培養物を４
℃、１７，０００×ｇで１５分間遠心をした後、再び上
清を遠心した。その結果得られた上清（３０ｍｌ）を室
温下、３０分間ＲＮａｓｅ（１５０μｇ／ｍｌ，シグマ
社製）で処理し、７．５ｍｌのＰＥＧ溶液（３．５Ｍ
ＮＨ₄ ＯＡｃの２０％ポリエチレングリコール８，００
０溶液）を添加した。遠心（１７，０００×ｇ，１５
分，４℃）後、残渣を３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
からなる緩衝液２００μｌに懸濁した。得られた溶液を
フェノール２００μｌおよびフェノール／ＣＨＣｌ
₃ （１／１）２００μｌで抽出し、続いてＣＨＣｌ
₃ （２００μｌ）で２回洗浄した。該溶液に、７．５Ｍ
ＮＨ₄ ＯＡｃ（１００μｌ）とエタノール（６００μ
ｌ）を添加してファージＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮＡ
を遠心により回収し、氷冷９０％エタノール７００μｌ
で洗浄し、真空下で乾燥させた。精製された１本鎖Ｕ−
ＤＮＡ（Ｕ−ｍｐ１８ｐ１８３−ＳＳ）をＴＥ緩衝液２
０μｌで懸濁し、使用するまで４℃で保存した。

【００６０】（２）変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑを
コードするＲＦ ＤＮＡの調製 （ｉ）オリゴデオキシリボヌクレオチドＳＯ−Ｋ１７０
Ｑの合成 ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｋ１７０Ｑ（５’ＡＧＣＧＣＣ
ＡＧＣＡＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＡ
Ｃ ３’）を３９２Ａ型ＤＮＡ合成機（アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて合成した。そのＤＮＡを、
ＣＰＧ（controlled pore glass)ポリマー支持体から２
８％アンモニア水で遊離し、その後６０℃で９時間加熱
することにより全保護基を除去した。その反応混合物を
真空下で減圧留去し、残渣をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ〕２００μｌに
溶解した。得られた粗ＤＮＡ溶液を、逆相ＨＰＬＣ〔カ
ラム； COSMOSIL C18, 4.6 mm ×150 mm（ナカライテス
ク）、溶離液；Ａ：０．１Ｍ トリエチルアンモニウム
酢酸緩衝液（ｐＨ７．２〜７．４）、Ｂ：アセトニトリ
ル、グラジェント；開始：Ａ（１００％）、終わり：Ａ
（６０％）＋Ｂ（４０％）、２５分間直線グラジェン
ト、流速；１．２ ml/min 〕に付した。目的のＤＮＡオ
リゴマーを含む溶出液を集め、真空下で減圧留去した。
精製されたＤＮＡをＴＥ緩衝液２００μｌに溶解し、使
用まで−２０℃で保存した。

【００６１】（ii）オリゴデオキシリボヌクレオチドの
リン酸化 ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｋ１７０Ｑ（約１６７ｐｍｏ
ｌ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（４．５ユニッ
ト、宝酒造製）を用いて、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２０ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＡＴＰ及び５０μｇ／ｍ
ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるライゲーショ
ン緩衝液３０μｌ中で、３７℃で１時間リン酸化した。

【００６２】（iii)アニーリング反応 １０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 及び４０ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液９μｌ中にお
いて、(ii)でリン酸化されたオリゴマー（１μｌ、約
５．６ｐｍｏｌ）を鋳型Ｕ−ｍｐ１８ｐ１８３−ＳＳ
（０．１０ｐｍｏｌ、約２５０ｎｇ）と混合した。該混
合物を７０℃、５分間加熱して、その後４０分かけて３
０℃で冷却して０℃で静置した。

【００６３】（iv）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの２重鎖ＤＮＡ
の合成 得られたアニーリング溶液（１０μｌ）を、合成緩衝液
〔２００ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８．０）−４０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 〕１μｌ、５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）１μｌ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（３００ユニット、宝酒造製）およびＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ（１０ユニット、ファルマシア）と混合
した。該混合物を氷上で５分間、２５℃で５分間、さら
に３７℃で９０分間、順次インキューベーションした。
１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）および１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡからなる緩衝液９０μｌを添加して、反応を停止
させた。

【００６４】（ｖ）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の形質転換 （iv）で得られた合成ＤＮＡ溶液のうち３μｌをＥ．ｃ
ｏｌｉＪＭ１０９のコンピテントセル（２００μｌ）に
添加し、該セルを氷上で３０分間インキュベーションし
て、形質転換体を得た。一方、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
のシングルコロニーをＬブロス（２ｍｌ）中で１６時間
培養した。該培養物（０．１ｍｌ）を新鮮なＬブロス
（２ｍｌ）に移し、更に２時間培養して、インディケー
ターセルを取得した。形質転換された細胞（２００μ
ｌ）に、インディケーターセル（２００μｌ）を加え
て、それらを５５℃で前加熱したＨ−Ｔｏｐ寒天（１％
バクトトリプトン、０．８％ＮａＣｌ、０．８％寒天）
３ｍｌと混合した。該細胞−寒天混合物をＨプレート
（１％バクトトリプトン、０．５％ ＮａＣｌ、１．５
％寒天）上に延展し、そのプレートを３７℃で１６時間
培養した。

【００６５】（vi）形質転換体から得られたＲＦ ＤＮ
Ａの特性 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のシングルコロニーを２ＸＴＹ
ブロス（１．６％バクトトリプトン、１％酵母抽出物、
０．５％ＮａＣｌ）２ｍｌ中で１６時間培養した。該培
養物（０．１ｍｌ）を新しい２ＸＴＹブロス（２ｍｌ）
に移し、更に２時間培養した。ステップ（iv）で調製さ
れたプレートのプラークを竹製爪楊枝（１５ｃｍ）で拾
い、爪楊枝を直ちに先に培養した２ＸＴＹブロスに移し
た。培養を３７℃、５〜６時間続けた。該培養物１ｍｌ
から、室温下１５秒、１０，０００ｒｐｍで遠心するこ
とにより、細胞を収集し、上清（次の実験でのＲＦ Ｄ
ＮＡの大量調製のために使用されるファージ溶液）につ
いては、使用するまで４℃で保存した。該細胞をＧＴＥ
緩衝液〔５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．０）、２５ｍＭ ＥＤＴＡ〕１００μｌに懸濁
し、アルカリ−ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％
ＳＤＳ）２００μｌと緩やかに混合し、そしてボルテッ
クスＴＭミキサーを用いて高塩緩衝液（３Ｍ ＫＯＡ
ｃ、３Ｍ ＡｃＯＨ）１５０μｌと激しく混合した。得
られた混合液を室温で５分間、１０，０００ｒｐｍで遠
心した。得られた上清（４００μｌ）をイソプロピルア
ルコール３００μｌで処理し、１０，０００ｒｐｍで５
分間遠心した。その上層部（３００μｌ）を分離し、エ
タノール６００μｌと混合した。その混液を遠心（１
０，０００ｒｐｍ、５分）した後、得られた沈澱を氷冷
７０％エタノール５００μｌで洗浄し、真空下で乾燥
し、ＲＮａｓｅ（シグマ社製）１μｇ／ｍｌを含有する
ＴＥ緩衝液５０μｌに懸濁し、ＲＦ ＤＮＡ ｍｐ１８
ｐ１８３Ｋ１７０Ｑ溶液を得た。該ＲＦＤＮＡ溶液の一
部分（１０μｌ）をＳｐｈＩを用いた制限エンドヌクレ
アーゼマッピングに用いた。これは、変異を調べるた
め、ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｋ１７０Ｑがその配列中に
ＳｐｈＩ認識部位を計画的に含んでいることによる。

【００６６】実施例４ 発現ベクターｐＣＫＫ１７０Ｑ
の構築 実施例３で得られたＲＦ ＤＮＡ（ｍｐ１８ｐ１８３Ｋ
１７０Ｑと表示）（１０μｇ）をＭｌｕＩ（５ユニッ
ト、東洋紡績（株）製）およびＢｓｔＢＩ（５ユニッ
ト、ニューイングランドバイオラボ（株）製）で消化し
た。得られた５８２ｂｐのＤＮＡフラグメントを０．８
％のアガロースゲル電気泳動にかけて消化混合物から単
離した。一方、実施例２（２）で得られたｐＣＫ０１３
（１０μｇ）をＭｌｕＩ（５ユニット）およびＢｓｔＢ
Ｉ（５ユニット）で消化し、５６９７ｂｐのＤＮＡフラ
グメントを単離した。５８２ｂｐと５６９７ｂｐのＭｌ
ｕＩ／ＢｓｔＢＩ ＤＮＡをライゲーション緩衝液２０
μｌ中で４℃、１６時間条件で連結した。該ライゲーシ
ョン混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換
した。カナマイシン耐性の形質転換体の一つから、ｐＣ
ＫＫ１７０Ｑと称する所望のプラスミドを単離し、制限
エンドヌクレアーゼ消化により、その特性を調べた（図
１参照）。

【００６７】実施例５ 変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０
ＱをコードするＤＮＡ配列 ｐＣＫＫ１７０Ｑの配列を３７３Ａ型ＤＮＡシークエン
サー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、直
接、Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ^TM法にて決定した。決定された
配列は予想されたものと一致していた。当該ｐＣＫＫ１
７０Ｑで発現され得る変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑ
の前駆体をコードするＤＮＡの塩基配列、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号１に示す。

【００６８】実施例６ 形質転換体（Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ
１０９／ｐＣＫＫ１７０Ｑ）の培養 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９をｐＣＫＫ１７０Ｑで形質転換
して調製された形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０
９／ｐＣＫＫ１７０Ｑのグリセロールストック（１ｍ
ｌ）を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有１００ｍｌＬ
ブロス（１％バクトトリプトン、０．５％酵母抽出物、
０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に移し、該混合物を
３０℃で８時間培養した。該培養物（０．２ｍｌ）を５
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２０ｍｌＭＳブロス
（１．２％バクトトリプトン、２．４％酵母抽出物、
１．２５％グリセロール、０．１１％ロイシン、０．１
１％プロリン、０．１１％イソロイシン、１．２５％
Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、０．３８％ ＫＨ₂ＰＯ₄ 、５０μｇ／
ｍｌチアミン・塩酸、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、
０．２ｍＭ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ、０．０５ｍＭ Ｆ
ｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ）に添加し、該混合液を３０℃で１
６時間培養した。得られた培養物（３．４ｍｌ）を、１
％のグリセロールと２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む２％Ｍ９ＣＡブロス（２％カザミノ酸、１．５２％
Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ、０．３％ ＫＨ ₂ Ｐ
Ｏ₄ 、０．１％ ＮＨ₄ Ｃｌ、０．０５％ ＮａＣｌ、
２ｍＭ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ
₂ ・２Ｈ₂ Ｏ、５０μｇ／ｍｌチアミン・塩酸、ｐＨ
７．２）に添加し、その混合液を２０℃で激しく振盪し
ながら培養した（３５０−４００ｒｐｍ／ｍｉｎ）。８
時間目に、３−インドールアクリル酸を最終濃度が２０
μｇ／ｍｌになるように該培養物に添加し、更に４０時
間培養を継続した。得られた培養物のうち２０ｍｌを４
℃下、７，０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、
細胞を集め、それをＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌ
に懸濁し、超音波処理により破砕した。該破砕物を、４
℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して不溶解物質
を除去した。得られた上清は４℃で保存され、ＧＬ−７
ＡＣＡアシラーゼ活性を測定するために、及び変異型Ｃ
ＣアシラーゼＫ１７０Ｑを調製するために使用された。

【００６９】実施例７ アシラーゼの精製と特性 （１）変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑの精製 培養物２０ｍｌから得られたＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／
ｐＣＫＫ１７０Ｑの破砕物（２０ｍｌ）に、硫酸アンモ
ニウム（４．１８ｇ、最終濃度：３５％飽和）を添加
し、該混合物を室温で２０分間攪拌した。得られた混合
液を遠心（２０℃、１５，０００ｒｐｍ、２０分間）
し、上清を集めて硫酸アンモニウム処理した（５．５６
ｇ、最終濃度：７５％飽和）。遠心（２０℃、１５，０
００ｒｐｍ、２０分間）により沈澱物を集め、それを１
００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）５ｍｌに溶解した。
得られた溶液を４℃で１００ｍＭトリス塩酸緩衝液各々
４Ｌに対して２回の透析を行った。得られた透析物をＭ
ｉｌｌｅｘ−ＨＶ^TM（０．４５μｍ、ミリポア）で濾過
し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した〔カラ
ム；ＴＳＫｇｅｌ^TM ＤＥＡＥ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−
５ＰＷ（東ソー）、溶離液；Ａ：２０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）、Ｂ：０．５Ｍ ＮａＣｌ−トリス塩酸
（ｐＨ８．０）、グラジェント；始め：Ａ（８０％）＋
Ｂ（２０％）、終わり（３０分後）：Ａ（５０％）＋Ｂ
（５０％）、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕。約０．１６
Ｍ濃度のＮａＣｌ溶液と共に溶出したメインピークを集
め、４Ｌの２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）に対して
透析して、精製された変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑ
を得た。

【００７０】精製されたＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑを逆
相ＨＰＬＣカラム〔ＣＯＳＭＯＳＩＬ４．６ｍｍ×５０
ｍｍ（ナカライテスク製）、溶離液；Ａ：０．０５％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ：６０％アセトニトリル
含有０．０５％ＴＦＡ、グラジェント；開始：Ａ（４０
％）＋Ｂ（６０％）、終わり（２０分後）：Ａ（０％）
＋Ｂ（１００％）〕、およびドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
で分析した。そのようにして得られたＣＣアシラーゼＫ
１７０Ｑの純度は、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り、約９５％であった。

【００７１】（２）ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ比活性の
測定 ３７℃で１０分間プレインキュベーションしたＧＬ−７
ＡＣＡ溶液２００μｌ〔０．１５Ｍトリス塩酸（ｐＨ
８．７）中に１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨは１Ｎ ＮａＯＨで
８．７に再調整された〕に、サンプルアシラーゼ２０μ
ｌを添加して、該混合液を３７℃で５分間インキュベー
ションした。これに、５％酢酸を２２０μｌ添加するこ
とにより反応を止めた。得られた混合液を遠心し（室温
下、１０，０００ｒｐｍで５分間）、上清を用いて７Ａ
ＣＡの生成を測定した。ＨＰＬＣ条件：カラム；ＴＳＫ
ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ ＴＭＣＴＲ ４．４ｍｍ×１０
０ｍｍ（東ソー製）、溶離液；５％（ｗ／ｖ）酢酸アン
モニウム含有３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、流速；
１．０ｍｌ／ｍｉｎ、注入量；１０μｌ、検出器２５４
ｎｍ １ユニットを、３７℃で１分間にＧＬ−７ＡＣＡ
から１．０μｍｏｌの７ＡＣＡを生成しうる活性として
定義した。その結果、天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６の
活性１００％に比べて、本発明の変異型ＣＣアシラーゼ
Ｋ１７０Ｑの活性は１３０％であり、ＧＬ−７ＡＣＡア
シラーゼ活性の向上が認められた。

【００７２】（３）変異型アシラーゼのアミノ末端配列
の決定 （ｉ）ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑの両鎖の単離：精製さ
れた変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑを逆相ＨＰＬＣに
付した〔カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ₄ （４．６ｍ
ｍ×３５ｍｍ，ナカライテスク製）、溶離液；０．０５
％ＴＦＡ中、アセトニトリル初濃度３６％から２０分で
６０％の直線グラジェント、流速；１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ〕。ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑのβ鎖およびα鎖は、
それぞれ約４８％および約５１％濃度のアセトニトリル
と共に溶出された。各溶出液を集め、凍結乾燥して、ア
シラーゼのα鎖およびβ鎖を得た。

【００７３】（ii）アミノ末端配列の決定 当該α鎖およびβ鎖のアミノ末端配列を、気相シークエ
ンサー４７０Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）で
決定し、予想されたものと一致することを確認した。

【００７４】

【発明の効果】本発明によれば、高いＧＬ−７ＡＣＡア
シラーゼ活性をもつ変異型セファロスポリンＣアシラー
ゼ、該酵素を高収率発現する発現系並びに該酵素の製造
方法を提供することができる。

【００７５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２３２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：１７０ 特徴を決定した方法： 配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC CAG CTC TGG CGC ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Gln Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT AGC GTC ACG CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【図面の簡単な説明】

【図１】変異型ＣＣアシラーゼＫ１７０Ｑの発現ベクタ
ーであるｐＣＫＫ１７０Ｑの制限酵素地図を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 35/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 宿主細胞中でα−サブユニットとβ−サ
   ブユニットにプロセッシングされる前の前駆体形として
   のアミノ酸配列が、式： Ａ1-169 −Ｘ1 −Ａ171-773 （式中、Ａ1-169 は、天然型セファロスポリンＣアシラ
   ーゼのＴｈｒ1 からＰｈｅ169 までのアミノ酸配列と同
   一のアミノ酸配列を示す。Ａ171-773 は、天然型セファ
   ロスポリンＣアシラーゼのＬｅｕ171 からＡｌａ773 ま
   でのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示す。Ｘ1 は
   Ｌｙｓ以外のアミノ酸を示す。）で示される、変異型セ
   ファロスポリンＣアシラーゼ。
2. 【請求項２】 Ｘ1 がＧｌｎである請求項１記載の変異
   型セファロスポリンＣアシラーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１または請求項２記載の変異型セ
   ファロスポリンＣアシラーゼをコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
   ー。
5. 【請求項５】 請求項４記載の発現ベクターによって形
   質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５記載の宿主細胞を培地で培養
   し、得られる培養物から変異型セファロスポリンＣアシ
   ラーゼを採取することを特徴とする請求項１または請求
   項２記載の変異型セファロスポリンＣアシラーゼの製造
   方法。
7. 【請求項７】 式： 【化１】 （式中、Ｒ1 はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素を示
   す。Ｒ2 はカルボン酸アシルを示す。）で示される化合
   物（II）またはその塩に請求項５の形質転換体の培養物
   またはその処理物を接触させて、式： 【化２】 （式中、Ｒ1 は前記と同意義。）で示される化合物
   （Ｉ）またはその塩を得ることを特徴とする化合物
   （Ｉ）の製造法。