JPH0898686A - Variant type cephalosporin c acylase and its production - Google Patents
Variant type cephalosporin c acylase and its productionInfo
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- JPH0898686A JPH0898686A JP6239272A JP23927294A JPH0898686A JP H0898686 A JPH0898686 A JP H0898686A JP 6239272 A JP6239272 A JP 6239272A JP 23927294 A JP23927294 A JP 23927294A JP H0898686 A JPH0898686 A JP H0898686A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、新規セファロスポリン
Cアシラーゼ(以下、CCアシラーゼという)に関す
る。より詳細には、新規な変異型CCアシラーゼ、それ
をコードする遺伝子、その遺伝子を含有する発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された微生物及び変異型
CCアシラーゼの製造法に関する。更に、本発明は上記
形質転換体の培養物またはその処理物を用いたセファロ
スポリン化合物の製造法に関する。The present invention relates to a novel cephalosporin C acylase (hereinafter referred to as CC acylase). More specifically, it relates to a novel mutant CC acylase, a gene encoding the same, an expression vector containing the gene, a microorganism transformed with the expression vector, and a method for producing the mutant CC acylase. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a cephalosporin compound using the culture of the above transformant or a treated product thereof.
【0002】[0002]
【従来の技術】CCアシラーゼは、一般にセファロスポ
リンCを7−アミノセファロスポラン酸(7−ACA)
に加水分解する酵素である。今まで、CCアシラーゼと
して分類される酵素としては、セファロスポリンCアシ
ラーゼSE83、N176及びV22の三酵素が見つか
っており、それらのアミノ酸配列は、Journal of Ferme
ntation and Bioengineering, Vol.72, p232-243 (199
1) に開示されている。この文献では、CCアシラーゼ
のアミノ酸配列の番号表記はそのN末端部位のMet基
から始まっている。2. Description of the Related Art CC acylase generally uses cephalosporin C as 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA).
It is an enzyme that hydrolyzes into. To date, three enzymes, cephalosporin C acylases SE83, N176 and V22, have been found as enzymes classified as CC acylases, and their amino acid sequences are shown in the Journal of Ferme.
ntation and Bioengineering, Vol.72, p232-243 (199
It is disclosed in 1). In this document, the numbering of the amino acid sequence of CC acylase begins with the Met group at its N-terminal site.
【0003】しかし、本明細書においてはCCアシラー
ゼのアミノ酸配列の番号表記はN末端部のMet基に隣
接するThr基から始まる(配列表配列番号1参照)。
これは原核生物中でCCアシラーゼ遺伝子を発現するこ
とによって得られる成熟CCアシラーゼのα−サブユニ
ットのN末端部のMetは、通常、宿主細胞の酵素(例
えば、アミノペプチダーゼなど)によって脱離して、N
末端アミノ酸としてThr基をもつ成熟CCアシラーゼ
となるからである。However, in the present specification, the numbering of the amino acid sequence of CC acylase starts from the Thr group adjacent to the Net-terminal Met group (see SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing).
This is because the Met at the N-terminal part of the α-subunit of the mature CC acylase obtained by expressing the CC acylase gene in a prokaryote is usually eliminated by a host cell enzyme (for example, aminopeptidase etc.), N
This is because it becomes a mature CC acylase having a Thr group as a terminal amino acid.
【0004】上記文献は、組換えDNA技術による天然
型CCアシラーゼが、GL−7ACAアシラーゼ活性
〔7−β−(4−カルボキシブタンアミド)−セファロ
スポラン酸から7−アミノセファロスポラン酸を生成す
る酵素活性をいう。〕を有していることについても開示
するものである。[0004] The above-mentioned document describes that a natural CC acylase produced by recombinant DNA technology produces GL-7ACA acylase activity [7-β- (4-carboxybutanamide) -cephalosporanic acid from 7-aminocephalosporanic acid. Refers to activity. ] Is also disclosed.
【0005】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な変異型CCアシラーゼ、それをコードするDNA、該
DNAを含む発現ベクター、該ベクターを導入した形質
転換体、及び該形質転換体を培養することによる変異型
CCアシラーゼの製造方法を提供することである。ま
た、本発明の他の目的は、上記形質転換体の培養物また
はその処理物を用いたセファロスポリン化合物の製造法
を提供することである。The object of the present invention is to provide a novel mutant CC acylase, a DNA encoding the same, an expression vector containing the DNA, a transformant into which the vector is introduced, and the transformant. It is intended to provide a method for producing a mutant CC acylase by culturing. Another object of the present invention is to provide a method for producing a cephalosporin compound using the culture of the above transformant or a treated product thereof.
【0006】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、高い酵素
活性、特にGL−7ACAに対して高い酵素活性を有す
るCCアシラーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果、か
かる望ましい性質を持つ新規CCアシラーゼの製造に成
功し、本発明を完成した。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted extensive studies to obtain a CC acylase having a high enzyme activity, particularly a high enzyme activity for GL-7ACA, and as a result, a novel CC having such desirable properties has been obtained. The production of acylase was successful and the present invention was completed.
【0007】即ち本発明は、下記の特徴を有する新規な
変異型CCアシラーゼに関するものである。天然型CC
アシラーゼのアミノ酸配列170位のLysが他のアミ
ノ酸で置換されてなる変異型CCアシラーゼ。言い換え
ると、本発明の変異型CCアシラーゼは、α−サブユニ
ットとβ−サブユニットとにプロセッシングされる前の
前駆体形として次式で示すことができる。 A1-169 −X1 −A171-773 (式中、A1-169 は、天然型CCアシラーゼのThr1
からPhe169 までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配
列を示す。A171-773 は、天然型CCアシラーゼのLe
u171 からAla773 までのアミノ酸配列と同一のアミ
ノ酸配列を示す。X1 は、Lys以外のアミノ酸であ
る。) また本発明は、上記式中、X1 がGlnである変異型C
Cアシラーゼに関する。That is, the present invention relates to a novel mutant CC acylase having the following characteristics. Natural CC
A mutant CC acylase in which Lys at the 170th amino acid sequence of acylase is substituted with another amino acid. In other words, the mutant CC acylase of the present invention can be represented by the following formula as a precursor form before being processed into α-subunit and β-subunit. A1-169-X1-A171-773 (In the formula, A1-169 is Thr1 of natural CC acylase.
1 to Phe169 have the same amino acid sequence. A171-773 is Le of natural CC acylase
It shows the same amino acid sequence as the amino acid sequence from u171 to Ala773. X1 is an amino acid other than Lys. The present invention also provides a mutant C wherein X1 is Gln in the above formula.
Regarding C acylase.
【0008】なお、本明細書で用いる下記アルファベッ
ト三文字は、天然L−アミノ酸を意味する:(Gly)
グリシン、(Ala)アラニン、(Val)バリン、
(Leu)ロイシン、(Ile)イソロイシン、(Se
r)セリン、(Thr)スレオニン、(Asp)アスパ
ラギン酸、(Glu)グルタミン酸、(Asn)アスパ
ラギン、(Gln)グルタミン、(Lys)リジン、
(Arg)アルギニン、(Cys)システイン、(Me
t)メチオニン、(Phe)フェニルアラニン、(Ty
r)チロシン、(Trp)トリプトファン、(His)
ヒスチジン、(Pro)プロリン。The following three letters of the alphabet used in the present specification mean a natural L-amino acid: (Gly)
Glycine, (Ala) alanine, (Val) valine,
(Leu) leucine, (Ile) isoleucine, (Se
r) serine, (Thr) threonine, (Asp) aspartic acid, (Glu) glutamic acid, (Asn) asparagine, (Gln) glutamine, (Lys) lysine,
(Arg) arginine, (Cys) cysteine, (Me
t) methionine, (Phe) phenylalanine, (Ty
r) tyrosine, (Trp) tryptophan, (His)
Histidine, (Pro) proline.
【0009】この明細書では、個々の変異型CCアシラ
ーゼの命名について、この分野の学会で広く用いられて
いる次のような命名法を便宜的に採用する。即ち、天然
型CCアシラーゼのアミノ酸配列の170位のLys残
基をGlnで置換した変異型CCアシラーゼは変異型C
CアシラーゼK170Qと命名され、ここでKは置換さ
れるLys残基の一文字記号を意味し、170は天然型
CCアシラーゼのアミノ酸配列の置換位置を意味し、Q
は前記Lys残基を置換したGlnの一文字記号を意味
する。In this specification, the following nomenclature, which is widely used by academic societies in this field, is adopted for the nomenclature of individual mutant CC acylases. That is, the mutant CC acylase in which the Lys residue at position 170 of the amino acid sequence of the natural CC acylase is replaced with Gln is a mutant C acylase.
C acylase K170Q, where K means the one-letter code of the Lys residue to be replaced, 170 means the substitution position of the amino acid sequence of the natural CC acylase, and Q
Means a one-letter symbol for Gln in which the Lys residue is substituted.
【0010】かかる特徴を有する本発明の変異型CCア
シラーゼのアミノ酸配列、ならびにそれをコードするD
NAのヌクレオチド配列の具体例を後記配列表に記す。
配列番号1は、プラスミドpCKK170Qで発現され
得る、変異型CCアシラーゼK170Qの前駆体をコー
ドするDNAのヌクレオチド配列およびそれから推定し
たアミノ酸配列を示す。The amino acid sequence of the mutant CC acylase of the present invention having such characteristics and D encoding the same
Specific examples of the nucleotide sequence of NA are shown in the sequence listing below.
SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding a precursor of mutant CC acylase K170Q, which can be expressed in plasmid pCKK170Q, and the amino acid sequence deduced therefrom.
【0011】本発明の変異型CCアシラーゼは、組換え
DNA技術やポリペプチド合成法等の当業者が通常用い
る方法を用いることにより調製することができる。The mutant CC acylase of the present invention can be prepared by using a method commonly used by those skilled in the art such as recombinant DNA technology and polypeptide synthesis method.
【0012】組換えDNA技術を用いる場合には、本発
明の変異型CCアシラーゼは、そのアミノ酸配列をコー
ドするDNAを含む発現ベクターで形質転換された宿主
細胞を培地中で培養し、該培養物から変異型CCアシラ
ーゼを採取することによって調製することができる。When the recombinant DNA technology is used, the mutant CC acylase of the present invention is prepared by culturing a host cell transformed with an expression vector containing a DNA encoding its amino acid sequence in a medium, Can be prepared by collecting the mutant CC acylase.
【0013】この過程について、その詳細を以下に詳し
く説明する。宿主細胞としては、微生物〔細菌(例え
ば、Escherichia coli,Bacillus subtilis など)、酵
母菌(例えば、Saccharomyces cerevisiaeなど)、動物
細胞系および培養植物細胞など〕が挙げられる。微生物
として好適には、細菌、特にEscherichia 属に属する菌
株(例えば E. coli JM109 ATCC 53323, E. coli HB101
ATCC 33694, E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. col
i 294 ATCC 31446 など)、酵母、特にSaccharomyces
属に属する菌株(例えば、Saccharomyces cerevisiae A
H22 )、動物細胞(例えばマウスL929細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣(CHO)細胞など)などが挙げ
られる。The details of this process will be described below. Examples of the host cell include microorganisms such as bacteria (eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis), yeasts (eg, Saccharomyces cerevisiae), animal cell lines and cultured plant cells). Preferable microorganisms include bacteria, in particular strains belonging to the genus Escherichia (for example, E. coli JM109 ATCC 53323, E. coli HB101).
ATCC 33694, E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. col
i 294 ATCC 31446), yeast, especially Saccharomyces
Strains belonging to the genus (eg Saccharomyces cerevisiae A
H22), animal cells (eg mouse L929 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, etc.) and the like.
【0014】細菌、特に E. coliを宿主細胞として用い
る場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター
−オペレーター領域、開始コドン、変異型CCアシラー
ゼのアミノ酸配列をコードするDNA、終止コドン、タ
ーミネーター領域および複製可能単位から構成される。
酵母または動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現
ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シ
グナルペプチドおよび変異型CCアシラーゼのアミノ酸
配列をコードするDNA、及び終止コドンを含んでいる
ことが好ましい。エンハンサー配列、変異型CCアシラ
ーゼの5’側及び3’側の非翻訳領域、スプライシング
接合部、ポリアデニレーション部位及び複製可能単位も
また発現ベクターに組み込むことが可能である。When a bacterium, particularly E. coli, is used as a host cell, the expression vector generally includes at least a promoter-operator region, a start codon, a DNA encoding the amino acid sequence of a mutant CC acylase, a stop codon, a terminator region and a replicable unit. Composed of.
When yeast or animal cells are used as host cells, the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, a signal peptide and a DNA encoding the amino acid sequence of mutant CC acylase, and a stop codon. Enhancer sequences, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of mutant CC acylases, splicing junctions, polyadenylation sites and replicable units can also be incorporated into expression vectors.
【0015】プロモーター−オペレーター領域は、プロ
モーター、オペレーター及び Shine-Dalgarno(SD) 配列
(例えば、AAGGなど)を含むものである。好ましく
はプロモーター−オペレーター領域は、常套的に用いら
れるプロモーター−オペレーター領域(例えば、E. col
i のPL−プロモーター及びtrp−プロモーター)及
びCCアシラーゼ N−176染色体遺伝子のプロモー
ターを含んでいてもよい。The promoter-operator region includes a promoter, an operator and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (for example, AAGG). Preferably the promoter-operator region is a conventionally used promoter-operator region (eg E. col.
i PL-promoter and trp-promoter) and a CC acylase N-176 chromosomal gene promoter.
【0016】酵母中で変異型CCアシラーゼを発現させ
るためのプロモーターとしては、S.cerevisiae の場
合、TRP1遺伝子、ADHIもしくはADHII遺伝
子、および酸ホスファターゼ(PH05)遺伝子のプロ
モーターが挙げられる。および哺乳動物細胞中で変異型
CCアシラーゼを発現させるためのプロモーターとして
は、SV40初期プロモーターまたは後期プロモータ
ー、HTLV−LTR−プロモーター、マウスメタロチ
オネインI(MMT)−プロモーター、ワクシニア−プ
ロモーターなどが含まれる。In the case of S. cerevisiae, the promoter for expressing the mutant CC acylase in yeast includes TRP1 gene, ADHI or ADHII gene, and acid phosphatase (PH05) gene promoter. The promoter for expressing the mutant CC acylase in mammalian cells includes SV40 early promoter or late promoter, HTLV-LTR-promoter, mouse metallothionein I (MMT) -promoter, vaccinia-promoter and the like.
【0017】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン(ATG)が含まれる。Suitable start codons include the methionine codon (ATG).
【0018】シグナルペプチドとしては、一般に使用さ
れる他の酵素のシグナルペプチド(天然型t−PAのシ
グナルペプチド、天然型プラスミノーゲンのシグナルペ
プチド)などが含まれる。The signal peptides include signal peptides of other commonly used enzymes (natural t-PA signal peptide, natural plasminogen signal peptide) and the like.
【0019】本発明の変異型CCアシラーゼのアミノ酸
配列をコードするDNAは、従来の方法で調製すること
ができる。例えば、DNA合成機を用いて一部のまたは
全てのDNAを合成したり、および/または形質転換体
〔例えば、 E. coli JM109(pCCN176−2) FER
M BP-3047 〕から得られる適切なベクター(例えば、p
CCN176−2)に挿入された天然型CCアシラーゼ
をコードする完全なDNA配列を適切な方法、例えば適
切な酵素(例えば、制限酵素、アルカリホスファター
ゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、DNAリガーゼ、DN
Aポリメラーゼなど)での処理に加えて、常套の変異方
法(例えば、カセット変異法〔徳永,Tら、Eur. J. Bi
ochem. Vol.153, p445-449 (1985) 参照〕、PCR変異
法〔樋口,Rら、Nucleic Acids Res. Vol.16, p7351-7
367 (1988)参照〕、クンケル法〔Kunkel, T. Aら. ,Me
thods Enzymol. Vol. 154, p367 (1987)など参照〕)の
ような適切な方法で処理することによって調製すること
ができる。The DNA encoding the amino acid sequence of the mutant CC acylase of the present invention can be prepared by a conventional method. For example, a DNA synthesizer is used to synthesize a part or all of the DNA, and / or a transformant [eg, E. coli JM109 (pCCN176-2) FER
M BP-3047], a suitable vector (eg p
The complete DNA sequence encoding the native CC acylase inserted into CCN176-2) is prepared by a suitable method, for example, a suitable enzyme (eg, restriction enzyme, alkaline phosphatase, polynucleotide kinase, DNA ligase, DN).
In addition to treatment with A polymerase, etc., conventional mutagenesis methods (eg, cassette mutagenesis [Tokunaga, T. et al., Eur. J. Bi.
Ochem. Vol.153, p445-449 (1985)], PCR mutation method [Higuchi, R et al., Nucleic Acids Res. Vol.16, p7351-7]
367 (1988)], Kunkel method [Kunkel, T. A. et al., Me.
thods Enzymol. Vol. 154, p367 (1987), etc.]).
【0020】終止コドンとしては、常用の終止コドン
(例えば、TAG、TGAなど)が含まれる。The stop codon includes a commonly used stop codon (eg, TAG, TGA, etc.).
【0021】ターミネーター領域としては、天然または
合成のターミネーター(例えば、合成fdファージター
ミネーターなど)が含まれる。The terminator region includes a natural or synthetic terminator (eg, synthetic fd phage terminator).
【0022】複製可能単位とは、宿主細胞中においてそ
の全DNA配列を複製することができる能力をもつDN
A化合物をいい、天然のプラスミド、人工的に修飾され
たプラスミド(例えば、天然のプラスミドから調製され
たDNAフラグメント)および合成プラスミドが含まれ
る。好適なプラスミドとしては、 E. coliではプラスミ
ドpBR322、もしくはその人工的修飾物(pBR3
22を適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグ
メント)が、酵母では酵母2μプラスミド、もしくは酵
母染色体DNAが、また哺乳動物細胞ではプラスミド p
RSVneo ATCC 37198 、プラスミド pSV2dhfr ATCC 3714
5、プラスミド pdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミド
pSV2neo ATCC 37149 などが挙げられる。A replication-competent unit is a DN having the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell.
Compound A refers to natural plasmids, artificially modified plasmids (eg, DNA fragments prepared from natural plasmids) and synthetic plasmids. A preferred plasmid is the plasmid pBR322 in E. coli, or its artificial modification (pBR3
DNA fragment obtained by treating 22 with an appropriate restriction enzyme) is yeast 2μ plasmid or yeast chromosomal DNA in yeast, or plasmid p in mammalian cells.
RSVneo ATCC 37198, plasmid pSV2dhfr ATCC 3714
5, plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, plasmid
Examples include pSV2neo ATCC 37149.
【0023】エンハンサー配列としては、SV40のエ
ンハンサー配列(72b.p.)が含まれる。The enhancer sequence includes the enhancer sequence of SV40 (72b.p.).
【0024】ポリアデニレーション部位としては、SV
40のポリアデニレーション部位が含まれる。As the polyadenylation site, SV
Forty polyadenylation sites are included.
【0025】スプライシング接合部位としては、SV4
0のスプライシング接合部位が含まれる。The splicing junction site is SV4
0 splicing junctions are included.
【0026】プロモーター、開始コドン、本発明の変異
型CCアシラーゼのアミノ酸配列をコードするDNA、
終止コドンおよびターミネーター領域は、連続的かつ環
状に適当な複製可能単位(プラスミド)に連結させるこ
とができ、この際所望により、常法(例えば、制限酵素
での消化、T4DNAリガーゼを用いるライゲーショ
ン)で適当なDNAフラグメント(例えば、リンカー、
他のレストリクションサイトなど)を用いることによ
り、発現ベクターが得られる。A promoter, a start codon, a DNA encoding the amino acid sequence of the mutant CC acylase of the present invention,
The stop codon and the terminator region can be ligated continuously and circularly to an appropriate replicable unit (plasmid), and if desired, by a conventional method (eg, digestion with a restriction enzyme, ligation using T4 DNA ligase). A suitable DNA fragment (eg, linker,
An expression vector can be obtained by using other restriction sites).
【0027】宿主細胞は、上述の発現ベクターを用いて
形質転換(形質移入)される。形質転換(形質移入)は
従来の方法(例えば、 E. coliは Kushner法、哺乳動物
細胞はリン酸カルシウム法、マイクロインジェクション
など)を用いて行うことができ、形質転換体(形質移入
体)が得られる。The host cell is transformed (transfected) with the above-mentioned expression vector. Transformation (transfection) can be performed by a conventional method (eg, Kushner method for E. coli, calcium phosphate method for mammalian cells, microinjection, etc.) to obtain a transformant (transfectant). .
【0028】本発明の工程で変異型CCアシラーゼを製
造するために、かくして得られた上記発現ベクターを含
む形質転換体は、栄養培養水溶液中で培養される。In order to produce the mutant CC acylase in the process of the present invention, the thus obtained transformant containing the above expression vector is cultivated in an aqueous nutrient culture solution.
【0029】栄養培地は、炭素源(例えば、グルコー
ス、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクト
ースなど)および無機窒素もしくは有機窒素源(例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水
分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプト
ン、ビーフ抽出物など)を含んでいてもよい。所望によ
り、他の栄養源〔例えば、無機塩(例えば、二リン酸ナ
トリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム)、ビタミン類(例えば、ビタミンB1 )、抗生物
質(例えば、アンピシリン、カナマイシン)など〕を培
地中に添加してもよい。哺乳動物細胞を培養するため
に、胎児ウシ血清および抗生物質を配合した Dulbecco'
s Modified Eagle's Minimum Essenntial Medium (DME
M) がしばしば用いられる。The nutrient medium includes carbon sources (eg glucose, glycerin, mannitol, fructose, lactose) and inorganic or organic nitrogen sources (eg ammonium sulfate, ammonium chloride, casein hydrolysates, yeast extract, polypeptone, bacto). Tryptone, beef extract, etc.). If desired, other nutritional sources [for example, inorganic salts (for example, sodium or potassium diphosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride), vitamins (for example, vitamin B1), Antibiotics (eg, ampicillin, kanamycin, etc.) may be added to the medium. Dulbecco 'with fetal bovine serum and antibiotics for culturing mammalian cells
s Modified Eagle's Minimum Essenntial Medium (DME
M) is often used.
【0030】形質転換体(形質移入体)の培養は、通常
pH5.5〜8.5(好適にはpH7〜7.5)、18
〜40℃(好適には20〜30℃)で5〜50時間実施
される。Cultivation of the transformant (transfectant) is usually pH 5.5 to 8.5 (preferably pH 7 to 7.5), 18
It is carried out at -40 ° C (preferably 20-30 ° C) for 5-50 hours.
【0031】かくして製造された変異型CCアシラーゼ
が培養液中に存在する場合は、その培養物を濾過または
遠心することにより、培養濾液(上清)を得る。変異型
CCアシラーゼは、該培養濾液から、天然または合成蛋
白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法
(例えば、透析、ゲル濾過、抗CCアシラーゼモノクロ
ーナル抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラ
フィー、適当な吸着材上でのカラムクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィーなど)を用いて精製す
ることができる。When the mutant CC acylase thus produced is present in the culture medium, the culture is filtered or centrifuged to obtain a culture filtrate (supernatant). The mutant CC acylase is a commonly used method for purifying and isolating a natural or synthetic protein from the culture filtrate (for example, dialysis, gel filtration, affinity column chromatography using anti-CC acylase monoclonal antibody, suitable Column chromatography on various adsorbents, high performance liquid chromatography, etc.).
【0032】製造された変異型CCアシラーゼが、培養
された形質転換体のペリプラズムおよび細胞質内に存在
する場合は、細胞を濾過および遠心により集め、当該細
胞の細胞壁および/または細胞膜を、例えば超音波およ
び/またはライソザイムで処理して、細胞破片を得る。
該細胞破片を適当な水溶液(例えば、8M尿素水溶液、
6Mグアニジウム塩水溶液)に溶解する。変異型CCア
シラーゼは、該水溶液から先に例示したような常法によ
り精製することができる。When the produced mutant CC acylase is present in the periplasm and cytoplasm of the transformed transformant, the cells are collected by filtration and centrifugation, and the cell wall and / or cell membrane of the cells are subjected to, for example, sonication. And / or treatment with lysozyme to obtain cell debris.
The cell debris is treated with a suitable aqueous solution (eg, 8M urea aqueous solution,
6M guanidinium salt solution). The mutant CC acylase can be purified from the aqueous solution by a conventional method as exemplified above.
【0033】本発明は更に、式:The invention further comprises the formula:
【0034】[0034]
【化3】 [Chemical 3]
【0035】(式中、R1 はアセトキシ、ヒドロキシま
たは水素を示す。R2 はカルボン酸アシルを示す。)で
示される化合物(II)またはその塩を、本発明の変異型C
CアシラーゼをコードするDNAを含む発現ベクターで
形質転換された微生物の培養物またはその処理物と接触
させて、式:(Wherein R 1 represents acetoxy, hydroxy or hydrogen, R 2 represents an acyl carboxylate), or a salt thereof is used as a mutant C of the present invention.
Contact with a culture of a microorganism transformed with an expression vector containing a DNA encoding C acylase or a treated product thereof to give a compound of the formula:
【0036】[0036]
【化4】 [Chemical 4]
【0037】(式中、R1 は前記と同意義である。)で
示される化合物(I) またはその塩の製造方法を提供する
ものである。The present invention provides a method for producing the compound (I) represented by the formula (wherein R 1 has the same meaning as defined above) or a salt thereof.
【0038】R2 で示されるカルボキン酸アシルとして
は、脂肪族、芳香族または複素環カルボン酸アシルが挙
げられ、その適切な例としては、アミノ基、カルボキシ
基、C1〜C6のアルカノイルアミノ基、ベンズアミド
基およびチエニル基等からなる群から選択される1つも
しくは2つの適当な置換基を有していてもよいC1〜C
6のアルカノイルが挙げられる。Examples of the carboquinate acyl represented by R 2 include an aliphatic, aromatic or heterocyclic carboxyl acyl, and suitable examples thereof include an amino group, a carboxy group, a C1-C6 alkanoylamino group and benzamide. C1 to C which may have one or two suitable substituents selected from the group consisting of groups and thienyl groups and the like.
6 is alkanoyl.
【0039】化合物(I)および化合物(II)の適当な
塩としては、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩、
カリウム塩、リチウム塩)が挙げられる。Suitable salts of compound (I) and compound (II) include alkali metal salts (for example, sodium salt,
Potassium salt, lithium salt).
【0040】CCアシラーゼ活性が通常形質転換細胞内
に存在するなら、培養物を処理して得られる物質(以
下、処理物という)としては、以下のものが例示され
る。If the CC acylase activity is usually present in the transformed cells, examples of the substance obtained by treating the culture (hereinafter referred to as the treated substance) are as follows.
【0041】(1)生細胞;濾過または遠心等の常法に
て培養物から分離される。 (2)乾燥細胞;上記(1) の生細胞を凍結乾燥または真
空乾燥等の常法により乾燥させることにより得られる。 (3)無細胞抽出物;上記(1) の生細胞または上記(2)
の乾燥細胞を常法(例えば、有機溶媒を用いた細胞の自
己消化、アルミナ、海砂などを用いた細胞の粉砕、また
は超音波にて細胞を処理すること)により破壊すること
により得られる。 (4)酵素溶液;上記(3) の無細胞抽出物を常法(例え
ば、カラムクロマトグラフィー)により精製または部分
精製することによって得られる。 (5)固定化細胞または酵素;上記(1) もしくは(2) の
細胞または上記(4) の酵素を常法(例えば、アクリルア
ミド、グラスビーズ、イオン交換樹脂などを用いた方
法)により固定化することにより調製される。(1) Live cells: isolated from the culture by a conventional method such as filtration or centrifugation. (2) Dry cells: Obtained by drying the live cells of (1) above by a conventional method such as freeze-drying or vacuum drying. (3) Cell-free extract; live cells of (1) above or (2) above
The dried cells can be obtained by disrupting the dried cells by a conventional method (for example, autolyzing the cells with an organic solvent, crushing the cells with alumina, sea sand, or treating the cells with ultrasonic waves). (4) Enzyme solution; obtained by purifying or partially purifying the cell-free extract of the above (3) by a conventional method (for example, column chromatography). (5) Immobilized cells or enzymes: The cells of (1) or (2) above or the enzyme of (4) above are immobilized by a conventional method (for example, a method using acrylamide, glass beads, ion exchange resin, etc.). It is prepared by
【0042】本発明の化合物(II)を酵素と接触させる
ことからなる反応は、水または緩衝液のような水性媒質
中で実施することができる。即ち、通常、化合物(II)
を含む水または緩衝液のような水性媒質中に、培養物ま
たはその処理物を溶解または懸濁することによって行わ
れる。The reaction consisting of contacting the compound (II) of the present invention with an enzyme can be carried out in an aqueous medium such as water or a buffer. That is, usually the compound (II)
Is carried out by dissolving or suspending the culture or a treated product thereof in an aqueous medium such as water or a buffer solution containing
【0043】該反応混液の好適なpH、化合物(II)の
濃度、反応時間および反応温度は、用いられる培養物ま
たはその処理物の性質によって変わりうる。一般に、該
反応はpH6〜10、好ましくはpH7〜9、5〜40
℃、好ましくは5〜37℃で0.5〜50時間実施され
る。The suitable pH of the reaction mixture, the concentration of compound (II), the reaction time and the reaction temperature may vary depending on the properties of the culture used or its treated product. Generally, the reaction is pH 6-10, preferably pH 7-9, 5-40.
It is carried out at 0 ° C, preferably 5 to 37 ° C for 0.5 to 50 hours.
【0044】反応混液中、基質としての化合物(II)の
濃度は、1〜100mg/mlの範囲で好適に選択する
ことができる。The concentration of the compound (II) as a substrate in the reaction mixture can be suitably selected within the range of 1 to 100 mg / ml.
【0045】このようにして製造された化合物(I)
は、上記反応混液から慣用の方法で精製、単離される。Compound (I) thus produced
Is purified and isolated from the above reaction mixture by a conventional method.
【0046】以下の実施例において、プラスミド、制限
酵素のような酵素、T4DNAリガーゼ、及び他の物質
は市販のものであり、常法に従って使用された。DNA
のクローニング、宿主細胞の形質転換、形質転換体の培
養、該培養物からのCCアシラーゼの採取などに用いら
れた操作は、当業者によく知られているものであるか、
もしくは文献から採用できるものである。In the following examples, plasmids, enzymes such as restriction enzymes, T4 DNA ligase, and other materials are commercially available and used according to conventional methods. DNA
The procedures used for the cloning of E. coli, transformation of host cells, cultivation of transformants, collection of CC acylase from the culture, etc. are well known to those skilled in the art,
Alternatively, it can be adopted from the literature.
【0047】[0047]
【実施例】以下の実施例は、本発明をより具体的に説明
することを目的として挙げられているものであり、本発
明はこれらにより何ら限定されるものではない。The following examples are given for the purpose of explaining the present invention more specifically, and the present invention is not limited thereto.
【0048】実施例1 trpプロモーター制御下での
天然型CCアシラーゼN176の発現ベクターの調製 (1)天然型CCアシラーゼN176のアンピシリン耐
性発現ベクターであるpCC002Aの構築: (i)pCC001Aの構築:プラスミドpCCN17
6−3(1.0μg)〔JOURNAL OF FERMENTATION AND
BIOENGINEERING, Vol. 72, p235 (1991)に、プラスミド
pCCN176−2(これは、常法により E. coli JM1
09 (pCCN176−2)FERM BP−3047か
ら入手可能である)からこのプラスミドを調製する方法
が記載されている〕を、EcoRI及びHindIII で
消化し、CCアシラーゼN176の全てのコーディング
領域を担持する2.9kbフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動によって単離した。一方、変異型t−PAの
発現ベクターであるpTQiPAΔtrp(1.0μ
g)、〔これは、常法により形質転換体であるE.co
liHB101−16(pTQiPAΔtrp)FER
M BP−1870から得ることができる。その調製方
法については、欧州特許出願公開明細書第302456
号に記載されている〕をEcoRI及びHindIII で
消化した。得られたtrpプロモーター、t−PAコー
ディング領域の一部分(Cys92からTrp113 )、及
びfdファージセントラルターミネーターの複写配列を
担持する4.3kbDNAを単離した。50mMのトリ
ス塩酸、10mM MgCl2 、10mMジチオスレイ
トール及び1mM ATPからなるライゲーション緩衝
液40μl中、T4DNAリガーゼ(300ユニット、
宝酒造製)の存在下、先に得られた2.9kbのDNA
フラグメントと当該4.3kbのDNAフラグメントを
混合して、16℃、5時間かけて結合させた。該結合物
を用いて、E.coliJM109を形質転換した。ア
ンピシリン耐性の形質転換体の一つからpCC001A
と命名する所望のプラスミドを取得し、制限酵素マッピ
ングにより、その特性を調べた。Example 1 Preparation of expression vector of natural CC acylase N176 under control of trp promoter (1) Construction of ampicillin resistant expression vector pCC002A of natural CC acylase N176: (i) Construction of pCC001A: plasmid pCCN17
6-3 (1.0 μg) [JOURNAL OF FERMENTATION AND
BIOENGINEERING, Vol. 72, p235 (1991), and the plasmid pCCN176-2 (this was prepared according to a conventional method using E. coli JM1
09 (pCCN176-2) (available from FERM BP-3047) has been described] and digested with EcoRI and HindIII to carry all coding regions of CC acylase N176. The .9 kb fragment was isolated by agarose gel electrophoresis. On the other hand, pTQiPAΔtrp (1.0 μm) which is an expression vector of mutant t-PA
g), [this is the transformant E. co
liHB101-16 (pTQiPAΔtrp) FER
It can be obtained from MBP-1870. For its preparation method, see European Patent Application Publication No. 302456.
Described in No.] was digested with EcoRI and HindIII. A 4.3 kb DNA carrying the resulting trp promoter, part of the t-PA coding region (Cys92 to Trp113), and the copy sequence of the fd phage central terminator was isolated. T4 DNA ligase (300 units, in 40 μl of ligation buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol and 1 mM ATP)
DNA of 2.9 kb previously obtained in the presence of Takara Shuzo
The fragment and the 4.3 kb DNA fragment were mixed and ligated at 16 ° C. for 5 hours. Using the conjugate, E. E. coli JM109 was transformed. From one of the transformants resistant to ampicillin, pCC001A
The desired plasmid, designated as, was obtained and characterized by restriction enzyme mapping.
【0049】(ii)pCC002Aの構築 (i) で得られたプラスミドpCC001Aは、trpプ
ロモーターとアシラーゼ遺伝子との間のt−PA遺伝子
の一部分(Cys92からTrp113 )を含む。この領域
を除去するために、pCC001A(1.0μg)をC
laI及びMluIで消化し、得られる6.1kbのD
NAフラグメントを単離した。一方、pCCN176−
3(1μg)をMluIおよびSau3AIで消化し、
アシラーゼのAsp7 からArg71間をコードする18
9bpのDNAを単離した。合成DNAオリゴマー00
2a及び002b(各々0.5nmol、表1参照)
を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(1.5ユニット、
宝酒造製)を用いて、緩衝液(キネーション緩衝液;5
0mMトリス塩酸、10mM MgCl2 、10mMD
TT、1.0mM ATP)中、37℃、1時間でリン
酸化し、該反応混合物を55℃で20分間加熱して酵素
を不活性化させた。その結果得られた混合物を、ライゲ
ーション緩衝液20μl中、T4DNAリガーゼ存在
下、15℃、3時間、先に得られた189bpのSau
3AI/MluI DNAフラグメントと混合して結合
させた。得られた結合物に、6.1kb ClaI/M
luIDNAフラグメントを添加し、その混合物を更に
追加したT4DNAリガーゼ(300ユニット)の存在
下で4℃、16時間インキュベーションした。その結果
得られた結合物を用いて、E.coliJM109を形
質転換した。これらの形質転換体の一つから、CCアシ
ラーゼN176の発現ベクターである所望のプラスミド
pCC002Aを単離して、制限酵素マッピングにより
その特性を調べた。(Ii) Construction of pCC002A The plasmid pCC001A obtained in (i) contains a part of the t-PA gene (Cys92 to Trp113) between the trp promoter and the acylase gene. To remove this region, pCC001A (1.0 μg) was added to C
6.1 kb D obtained by digestion with laI and MluI
The NA fragment was isolated. On the other hand, pCCN176-
3 (1 μg) was digested with MluI and Sau3AI,
18 that encodes the acylase between Asp7 and Arg71
A 9 bp DNA was isolated. Synthetic DNA oligomer 00
2a and 002b (0.5 nmol each, see Table 1)
To T4 polynucleotide kinase (1.5 units,
Using Takara Shuzo, a buffer (kination buffer; 5)
0 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mMD
Phosphorylation in TT, 1.0 mM ATP) at 37 ° C. for 1 hour, the reaction mixture was heated at 55 ° C. for 20 minutes to inactivate the enzyme. The resulting mixture was mixed with 20 μl of ligation buffer in the presence of T4 DNA ligase at 15 ° C. for 3 hours at 189 bp of Sau obtained above.
The 3AI / MluI DNA fragment was mixed and ligated. To the resulting conjugate, 6.1 kb ClaI / M
The luI DNA fragment was added and the mixture was incubated at 4 ° C. for 16 hours in the presence of additional T4 DNA ligase (300 units). The resulting conjugate was used to transform E. E. coli JM109 was transformed. The desired plasmid pCC002A, which is an expression vector for CC acylase N176, was isolated from one of these transformants, and its characteristics were examined by restriction enzyme mapping.
【0050】[0050]
【表1】 [Table 1]
【0051】(2)カナマイシン耐性CCアシラーゼN
176の発現ベクターであるpCK002の構築 プラスミドpCC002AをDraI(東洋紡績(株)
製)で消化した。その結果得られた混合液をフェノール
で処理して酵素を除去し、エタノールで沈澱させた。回
収されたDNAをライゲーション緩衝液20μlに懸濁
し、リン酸化されたEcoRIリンカー(2μg、ファ
ルマシア製)と混合してT4DNAリガーゼ(300ユ
ニット)とともに4℃で16時間インキュベーションし
た。該反応混合物をフェノールで抽出し、エタノールで
沈澱させた。回収したDNAをEcoRIで消化し、そ
の結果得られたアンピシリン耐性遺伝子を欠失した5.
6kbのDNAをアガロースゲル電気泳動によって単離
した。一方、プラスミドpA097(1μg)〔これ
は、形質転換体E.coliJM109(pAO97)
FERM BP−3772から常法により得ることがで
きる。〕をEcoRIで消化し、その結果カナマイシン
耐性遺伝子である1.2kbDNAを単離した。ライゲ
ーション緩衝液50μl中、T4DNAリガーゼ(30
0ユニット)を用いて、当該1.2kbのEcoRI
DNAを16℃、2時間反応させ、5.6kbのEco
RI DNAに結合させた。該結合物を用いてE.co
liJM109を形質転換し、抗生物質マーカーとして
カナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプラスミドp
CK002を得た。(2) Kanamycin resistant CC acylase N
Construction of pCK002, an expression vector of 176. Plasmid pCC002A was transformed with DraI (Toyobo Co., Ltd.).
Made). The resulting mixture was treated with phenol to remove the enzyme and precipitated with ethanol. The recovered DNA was suspended in 20 μl of ligation buffer, mixed with phosphorylated EcoRI linker (2 μg, manufactured by Pharmacia), and incubated with T4 DNA ligase (300 units) at 4 ° C. for 16 hours. The reaction mixture was extracted with phenol and precipitated with ethanol. 4. The recovered DNA was digested with EcoRI and the resulting ampicillin resistance gene was deleted.
A 6 kb DNA was isolated by agarose gel electrophoresis. On the other hand, plasmid pA097 (1 μg) [this was used as transformant E. coli JM109 (pAO97)
It can be obtained from FERM BP-3772 by a conventional method. ] Was digested with EcoRI, and as a result, 1.2 kb DNA which is a kanamycin resistance gene was isolated. T4 DNA ligase (30 μl) in 50 μl of ligation buffer
0 unit), the 1.2 kb EcoRI
The DNA is reacted at 16 ° C. for 2 hours and then 5.6 kb Eco
It was attached to RI DNA. Using the conjugate, E. co
liJM109 was transformed with the desired plasmid p carrying the kanamycin resistance gene as an antibiotic marker.
CK002 was obtained.
【0052】実施例2 CCアシラーゼN176の高発
現ベクターであるpCK013の構築 (1)pCC013Aの構築 (i)pCC007Aの構築 実施例1(1)(i) で得られたプラスミドpCC001
AをEcoRIおよびMluIで消化し、その結果得ら
れた6.4kbのDNAフラグメントをアガロースゲル
電気泳動により単離した。回収されたDNAを、予めリ
ン酸化しておいた合成DNAオリゴマー007a及び0
07b(各々0.5μg、表2参照)に、T4DNAリ
ガーゼ(300ユニット)を用いて16℃、5時間処理
し、結合させた。得られた混合物を用いてE.coli
JM109を形質転換し、所望のプラスミドpCC00
7Aを得た。Example 2 Construction of pCK013 which is a high expression vector of CC acylase N176 (1) Construction of pCC013A (i) Construction of pCC007A Plasmid pCC001 obtained in Example 1 (1) (i)
A was digested with EcoRI and MluI and the resulting 6.4 kb DNA fragment was isolated by agarose gel electrophoresis. Synthesized DNA oligomers 007a and 0, which have been phosphorylated in advance, on the recovered DNA.
07b (0.5 μg each, see Table 2) was treated with T4 DNA ligase (300 units) at 16 ° C. for 5 hours for binding. The resulting mixture was used to transform E. coli
Transformation of JM109 with desired plasmid pCC00
7A was obtained.
【0053】(ii)pCCNt013の構築 プラスミドpCC007A(1.0μg)をClaIと
BamHIで消化し、得られた6.1kbのDNAを5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。該
DNAを合成オリゴマー013aと013b(各々0.
5μg、それらの各々はリン酸化されている。表2参
照)に、T4DNAリガーゼ(300ユニット)を用い
て、結合した。該結合混合物を用いてE.coliJM
109を形質転換し、所望のプラスミドpCCNt01
3をアンピシリン耐性形質転換体から単離した。(Ii) Construction of pCCNt013 Plasmid pCC007A (1.0 μg) was digested with ClaI and BamHI, and the resulting 6.1 kb DNA was 5
% Polyacrylamide gel electrophoresis. The DNA was synthesized into synthetic oligomers 013a and 013b (0.
5 μg, each of which is phosphorylated. (See Table 2) was ligated with T4 DNA ligase (300 units). E. coli with the ligation mixture. coliJM
109 and transformed into the desired plasmid pCCNt01.
3 was isolated from ampicillin resistant transformants.
【0054】[0054]
【表2】 [Table 2]
【0055】(iii) pCC013Aの構築 プラスミドpCCNt013をBamHIとMluIで
消化し、その結果得られる6.1kbのDNAを単離し
た。一方、実施例1(1)(ii)で得られたpCC002
A(1.0μg)をMluIとSau3AIで消化して
189bpのDNAフラグメントを取得した。得られた
DNAをT4DNAリガーゼ(300ユニット)を用い
て、6.1kbのBamHI/MluIのDNAフラグ
メントに結合し、該結合混合物を用いてE.coliJ
M109を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換
体の一つから、ATリッチなNH2 末端側DNA配列
(天然型CCアシラーゼN176のアミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列をコードする)をもつ所望のプラスミド
pCC013Aを単離した。(Iii) Construction of pCC013A The plasmid pCCNt013 was digested with BamHI and MluI, and the resulting 6.1 kb DNA was isolated. On the other hand, pCC002 obtained in Example 1 (1) (ii)
A (1.0 μg) was digested with MluI and Sau3AI to obtain a 189 bp DNA fragment. The resulting DNA was ligated to the 6.1 kb BamHI / MluI DNA fragment using T4 DNA ligase (300 units) and the ligation mixture was used to E. coliJ
M109 was transformed. From one of the ampicillin-resistant transformants, the desired plasmid pCC013A having the AT-rich NH 2 -terminal DNA sequence (encoding the same amino acid sequence as the amino acid sequence of native CC acylase N176) was isolated.
【0056】(2)天然型CCアシラーゼN176のカ
ナマイシン耐性発現ベクターであるpCK013の構築 (i)pΔN176の構築 実施例1(2)で得られたプラスミドpCK002
(1.0μg)をAatII(東洋紡績(株)製)で消化
し、得られたDNAを自己結合させる為にT4DNAリ
ガーゼ(150ユニット)で処理した。かかる結合混合
物を用いてE.coliJM109を形質転換し、ユニ
ークなAatII制限酵素切断部位を担持する所望のプラ
スミドpΔN176を取得した。(2) Construction of pCK013 which is a kanamycin resistant expression vector of natural CC acylase N176 (i) Construction of pΔN176 Plasmid pCK002 obtained in Example 1 (2)
(1.0 μg) was digested with AatII (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and treated with T4 DNA ligase (150 units) for self-ligation of the obtained DNA. With such a ligation mixture E. E. coli JM109 was transformed to obtain the desired plasmid pΔN176 carrying a unique AatII restriction enzyme cleavage site.
【0057】(ii)pCK013の構築 プラスミドpΔN176(1.0μg)をAatIIで消
化し、直線化したDNAを細菌由来のアルカリホスファ
ターゼ(1ユニット、宝酒造製)で、100mMトリス
塩酸緩衝液(pH8.0)中、42℃にて1時間処理し
た。その脱リン酸化されたDNAを単離して、T4DN
Aリガーゼを用いてpCC013A由来の2.5kbの
AatII DNAフラグメントに結合した。該結合混合
物を用いてE.coliJM109を形質転換し、マー
カーとしてカナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプ
ラスミドpCK013を取得した。(Ii) Construction of pCK013 Plasmid pΔN176 (1.0 μg) was digested with AatII and the linearized DNA was treated with a bacterial alkaline phosphatase (1 unit, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). ), And was treated at 42 ° C. for 1 hour. The dephosphorylated DNA was isolated and labeled with T4DN
A ligase was used to ligate to the 2.5 kb AatII DNA fragment from pCC013A. E. coli with the ligation mixture. E. coli JM109 was transformed to obtain a desired plasmid pCK013 carrying a kanamycin resistance gene as a marker.
【0058】実施例3 CCアシラーゼN176をコー
ドするDNAのクンケル法によるポイントミューテーシ
ョン (1)CCアシラーゼN176をコードするDNAのM
13ファージへのサブクローニング (i)mp18p183の調製 実施例2(1)(iii) で得られたプラスミドpCC01
3AをHpaIおよびEco47IIIで消化し、CC
アシラーゼN176のThr1からAla374までをコー
ドする1162bpのDNAを単離した。該DNAを、
HincIIで消化されたM13mp18に、T4DN
Aリガーゼを用いて連結し、該結合混合物を用いてE.
coliJM109を形質転換した。プラークのうちの
一つから、所望のRF DNA mp18p183を単
離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。一
方、菌体を除いた培地画分(ファージ粒子を含む)から
ファージ溶液を調製し、得られたファージ溶液は使用す
るまで4℃で保存した。Example 3 Point mutation of the DNA encoding CC acylase N176 by the Kunkel method (1) M of the DNA encoding CC acylase N176
Subcloning into 13 phage (i) Preparation of mp18p183 Plasmid pCC01 obtained in Example 2 (1) (iii)
3A was digested with HpaI and Eco47III, CC
A 1162 bp DNA encoding Thr1 to Ala374 of acylase N176 was isolated. The DNA is
To M13mp18 digested with HincII, T4DN
A. ligase was used to ligate and the ligation mixture was used to transform E.
E. coli JM109 was transformed. The desired RF DNA mp18p183 was isolated from one of the plaques and characterized by restriction enzyme mapping. On the other hand, a phage solution was prepared from the medium fraction (containing phage particles) excluding the cells, and the obtained phage solution was stored at 4 ° C until use.
【0059】(ii)一本鎖U−mp18p183−SS
の調製(Kunkel, T.A. et al., Methods Enzyml. 154,
367 参照) :E.coliCJ236(dut−,un
g−,F’)(バイオ・ラッドラボラトリーズ製)のシ
ングルコロニーをクロラムフェニコール(30μg/m
l)を含有する2XTYブロス2ml中で37℃、16
時間培養した。細胞(0.1ml)を30μg/mlク
ロラムフェニコールを含有する新鮮な2XTYブロス
(50ml)に移し、37℃で培養を継続した。600
nmでの吸光度が0.3に達したとき、該培養物にmp
18p183のファージ溶液(MOI<0.2)を添加
し、さらに5時間培養を続けた。得られた培養物を4
℃、17,000×gで15分間遠心をした後、再び上
清を遠心した。その結果得られた上清(30ml)を室
温下、30分間RNase(150μg/ml,シグマ
社製)で処理し、7.5mlのPEG溶液(3.5M
NH4 OAcの20%ポリエチレングリコール8,00
0溶液)を添加した。遠心(17,000×g,15
分,4℃)後、残渣を300mM NaCl,100m
Mトリス塩酸(pH8.0)及び0.1mM EDTA
からなる緩衝液200μlに懸濁した。得られた溶液を
フェノール200μlおよびフェノール/CHCl
3 (1/1)200μlで抽出し、続いてCHCl
3 (200μl)で2回洗浄した。該溶液に、7.5M
NH4 OAc(100μl)とエタノール(600μ
l)を添加してファージDNAを沈澱させた。該DNA
を遠心により回収し、氷冷90%エタノール700μl
で洗浄し、真空下で乾燥させた。精製された1本鎖U−
DNA(U−mp18p183−SS)をTE緩衝液2
0μlで懸濁し、使用するまで4℃で保存した。(Ii) Single-stranded U-mp18p183-SS
(Kunkel, TA et al., Methods Enzyml. 154,
367): E. coli CJ236 (dut-, un
g-, F ') (Bio-Rad Laboratories) single colony was chloramphenicol (30 μg / m
1) in 2 ml 2XTY broth at 37 ° C, 16
Cultured for hours. The cells (0.1 ml) were transferred to fresh 2XTY broth (50 ml) containing 30 μg / ml chloramphenicol and the culture was continued at 37 ° C. 600
When the absorbance at nm reached 0.3, the culture was mp
18p183 phage solution (MOI <0.2) was added, and the culture was continued for further 5 hours. 4 of the resulting culture
After centrifugation at 17,000 xg for 15 minutes at 0 ° C, the supernatant was centrifuged again. The resulting supernatant (30 ml) was treated with RNase (150 μg / ml, Sigma) for 30 minutes at room temperature, and 7.5 ml of PEG solution (3.5 M) was added.
NH 4 OAc 20% polyethylene glycol 8,000
0 solution) was added. Centrifuge (17,000 xg, 15
Min, 4 ° C.), the residue is treated with 300 mM NaCl, 100 m
M Tris-HCl (pH 8.0) and 0.1 mM EDTA
Was suspended in 200 μl of a buffer solution consisting of 200 μl of phenol and phenol / CHCl were added to the resulting solution.
3 (1/1) 200 μl extraction followed by CHCl
It was washed twice with 3 (200 μl). To the solution, 7.5M
NH 4 OAc (100 μl) and ethanol (600 μl
1) was added to precipitate the phage DNA. The DNA
Were collected by centrifugation and 700 μl of ice-cold 90% ethanol
Washed with and dried under vacuum. Purified single-stranded U-
DNA (U-mp18p183-SS) in TE buffer 2
Suspended in 0 μl and stored at 4 ° C until use.
【0060】(2)変異型CCアシラーゼK170Qを
コードするRF DNAの調製 (i)オリゴデオキシリボヌクレオチドSO−K170
Qの合成 DNAオリゴマーSO−K170Q(5’AGCGCC
AGCATGCGCCAGAGCTGGAACCACA
C 3’)を392A型DNA合成機(アプライドバイ
オシステムズ社製)を用いて合成した。そのDNAを、
CPG(controlled pore glass)ポリマー支持体から2
8%アンモニア水で遊離し、その後60℃で9時間加熱
することにより全保護基を除去した。その反応混合物を
真空下で減圧留去し、残渣をTE緩衝液〔10mMトリ
ス塩酸(pH7.4)−1mMEDTA〕200μlに
溶解した。得られた粗DNA溶液を、逆相HPLC〔カ
ラム; COSMOSIL C18, 4.6 mm ×150 mm(ナカライテス
ク)、溶離液;A:0.1M トリエチルアンモニウム
酢酸緩衝液(pH7.2〜7.4)、B:アセトニトリ
ル、グラジェント;開始:A(100%)、終わり:A
(60%)+B(40%)、25分間直線グラジェン
ト、流速;1.2 ml/min 〕に付した。目的のDNAオ
リゴマーを含む溶出液を集め、真空下で減圧留去した。
精製されたDNAをTE緩衝液200μlに溶解し、使
用まで−20℃で保存した。(2) Preparation of RF DNA encoding mutant CC acylase K170Q (i) Oligodeoxyribonucleotide SO-K170
Synthesis of Q DNA oligomer SO-K170Q (5'AGCGCC
AGCATGCGCCAGAGCTTGGAACCACA
C3 ′) was synthesized using a 392A type DNA synthesizer (manufactured by Applied Biosystems). The DNA
From CPG (controlled pore glass) polymer support 2
It was liberated with 8% aqueous ammonia and then heated at 60 ° C. for 9 hours to remove all protecting groups. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure under vacuum, and the residue was dissolved in 200 μl of TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.4) -1 mM EDTA]. The obtained crude DNA solution was subjected to reverse-phase HPLC [column; COSMOSIL C18, 4.6 mm x 150 mm (Nacalai Tesque), eluent; A: 0.1 M triethylammonium acetate buffer (pH 7.2-7.4), B: acetonitrile, gradient; start: A (100%), end: A
(60%) + B (40%), linear gradient for 25 minutes, flow rate; 1.2 ml / min]. The eluate containing the target DNA oligomer was collected and evaporated under reduced pressure under vacuum.
The purified DNA was dissolved in 200 μl of TE buffer and stored at −20 ° C. until use.
【0061】(ii)オリゴデオキシリボヌクレオチドの
リン酸化 DNAオリゴマーSO−K170Q(約167pmo
l)を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(4.5ユニッ
ト、宝酒造製)を用いて、50mMトリス塩酸(pH
7.8)、10mM MgCl2 、20mMジチオスレ
イトール(DTT)、1mM ATP及び50μg/m
lウシ血清アルブミン(BSA)からなるライゲーショ
ン緩衝液30μl中で、37℃で1時間リン酸化した。(Ii) Phosphorylation of oligodeoxyribonucleotides DNA oligomer SO-K170Q (about 167 pmo
l) using T4 polynucleotide kinase (4.5 units, manufactured by Takara Shuzo), 50 mM Tris-HCl (pH
7.8) 10 mM MgCl 2 , 20 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM ATP and 50 μg / m
Phosphorylation was carried out at 37 ° C. for 1 hour in 30 μl of a ligation buffer containing 1 bovine serum albumin (BSA).
【0062】(iii)アニーリング反応 10mMトリス塩酸(pH8.0)、6mM MgCl
2 及び40mM NaClからなる緩衝液9μl中にお
いて、(ii)でリン酸化されたオリゴマー(1μl、約
5.6pmol)を鋳型U−mp18p183−SS
(0.10pmol、約250ng)と混合した。該混
合物を70℃、5分間加熱して、その後40分かけて3
0℃で冷却して0℃で静置した。(Iii) Annealing reaction 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 6 mM MgCl 2
The oligomers phosphorylated in (ii) (1 μl, about 5.6 pmol) were templated U-mp18p183-SS in 9 μl of a buffer consisting of 2 and 40 mM NaCl.
(0.10 pmol, about 250 ng). The mixture is heated at 70 ° C. for 5 minutes, then 3 minutes over 40 minutes.
It cooled at 0 degreeC and stood at 0 degreeC.
【0063】(iv)in vitroでの2重鎖DNA
の合成 得られたアニーリング溶液(10μl)を、合成緩衝液
〔200mMトリス・塩酸(pH8.0)−40mM
MgCl2 〕1μl、5mM dNTP(dATP,d
CTP,dGTPおよびdTTP)1μl、T4DNA
リガーゼ(300ユニット、宝酒造製)およびT4DN
Aポリメラーゼ(10ユニット、ファルマシア)と混合
した。該混合物を氷上で5分間、25℃で5分間、さら
に37℃で90分間、順次インキューベーションした。
10mMトリス塩酸(pH8.0)および10mM E
DTAからなる緩衝液90μlを添加して、反応を停止
させた。(Iv) Double-stranded DNA in vitro
Synthesis of the obtained annealing solution (10 μl) was added to a synthesis buffer [200 mM Tris / HCl (pH 8.0) -40 mM
MgCl 2 ] 1 μl, 5 mM dNTP (dATP, d
CTP, dGTP and dTTP) 1 μl, T4 DNA
Ligase (300 units, Takara Shuzo) and T4DN
Mixed with A polymerase (10 units, Pharmacia). The mixture was sequentially incubated on ice for 5 minutes, 25 ° C. for 5 minutes, and 37 ° C. for 90 minutes.
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 10 mM E
The reaction was stopped by adding 90 μl of buffer consisting of DTA.
【0064】(v)E.coliJM109の形質転換 (iv)で得られた合成DNA溶液のうち3μlをE.c
oliJM109のコンピテントセル(200μl)に
添加し、該セルを氷上で30分間インキュベーションし
て、形質転換体を得た。一方、E.coliJM109
のシングルコロニーをLブロス(2ml)中で16時間
培養した。該培養物(0.1ml)を新鮮なLブロス
(2ml)に移し、更に2時間培養して、インディケー
ターセルを取得した。形質転換された細胞(200μ
l)に、インディケーターセル(200μl)を加え
て、それらを55℃で前加熱したH−Top寒天(1%
バクトトリプトン、0.8%NaCl、0.8%寒天)
3mlと混合した。該細胞−寒天混合物をHプレート
(1%バクトトリプトン、0.5% NaCl、1.5
%寒天)上に延展し、そのプレートを37℃で16時間
培養した。(V) E. Transformation of E. coli JM109 3 μl of the synthetic DNA solution obtained in (iv) was transformed into E. coli. c
It was added to competent cells (200 μl) of oliJM109, and the cells were incubated on ice for 30 minutes to obtain transformants. On the other hand, E. coliJM109
Single colony of was cultured in L broth (2 ml) for 16 hours. The culture (0.1 ml) was transferred to fresh L broth (2 ml) and further cultured for 2 hours to obtain an indicator cell. Transformed cells (200μ
1) to H-Top agar (1% by adding indicator cells (200 μl) and preheating them at 55 ° C.)
Bactrypton, 0.8% NaCl, 0.8% agar)
Mixed with 3 ml. The cell-agar mixture was placed on an H plate (1% bactotryptone, 0.5% NaCl, 1.5%).
% Agar) and the plates were incubated at 37 ° C. for 16 hours.
【0065】(vi)形質転換体から得られたRF DN
Aの特性 E.coliJM109のシングルコロニーを2XTY
ブロス(1.6%バクトトリプトン、1%酵母抽出物、
0.5%NaCl)2ml中で16時間培養した。該培
養物(0.1ml)を新しい2XTYブロス(2ml)
に移し、更に2時間培養した。ステップ(iv)で調製さ
れたプレートのプラークを竹製爪楊枝(15cm)で拾
い、爪楊枝を直ちに先に培養した2XTYブロスに移し
た。培養を37℃、5〜6時間続けた。該培養物1ml
から、室温下15秒、10,000rpmで遠心するこ
とにより、細胞を収集し、上清(次の実験でのRF D
NAの大量調製のために使用されるファージ溶液)につ
いては、使用するまで4℃で保存した。該細胞をGTE
緩衝液〔50mMグルコース、25mMトリス塩酸(p
H8.0)、25mM EDTA〕100μlに懸濁
し、アルカリ−SDS溶液(0.2N NaOH、1%
SDS)200μlと緩やかに混合し、そしてボルテッ
クスTMミキサーを用いて高塩緩衝液(3M KOA
c、3M AcOH)150μlと激しく混合した。得
られた混合液を室温で5分間、10,000rpmで遠
心した。得られた上清(400μl)をイソプロピルア
ルコール300μlで処理し、10,000rpmで5
分間遠心した。その上層部(300μl)を分離し、エ
タノール600μlと混合した。その混液を遠心(1
0,000rpm、5分)した後、得られた沈澱を氷冷
70%エタノール500μlで洗浄し、真空下で乾燥
し、RNase(シグマ社製)1μg/mlを含有する
TE緩衝液50μlに懸濁し、RF DNA mp18
p183K170Q溶液を得た。該RFDNA溶液の一
部分(10μl)をSphIを用いた制限エンドヌクレ
アーゼマッピングに用いた。これは、変異を調べるた
め、DNAオリゴマーSO−K170Qがその配列中に
SphI認識部位を計画的に含んでいることによる。(Vi) RF DN obtained from the transformant
Characteristics of A. E. 2XTY single colony of E. coli JM109
Broth (1.6% bactotryptone, 1% yeast extract,
Cultured in 2 ml of 0.5% NaCl) for 16 hours. The culture (0.1 ml) was replaced with fresh 2XTY broth (2 ml).
And further cultured for 2 hours. The plaques on the plate prepared in step (iv) were picked up with a bamboo toothpick (15 cm), and the toothpick was immediately transferred to the previously cultured 2XTY broth. Culturing was continued at 37 ° C. for 5 to 6 hours. 1 ml of the culture
Cells were collected by centrifugation at 10,000 rpm for 15 seconds at room temperature, and the supernatant (RF D in the next experiment
The phage solution used for large-scale preparation of NA) was stored at 4 ° C. until use. GTE the cells
Buffer solution [50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (p
H8.0), 25 mM EDTA] 100 μl, and suspended in an alkali-SDS solution (0.2 N NaOH, 1%
SDS) gently mixed with 200 μl and high salt buffer (3M KOA) using a Vortex ™ mixer.
c, 3M AcOH). The resulting mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at room temperature. The obtained supernatant (400 μl) was treated with 300 μl of isopropyl alcohol, and the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes.
Centrifuge for minutes. The upper layer (300 μl) was separated and mixed with 600 μl of ethanol. Centrifuge the mixture (1
(10,000 rpm, 5 minutes), the obtained precipitate was washed with 500 μl of ice-cold 70% ethanol, dried under vacuum, and suspended in 50 μl of TE buffer containing 1 μg / ml of RNase (manufactured by Sigma). , RF DNA mp18
A p183K170Q solution was obtained. A portion (10 μl) of the RFDNA solution was used for restriction endonuclease mapping with SphI. This is because the DNA oligomer SO-K170Q intentionally contains an SphI recognition site in its sequence to investigate mutations.
【0066】実施例4 発現ベクターpCKK170Q
の構築 実施例3で得られたRF DNA(mp18p183K
170Qと表示)(10μg)をMluI(5ユニッ
ト、東洋紡績(株)製)およびBstBI(5ユニッ
ト、ニューイングランドバイオラボ(株)製)で消化し
た。得られた582bpのDNAフラグメントを0.8
%のアガロースゲル電気泳動にかけて消化混合物から単
離した。一方、実施例2(2)で得られたpCK013
(10μg)をMluI(5ユニット)およびBstB
I(5ユニット)で消化し、5697bpのDNAフラ
グメントを単離した。582bpと5697bpのMl
uI/BstBI DNAをライゲーション緩衝液20
μl中で4℃、16時間条件で連結した。該ライゲーシ
ョン混合物を用いてE.coliJM109を形質転換
した。カナマイシン耐性の形質転換体の一つから、pC
KK170Qと称する所望のプラスミドを単離し、制限
エンドヌクレアーゼ消化により、その特性を調べた(図
1参照)。Example 4 Expression vector pCKK170Q
Construction of RF DNA (mp18p183K) obtained in Example 3
170Q) (10 μg) was digested with MluI (5 units, Toyobo Co., Ltd.) and BstBI (5 units, New England Biolabs Co., Ltd.). The obtained 582 bp DNA fragment was added to 0.8
% Of the agarose gel and isolated from the digestion mixture. On the other hand, pCK013 obtained in Example 2 (2)
(10 μg) with MluI (5 units) and BstB
Digested with I (5 units) and the 5697 bp DNA fragment was isolated. Ml of 582bp and 5697bp
Add uI / BstBI DNA to ligation buffer 20
Ligation was performed in 4 μl for 16 hours at 4 ° C. E. coli with the ligation mixture. E. coli JM109 was transformed. From one of the kanamycin resistant transformants, pC
The desired plasmid, designated KK170Q, was isolated and characterized by restriction endonuclease digestion (see Figure 1).
【0067】実施例5 変異型CCアシラーゼK170
QをコードするDNA配列 pCKK170Qの配列を373A型DNAシークエン
サー(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、直
接、Dye DeoxyTM法にて決定した。決定された
配列は予想されたものと一致していた。当該pCKK1
70Qで発現され得る変異型CCアシラーゼK170Q
の前駆体をコードするDNAの塩基配列、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号1に示す。Example 5 Mutant CC acylase K170
DNA sequence encoding Q The sequence of pCKK170Q was directly determined by the Dye Deoxy ™ method using a 373A type DNA sequencer (manufactured by Applied Biosystems). The determined sequence was in agreement with what was expected. The pCKK1
Mutant CC acylase K170Q that can be expressed in 70Q
The nucleotide sequence of the DNA encoding the precursor of and the amino acid sequence deduced therefrom is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
【0068】実施例6 形質転換体(E.coliJM
109/pCKK170Q)の培養 E.coliJM109をpCKK170Qで形質転換
して調製された形質転換体であるE.coliJM10
9/pCKK170Qのグリセロールストック(1m
l)を、50μg/mlアンピシリン含有100mlL
ブロス(1%バクトトリプトン、0.5%酵母抽出物、
0.5% NaCl、pH7.4)に移し、該混合物を
30℃で8時間培養した。該培養物(0.2ml)を5
0μg/mlアンピシリン含有20mlMSブロス
(1.2%バクトトリプトン、2.4%酵母抽出物、
1.25%グリセロール、0.11%ロイシン、0.1
1%プロリン、0.11%イソロイシン、1.25%
K2 HPO4 、0.38% KH2PO4 、50μg/
mlチアミン・塩酸、2mM MgSO4 ・7H2 O、
0.2mM CaCl2 ・2H2 O、0.05mM F
eSO4 ・7H2 O)に添加し、該混合液を30℃で1
6時間培養した。得られた培養物(3.4ml)を、1
%のグリセロールと25μg/mlのアンピシリンを含
む2%M9CAブロス(2%カザミノ酸、1.52%
Na2 HPO4 ・12H2 O、0.3% KH 2 P
O4 、0.1% NH4 Cl、0.05% NaCl、
2mM MgSO4・7H2 O、0.2mM CaCl
2 ・2H2 O、50μg/mlチアミン・塩酸、pH
7.2)に添加し、その混合液を20℃で激しく振盪し
ながら培養した(350−400rpm/min)。8
時間目に、3−インドールアクリル酸を最終濃度が20
μg/mlになるように該培養物に添加し、更に40時
間培養を継続した。得られた培養物のうち20mlを4
℃下、7,000rpmで5分間遠心することにより、
細胞を集め、それをTE緩衝液(pH8.0)20ml
に懸濁し、超音波処理により破砕した。該破砕物を、4
℃、15,000rpmで20分間遠心して不溶解物質
を除去した。得られた上清は4℃で保存され、GL−7
ACAアシラーゼ活性を測定するために、及び変異型C
CアシラーゼK170Qを調製するために使用された。Example 6 Transformant (E. coli JM
109 / pCKK170Q) culture E. Transformation of E. coli JM109 with pCKK170Q
The transformant E. coli JM10
9 / pCKK170Q glycerol stock (1m
l), 100 μl containing 50 μg / ml ampicillin
Broth (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract,
0.5% NaCl, pH 7.4) and the mixture is
It was cultured at 30 ° C. for 8 hours. 5 times the culture (0.2 ml)
20 ml MS broth containing 0 μg / ml ampicillin
(1.2% bactotryptone, 2.4% yeast extract,
1.25% glycerol, 0.11% leucine, 0.1
1% proline, 0.11% isoleucine, 1.25%
K2HPOFour, 0.38% KH2POFour, 50 μg /
ml thiamine / hydrochloric acid, 2mM MgSOFour・ 7H2O,
0.2 mM CaCl2・ 2H2O, 0.05 mM F
eSOFour・ 7H2O), and the mixture at 30 ° C for 1
Cultured for 6 hours. The obtained culture (3.4 ml) was added to 1
% Glycerol and 25 μg / ml ampicillin
2% M9CA broth (2% casamino acid, 1.52%
Na2HPOFour・ 12H2O, 0.3% KH 2P
OFour, 0.1% NHFourCl, 0.05% NaCl,
2 mM MgSOFour・ 7H2O, 0.2 mM CaCl
2・ 2H2O, 50 μg / ml thiamine / hydrochloric acid, pH
7.2) and shake the mixture vigorously at 20 ° C.
While culturing (350-400 rpm / min). 8
At the hour, the final concentration of 3-indole acrylic acid was 20
Add to the culture so that it becomes μg / ml, and further 40 hours
The culture was continued. 20 ml of the obtained culture is 4
By centrifuging at 7,000 rpm for 5 minutes at ℃,
Collect cells and use it in 20 ml TE buffer (pH 8.0)
And suspended by sonication. The crushed material is 4
Insoluble substances by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes at ℃
Was removed. The resulting supernatant was stored at 4 ° C and used for GL-7
For measuring ACA acylase activity and for mutant C
It was used to prepare C acylase K170Q.
【0069】実施例7 アシラーゼの精製と特性 (1)変異型CCアシラーゼK170Qの精製 培養物20mlから得られたE.coliJM109/
pCKK170Qの破砕物(20ml)に、硫酸アンモ
ニウム(4.18g、最終濃度:35%飽和)を添加
し、該混合物を室温で20分間攪拌した。得られた混合
液を遠心(20℃、15,000rpm、20分間)
し、上清を集めて硫酸アンモニウム処理した(5.56
g、最終濃度:75%飽和)。遠心(20℃、15,0
00rpm、20分間)により沈澱物を集め、それを1
00mMトリス塩酸(pH9.0)5mlに溶解した。
得られた溶液を4℃で100mMトリス塩酸緩衝液各々
4Lに対して2回の透析を行った。得られた透析物をM
illex−HVTM(0.45μm、ミリポア)で濾過
し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した〔カラ
ム;TSKgelTM DEAE TOYOPEARL−
5PW(東ソー)、溶離液;A:20mMトリス塩酸
(pH8.0)、B:0.5M NaCl−トリス塩酸
(pH8.0)、グラジェント;始め:A(80%)+
B(20%)、終わり(30分後):A(50%)+B
(50%)、流速;1.0ml/min〕。約0.16
M濃度のNaCl溶液と共に溶出したメインピークを集
め、4Lの20mMトリス塩酸(pH9.0)に対して
透析して、精製された変異型CCアシラーゼK170Q
を得た。Example 7 Purification and properties of acylase (1) Purification of mutant CC acylase K170Q E. coli obtained from 20 ml of the culture. coliJM109 /
Ammonium sulfate (4.18 g, final concentration: 35% saturated) was added to the crushed product of pCKK170Q (20 ml), and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. Centrifuge the resulting mixture (20 ° C, 15,000 rpm, 20 minutes)
The supernatant was collected and treated with ammonium sulfate (5.56).
g, final concentration: 75% saturation). Centrifuge (20 ℃, 15.0
(00 rpm, 20 minutes) to collect the precipitate,
It was dissolved in 5 ml of 00 mM Tris-HCl (pH 9.0).
The resulting solution was dialyzed twice at 4 ° C. against 4 L each of 100 mM Tris-HCl buffer. The dialyzed product obtained is M
illex-HV ™ (0.45 μm, Millipore) and purified by high performance liquid chromatography [column; TSKgel ™ DEAE TOYOPEARL-
5PW (Tosoh), eluent; A: 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), B: 0.5 M NaCl-Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), gradient; Start: A (80%) +
B (20%), end (after 30 minutes): A (50%) + B
(50%), flow rate; 1.0 ml / min]. About 0.16
The main peak eluted with the M concentration of NaCl solution was collected and dialyzed against 4 L of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 9.0) to purify the mutant CC acylase K170Q.
Got
【0070】精製されたCCアシラーゼK170Qを逆
相HPLCカラム〔COSMOSIL4.6mm×50
mm(ナカライテスク製)、溶離液;A:0.05%ト
リフルオロ酢酸(TFA)、B:60%アセトニトリル
含有0.05%TFA、グラジェント;開始:A(40
%)+B(60%)、終わり(20分後):A(0%)
+B(100%)〕、およびドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)
で分析した。そのようにして得られたCCアシラーゼK
170Qの純度は、HPLC及びSDS−PAGEによ
り、約95%であった。The purified CC acylase K170Q was applied to a reverse phase HPLC column [COSMOSIL 4.6 mm × 50].
mm (manufactured by Nacalai Tesque), eluent; A: 0.05% trifluoroacetic acid (TFA), B: 0.05% TFA containing 60% acetonitrile, gradient; start: A (40
%) + B (60%), end (after 20 minutes): A (0%)
+ B (100%)], and sodium dodecyl sulfate-
Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Was analyzed. CC acylase K thus obtained
The purity of 170Q was about 95% by HPLC and SDS-PAGE.
【0071】(2)GL−7ACAアシラーゼ比活性の
測定 37℃で10分間プレインキュベーションしたGL−7
ACA溶液200μl〔0.15Mトリス塩酸(pH
8.7)中に10mg/ml、pHは1N NaOHで
8.7に再調整された〕に、サンプルアシラーゼ20μ
lを添加して、該混合液を37℃で5分間インキュベー
ションした。これに、5%酢酸を220μl添加するこ
とにより反応を止めた。得られた混合液を遠心し(室温
下、10,000rpmで5分間)、上清を用いて7A
CAの生成を測定した。HPLC条件:カラム;TSK
gel ODS−80 TMCTR 4.4mm×10
0mm(東ソー製)、溶離液;5%(w/v)酢酸アン
モニウム含有3%(v/v)アセトニトリル、流速;
1.0ml/min、注入量;10μl、検出器254
nm 1ユニットを、37℃で1分間にGL−7ACA
から1.0μmolの7ACAを生成しうる活性として
定義した。その結果、天然型CCアシラーゼN176の
活性100%に比べて、本発明の変異型CCアシラーゼ
K170Qの活性は130%であり、GL−7ACAア
シラーゼ活性の向上が認められた。(2) Measurement of GL-7ACA acylase specific activity GL-7 preincubated at 37 ° C. for 10 minutes
200 μl of ACA solution [0.15M Tris-HCl (pH
8.7) 10 mg / ml, and the pH was readjusted to 8.7 with 1N NaOH].
1 was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes. The reaction was stopped by adding 220 μl of 5% acetic acid. The resulting mixed solution was centrifuged (at room temperature, 10,000 rpm for 5 minutes), and the supernatant was used for 7A.
The production of CA was measured. HPLC conditions: column; TSK
gel ODS-80 TMCTR 4.4 mm x 10
0 mm (manufactured by Tosoh Corporation), eluent; 3% (v / v) acetonitrile containing 5% (w / v) ammonium acetate, flow rate;
1.0 ml / min, injection volume; 10 μl, detector 254
nm 1 unit at 37 ° C for 1 minute with GL-7ACA
Was defined as the activity capable of producing 1.0 μmol of 7ACA. As a result, the activity of the mutant CC acylase K170Q of the present invention was 130% as compared with 100% of the activity of the natural CC acylase N176, and it was confirmed that the GL-7ACA acylase activity was improved.
【0072】(3)変異型アシラーゼのアミノ末端配列
の決定 (i)CCアシラーゼK170Qの両鎖の単離:精製さ
れた変異型CCアシラーゼK170Qを逆相HPLCに
付した〔カラム;COSMOSIL 5C4 (4.6m
m×35mm,ナカライテスク製)、溶離液;0.05
%TFA中、アセトニトリル初濃度36%から20分で
60%の直線グラジェント、流速;1.0ml/mi
n〕。CCアシラーゼK170Qのβ鎖およびα鎖は、
それぞれ約48%および約51%濃度のアセトニトリル
と共に溶出された。各溶出液を集め、凍結乾燥して、ア
シラーゼのα鎖およびβ鎖を得た。(3) Determination of amino terminal sequence of mutant acylase (i) Isolation of both chains of CC acylase K170Q: Purified mutant CC acylase K170Q was subjected to reverse phase HPLC [column; COSMOSIL 5C 4 ( 4.6m
m × 35 mm, manufactured by Nacalai Tesque), eluent: 0.05
A linear gradient of 60% in 20 minutes from an initial concentration of acetonitrile of 36% in TFA, flow rate; 1.0 ml / mi
n]. The β and α chains of CC acylase K170Q are
It was eluted with acetonitrile at concentrations of about 48% and about 51%, respectively. The eluates were collected and freeze-dried to obtain α-chain and β-chain of acylase.
【0073】(ii)アミノ末端配列の決定 当該α鎖およびβ鎖のアミノ末端配列を、気相シークエ
ンサー470A(アプライドバイオシステムズ社製)で
決定し、予想されたものと一致することを確認した。(Ii) Determination of amino-terminal sequence The amino-terminal sequences of the α chain and β chain were determined by a gas phase sequencer 470A (manufactured by Applied Biosystems) and confirmed to be the same as expected.
【0074】[0074]
【発明の効果】本発明によれば、高いGL−7ACAア
シラーゼ活性をもつ変異型セファロスポリンCアシラー
ゼ、該酵素を高収率発現する発現系並びに該酵素の製造
方法を提供することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide a mutant cephalosporin C acylase having a high GL-7ACA acylase activity, an expression system for expressing the enzyme in high yield, and a method for producing the enzyme.
【0075】[0075]
配列番号:1 配列の長さ:2325 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:4..2322 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:peptide 存在位置:4..2322 特徴を決定した方法:S 特徴を表す記号:mutation 存在位置:170 特徴を決定した方法: 配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC CAG CTC TGG CGC ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Gln Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT AGC GTC ACG CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 2325 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Sequence features Characteristic symbols: CDS Location: 4. . 2322 Method for determining feature: E Feature symbol: peptide Location: 4. . 2322 Method for determining characteristic: S Character for expressing characteristic: mutation Location: 170 Method for determining characteristic: Sequence ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC CAG CTC TGG CGC ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Gln Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Gl u Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT AGC GTC ACG CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile H is Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Al a Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGA GC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GA C AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770
【図1】変異型CCアシラーゼK170Qの発現ベクタ
ーであるpCKK170Qの制限酵素地図を示す図であ
る。FIG. 1 is a diagram showing a restriction enzyme map of pCKK170Q which is an expression vector of mutant CC acylase K170Q.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 //(C12N 9/80 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 35/06 C12R 1:19) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI technical display location // (C12N 9/80 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 35 / 06 C12R 1:19)
Claims (7)
ブユニットにプロセッシングされる前の前駆体形として
のアミノ酸配列が、式: A1-169 −X1 −A171-773 (式中、A1-169 は、天然型セファロスポリンCアシラ
ーゼのThr1 からPhe169 までのアミノ酸配列と同
一のアミノ酸配列を示す。A171-773 は、天然型セファ
ロスポリンCアシラーゼのLeu171 からAla773 ま
でのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示す。X1 は
Lys以外のアミノ酸を示す。)で示される、変異型セ
ファロスポリンCアシラーゼ。1. A precursor amino acid sequence before being processed into α-subunit and β-subunit in a host cell has the formula: A1-169-X1 -A171-773 (wherein A1-169). Shows the same amino acid sequence as the amino acid sequence of Thr1 to Phe169 of natural cephalosporin C acylase A171-773 shows the same amino acid sequence as the amino acid sequence of Leu171 to Ala773 of natural cephalosporin C acylase. X1 represents an amino acid other than Lys)), which is a mutant cephalosporin C acylase.
型セファロスポリンCアシラーゼ。2. The mutant cephalosporin C acylase according to claim 1, wherein X1 is Gln.
ファロスポリンCアシラーゼをコードするDNA。3. A DNA encoding the mutant cephalosporin C acylase according to claim 1 or 2.
ー。4. An expression vector containing the DNA according to claim 3.
質転換された宿主細胞。5. A host cell transformed with the expression vector according to claim 4.
し、得られる培養物から変異型セファロスポリンCアシ
ラーゼを採取することを特徴とする請求項1または請求
項2記載の変異型セファロスポリンCアシラーゼの製造
方法。6. The mutant cephalo according to claim 1 or 2, wherein the host cell according to claim 5 is cultured in a medium, and the mutant cephalosporin C acylase is collected from the resulting culture. Method for producing sporin C acylase.
す。R2 はカルボン酸アシルを示す。)で示される化合
物(II)またはその塩に請求項5の形質転換体の培養物
またはその処理物を接触させて、式: 【化2】 (式中、R1 は前記と同意義。)で示される化合物
(I)またはその塩を得ることを特徴とする化合物
(I)の製造法。7. The formula: (Wherein R1 represents acetoxy, hydroxy or hydrogen. R2 represents an acyl carboxylate) or a salt thereof is contacted with the culture of the transformant of claim 5 or a treated product thereof. Let the formula: (In the formula, R1 is as defined above.) A compound (I) or a salt thereof is obtained, and a process for producing the compound (I).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6239272A JPH0898686A (en) | 1994-10-03 | 1994-10-03 | Variant type cephalosporin c acylase and its production |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6239272A JPH0898686A (en) | 1994-10-03 | 1994-10-03 | Variant type cephalosporin c acylase and its production |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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JPH0898686A true JPH0898686A (en) | 1996-04-16 |
Family
ID=17042295
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP6239272A Pending JPH0898686A (en) | 1994-10-03 | 1994-10-03 | Variant type cephalosporin c acylase and its production |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JPH0898686A (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7399624B2 (en) * | 2004-01-12 | 2008-07-15 | Antibioticos S.P.A. | Cephalosporin C acylases |
US7592168B2 (en) | 2003-08-11 | 2009-09-22 | Sandoz Ag | Cephalosporin C acylase mutant and method for preparing 7-ACA using same |
CN102321721A (en) * | 2011-10-25 | 2012-01-18 | 石药集团河北中润制药有限公司 | Process for preparing 3-deacetylate-7-aminocephalosporanic acid |
-
1994
- 1994-10-03 JP JP6239272A patent/JPH0898686A/en active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7592168B2 (en) | 2003-08-11 | 2009-09-22 | Sandoz Ag | Cephalosporin C acylase mutant and method for preparing 7-ACA using same |
US7399624B2 (en) * | 2004-01-12 | 2008-07-15 | Antibioticos S.P.A. | Cephalosporin C acylases |
CN102321721A (en) * | 2011-10-25 | 2012-01-18 | 石药集团河北中润制药有限公司 | Process for preparing 3-deacetylate-7-aminocephalosporanic acid |
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