JPH088878B2 - Ｄ−アラニンの製造法 - Google Patents
Ｄ−アラニンの製造法Info
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- JPH088878B2 JPH088878B2 JP2970987A JP2970987A JPH088878B2 JP H088878 B2 JPH088878 B2 JP H088878B2 JP 2970987 A JP2970987 A JP 2970987A JP 2970987 A JP2970987 A JP 2970987A JP H088878 B2 JPH088878 B2 JP H088878B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明はＤ−アラニンを発酵法によって工業的に製造
する方法に関するものである。
する方法に関するものである。
Ｄ−アラニンは医薬中間体や甘味料中間体として有用
である。
である。
＜従来の技術＞ グルコースとDL−アラニンを含有する培地中で酵母を
培養することによりＤ−アラニンを製造する方法はすで
に知られている（「発酵と代謝」、15、89（1987））。
培養することによりＤ−アラニンを製造する方法はすで
に知られている（「発酵と代謝」、15、89（1987））。
また、グルコースを炭素源とするコリネバクテリウム
・ファスシアンスによる直接Ｄ−アラニン発酵法も知ら
れている（特公昭51−21076号公報）。
・ファスシアンスによる直接Ｄ−アラニン発酵法も知ら
れている（特公昭51−21076号公報）。
＜発明が解決しようとする問題点＞ 前者の方法は安価なDL−アラニンから、高価なＤ−ア
ラニンを高純度で得る方法として優れている。
ラニンを高純度で得る方法として優れている。
しかしながらDL−アラニン濃度を20g/以上にすると
菌の生育が阻止されるばかりでなく、Ｌ−アラニンの資
化能も低下すること、また、Ｄ−アラニンも資化されて
しまうために、残存Ｄ−アラニン回収率も低いことなど
のために工業的に有利な方法とはいえない。
菌の生育が阻止されるばかりでなく、Ｌ−アラニンの資
化能も低下すること、また、Ｄ−アラニンも資化されて
しまうために、残存Ｄ−アラニン回収率も低いことなど
のために工業的に有利な方法とはいえない。
また、後者の方法はＤ−アラニンの蓄積濃度が6g/
と低いこと、培養時間が５日間と長いことなどのため
に、同様に工業的に有利な方法とはいえない。
と低いこと、培養時間が５日間と長いことなどのため
に、同様に工業的に有利な方法とはいえない。
しかも、従来技術はグルコース、グリセロールなどを
炭素源とする培地で微生物を培養し、その微生物の保有
する酵素によってＬ−アラニンを他の物質に変換せしめ
ることにより、DL−アラニンからＤ−アラニンを製造す
る方法である。
炭素源とする培地で微生物を培養し、その微生物の保有
する酵素によってＬ−アラニンを他の物質に変換せしめ
ることにより、DL−アラニンからＤ−アラニンを製造す
る方法である。
＜問題点を解決するための手段および作用＞ そこで、本発明者らは実質的にＬ−アラニンを単一炭
素源および単一窒素源として生育可能な微生物をDL−ア
ラニンを含有する培地で培養することにより、Ｌ−アラ
ニンのみを資化せしめＤ−アラニンを製造する方法を検
討した。
素源および単一窒素源として生育可能な微生物をDL−ア
ラニンを含有する培地で培養することにより、Ｌ−アラ
ニンのみを資化せしめＤ−アラニンを製造する方法を検
討した。
この方法によればＬ−アラニンは微生物を生育するた
めのエネルギーとして消費されるために、Ｌ−アラニン
を全量資化した時点では培地中にはＤ−アラニンのみが
蓄積され、他の副生物はほとんど存在しないこととな
る。加えて、選ばれた微生物がラセマーゼを保有しない
が、あるいは保有したとしても不活性化される条件下で
培養することにより、DL−アラニンに含まれるＤ−アラ
ニンは実質的に理論量蓄積されることとなる。
めのエネルギーとして消費されるために、Ｌ−アラニン
を全量資化した時点では培地中にはＤ−アラニンのみが
蓄積され、他の副生物はほとんど存在しないこととな
る。加えて、選ばれた微生物がラセマーゼを保有しない
が、あるいは保有したとしても不活性化される条件下で
培養することにより、DL−アラニンに含まれるＤ−アラ
ニンは実質的に理論量蓄積されることとなる。
本発明者らは、このような目的に合致する微生物を探
究した。
究した。
すなわち、単一炭素源および単一窒素源として安価な
DL−アラニンを使用しこの特定の培地を使用してＬ−ア
ラニンのみを資化し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しな
い、すなわち選択的資化能を有する微生物について探究
した。
DL−アラニンを使用しこの特定の培地を使用してＬ−ア
ラニンのみを資化し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しな
い、すなわち選択的資化能を有する微生物について探究
した。
Ｌ−アラニンを他の物質に変換する酵素としては、例
えば、アラニル−tRNAシンテターゼ〔EC6,1,1,7〕、ア
ラニンアミノトランスフェラーゼ〔EC2,6,1,2〕、アラ
ニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ〔EC2,6,1,1
2〕、アラニンデヒドロゲナーゼ〔EC1,4,1,1〕などが知
られており、さらに、アラニンラセマーゼが知られてい
る。
えば、アラニル−tRNAシンテターゼ〔EC6,1,1,7〕、ア
ラニンアミノトランスフェラーゼ〔EC2,6,1,2〕、アラ
ニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ〔EC2,6,1,1
2〕、アラニンデヒドロゲナーゼ〔EC1,4,1,1〕などが知
られており、さらに、アラニンラセマーゼが知られてい
る。
これらの酵素は例えば、スタフィロコッカス属、キャ
ンディダ属、サッカロマイコプシス属、ラクトバチルス
属、バシリス属、トルロプシス属、ピキア属、デバリオ
マイセス属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属、サ
ッカロマイセス属、アエロバクター属、ハンゼヌラ属、
クリプトコッカス属、トリコスポロン属などに属する微
生物に存在する。
ンディダ属、サッカロマイコプシス属、ラクトバチルス
属、バシリス属、トルロプシス属、ピキア属、デバリオ
マイセス属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属、サ
ッカロマイセス属、アエロバクター属、ハンゼヌラ属、
クリプトコッカス属、トリコスポロン属などに属する微
生物に存在する。
しかし、これらの微生物がＬ−アラニンを他の物質に
変換する能力を有していても、Ｄ−アラニンをも変換す
る酵素が共に存在している場合やアラニン・ラセマーゼ
が存在している場合には、残留アラニン中にＬ−アラニ
ンが混入するため、Ｄ−アラニンのみを蓄積することは
できない。
変換する能力を有していても、Ｄ−アラニンをも変換す
る酵素が共に存在している場合やアラニン・ラセマーゼ
が存在している場合には、残留アラニン中にＬ−アラニ
ンが混入するため、Ｄ−アラニンのみを蓄積することは
できない。
すなわち、Ｌ−アラニンを変換する能力を有する微生
物をDL−アラニン培地で培養したとしても、Ｄ−アラニ
ンのみを残留せしめることが可能か否かは予測できな
い。
物をDL−アラニン培地で培養したとしても、Ｄ−アラニ
ンのみを残留せしめることが可能か否かは予測できな
い。
そこで本発明者らは工業的に有利なＤ−アラニンの製
造法を提供することを目的として鋭意検討した結果、特
定の酵母を特定炭素源および特定窒素源の培地で培養す
ることにより、数十g/以上の蓄積濃度でＤ−アラニン
が得られることを見い出し、本発明を完成した。
造法を提供することを目的として鋭意検討した結果、特
定の酵母を特定炭素源および特定窒素源の培地で培養す
ることにより、数十g/以上の蓄積濃度でＤ−アラニン
が得られることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は実質的にDL−アラニンを単一炭素
源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンデ
ィダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプ
シス属、クリプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリ
コスポロン属に属しかつＬ−アラニンを資化しＤ−アラ
ニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、
培養物からＤ−アラニンを採取することを特徴とするＤ
−アラニンの製造法に関するものである。
源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンデ
ィダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプ
シス属、クリプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリ
コスポロン属に属しかつＬ−アラニンを資化しＤ−アラ
ニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、
培養物からＤ−アラニンを採取することを特徴とするＤ
−アラニンの製造法に関するものである。
以下、本発明の構成を詳述する。
本発明で使用する酵母としては、キャンディダ属、サ
ッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプシス属、ク
リプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン
属に属する酵母が挙げられる。これらの酵母のうち実質
的にDL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として
含有する培地中で生育可能であって、かつＬ−アラニン
資化能を有し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母
が本発明では用いられる。
ッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプシス属、ク
リプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン
属に属する酵母が挙げられる。これらの酵母のうち実質
的にDL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として
含有する培地中で生育可能であって、かつＬ−アラニン
資化能を有し、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母
が本発明では用いられる。
ここで、Ｄ−アラニンを実質的に資化しない酵母と
は、本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてＤ
−アラニンを少量のみ資化する酵母、あるいはＬ−アラ
ニンの資化後、Ｌ−アラニンの不存在条件下ではＤ−ア
ラニンを資化する酵母も含まれる。
は、本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてＤ
−アラニンを少量のみ資化する酵母、あるいはＬ−アラ
ニンの資化後、Ｌ−アラニンの不存在条件下ではＤ−ア
ラニンを資化する酵母も含まれる。
例えば、キャンディダ・フミコーラ（Candida humico
la）ATCC36992、キャンディダ・ルゴーザ（Candida rug
osa）ATCC10571、サッカロマイコプシス・リポリティカ
（Saccharomycopsis lipolytica）ATCC20306、サッカロ
マイコプシス・リポリティカ（Sacharomycopsis lipoly
tica）IFO 0717、クリプトコッカス・ラウレンティ（C
ryptococcus laurentii）ATCC36832、、トルロプシス・
キャンディダ（Torulopsis candida）ATCC20284、トル
ロプシス・グラブラタ（Torulopsis glabrata）IFO 00
05、ピキア・ブルトニー（Pichia burtonii）ATCC2027
9、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）IFO 094
7、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorph
a）ATCC26012、ハンゼヌラ・カプスラータ（Hansenula
capsulata）ATCC16753、トリコスポロン・ベイゲリー
（Trichosporon beigelii）ATCC36993などが挙げられ
る。
la）ATCC36992、キャンディダ・ルゴーザ（Candida rug
osa）ATCC10571、サッカロマイコプシス・リポリティカ
（Saccharomycopsis lipolytica）ATCC20306、サッカロ
マイコプシス・リポリティカ（Sacharomycopsis lipoly
tica）IFO 0717、クリプトコッカス・ラウレンティ（C
ryptococcus laurentii）ATCC36832、、トルロプシス・
キャンディダ（Torulopsis candida）ATCC20284、トル
ロプシス・グラブラタ（Torulopsis glabrata）IFO 00
05、ピキア・ブルトニー（Pichia burtonii）ATCC2027
9、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）IFO 094
7、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorph
a）ATCC26012、ハンゼヌラ・カプスラータ（Hansenula
capsulata）ATCC16753、トリコスポロン・ベイゲリー
（Trichosporon beigelii）ATCC36993などが挙げられ
る。
本発明では、実質的にDL−アラニンを単一炭素源およ
び単一窒素源として含有する培地中で培養を行う。すな
わち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として
実質的にDL−アラニンを用いるが、本発明の効果を阻害
しない範囲内で他の炭素数および／または窒素源を少量
含有していてもよい。
び単一窒素源として含有する培地中で培養を行う。すな
わち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として
実質的にDL−アラニンを用いるが、本発明の効果を阻害
しない範囲内で他の炭素数および／または窒素源を少量
含有していてもよい。
培養液中に栄養源としてグルコースを共存させるとＬ
−アラニンの資化速度が遅くなるので、グルコースはで
きるだけ含有させないようにすることが好ましい。
−アラニンの資化速度が遅くなるので、グルコースはで
きるだけ含有させないようにすることが好ましい。
培地中のDL−アラニン濃度は１中に１〜150g、好ま
しくは、30〜120gである。DL−アラニン濃度が低いと生
産効率が悪く、逆に濃度が高いと培養時間が長くなり、
また、微生物の生育が阻害される傾向となる。
しくは、30〜120gである。DL−アラニン濃度が低いと生
産効率が悪く、逆に濃度が高いと培養時間が長くなり、
また、微生物の生育が阻害される傾向となる。
DL−アラニンは始めから培養液に全量仕込んでもよい
が、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間
が長くなるので、初濃度を20〜50g/にし、残りのDL−
アラニンを分割添加する流加培養法が好ましい。
が、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間
が長くなるので、初濃度を20〜50g/にし、残りのDL−
アラニンを分割添加する流加培養法が好ましい。
培養は酸性で実施するのが好ましい。培養液は通常培
養開始時にpH5に調整するが、培養が進むにつれてpHが
上昇する。そのままで培養するとＤ−アラニンの回収率
が低下するのでpHを酸性側にコントロールする必要があ
る。pHがアルカリ側になるとＤ−アラニンの回収率が低
下する原因として、アラニン・ラセマーゼが活性化され
ること、またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ
が活性化されることなどにより、Ｄ−アラニンが資化さ
れるものと考えられる。
養開始時にpH5に調整するが、培養が進むにつれてpHが
上昇する。そのままで培養するとＤ−アラニンの回収率
が低下するのでpHを酸性側にコントロールする必要があ
る。pHがアルカリ側になるとＤ−アラニンの回収率が低
下する原因として、アラニン・ラセマーゼが活性化され
ること、またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ
が活性化されることなどにより、Ｄ−アラニンが資化さ
れるものと考えられる。
これらの理由から、培養時のpHは通常４〜７、好まし
くは4.5〜6.5に調整する。調整用の酸としては、例え
ば、リン酸、硫酸、塩酸などの無機酸水溶液が好まし
い。
くは4.5〜6.5に調整する。調整用の酸としては、例え
ば、リン酸、硫酸、塩酸などの無機酸水溶液が好まし
い。
培養温度は通常20〜40℃、好ましくは25〜35℃であ
る。
る。
培養は通気しながら撹拌する。通気量は通常、0.5〜
2.0vvm、好ましくは0.6〜1.2vvmである。通気量が少な
すぎるとＬ−アラニン資化速度が遅くなる傾向となり、
また、多くても効果に変わりなく、むしろ培養液の蒸発
を促進するために培養液濃度が高くなったり、発泡が激
しくなり好ましくない。
2.0vvm、好ましくは0.6〜1.2vvmである。通気量が少な
すぎるとＬ−アラニン資化速度が遅くなる傾向となり、
また、多くても効果に変わりなく、むしろ培養液の蒸発
を促進するために培養液濃度が高くなったり、発泡が激
しくなり好ましくない。
Ｌ−アラニンがすべて資化された時点で通常、培養を
終了する。Ｌ−アラニンの全量資化はＤ−０をモニター
することにより、また、アラニンのＤ、Ｌを分析する
か、酸の添加量をモニターすることにより知ることがで
きる。
終了する。Ｌ−アラニンの全量資化はＤ−０をモニター
することにより、また、アラニンのＤ、Ｌを分析する
か、酸の添加量をモニターすることにより知ることがで
きる。
Ｌ−アラニンがすべて資化されたのち、さらに培養を
続けるとＤ−アラニンも徐々に資化される場合もあるの
で、培養の終点を明確に知ることが好ましい。
続けるとＤ−アラニンも徐々に資化される場合もあるの
で、培養の終点を明確に知ることが好ましい。
かくして得られた培養液を遠心分離により菌体を除去
したのち、通常の方法によってＤ−アラニンを単離すれ
ばよい。
したのち、通常の方法によってＤ−アラニンを単離すれ
ばよい。
例えば、イオ交換樹脂SK−1B（三菱化成製）に通液し
てアラニンを樹脂に吸着させた後よく洗浄する。次いで
アンモニア水溶液で溶出させたのち、溶出液を濃縮すれ
ばよい。ここで得られた粗Ｄ−アラニンを水で再結晶す
れば精製されたＤ−アラニンが得られる。
てアラニンを樹脂に吸着させた後よく洗浄する。次いで
アンモニア水溶液で溶出させたのち、溶出液を濃縮すれ
ばよい。ここで得られた粗Ｄ−アラニンを水で再結晶す
れば精製されたＤ−アラニンが得られる。
＜実施例＞ 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例においてアラニンのDL分析は、濃縮乾燥したＤ
−アラニン含有粉末をメタノール−塩酸によりメチルエ
ステル化したのち、3,5−ジニトロフェニルイソシアネ
ートと反応させたのちこれを次の条件によりHPLCで分析
する方法によって行った。
−アラニン含有粉末をメタノール−塩酸によりメチルエ
ステル化したのち、3,5−ジニトロフェニルイソシアネ
ートと反応させたのちこれを次の条件によりHPLCで分析
する方法によって行った。
カラム:OA−1000（住友科学） 移動層:n−ヘキサン：ジクロルメタン：エタノール（2
0:8:1） 流速:1ml/min 検出:UV254nm 実施例１ 乾燥ブイヨン30g/（pH6.0）を含む培地50mlを１
三角フラスコに分注し、120℃、20分間滅菌し、種培養
培地とした。これにキャンディダ・フミコーラATCC3699
2を一白金耳植菌し、30℃で一日振とう培養した。一
方、DL−アラニン100g/、リン酸一カリウム2g/、硫
酸マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g/を含む
培地（pH5.0）１を３のミニジャーファーメンター
に仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の主培養
培地を接種し、30℃、1.0vvm通気撹拌培養をした。な
お、培養中は2N硫酸によりpH5.0±0.1に調整を行った。
約70時間で培地中のＬ−アラニンは全量資化され、Ｄ−
アラニン48g、硫酸アンモニウム35gを含む培養液約1.2
を得た。
0:8:1） 流速:1ml/min 検出:UV254nm 実施例１ 乾燥ブイヨン30g/（pH6.0）を含む培地50mlを１
三角フラスコに分注し、120℃、20分間滅菌し、種培養
培地とした。これにキャンディダ・フミコーラATCC3699
2を一白金耳植菌し、30℃で一日振とう培養した。一
方、DL−アラニン100g/、リン酸一カリウム2g/、硫
酸マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g/を含む
培地（pH5.0）１を３のミニジャーファーメンター
に仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の主培養
培地を接種し、30℃、1.0vvm通気撹拌培養をした。な
お、培養中は2N硫酸によりpH5.0±0.1に調整を行った。
約70時間で培地中のＬ−アラニンは全量資化され、Ｄ−
アラニン48g、硫酸アンモニウム35gを含む培養液約1.2
を得た。
この培養液を10,000rpm10分間遠心分離して菌体を除
いたのち、イオン交換樹脂SK−1B（Ｈ型）を充填したカ
ラムにとおし、Ｄ−アラニンを吸着させた。このカラム
を十分水洗したのち４％アンモニア水でＤ−アラニンを
溶出した。この溶出液を減圧濃縮し乾固してＤ−アラニ
ン45gを得た。HPLCにより分析したところ、光学純度は9
9.6％ee以上であった。化学純度は99.45％であった。
いたのち、イオン交換樹脂SK−1B（Ｈ型）を充填したカ
ラムにとおし、Ｄ−アラニンを吸着させた。このカラム
を十分水洗したのち４％アンモニア水でＤ−アラニンを
溶出した。この溶出液を減圧濃縮し乾固してＤ−アラニ
ン45gを得た。HPLCにより分析したところ、光学純度は9
9.6％ee以上であった。化学純度は99.45％であった。
実施例２ 実施例１に示した操作のうち、主培養培地中のDL−ア
ラニン濃度を80g/し、他は同じ条件で培養を行った。
約35時間で培養は終了し、Ｄ−アラニン38g、硫酸アン
モニウム28gを含む培養液約1.2を得た。
ラニン濃度を80g/し、他は同じ条件で培養を行った。
約35時間で培養は終了し、Ｄ−アラニン38g、硫酸アン
モニウム28gを含む培養液約1.2を得た。
この培養液を遠心分離して菌体を除いたのち、水酸化
カルシウム18.3gを加えて撹拌し、約２時間塩交換を行
った。この懸濁液を1/3量まで減圧濃縮したのち、濾過
して無機塩を除いた。濾液は、イオン交換樹脂SK−1B
（アンモニウム型）を充填したカラムにとおし、微量の
金属イオンを吸着させた、溶出液とカラムの洗浄液を合
せ、濃縮晶析させ、精Ｄ−アラニン32gを得た。
カルシウム18.3gを加えて撹拌し、約２時間塩交換を行
った。この懸濁液を1/3量まで減圧濃縮したのち、濾過
して無機塩を除いた。濾液は、イオン交換樹脂SK−1B
（アンモニウム型）を充填したカラムにとおし、微量の
金属イオンを吸着させた、溶出液とカラムの洗浄液を合
せ、濃縮晶析させ、精Ｄ−アラニン32gを得た。
光学純度99.9％ee、化学純度99.9％であった。
実施例３ 実施例２と同様の条件で、主培養培地成分のうち粉末
酵母エキスを抜いて行ったところ、培養に約100時間を
要した。培養終了後、得られたＤ−アラニンの収量、光
学純度は実施例２とほぼ同様であった。
酵母エキスを抜いて行ったところ、培養に約100時間を
要した。培養終了後、得られたＤ−アラニンの収量、光
学純度は実施例２とほぼ同様であった。
実施例４ DL−アラニン20g/、リン酸−カリウム2g/、硫酸
マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g/を含む培
地（pH5.0）50mlを１三角フラスコに分注し、滅菌し
て種培養培地とした。これにキャンディダ・フミコーラ
ATCC36992を一白金菌耳植菌し、30℃で約24時間振とう
培養した。一方、上記培地組成のうち、DL−アラニンを
40g/とした培地１を３のミニジャーファーメンタ
ーに仕込み滅菌し主培養培地とした。これに先の種培養
液を接種し、30℃、1.0vvmで通気撹拌培養をした。培養
中は、2N硫酸によりpH5.0±0.1に調整を行った。約20時
間後、培地中のＬ−アラニンの約80％が資化されたとこ
ろで、この培養液を同じ構成成分の新しい主培養培地１
に５％シードで接種し、先ほどと同条件で通気撹拌培
養を行った。再び約20時間培養したところで、次にこの
培養液を、DL−アラニン80g/を含有し他成分は前回ま
でと同様である主培養培地１に、５％シードで接種し
た。同条件で通気撹拌培養を約60時間行うと、培地中の
Ｌ−アラニンが全量資化された。培養収量後実施例２に
示した操作により得られたＤ−アラニンの収量、光学純
度、化学純度は実施例２とほぼ同様であった。
マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g/を含む培
地（pH5.0）50mlを１三角フラスコに分注し、滅菌し
て種培養培地とした。これにキャンディダ・フミコーラ
ATCC36992を一白金菌耳植菌し、30℃で約24時間振とう
培養した。一方、上記培地組成のうち、DL−アラニンを
40g/とした培地１を３のミニジャーファーメンタ
ーに仕込み滅菌し主培養培地とした。これに先の種培養
液を接種し、30℃、1.0vvmで通気撹拌培養をした。培養
中は、2N硫酸によりpH5.0±0.1に調整を行った。約20時
間後、培地中のＬ−アラニンの約80％が資化されたとこ
ろで、この培養液を同じ構成成分の新しい主培養培地１
に５％シードで接種し、先ほどと同条件で通気撹拌培
養を行った。再び約20時間培養したところで、次にこの
培養液を、DL−アラニン80g/を含有し他成分は前回ま
でと同様である主培養培地１に、５％シードで接種し
た。同条件で通気撹拌培養を約60時間行うと、培地中の
Ｌ−アラニンが全量資化された。培養収量後実施例２に
示した操作により得られたＤ−アラニンの収量、光学純
度、化学純度は実施例２とほぼ同様であった。
実施例５ 実施例１に示した操作のうち、主培養培地をDL−アラ
ニン55g、リン酸−カリウム2g、硫酸マグネシウム0.5
g、粉末酵母エキス1gを含む培地700mlとし、実施例１と
同条件で培養を行った。約20時間後、DL−アラニン45g
を含む水溶液300mlを15ml/hrの流速で添加を始めた。約
20時間で添加を終えたのちも、さらに培養を続けた。培
養を始めてから約60時間で培養は終結した。
ニン55g、リン酸−カリウム2g、硫酸マグネシウム0.5
g、粉末酵母エキス1gを含む培地700mlとし、実施例１と
同条件で培養を行った。約20時間後、DL−アラニン45g
を含む水溶液300mlを15ml/hrの流速で添加を始めた。約
20時間で添加を終えたのちも、さらに培養を続けた。培
養を始めてから約60時間で培養は終結した。
培養液から実施例１に示した操作で得られたＤ−アラ
ニンは収量、光学純度、化学純度ともに実施例１と同様
であった。
ニンは収量、光学純度、化学純度ともに実施例１と同様
であった。
実施例６〜15 乾燥ブイヨン30g/からなる種培地（pH5.0）5mlを18
×180mmの試験管に分注し、滅菌した。これに表１に示
した酵母を一白金菌耳植菌し、30℃で１〜２日振とう培
養した。一方、DL−アラニン10g/、リン酸−カリウム
2g/、硫酸マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g
/よりなる主培養培地（pH5.0）5ml5を18×180mm試験
管に分注して滅菌した。これに先の種培養液を５％シー
ドで接種し、30℃で振とう培養した。24時間後、遠心分
離して菌体を除いたのち減圧濃縮して乾固ののち乾燥し
た。得られた固形分についてHPLCにより残存したアラニ
ンのＬ体、Ｄ体の残存率を求めた。
×180mmの試験管に分注し、滅菌した。これに表１に示
した酵母を一白金菌耳植菌し、30℃で１〜２日振とう培
養した。一方、DL−アラニン10g/、リン酸−カリウム
2g/、硫酸マグネシウム0.5g/、粉末酵母エキス0.5g
/よりなる主培養培地（pH5.0）5ml5を18×180mm試験
管に分注して滅菌した。これに先の種培養液を５％シー
ドで接種し、30℃で振とう培養した。24時間後、遠心分
離して菌体を除いたのち減圧濃縮して乾固ののち乾燥し
た。得られた固形分についてHPLCにより残存したアラニ
ンのＬ体、Ｄ体の残存率を求めた。
結果を表１に示す。
比較例 実施例２に示した操作のうち、主培養培地にグルコー
ス10g/を加え他は同じ条件で培養を行った。培養は約
54時間で終了し、Ｄ−アラニン32g、硫酸アンモニウム2
9gを含む培養液約1.2を得た。この培養液の50mlを実
施例６と同様の処理をして得られた固形分をHPLCにより
分析した結果、Ｄ−アラニンの光学純度は99.6％ee以上
であった。
ス10g/を加え他は同じ条件で培養を行った。培養は約
54時間で終了し、Ｄ−アラニン32g、硫酸アンモニウム2
9gを含む培養液約1.2を得た。この培養液の50mlを実
施例６と同様の処理をして得られた固形分をHPLCにより
分析した結果、Ｄ−アラニンの光学純度は99.6％ee以上
であった。
＜発明の効果＞ 本発明は次の効果を発揮する。
（１）DL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源とし
て酵母を培養することにより、Ｌ−アラニンを高選択的
に資化することができる。
て酵母を培養することにより、Ｌ−アラニンを高選択的
に資化することができる。
（２）さらに蓄積濃度も高く、短時間でＤ−アラニンが
得られる。
得られる。
（３）加えて、消費されたＬ−アラニンはほとんど炭酸
ガスと水にまで変換されて、培養液中にはＤ−アラニン
以外の副生物は実質的には存在しない。
ガスと水にまで変換されて、培養液中にはＤ−アラニン
以外の副生物は実質的には存在しない。
（４）このためにＤ−アラニンの単離精製が容易であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:88）
Claims (1)
- 【請求項１】実質的にDL−アラニンを単一炭素源および
単一窒素源として含有する培地中で、キャンディダ（Ca
ndida）属、サッカロマイコプシス（Saccharomycopsi
s）属、ピキア（Pichia）属、トルロプシス（Torulopsi
s）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、ハンゼ
ヌラ（Hansenura）属またはトルコスポロン（Torycospo
ron）属に属しかつ、Ｌ−アラニンを資化しＤ−アラニ
ンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培
養物からＤ−アラニンを採取することを特徴とするＤ−
アラニンの製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2970987A JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Ｄ−アラニンの製造法 |
| EP88901636A EP0301107B1 (en) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Process for preparing d-alanine |
| DE3851108T DE3851108T2 (de) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Verfahren zur herstellung von d-alanin. |
| PCT/JP1988/000139 WO1988006188A1 (en) | 1987-02-13 | 1988-02-12 | Process for preparing d-alanine |
| HU681688A HU208435B (en) | 1987-02-13 | 1988-06-16 | New process for producing substituted cyclopentenone- and cyclohexanone derivatives |
| US08/027,551 US5422255A (en) | 1987-02-13 | 1993-03-05 | Method for producing D-alanine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2970987A JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Ｄ−アラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63198997A JPS63198997A (ja) | 1988-08-17 |
| JPH088878B2 true JPH088878B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=12283636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2970987A Expired - Lifetime JPH088878B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Ｄ−アラニンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0301107B1 (ja) |
| JP (1) | JPH088878B2 (ja) |
| DE (1) | DE3851108T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988006188A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0249598A (ja) * | 1988-08-11 | 1990-02-19 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 微生物を用いるｄ−アラニンの製法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5121076B2 (ja) * | 1972-07-28 | 1976-06-30 |
-
1987
- 1987-02-13 JP JP2970987A patent/JPH088878B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-02-12 DE DE3851108T patent/DE3851108T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 EP EP88901636A patent/EP0301107B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-12 WO PCT/JP1988/000139 patent/WO1988006188A1/ja active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0301107A4 (en) | 1991-04-10 |
| EP0301107A1 (en) | 1989-02-01 |
| DE3851108T2 (de) | 1995-03-02 |
| WO1988006188A1 (en) | 1988-08-25 |
| DE3851108D1 (de) | 1994-09-22 |
| EP0301107B1 (en) | 1994-08-17 |
| JPS63198997A (ja) | 1988-08-17 |
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| JPS6258710B2 (ja) |
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