发明内容
本申请提供了一种利用生物多酶偶联法制备L-草铵膦的方法,其以D,L-草铵膦为原料,经多酶催化体系获得L-草铵膦,所述多酶催化体系包括:(R)-转氨酶和(S)-转氨酶。该方法原料转化率高、分离精制过程简单、产品收率高、生产成本低,易于工业化。
在一些实施方式中,本申请提供了一种生产L-草铵膦的方法,所述方法包括:在(R)-转氨酶、(S)-转氨酶、氨基受体和氨基供体的存在下,使D,L-草铵膦转化为L-草铵膦。
本申请方法在初始时仅需加入外消旋草铵膦、微量氨基受体(例如丙酮酸)(用以启动第一步反应),氨基供体(例如L-天冬氨酸)(用以启动第二步反应),以及生物催化剂(R)-转氨酶和(S)-转氨酶。本申请的方法涉及两步反应,在第一步反应中,(R)-转氨酶介导外消旋草铵膦中的D-草铵膦的脱氨反应生成中间体酮酸2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO),而L-草铵膦不参与反应而完全保留;在第二步反应中,PPO及时被(S)-转氨酶还原胺化,生成L-草铵膦,生成的副产物例如草酰乙酸自发降解为氨基受体,回补第一步的脱氨化反应。整个反应过程中,氨基受体的含量始终维持在低浓度,从而降低了对反应的抑制程度,而且由于副产物的自发降解,推动反应平衡始终移向产物一侧,打破热力学平衡的限制实现完全转化。本申请方法仅通过两种立体选择性互补的转氨酶的偶联,即可以实现一锅一步的外消旋草铵膦的去消旋化,无需引入辅因子原位再生***除去氨基受体,仅通过副产物的自发降解实现氨基受体的循环利用,大大降低了反应体系的复杂性。
转氨酶(Amine Transaminase,ATA,EC 2.6.1.X)属于转移酶类,是催化1个氨基供体(氨基酸或简单的胺)上的氨基转移到前手性的受体酮,得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸的一类酶,其催化的反应是可逆的。根据氨基被转移到不同位置的氨基受体上,转氨酶又可以被分为α-转氨酶和ω-转氨酶(EC 2.6.1.1)。ω-转氨酶反应过程可分为两步,第一步反应是在ω-转氨酶的作用下将氨基供体上的氨基转移到PLP的羰基上,从而形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和与氨基供体对应的酮;第二步反应同样在ω-转氨酶的作用下将PMP上的氨基转移到氨基受体上,PMP又转变为PLP实现循环。转氨酶的立体选择性可在包含手性中心的底物外消旋混合物的外消旋拆分中测定。ω-转氨酶根据立体选择性可分为“(R)-转氨酶”((R)-amine transaminase)和(S)-转氨酶((S)-amine transaminase)。
根据本申请,(R)-转氨酶可以是在存在酮底物(例如丙酮酸)的情况下,优先从外消旋D,L-草铵膦中诱导D-草铵膦的转氨反应的酶。(R)-转氨酶可以为本领域已知的任何具有(R)-转氨酶活性的酶。在一些实施方式中,所述(R)-转氨酶为选自以下中的任一种:APH1(例如NCBI序列号为WP_015938787.1)、HEA-2(例如NCBI序列号为ABX05998.1)、TSP-1(例如NCBI序列号为WP_013128145.1)、DEP-2(例如NCBI序列号为WP_013615256.1)和MPH(例如NCBI序列号为WP_013863226.1)。在一些实施方式中,所述(R)-转氨酶为APH1。在一些实施方式中,所述(R)-转氨酶来自Pseudarthrobacter chlorophenolicus,例如来自Pseudarthrobacter chlorophenolicus的APH1。在一些实施方式中,(R)-转氨酶的序列的NCBI登录号为WP_015938787.1。在一些实施方式中,所述(R)-转氨酶的氨基酸序列与SEQID No.1所示的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、91%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%的同一性。在一些实施方式中,所述(R)-转氨酶的核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、91%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%的同一性。在一些实施方式中,所述(R)-转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1。在一些实施方式中,所述(R)-转氨酶的核苷酸序列为SEQ IDNo.2。
根据本发明,(S)-转氨酶是在存在酮底物比如丙酮酸的情况下,优先从外消旋D,L-草铵膦诱导L-草铵膦的转氨反应的酶。本申请所述的(S)-转氨酶可以为本领域已知的任何具有(S)-转氨酶活性的酶。在一些实施方式中,所述(S)-转氨酶为选自以下中的任一种:LMG42(即EN5)(例如NCBI序列号为PZN34824.1)和ATA-0303(例如NCBI序列号为WP_012204645.1)。在一些实施方式中,所述(S)-转氨酶来自Corynebacterium vitaeruminis,例如来自Corynebacterium vitaeruminis的EN5。在一些实施方式中,所述(S)-转氨酶来自Corynebacterium vitaeruminis DSM 20294。在一些实施方式中,所述(S)-转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、91%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%的同一性。在一些实施方式中,所述(S)-转氨酶的核苷酸序列与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、91%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%的同一性。在一些实施方式中,所述(S)-转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3。在一些实施方式中,所述(S)-转氨酶的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
所述(R)-转氨酶和(S)-转氨酶的酶制剂形式可以为纯化的酶;部分纯化的酶;无细胞提取物或粗细胞提取物;液体、粉末或固定形式;含有酶的可透化处理的细胞、完整细胞或完整发酵液、冻干细胞或其他任何合适形式。因此,在一些实施方式中,(R)-转氨酶和(S)-转氨酶的形式各自独立地选自:部分纯化的酶;无细胞提取物或粗细胞提取物;液体、粉末或固定形式;含有酶的可透化处理的细胞、完整细胞或完整发酵液、冻干细胞或其任何组合。
在一些优选的实施方式中,本申请方法中使用的(R)-转氨酶和(S)-转氨酶由单一重组微生物共表达。因此,本申请方法可以包括:在共表达(R)-转氨酶和(S)-转氨酶的重组微生物、氨基受体和氨基供体的存在下,使D,L-草铵膦转化为L-草铵膦。可以利用本领域已知的任何方法构建所述重组微生物。例如,所述重组微生物可以如下构建:构建含所述(R)-转氨酶和(S)-转氨酶基因的重组载体,将所述重组载体转化至微生物,对获得的重组微生物进行诱导培养,分离培养液得到含有(R)-转氨酶和(S)-转氨酶基因的重组微生物。优选地,按照10000rpm离心10min后的菌体湿重计,所述重组微生物的添加量为5g/L-200g/L反应液;更优选地,30g/L-100g/L反应液;最优选地,为30g/L反应液。优选地,以干菌体重量计,所述重组微生物的添加量为1-50g干菌体/L反应液。
所述重组微生物可以是任何适用于酶表达的工程菌。在一些实施方式中,所述重组微生物属于以下属中的一种:酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、腐质霉属(Humicola)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属(Yarrowia)或埃希氏杆菌属(Escherichia)。在一些优选的实施方式中,所述重组微生物选自:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些更优选的实施方式中,所述重组微生物是大肠杆菌。
在一些实施方式中,所述氨基受体为丙酮酸。
在一些实施方式中,所述氨基供体为L-天冬氨酸或L-丙氨酸。在一些优选的实施方式中,所述氨基供体为L-天冬氨酸。
在一些实施方式中,所述方法在反应缓冲液的存在下进行,优选地,所述反应缓冲液是pH为7-10,优选8-9的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。在这种磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中进行反应时可以获得更优的反应效率。
在一些实施方式中,氨基受体和D,L-草铵膦的摩尔比为1:500-1:5,例如1:500-1:10;更优选地,为1:50-1:10。
在一些实施方式中,所述方法在辅酶磷酸吡哆醛的存在下进行。在一些实施方式中,磷酸吡哆醛与底物的摩尔比为1:10-1:200。在一些实施方式中,以摩尔浓度计,磷酸吡哆醛的添加量为0.1-2mM;更优选为1mM。
在一些实施方式中,所述方法进行的温度为20-70℃,时间为6-96小时;更优选,温度为30-50℃,例如30-45℃,时间为48-72小时,最优选的,时间为48h。
在一些实施方式中,所述方法在pH 6-10,例如pH 7-9或pH 8-9的条件下进行。
本申请所述的方法可以在一个或更多个反应容器中进行。优选地,本申请所述的方法在一个反应容器中进行(即“一锅一步法”)。
本申请方法的产率可以通过本领域已知的任何方法测量。例如,可以通过手性HPLC来测量所获得的草铵膦产物中两个构型含量。在一些实施方式中,获得的草铵膦产物的对映体过量(e.e.)至少为80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%。
本申请方法具有以下有益效果:
(1)D-草铵膦被氧化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸,L-草铵膦因不参与反应而被完全保留;产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸又可以被转氨酶继续催化还原为L-草铵膦,进而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化。而传统的氧化方法则需要将D-草铵膦和L-草铵膦都转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸,造成了原料的浪费。
(2)本发明能够直接以D,L-草铵膦为底物进行拆分,无需昂贵的拆分试剂,也无需合成草铵膦衍生物,更无需对D-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤。
(3)本方法克服了化学法合成L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的缺陷,是一种绿色,环保,低碳的工艺路线,适合大规模工业化生产应用。
对序列表的描述
SEQ ID NO:1是来源于Pseudarthrobacter chlorophenolicus的注释为(R)-转氨酶(APH1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是来源于Pseudarthrobacter chlorophenolicus的注释为(R)-转氨酶(APH1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是来源于Corynebacterium vitaeruminis DSM 20294的注释为(S)-转氨酶(EN5)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是来源于Corynebacterium vitaeruminis DSM 20294的注释为(S)-转氨酶(EN5)的核苷酸序列。
具体实施方式
实施例
材料和方法
基因工程所用材料和试剂:基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司;一步克隆试剂盒是诺唯赞有限公司(Vazyme)的
MultiS One Step Cloning Kit;E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)、pCDFduet-1载体等购自上海旭冠生物科技发展有限公司;DNA marker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京GenStar有限公司;过氧化氢酶购自宁夏夏盛实业集团有限公司,商品编号为CAT-400。以上试剂使用方法参考商品说明书。
序列合成,序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。
催化工艺所用试剂2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO),D,L-草铵膦购自永农生物科学有限公司;其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行,并对PPO进行分析。HPLC分析方法为:色谱柱/PBr;柱温/30℃;流速/0.8mL/min;检测波长/210nm;流动相:50mM(NH4)2HPO4,加入12%的乙腈。
通过手性HPLC分析方法检查草铵膦的两个构型含量,手性HPLC分析方法为:色谱柱/OA-5000L;流动相/0.5%五水硫酸铜;检测波长/254nm;流速/0.7mL/min;柱温/35℃。
实施例1:工程菌菌体的培养
将工程菌E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-APH1、E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-EN5、E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-APH1-EN5经平皿划线活化后,挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中,37℃震荡培养10h。按2%的接种量转接至50mL同样含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时,加入终浓度为0.5mM的IPTG,28℃下震荡培养12h。培养结束后,将培养液8000rpm离心10min,弃上清,收集菌体,放到-80℃超低温冰箱中保存,待用。
实施例2:酶序列合成和菌株构建
将来源于Pseudarthrobacter chlorophenolicus的注释为(R)-转氨酶(APH1)的序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)进行全基因合成后,***表达质粒pET-28a(+)得到pET28a-APH1。测序验证无误后将pET28a-APH1转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
将来源于Corynebacterium vitaeruminis DSM 20294注释为(S)-转氨酶(EN5)的序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示,核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)进行全基因合成后,***表达质粒pET-28a(+)得到pET28a-EN5。测序验证无误后将pET28a-EN3转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
实施例3:含(R)-转氨酶和(S)-转氨酶***的共表达菌株的构建:
将实施例2中使用的APH1基因通过一步克隆试剂盒连接到多克隆位点载体pCDFduet-1上,酶切位点为HindIII和XhoI,一步克隆引物为C1-F和C1-R(表1),构建得到质粒pCDFduet-1-APH1。再在pCDFduet-1-APH1质粒的基础上,通过一步克隆试剂盒将实施例2中使用的EN5连接到多克隆位点载体pCDFduet-1第二个克隆位点上,酶切位点为NdeI和XhoI,一步克隆引物为C2-F和C2-R,构建得到质粒pCDFduet-1-APH1-EN5,构建得到共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-APH1-EN5。APH1-EN5构建体如图2所示。
表1:克隆引物序列
引物 |
序列 |
C1-F |
CCCAAGCTTAAGGAGATATACATATGACCTCTCCCGCTTCCGT |
C1-R |
CCGCTCGAGCTATTGGATTCCGGCGTAAAGC |
C2-F |
CCCAAGCTTATGACGCCACAGGGCACGTTCTTCCTCCCGGGGCC |
C2-R |
CCGCTCGAG TTATCAGATGACTTCCCCTATCACGGCGAGGAGGGCGT |
实施例4:单菌多酶一锅一步去消旋化制备L-草铵膦
按照实施例3的方法构建和培养能够表达(R)-转氨酶和(S)-转氨酶***的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-APH1-EN5,离心收集菌体细胞。
30ml的反应体系包含500mM D,L-PPT,10mM丙酮酸,600mM L-天冬氨酸,100mM磷酸盐缓冲液,用氨水将反应体系的pH调节至8.0,加入共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-APH1-EN5 30g/L干细胞。反应条件为:温度30℃,转速250rpm。每隔一段时间取样(100μl),加入900μl去离子水,加热终止反应。通过HPLC检测D-PPT的转化情况和L-PPT的生成情况,反应进程曲线如图3所示。
结果显示,反应48小时,液相检测D-PPT为0mM,D-PPT转化率为99.9%,PPO为2mM,L-PPT为488mM,产品草铵膦的e.e.值为99.9%。
序列表
<110> 永农生物科学有限公司
<120> 利用生物多酶偶联法制备L-草铵膦的方法
<130> PD200280N
<160> 4
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 309
<212> PRT
<213> Pseudarthrobacter chlorophenolicus
<400> 1
Met Thr Ser Pro Ala Ser Val Val Leu Val Phe Leu Asp Pro Ala Phe
1 5 10 15
Pro Asp Gly Arg Leu Ala Asp Ala Ala Gln Pro Gln Leu Met Val Thr
20 25 30
Asp Gln Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Ile Phe Glu Thr Met Leu Ala
35 40 45
Val Arg Gly Ser Val Arg Lys Ile Gln Ala His Leu Asp Arg Leu Asp
50 55 60
Gly Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Ser Ile Pro Gly Gln Asp Asp Trp
65 70 75 80
Arg Arg Ala Ile Ala Thr Ala Ile Ala Glu His Gln Ala Gln Tyr Pro
85 90 95
Ala Pro Asp Ala Gly Asp Asp Glu Leu Val Val Lys Leu Val Val Thr
100 105 110
Arg Gly Val Glu Gly Ala Gly Ser Pro Thr Ala Trp Val Gln Val Ser
115 120 125
Pro Ala Pro Ala Ala Gly Arg Arg Gln Arg Glu Thr Gly Ile Asp Val
130 135 140
Ile Leu Leu Asp Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Val Ala Glu Arg Ala Pro
145 150 155 160
Trp Leu Leu Met Gly Ala Lys Thr Leu Ser Tyr Ala Val Asn Met Ala
165 170 175
Ala Leu Arg His Ala Arg Arg Gln Gly Ala Asp Asp Val Ile Phe Leu
180 185 190
Ser Ser Asp Gly Arg Val Leu Glu Gly Pro Thr Ser Thr Val Leu Leu
195 200 205
Ala His Val Glu Glu Ser Ala Asp Gly Thr Ala Ile Lys Arg Leu Ile
210 215 220
Thr Pro Gln Leu Asp Ser Gly Ile Leu Pro Gly Thr Ser Gln Gly Ala
225 230 235 240
Leu Phe Thr Ala Ala Lys Ala Ala Gly Trp Glu Leu Gly Tyr Gly Pro
245 250 255
Leu Glu Pro Gln Asp Leu Leu Asp Ala Asp Ala Val Trp Leu Ile Ser
260 265 270
Ser Val Arg Leu Leu Ala Pro Val Asn Thr Ile Asp Gly Lys Gln Ile
275 280 285
Gly Thr Pro Ala Leu Gln Lys Glu Leu Thr Ala Glu Leu Thr Gly Leu
290 295 300
Tyr Ala Gly Ile Gln
305
<210> 2
<211> 930
<212> DNA
<213> Pseudarthrobacter chlorophenolicus
<400> 2
atgacctctc ccgcttccgt ggtactcgtt ttccttgatc ccgccttccc cgacggccgg 60
ctggccgacg ccgcccagcc gcagctgatg gtcacggacc agggcgccac caggggcgat 120
ggcatcttcg aaacgatgct cgccgtgcgc gggtcagtcc gaaaaatcca ggcccacctg 180
gaccgcctgg acggctccgc ggcggcgctg gacctcagca tcccgggcca ggatgactgg 240
cggcgggcca ttgccactgc cattgccgaa caccaggcgc agtacccggc ccccgatgcg 300
ggcgacgatg aactggtggt caagctggtg gtcacccgcg gcgttgaagg tgcgggctcc 360
cccaccgcct gggtgcaggt ctcccctgct ccggccgccg gccgccgcca acgggaaaca 420
ggcatcgacg tcatcctcct tgaccgcggg tacgacagtg acgttgccga gcgtgcgccg 480
tggctgctca tgggcgccaa gacgctctcc tacgccgtca acatggccgc cctgcgccat 540
gcccgcaggc agggcgcaga cgacgtcatc ttcctgtcct cggatggccg cgtgcttgag 600
ggccccacgt ccacggtgct gctggcgcac gtggaggagt ccgctgacgg gacggccatc 660
aagcgcctca tcacgccgca gctggacagc ggcatcctgc ccggaacatc gcagggggcc 720
ctcttcaccg cggcaaaggc ggcgggctgg gaactgggct acggacccct ggaaccgcag 780
gacctgctgg atgccgacgc ggtctggctg atctccagtg tccgcctcct cgccccggtc 840
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<210> 3
<211> 353
<212> PRT
<213> Corynebacterium vitaeruminis DSM 20294
<400> 3
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1 5 10 15
Pro Asp Val Leu Ala Ala Gln Thr Arg Pro Met Ile Gly His Arg Gly
20 25 30
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50 55 60
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Ile
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<211> 1062
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<213> Corynebacterium vitaeruminis DSM 20294
<400> 4
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