JPH012594A

JPH012594A - Ｄ−セリンの製造法

Info

Publication number: JPH012594A
Application number: JP62-154992A
Authority: JP
Inventors: 治代佐藤; 伊藤　則子; 今村　伸三
Original assignee: 東レ株式会社
Filing date: 1987-06-22
Publication date: 1989-01-06
Anticipated expiration: 2011-06-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は医薬中間体とし有用なり一セリンを選択前化法
によって工業的に製造する方法に関するものである。

〈従来の技術〉ＤＬ−５−ヒドロキシメチルヒダントインを微生物によ
りＮ−カルバミル−Ｄ−セリンとしたのち、加水分解し
てＤ−セリンを得る方法はすでに知られている（特開昭
６１−１５２２９１号公報）。

〈発明が解決しようとする問題点〉前記方法はＤＬ−５−ヒドロキシメチルヒダントインか
らＤ−セリンを得る方法として優れている。

しかしながら、ＤＬ−５−ヒドロキシメチルしダントイ
ンからＮ−カルバミル−Ｄ−セリンを得る反応が４０％
以下と低収率であること、また、酵素活性が低く、生菌
体を使用する場合には５０　ｔ　／　Ｊ！もの分離菌体
を必要とするなど、工業的な製造法として有利な方法と
はいえない。

く問題点を解決するための手段および作用〉そこで、本
発明者らはＤＬ−セリンを含有する培地で微生物を培養
することにより、Ｌ−セリンのみを選択資化せしめ、Ｄ
−セリンをＨ造する方法を検討した。

この方法によれば、し−セリンは微生物が生育するため
のエネルギーとして消費されるために、Ｌ−セリンを全
量資化した時点では培地中にはＤ−セリンのみが蓄積さ
れ、他に副生物はほとんど存在しないことになる。

加えて、選ばれた微生物がラセマーゼを保有しないか、
あるいは保有したとしても不活性化される条件下で培養
することにより、ＤＬ−セリンに含まれるＤ−セリンは
実質的に理論量蓄積されることになる。

本発明者らは、このような目的に合致する微生物を探究
した。

すなわち、安価なりＬ−セリンを炭素源、窒素源として
含む培地中で、Ｌ−セリンのみを資化し、Ｄ−セリンを
実質的に資化しない、選択資化能を有する微生物につい
て探究したところ、特定の微生物をＤＬ−セリン培地で
培養することにより、数十ｇ／ｊ！以上の蓄積濃度でＤ
−セリンが得られることを見い出し、本発明を完成した
。

すなわち、本発明はＤＬ−セリンを含有する培地中で、
キャンディダ属、トルロプシス属、クリプトコツカス属
、サツカロマイコブシス属、ハンゼヌラ属などの酵母類
またはエッシエリヒア属、クレブシェラ属、プロビデン
シア属、ミクロバクテリウム属、セラチア属などの細菌
類に属しかつＬ−セリンを資化し、Ｄ−セリンを実質的
に資化しない能力を有する微生物を培養し、培養液中か
らＤ−セリンを単離採取することを特徴とするＤ−セリ
ンの製造法である。

以下、本発明の構成を詳述する。

本発明で使用する微生物としては、キャンディダ属、ト
ルロプシス属、クリプトコツカス属、サツカロマイコブ
シス属、ハンゼヌラ属などの酵母類、またはエッシェリ
ヒア属、クレブシェラ属、１０ビデ゛ンシア属、ミクロ
バクテリウム属、セラチア属などの細菌類に属する微生
物が挙げられる。

これらの微生物のうち、実質的にＤＬ−セリンを炭素源
および窒素源として含有する培地中で生育可能であって
、かつＬ−セリン資化能を有し、Ｄ−セリンを実質的に
資化しない微生物が本発明では使用される。

ここで、Ｄ−セリンを実質的に資化しない微生物とは、
本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてＤ−セ
リンを少量のみ資化する微生物、あるいは、Ｌ−セリン
資化後、Ｌ−セリンの不存在下ではＤ−セリンを資化す
る微生物も含まれる。

たとえば、キャンディダ・ルゴーザ１ｃａｎｄ　ｉｄａ
ｒｕｇｏｓａ）ＡＴＣＣ１０５７１、’？ヤンディダ・
リボリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｌ　１ｐｏｌｙｔｉｃ
ａ）　ｌ　Ｆ　００７１７、トルロプシス・キャンディ
ダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｃａｎｄｉｄａ）Ｉ　ＦＯ
Ｏ３８０、クリプトコツカス・ロウレンチ４　ｔｃｒｙ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｕｒｅｎｔｉｉ）ＡＴＣＣ３
６８３２，サツカロマイコブシス・リボリティカ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｎｙｃｏｐｓｉｓ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ
）ＡＴＣＣ２０３０６、ハンゼヌラ・アノマラ　（Ｈａ
ｎｓｅｎｕｌａ　ａｎｏｉａｌａ）　Ｉ　Ｆ　ＯＯ１２
０、エツシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）　Ｉ　Ａ　Ｍ　１２６８、クレブシェラ・プ
ノイモニア（に１ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎａｕｍｏｎｉ
ａｅ）　ＡＴＣＣ２１３１６、プロビデンシア・レトゲ
リ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒａｔｔｇｅｒｉ）Ａ　
Ｔ　ＣＣ９８８６、ミクロバクテリウム・アンモニアフ
ィルム（Ｈｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｌａｉｌｏｎｉａ
ｐｈｉｌｕｎ）Ｆ　ＥＲＭ−Ｐ２４０８、セラチア・マ
ルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎａｒｃｅｓｃｅｎｓ
）　Ｉ　ＡＭ　１２１４２などが挙げられる。

本発明では、ＤＬ−セリンを炭素源、窒素源として含有
する培地中で培養を行うが、他の炭素源および／または
窒素源を含有してもよい。

好ましくは、ＤＬ−セリンを単一炭素源、窒素源として
含有する培地中で培養を行う。

培地中のＤＬ−セリン濃度は１（中に１〜１５０ｇ、好
ましくは１０〜１００ｇである。ＤＬ−セリン濃度が低
いと生産効率が悪くなり、逆に濃度が高いと培養時間が
長くなり、また、微生物の生育が阻害される傾向となる
。

ＤＬ−セリンは始めから培養液に全量仕込んでもよいが
、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなったり、過飽
和のＤＬ＝セリンが析出してくるので初濃度を１〜４０
　ｇ　／　ｉ！にして、残りのＤＬ−セリンを分割添加
する流加培養法が好ましい。

培養は酸性で実施するのが好ましい。培養液は通常培養
開始時にｐ　Ｈ５〜６に調整する。培養が進むにつれて
ｐ　Ｈが上昇する。そのままで培養すると微生物の生育
速度が遅くなり、またＤ−セリンの回収率が低くなる傾
向となるのでｐ　Ｈを酸性に：ｌント１プールする必要
がある。

培養時のｐＨは通常４〜７、好ましくは４．５〜６．５
に調整する。調整用の酸としては、たとえばリン酸、硫
酸、塩酸などの無機酸水溶液が好ましい。

培養温度は通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃
である。

培養は通気しながら撹拌する。通気量は通常０．５〜２
．Ｏｖｖｍ、好ましくは０．６〜１，２ｖｖｎである。

通気量が少なすぎると微生物の生育が阻害され、Ｌ−セ
リンの資化速度も遅くなる。

また、多くても効果に変わりなく、むしろ培養液の蒸発
を促進するために培養液濃度が高くなったり、発泡が激
しくなり、好ましくない。

Ｌ−セリンがすべて資化された時点で培養を終了する。

Ｌ−セリンの全量資化はＤＯをモニターすることにより
、また、セリンのり、Ｌを分析するか、酸の添加量をモ
ニターすることにより知ることができる。

し−セリンがすべて資化されたのち、さらに培養を続け
るとＤ−セリンも徐々に資化される場合もあるので、培
養の終点を明確に知ることが好ましい。

かくして得られた培養液を遠心分離により菌体を除去し
たのち、通常の方法によってＤ−セリーンを単離すれば
よい、たとえば、イオン交換樹脂５Ｋ−ＩＢ（三菱化成
製）に通液してセリンを樹脂に吸着させたのちよく洗浄
する０次いでアンモニア水溶液で溶出させたのち、溶出
液を濃縮すればよい。ここで得られた粗り−セリンを水
で再結晶すれば精製されたＤ−セリンが得られる。

〈実施例〉以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例においてセリンの光学純度分析は、濃縮乾燥した
Ｄ−セリン含有粉末をメタノール−塩酸によりメチルエ
ステル化したのち３，５−ジニトロフェニルイソシアネ
ートと反応させたのちこれを次の条件によりＨＰ　Ｌ　
Ｃで分析する方法によって行った。

カラム：０Ａ−１０００（注文化学）移動ｌ：ｎ−ヘキサン：ジクロルメタン：エタノール（
４：２：１）流　速：　０．７　ｍｌ　／　ＩＩ　ｉ　ｎ検　出：Ｕ
Ｖ２５４ｎｍ実施例１乾燥ブイヨン３０　ｔ／　１．、　（ｐ　Ｈ６，０＞を
含む培地５０ｍ１を１１三角フラスコに分注し、１２０
℃、２０分間滅菌し、種培養培地とした。これにキャン
ディダ・ルゴーザＡＴＣＣ１０５７１を一白金耳植菌し
、３０℃で一日振とう培養した。一方、ＤＬ−セリン８
０　ｇ　／　Ｉｔ、リン酸−カリウム２　ｇ　／　Ｊ！
　、　Ｋ酸マグネシウム０６５ｇ／Ｊ２、粉末酵母エキ
ス１．０ｇ／ｌを含む培地（ｐＨ５，６）ＩＪを３４の
ミニジャーファーメンタ−に仕込み滅菌して主培養培地
とした。これに先の種培養液を接種し、３０℃、１．　
Ｏｖ　ｖ　ｒａ通気撹拌培養をした。なお、培養中は４
Ｎ硫酸によりｐ　Ｈ５，５±０．１に調整を行った。約
７０時間で培地中のし一セリンは全量資化され、Ｄ−セ
リン３７ｇ、硫酸アンモニウム２５ｇを含む培養液的１
．１１を得た。

この培養液を１０，０００ｒｐｎ＋１０分間遠心分離し
て菌体を除いたのち、イオン交換樹脂５Ｋ−ＩＢ（Ｈ型
）を充填したカラムにとおし、Ｄ−セリンを吸着させた
。このカラムを十分水洗したのち、４％アンモニア水で
Ｄ−セリンを溶出した。この溶出液を減圧濃縮し乾固し
てＤ−セリン３５ｇを得た。ＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析し
たところ、光学純度はり９．６％ｅｅ以上であった。

化学純度は９９．４％であった。

実施例２ＤＬ−セリン１０ｇ／オ、グルコース５ｇ／′ｌ、リン
酸−カリウム２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．５　ｔ　
／　Ｊ！　、粉末酵母エキス０．５ｇ／Ｒを含む培地（
ｐＨ５，０）５０ｍｌを１ｊ！三角フラスコに分注し、
滅菌して種培養培地とした。これにキャンデイダ・ルゴ
ーザＡＴＣＣ１０５７１を一白金耳植菌し、３０℃で約
２０時間後どう培養した。

一方、上記培地組成のうち、ＤＬ−セリンを３０　ｇ　
／　１とし、グルコ」スを除いた培地１１を３尤のミニ
ジャーファーメンタ−に仕込み滅菌し主培養培地とした
。これに先の種培養液を接種し、３０℃、１．　Ｏｖ　
ｖ　ｔｓで通気撹拌培養をした。培養中は、２Ｎ硫酸に
よりｐ　Ｈ５，６±０．１に調整を行った。約２０時間
後、培地中のＬ−セリンが資化されたところで、ＤＬ−
セリン３０Ｉｚを添加しさらに３０時間培養した。

以下、実施例１と同様にしてＤ−セリン２３゜３「を得
た。光学純度、化学純度はほぼ実施例１と、同様であっ
た。

実施例３〜１５乾燥ブイヨン３０　ｇ　／　１からなる種培地（ＰＨ５
，０）５ｍｌを１８Ｘ１８０ｍｉｎの試験管に分注し、
滅菌した。これに表１に示した微生物を一白金耳植菌し
、３０℃で１〜２日振とう培養した。一方、ＤＬ−セリ
ン１０’ｓｒ／Ｊ！、リン酸−カリウム２ｇ／Ｊ！、硫
酸マグネシウム０．５ｇ／ｌ、粉末酵母エキス１．０ｇ
／ｌよりなる主培養培地（ｐＨ５，６）５ｍｌを１８Ｘ
１８０ｎｍφ試験管に分注して滅菌した。これに先の種
培ｆ！液を５％シードで接種し、３０°Ｃで振とう培養
した。

２４時間後、遠心分離して菌体を除いたのち減圧濃縮し
て乾固したのち乾燥した。得られた固形分についてＨＰ
ＬＣにより残存したセリンの１体、９体の残存率を求め
た。

結果を表１に示す。

〈発明の効果〉本発明は次の効果を発揮する。

（１）ＤＬ−セリンを炭素源および窒素源として微生物
を培養することにより、Ｌ−セリンを高選択的に資化す
ることができる。

（２）さらに蓄積濃度も高く、短時間でＤ−セリンが得
られる。

（３）加えて、消費されたし一セリンはほとんど炭酸ガ
スと水にまで変換されて、培養液中にはＤ−セリン以外
の副生物は実質的には存在しない。

（４）このためにＤ−セリンの単離精製が容易である。

Claims

【特許請求の範囲】

ＤＬ−セリンを含有する培地中で、キャンディダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏ
ｐｓｉｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属な
どの酵母類またはエッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、
プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、ミクロ
バクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セ
ラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属などの細菌類に属しかつ
Ｌ−セリンを資化しＤ−セリンを実質的に資化しない能
力を有する微生物を培養し、培養液中からＤ−セリンを
単離採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。