JP2006246791A - D−アラニンの製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明はD−アラニンを発酵法によって工業的に製造する。
【解決手段】DL−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源を含有する培地中で、キャンディダ(Candida)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、ピキア(Pichia)属、トルロプシス(Torulopsis)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、ハンゼヌラ(Hansenura)属またはトルコスポロン(Torycosporon)属などのL−アラニンを資化しD−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からD−アラニンを採取する際に、DL−アラニンを含有する無機酸水溶液を添加することで培地のpHを調整する。
【選択図】なし
【解決手段】DL−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源を含有する培地中で、キャンディダ(Candida)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、ピキア(Pichia)属、トルロプシス(Torulopsis)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、ハンゼヌラ(Hansenura)属またはトルコスポロン(Torycosporon)属などのL−アラニンを資化しD−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からD−アラニンを採取する際に、DL−アラニンを含有する無機酸水溶液を添加することで培地のpHを調整する。
【選択図】なし
Description
本発明はD−アラニンを発酵法によって工業的に製造する方法に関するものである。
グルコースとDL−アラニンを含有する培地中で酵母を培養することによりD−アラニンを製造する方法はすでに知られている(非特許文献1)。
また、グルコースを炭素源とするコリネバクテリウム・ファスシアンスによる直接D−アラニン発酵法も知られている(特許文献1)。
1回の培養で得られるD−アラニンの生産量を増やすためには培養槽に大量の培養液を仕込む方法と培養液中のDL−アラニン濃度を増加させる方法がある。
特公昭51−21076号公報
「発酵と代謝」、15、89(1987)
前項について、非特許文献1に記載の方法は安価なDL−アラニンから、高価なD−アラニンを高純度で得る方法として優れている。
しかしながらDL−アラニン濃度を20g/l以上にすると菌の生育が阻止されるばかりでなく、L−アラニンの資化能も低下すること、また、D−アラニンも資化されてしまうために、残存D−アラニン回収率も低いことなどのために工業的に有利な方法とはいえない。
また、特許文献1に記載の方法はD−アラニンの蓄積濃度が6g/lと低いこと、培養時間が5日間と長いことなどのために、同様に工業的に有利な方法とはいえない。
しかも、従来技術はグルコース、グリセロールなどを炭素源とする培地で微生物を培養し、その微生物の保有する酵素によってL−アラニンを他の物質に変換せしめることにより、DL−アラニンからD−アラニンを製造する方法である。
また、D−アラニンの生産量を増やすために培養槽に大量の培養液を仕込む方法では、通気撹拌により起こる液面の上昇や発泡が原因で培養槽から培養液がオーバーフローする危険性がある。さらに、培養液中のDL−アラニン濃度を増加させる方法では、DL−アラニン濃度が高いため、微生物の成育が阻害され、培養時間が長くなるという問題点があった。
そこで、本発明者らはpHを酸性側にコントロールするための無機酸にDL−アラニンを溶かし込み、DL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地に追添加することにより、L−アラニンを資化せしめD−アラニンを製造する方法を検討した。
本発明は培養槽内の培養液量を制限でき、また、培地中のDL−アラニン濃度を微生物が正常に成育できる濃度のままで高効率にD−アラニンを蓄積させることができる培養方法に関する。
本発明者らは単一炭素源および単一窒素源として安価なDL−アラニンを使用しこの特定の培地を使用してL−アラニンのみを資化する選択的資化能を有する微生物を用いて、pH調整用硫酸に溶かしたDL−アラニン追添加後のD−アラニンの蓄積量および光学純度について探究した。また、L−アラニンを他の物質に変換する酵素としては、例えば、アラニル−tRNAシンテターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼなどが知られており、さらに、アラニンラセマーゼが知られている。
これらの酵素は例えば、スタフィロコッカス属、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ラクトバチルス属、バシリス属、トルロプシス属、ピキア属、デバリオマイセス属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属、サッカロマイセス属、アエロバクター属、ハンゼヌラ属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属などに属する微生物に存在する。
しかし、これらの微生物がL−アラニンを他の物質に変換する能力を有していても、D−アラニンをも変換する酵素が共に存在している場合やアラニン・ラセマーゼが存在している場合には、残留アラニン中にL−アラニンが混入するため、D−アラニンのみを蓄積することはできない。そこで、本発明は実質的にDL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプシス属、クリプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン属に属しかつL−アラニンを資化しD−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からD−アラニンを採取する際に、DL−アラニンを無機酸水溶液に溶かして追加添加することを特徴とするD−アラニンの製造法に関するものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)DL−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源を含有する培地中で、L−アラニンを資化しD−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からD−アラニンを採取する際に、DL−アラニンを含有する無機酸水溶液を添加することで培地のpHを調整することを特徴とするD−アラニンの製造法。
(2)L−アラニンを資化しD−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母が、キャンディダ(Candida)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、ピキア(Pichia)属、トルロプシス(Torulopsis)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、ハンゼヌラ(Hansenura)属またはトルコスポロン(Torycosporon)属のいずれかに属する酵母であることを特徴とする(1)記載のD−アラニンの製造法。
(3)無機酸が硫酸または塩酸またはリン酸である(1)または(2)記載のD−アラニンの製造法。
DL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として酵母を培養することにより、L−アラニンを高選択的に資化することができる。さらに蓄積濃度も高く、短時間でD−アラニンが得られる。
加えて、消費されたL−アラニンはほとんど炭酸ガスと水にまで変換されて、培養 液中にはD−アラニン以外の副生物は実質的には存在しない。このためにD−アラニンの単離精製が容易である。
培養槽に仕込む培養液の液量を増やすことなく一回の培養で得られるD−アラニンの生産量を増やすことができる。さらに初期DL−アラニン濃度を高くすることなく一回の培養で得られるD−アラニンの生産量を増やすことができる。
以下、本発明の構成を詳述する。
本発明で使用する酵母としては、L−アラニン資化能を有し、D−アラニンを実質的に資化しない酵母であれば、どのようなものでもよいが、キャンディダ属、サッカロマイコプシス属、ピキア属、トルロプシス属、クリプトコッカス属、ハンゼヌラ属またはトリコスポロン属に属する酵母が好ましく使用できる。これらの酵母のうち実質的にDL−アラニンを単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で生育可能であって、かつL−アラニン資化能を有し、D−アラニンを実質的に資化しない酵母が本発明では用いられる。
ここで、D−アラニンを実質的に資化しない酵母とは、本発明の効果を実質的に阻害しない範囲においてD−アラニンを少量のみ資化する酵母、あるいはL−アラニンの資化後、L−アラニンの不存在条件下ではD−アラニンを資化する酵母も含まれる。
例えば、キャンディダ・フミコーラ(Candida humicola)ATCC36992、キャンディダ・ルゴーザ(Candida rugosa)ATCC10571、サッカロマイコプシス・リポリティカ(Saccharomycopsis lipolytica)ATCC20306、サッカロマイコプシス・リポリティカ(Sacharomycopsis lipolytica)IFO 0717、クリプトコッカス・ラウレンティ(Cryptococcus laurentii)ATCC36832、トルロプシス・キャンディダ(Torulopsis candida)ATCC20284、トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)IFO 0005、ピキア・ブルトニー(Pichia burtonii)ATCC20279、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)IFO 0947、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)ATCC26012、ハンゼヌラ・カプスラータ(Hansenula capsulata)ATCC16753、トリコスポロン・ベイゲリー(Trichosporon beigelii)ATCC36993などが挙げられる。
本発明では、DL−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源として含有する培地中で培養を行う。すなわち、本発明では、培地中の炭素源および窒素源として実質的にDL−アラニンを用いるが、本発明の効果を阻害しない範囲内で他の炭素源および/または窒素源を少量含有していてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、でんぷんの加水分解物、糖密等の糖類、酢酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類等が使用でき、グルコース、フルクトースが好ましく使用できる。また、窒素源としては、酢酸アンモニウム等の有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等が使用でき、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウムが好ましく使用できる。DL−アラニン以外の炭素源および窒素源の濃度としては、培地中に0.01〜10g/l程度が好ましく、さらに好ましくは0.01g/l〜1g/lである。また、有機微量栄養素として粉末酵母エキスを適宜添加するのが好ましい。これらの他にリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム7水、硫酸亜鉛7水、硫酸第一鉄7水等の微量金属成分が添加される。
培地中のDL−アラニン濃度は1l中に1〜150g、好ましくは、30〜120gである。DL−アラニン濃度が低いと生産効率が悪く、逆に濃度が高いと培養時間が長くなり、また、微生物の生育が阻害される傾向となる。
DL−アラニンは始めから培養液に全量仕込んでもよいが、濃度が高くなると微生物の生育が遅くなり培養時間が長くなるので、初濃度を20〜50g/lにし、残りのDL−アラニンを分割添加する流加培養法が好ましい。
培養は酸性で実施するのが好ましい。培養液は通常培養開始時にpH5に調整するが、培養が進むにつれてpHが上昇する。そのままで培養するとD−アラニンの回収率が低下するので通常は、pHを酸性側にコントロールする。pHがアルカリ側になるとD−アラニンの回収率が低下する原因として、アラニン・ラセマーゼが活性化されること、またはD−アラニンアミノトランスフェラーゼが活性化されることなどにより、D−アラニンが資化されるものと考えられる。これらの理由から、培養時のpHは通常4〜7、好ましくは4.5〜6.5に調整する。調整用の酸としては、無機酸が好ましく、例えば、リン酸、硫酸、塩酸などの無機酸水溶液の状態で添加するのが好ましい。
本発明では、このpH調整を行う際に、DL−アラニンを含有する無機酸水溶液を培養液に添加するのがポイントである。無機酸水溶液にDL−アラニンを10〜1000g/lの濃度になるように含有させ、それを用いてpHの調整を行う。DL−アラニンを含有する無機酸水溶液添加の仕方は、pHが4.5〜6.5の範囲に保たれるように適宜添加するのが好ましい。こうすることで、D−アラニンの生産量を増加させることができる。
培養温度は通常20〜40℃、好ましくは25〜35℃である。
培養は通気しながら撹拌する。通気量は通常、0.5〜2.0vvm、好ましくは0.6〜1.2vvmである。通気量が少なすぎるとL−アラニン資化速度が遅くなる傾向となり、また、多くても効果に変わりなく、むしろ培養液の蒸発を促進するために培養液濃度が高くなったり、発泡が激しくなり好ましくない。
L−アラニンがすべて資化された時点で通常、培養を終了する。L−アラニンの全量資化はD−0をモニターすることにより、また、アラニンのD、Lを分析するか、酸の添加量をモニターすることにより知ることができる。L−アラニンがすべて資化されたのち、さらに培養を続けるとD−アラニンも徐々に資化される場合もあるので、培養の終点を明確に知ることが好ましい。
かくして得られた培養液を遠心分離により菌体を除去したのち、通常の方法によってD−アラニンを単離すればよい。
例えば、イオ交換樹脂SK−1B(三菱化学製)に通液してアラニンを樹脂に吸着させた後よく洗浄する。次いでアンモニア水溶液で溶出させたのち、溶出液を濃縮すればよい。ここで得られた粗D−アラニンを水で再結晶すれば精製されたD−アラニンが得られる。
実施例においてアラニンのDL分析は、遠心分離後のD−アラニン含有上清をトリエチルアミンとGITC(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-beta-D-glucopyranosyl Isothiocyanate)試薬により誘導体化し、ジエチルアミンを加えたのちこれを次の条件によりHPLCで分析する方法によって行った。
カラム:SG120 4.6mmφ×150(資生堂)
移動層:0.1Mリン酸:メタノール(56:44)
流速:1ml/min
検出:UV254nm
温度:35℃
(実施例1)
乾燥ブイヨン1.8g、無水ブドウ糖1.0gに水100mlを加えた培地を500ml三角フラスコに分注し、120℃、20分間滅菌し、種培養培地とした。これにキャンディダ・フミコーラATCC36992を一白金耳植菌し、30℃で一日振とう培養した。一方、DL−アラニン120g、リン酸一カリウム1.5g、硫酸マグネシウム7水0.75g、硫酸亜鉛7水0.03g、硫酸第一鉄7水0.03g、粉末酵母エキス0.75gに水1.5 lを加えた培地(pH5.0)を3 lのミニジャーファーメンターに仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の種培養培地を接種し、30℃、0.5vvm通気撹拌培養をした。約15時間後、この培養液を上記培養組成のうち、DL−アラニン225g、他は同じ組成とした新しい主培養培地に5%シードで接種し、先ほどと同条件で通気撹拌培養をした。培養中は12N硫酸70mlにDL−アラニン45gを溶かし込んだ硫酸によりpH5.0±0.1に調整して培養を行った。約39時間で添加を終えたのちも、さらに培養を続けた。培養を始めてから約45時間で培養は終結し、D−アラニン136gを含む培養液約1.75 lを得た。
移動層:0.1Mリン酸:メタノール(56:44)
流速:1ml/min
検出:UV254nm
温度:35℃
(実施例1)
乾燥ブイヨン1.8g、無水ブドウ糖1.0gに水100mlを加えた培地を500ml三角フラスコに分注し、120℃、20分間滅菌し、種培養培地とした。これにキャンディダ・フミコーラATCC36992を一白金耳植菌し、30℃で一日振とう培養した。一方、DL−アラニン120g、リン酸一カリウム1.5g、硫酸マグネシウム7水0.75g、硫酸亜鉛7水0.03g、硫酸第一鉄7水0.03g、粉末酵母エキス0.75gに水1.5 lを加えた培地(pH5.0)を3 lのミニジャーファーメンターに仕込み滅菌して主培養培地とした。これに先の種培養培地を接種し、30℃、0.5vvm通気撹拌培養をした。約15時間後、この培養液を上記培養組成のうち、DL−アラニン225g、他は同じ組成とした新しい主培養培地に5%シードで接種し、先ほどと同条件で通気撹拌培養をした。培養中は12N硫酸70mlにDL−アラニン45gを溶かし込んだ硫酸によりpH5.0±0.1に調整して培養を行った。約39時間で添加を終えたのちも、さらに培養を続けた。培養を始めてから約45時間で培養は終結し、D−アラニン136gを含む培養液約1.75 lを得た。
この培養液を10,000rpm10分間遠心分離して菌体を除いた上清をHPLCにより分析したところ、光学純度は99%ee以上であった。
(実施例2)
実施例1に示した操作のうち、pH調整に用いる酸を12N塩酸とし、他は実施例1と同条件で培養を行ったところ、収量、光学純度ともに実施例1と同様であった。
実施例1に示した操作のうち、pH調整に用いる酸を12N塩酸とし、他は実施例1と同条件で培養を行ったところ、収量、光学純度ともに実施例1と同様であった。
(実施例3)
実施例1に示した操作のうち、pH調整に用いる酸を12Nリン酸とし、他は実施例1と同条件で培養を行ったところ、収量、光学純度ともに実施例1と同様であった。
実施例1に示した操作のうち、pH調整に用いる酸を12Nリン酸とし、他は実施例1と同条件で培養を行ったところ、収量、光学純度ともに実施例1と同様であった。
(比較例1)
実施例1に示した操作のうち、DL−アラニン無添加の12N硫酸によりpH5.0±0.1に調整し他は同じ条件で培養を行った。培養は約40時間で終了し、D−アラニン113gを含む培養液約1.7lを得た。培養液から実施例1に示した操作で得られたD−アラニンの光学純度は99%ee以上であった。
実施例1に示した操作のうち、DL−アラニン無添加の12N硫酸によりpH5.0±0.1に調整し他は同じ条件で培養を行った。培養は約40時間で終了し、D−アラニン113gを含む培養液約1.7lを得た。培養液から実施例1に示した操作で得られたD−アラニンの光学純度は99%ee以上であった。
(比較例2)
実施例1に示した操作のうち、DL−アラニンを150g/lとした主培養培地を1.8lとして他は同じ条件で培養を行った。培養を始めてから30時間を過ぎたところで排気口から培養液がオーバーフローした。
実施例1に示した操作のうち、DL−アラニンを150g/lとした主培養培地を1.8lとして他は同じ条件で培養を行った。培養を始めてから30時間を過ぎたところで排気口から培養液がオーバーフローした。
Claims (3)
- DL−アラニンを実質的に単一炭素源および単一窒素源を含有する培地中で、L−アラニンを資化しD−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母を培養し、培養物からD−アラニンを採取する際に、DL−アラニンを含有する無機酸水溶液を添加することで培地のpHを調整することを特徴とするD−アラニンの製造法。
- L−アラニンを資化しD−アラニンを実質的に資化しない能力を有する酵母が、キャンディダ(Candida)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、ピキア(Pichia)属、トルロプシス(Torulopsis)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、ハンゼヌラ(Hansenura)属またはトルコスポロン(Torycosporon)属のいずれかに属する酵母であることを特徴とする請求項1記載のD−アラニンの製造法。
- 無機酸が硫酸または塩酸またはリン酸である請求項1または2記載のD−アラニンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005067925A JP2006246791A (ja) | 2005-03-10 | 2005-03-10 | D−アラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
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JP2005067925A JP2006246791A (ja) | 2005-03-10 | 2005-03-10 | D−アラニンの製造法 |
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ID=37087905
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JP2005067925A Pending JP2006246791A (ja) | 2005-03-10 | 2005-03-10 | D−アラニンの製造法 |
Country Status (1)
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JP (1) | JP2006246791A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009112305A (ja) * | 2007-10-16 | 2009-05-28 | Sapporo Breweries Ltd | 固体培地 |
US20110206823A1 (en) * | 2008-11-18 | 2011-08-25 | Asahi Breweries, Ltd | Method for producing amino acid-rich yeast |
US20110223288A1 (en) * | 2008-11-18 | 2011-09-15 | Asahi Breweries, Ltd. | Method for producing alanine-rich yeast |
-
2005
- 2005-03-10 JP JP2005067925A patent/JP2006246791A/ja active Pending
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US20110206823A1 (en) * | 2008-11-18 | 2011-08-25 | Asahi Breweries, Ltd | Method for producing amino acid-rich yeast |
US20110223288A1 (en) * | 2008-11-18 | 2011-09-15 | Asahi Breweries, Ltd. | Method for producing alanine-rich yeast |
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