JPH0856692A - 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 - Google Patents
自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用Info
- Publication number
- JPH0856692A JPH0856692A JP7087269A JP8726995A JPH0856692A JP H0856692 A JPH0856692 A JP H0856692A JP 7087269 A JP7087269 A JP 7087269A JP 8726995 A JP8726995 A JP 8726995A JP H0856692 A JPH0856692 A JP H0856692A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- self
- cells
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 85
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 51
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 10
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 3
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 claims description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 claims description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 241000283089 Perissodactyla Species 0.000 claims description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 2
- 241001493546 Suina Species 0.000 claims description 2
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 claims 1
- 102000008395 cell adhesion mediator activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 1
- 238000007860 single-cell PCR Methods 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 11
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 3
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- -1 haptens Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 3
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000008621 organismal health Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 108700019828 Hinge Exons Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 1
- 102100021852 Neuronal cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 101710130688 Neuronal cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000001593 brown adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000033772 system development Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、自己抗原またはそのホモログに対
するモノクローナル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を得る新規
の方法を提供する。 【構成】 本方法は、抗原の少なくとも１つのエピトー
プを生合成せず、そして抗原に特異的な抗体を産生する
エピトープに対する宿主の自己寛容の欠如を利用する、
遺伝的に操作された宿主動物を得ることを包含する。本
発明はまた、本方法により産生されるＡＭＡＢを包含す
る。本発明はさらに、細胞表面抗原に対する特異性を有
するＡＭＡＢの使用を含む細胞の単離方法を包含する。
するモノクローナル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を得る新規
の方法を提供する。 【構成】 本方法は、抗原の少なくとも１つのエピトー
プを生合成せず、そして抗原に特異的な抗体を産生する
エピトープに対する宿主の自己寛容の欠如を利用する、
遺伝的に操作された宿主動物を得ることを包含する。本
発明はまた、本方法により産生されるＡＭＡＢを包含す
る。本発明はさらに、細胞表面抗原に対する特異性を有
するＡＭＡＢの使用を含む細胞の単離方法を包含する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は自己抗原またはそのホモ
ログに対するモノクローナル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を
得る方法、およびこれらの抗体の細胞集団の分析におけ
る使用および細胞分離手法における使用に関する。
ログに対するモノクローナル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を
得る方法、およびこれらの抗体の細胞集団の分析におけ
る使用および細胞分離手法における使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗体は診断および治療の両方を含む医療
用途において有用であり、そして細胞分離を包含するバ
イオテクノロジーの用途においても有用であることが立
証されている。より一般的には、抗体を産生させ得る任
意の化合物を電子顕微鏡検査および酵素免疫測定アッセ
イのような種々の手法を用いて、同定および位置付けを
する際に抗体を使用することが、高い結合特異性を有す
る抗体によって容易になる。
用途において有用であり、そして細胞分離を包含するバ
イオテクノロジーの用途においても有用であることが立
証されている。より一般的には、抗体を産生させ得る任
意の化合物を電子顕微鏡検査および酵素免疫測定アッセ
イのような種々の手法を用いて、同定および位置付けを
する際に抗体を使用することが、高い結合特異性を有す
る抗体によって容易になる。
【０００３】抗体は、鎖間のジスルフィド結合および他
の分子内相互作用によって結合した重鎖および軽鎖の両
ポリペプチドを含有する。個々の重鎖および軽鎖は、こ
れらのジスルフィド結合によって対をなす。異なるクラ
スまたはアイソタイプの抗体のうち、３種のアイソタイ
プ（ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧ）はジスルフィド結
合により結合した２つの同じ重鎖／軽鎖対で構成され、
そして残りの２種のアイソタイプ（ＩｇＡおよびＩｇ
Ｍ）は同じ重鎖／軽鎖対の、より複雑なポリマーで構成
される。各鎖は定常部および可変部を含む。定常部はそ
の抗体を産生する動物および抗体の特定のアイソタイプ
に特有であり、可変部はその抗体が結合するエピトープ
の構造に対応する。
の分子内相互作用によって結合した重鎖および軽鎖の両
ポリペプチドを含有する。個々の重鎖および軽鎖は、こ
れらのジスルフィド結合によって対をなす。異なるクラ
スまたはアイソタイプの抗体のうち、３種のアイソタイ
プ（ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧ）はジスルフィド結
合により結合した２つの同じ重鎖／軽鎖対で構成され、
そして残りの２種のアイソタイプ（ＩｇＡおよびＩｇ
Ｍ）は同じ重鎖／軽鎖対の、より複雑なポリマーで構成
される。各鎖は定常部および可変部を含む。定常部はそ
の抗体を産生する動物および抗体の特定のアイソタイプ
に特有であり、可変部はその抗体が結合するエピトープ
の構造に対応する。
【０００４】「抗原」という用語は、本明細書中では基
質を意味し、これは、この基質に特異的に結合する抗体
の産生を誘起し得る分子の、分子全体または分子中のド
メインのいずれかである。さらに、この抗原という用語
は、本明細書中では、野生型の宿主生物においては、自
己認識によって抗体産生を誘起しないが、適当な遺伝学
的操作を受けた宿主動物においてはこのような応答を誘
起し得る基質を意味する。
質を意味し、これは、この基質に特異的に結合する抗体
の産生を誘起し得る分子の、分子全体または分子中のド
メインのいずれかである。さらに、この抗原という用語
は、本明細書中では、野生型の宿主生物においては、自
己認識によって抗体産生を誘起しないが、適当な遺伝学
的操作を受けた宿主動物においてはこのような応答を誘
起し得る基質を意味する。
【０００５】「エピトープ」という用語は、本明細書中
では、Ｂリンパ球によって認識される、抗原上の個別の
(discrete)三次元的な部位を意味する。エピトープは複
雑な抗原上の免疫学的に活性な領域であり、この領域は
Ｂ細胞レセプターに実際に結合し、その結果、このＢ細
胞により産生される抗体分子によっても実際に結合され
る領域である。抗原は一般に少なくとも１つのエピトー
プを有し、そして通常１つより多いエピトープを有する
ことが多い。タンパク質抗原のエピトープは線形または
非線形であり得る。線形のエピトープとはタンパク質の
アミノ酸配列中の連続したアミノ酸残基から構成される
エピトープである。線形エピトープは、立体的に折り畳
まれても折り畳まれていなくてもよく、天然の三次元構
造を形成し、そして免疫応答を誘起してこの抗原に対す
る結合特異性を有する抗体を産生する。非線形エピトー
プは不連続のアミノ酸残基から構成される。従って、非
線形エピトープは常にある程度タンパク質が折り畳まれ
ている必要があり、必要なアミノ酸残基を互いに近接さ
せて、天然の三次元構造を形成し、そして免疫応答を誘
起してこの抗原に対する結合特異性を有する抗体を産生
する。
では、Ｂリンパ球によって認識される、抗原上の個別の
(discrete)三次元的な部位を意味する。エピトープは複
雑な抗原上の免疫学的に活性な領域であり、この領域は
Ｂ細胞レセプターに実際に結合し、その結果、このＢ細
胞により産生される抗体分子によっても実際に結合され
る領域である。抗原は一般に少なくとも１つのエピトー
プを有し、そして通常１つより多いエピトープを有する
ことが多い。タンパク質抗原のエピトープは線形または
非線形であり得る。線形のエピトープとはタンパク質の
アミノ酸配列中の連続したアミノ酸残基から構成される
エピトープである。線形エピトープは、立体的に折り畳
まれても折り畳まれていなくてもよく、天然の三次元構
造を形成し、そして免疫応答を誘起してこの抗原に対す
る結合特異性を有する抗体を産生する。非線形エピトー
プは不連続のアミノ酸残基から構成される。従って、非
線形エピトープは常にある程度タンパク質が折り畳まれ
ている必要があり、必要なアミノ酸残基を互いに近接さ
せて、天然の三次元構造を形成し、そして免疫応答を誘
起してこの抗原に対する結合特異性を有する抗体を産生
する。
【０００６】「自己」という用語は、本明細書中では、
通常、宿主種によって生合成される基質、または通常そ
の宿主種が曝される基質に包含されているため、野生型
宿主種のＢ細胞レセプターによって認識されないか、あ
るいはごくわずかしか認識されない抗原またはエピトー
プを表す。このような基質は宿主免疫系の寛容を誘導
し、そしてその宿主はこの基質に対して「寛容にされ
た」という。
通常、宿主種によって生合成される基質、または通常そ
の宿主種が曝される基質に包含されているため、野生型
宿主種のＢ細胞レセプターによって認識されないか、あ
るいはごくわずかしか認識されない抗原またはエピトー
プを表す。このような基質は宿主免疫系の寛容を誘導
し、そしてその宿主はこの基質に対して「寛容にされ
た」という。
【０００７】脊椎動物の免疫系は自己抗原と外来抗原と
を識別し得、外来抗原に対しては抗体を介する免疫応答
を発現するが、自己抗原に対しては発現しない。抗体の
応答はＢ細胞によって媒介される。骨髄中でＢ細胞が成
熟する間に、整列していた配列において可変部の遺伝子
再配列が起こる。このプロセスの最後には、各Ｂ細胞は
イムノグロブリン重鎖をコードする単一の機能性可変部
ＤＮＡ配列と、イムノグロブリン軽鎖をコードする単一
の機能性可変部ＤＮＡ配列とを含有するようになる。こ
のプロセスにより、各々が抗原的に単一エピトープに関
与する、成熟した免疫適格性Ｂ細胞の産生に至る。まだ
明らかにされていないプロセスによって、「自己」成分
に対する免疫寛容は、抗原的に自己エピトープに関する
可変部を有するＢ細胞を選択的に除去して達成される。
この自己寛容は、宿主脊髄動物によって合成される抗原
またはエピトープに特異的な抗体の産生を防止する。従
って、宿主によって外来性と認識されるエピトープを含
む抗原のみが、抗体産生のために使用され得る。
を識別し得、外来抗原に対しては抗体を介する免疫応答
を発現するが、自己抗原に対しては発現しない。抗体の
応答はＢ細胞によって媒介される。骨髄中でＢ細胞が成
熟する間に、整列していた配列において可変部の遺伝子
再配列が起こる。このプロセスの最後には、各Ｂ細胞は
イムノグロブリン重鎖をコードする単一の機能性可変部
ＤＮＡ配列と、イムノグロブリン軽鎖をコードする単一
の機能性可変部ＤＮＡ配列とを含有するようになる。こ
のプロセスにより、各々が抗原的に単一エピトープに関
与する、成熟した免疫適格性Ｂ細胞の産生に至る。まだ
明らかにされていないプロセスによって、「自己」成分
に対する免疫寛容は、抗原的に自己エピトープに関する
可変部を有するＢ細胞を選択的に除去して達成される。
この自己寛容は、宿主脊髄動物によって合成される抗原
またはエピトープに特異的な抗体の産生を防止する。従
って、宿主によって外来性と認識されるエピトープを含
む抗原のみが、抗体産生のために使用され得る。
【０００８】自己エピトープと外来エピトープとが構造
的に類似、あるいは「相同」である場合、宿主の免疫応
答は弱くなる。従って、このようなエピトープに対して
高い親和性を有する抗体を得ることは実質的に不可能で
ある。この結果、タンパク質（例えば、ＮＣＡＭ、サイ
トカイン、およびイムノグロブリン）の高度に保存され
たドメインに対する抗体を生成することは非常に困難で
ある。なぜなら、この保存されたドメインを共有する動
物は、このドメインを外来性として認識できないからで
ある。ある種の自己免疫疾患の結果として、自己抗原に
対する抗体が産生されるが、これらの抗体は非常に限ら
れた一群の自己抗原に対して結合特異性を有するが、こ
れらは人工的に操作し得ず、一般に結合親和性が低い。
従って、自己免疫疾患の動物は、自己抗原に結合特異性
を有する抗体の産生に広く有用であるわけではない。
的に類似、あるいは「相同」である場合、宿主の免疫応
答は弱くなる。従って、このようなエピトープに対して
高い親和性を有する抗体を得ることは実質的に不可能で
ある。この結果、タンパク質（例えば、ＮＣＡＭ、サイ
トカイン、およびイムノグロブリン）の高度に保存され
たドメインに対する抗体を生成することは非常に困難で
ある。なぜなら、この保存されたドメインを共有する動
物は、このドメインを外来性として認識できないからで
ある。ある種の自己免疫疾患の結果として、自己抗原に
対する抗体が産生されるが、これらの抗体は非常に限ら
れた一群の自己抗原に対して結合特異性を有するが、こ
れらは人工的に操作し得ず、一般に結合親和性が低い。
従って、自己免疫疾患の動物は、自己抗原に結合特異性
を有する抗体の産生に広く有用であるわけではない。
【０００９】マウスでは、系統間のアロジェニックな差
異（allogeneic difference）によって、このようなア
ロジェニックな差異を生じるタンパク質に対して特異的
なマウス抗マウス抗体を産生することが可能である。Ke
sslerら、（1979）J. Immunol. 123:2772-2778; Reifお
よびAllen（1964）J. Exp. Med. 120:413-433; Marshak
-Rothstein（1979）J. Immunol. 122:2491-2497; なら
びにOiおよびHerzenberg（1979）Molec. Immunol. 16:1
005-1017を参照のこと。最初に、Ｔ細胞表面タンパク質
およびマウスＩｇＤ抗体に特異的なポリクローナル抗血
清およびモノクローナル抗体がこの方法で得られた。し
かし、これらの抗体は特定の系統のマウスの遺伝子産物
を認識するに過ぎない。これらの抗体は、抗体産生宿主
の自己抗原と構造的に相同ではないエピトープを認識し
得るに過ぎない。さらに、これらの抗体が得られ得るエ
ピトープは、系統間の差異およびアロタイプ系統自身の
入手可能性によって制限され、従って、実際には有用性
は少ない。
異（allogeneic difference）によって、このようなア
ロジェニックな差異を生じるタンパク質に対して特異的
なマウス抗マウス抗体を産生することが可能である。Ke
sslerら、（1979）J. Immunol. 123:2772-2778; Reifお
よびAllen（1964）J. Exp. Med. 120:413-433; Marshak
-Rothstein（1979）J. Immunol. 122:2491-2497; なら
びにOiおよびHerzenberg（1979）Molec. Immunol. 16:1
005-1017を参照のこと。最初に、Ｔ細胞表面タンパク質
およびマウスＩｇＤ抗体に特異的なポリクローナル抗血
清およびモノクローナル抗体がこの方法で得られた。し
かし、これらの抗体は特定の系統のマウスの遺伝子産物
を認識するに過ぎない。これらの抗体は、抗体産生宿主
の自己抗原と構造的に相同ではないエピトープを認識し
得るに過ぎない。さらに、これらの抗体が得られ得るエ
ピトープは、系統間の差異およびアロタイプ系統自身の
入手可能性によって制限され、従って、実際には有用性
は少ない。
【００１０】細胞集団を分析および分類する多くの方法
が考案されている。これらの方法には蛍光標示式細胞分
取（ＦＡＣＳ）、磁性分離（磁性ビーズに複合体化した
抗体を使用する）、および特定の細胞表面「マーカー」
として知られるタンパク質に対する抗体の親和性による
他の方法が包含されるがこれらに限定されない。細胞の
分析および分離に対するこのようなアプローチは、特
に、細胞系統の決定、特定の物質を合成し得る細胞の単
離、および特定の細胞タイプに伴う種々の疾患状態の治
療に有用である。例えば、高度に精製した造血幹細胞は
造血移植に必須であり、これにはガン患者および造血移
植に関連する他の器官の移植が包含されるがこれらに限
定されない。単離された細胞集団はまた、遺伝疾患、AI
DS、および種々の形態のガンの治療における遺伝子治療
のための重要な標的である。従って、種々の所定の細胞
を実質的に純粋な形態または純粋な形態で単離する数多
くの努力がなされてきた。幹細胞の単離のような場合に
は、このように体内で低濃度の細胞を効果的に精製する
ためには、幹細胞に特異的なマーカーを高い親和性で認
識し、かつこのマーカーに高い親和性で結合する抗体が
必要とされる。このような抗体を得ることは、ヒトとネ
ズミとで幹細胞マーカーが相同であるため、困難であ
る。
が考案されている。これらの方法には蛍光標示式細胞分
取（ＦＡＣＳ）、磁性分離（磁性ビーズに複合体化した
抗体を使用する）、および特定の細胞表面「マーカー」
として知られるタンパク質に対する抗体の親和性による
他の方法が包含されるがこれらに限定されない。細胞の
分析および分離に対するこのようなアプローチは、特
に、細胞系統の決定、特定の物質を合成し得る細胞の単
離、および特定の細胞タイプに伴う種々の疾患状態の治
療に有用である。例えば、高度に精製した造血幹細胞は
造血移植に必須であり、これにはガン患者および造血移
植に関連する他の器官の移植が包含されるがこれらに限
定されない。単離された細胞集団はまた、遺伝疾患、AI
DS、および種々の形態のガンの治療における遺伝子治療
のための重要な標的である。従って、種々の所定の細胞
を実質的に純粋な形態または純粋な形態で単離する数多
くの努力がなされてきた。幹細胞の単離のような場合に
は、このように体内で低濃度の細胞を効果的に精製する
ためには、幹細胞に特異的なマーカーを高い親和性で認
識し、かつこのマーカーに高い親和性で結合する抗体が
必要とされる。このような抗体を得ることは、ヒトとネ
ズミとで幹細胞マーカーが相同であるため、困難であ
る。
【００１１】
【発明の要旨】本発明は、自己抗原またはそのホモログ
に対するモノクローナル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を得る
新規の方法を提供する。本方法は、自己抗原内の改変形
態の少なくとも１つのエピトープを生合成しないまたは
合成しない遺伝的に操作された宿主動物を得ること、お
よび少なくとも１つのエピトープに対する宿主の自己寛
容の欠如を利用して抗原に特異的な抗体を産生すること
を包含する。本発明はまた、本方法により産生される抗
体またはそのあらゆる機能性誘導体を包含する。本発明
はさらに、本明細書に記載された方法により得られる、
細胞表面抗原に対して特異的な抗体を利用することを含
む、細胞の単離方法を包含する。
に対するモノクローナル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を得る
新規の方法を提供する。本方法は、自己抗原内の改変形
態の少なくとも１つのエピトープを生合成しないまたは
合成しない遺伝的に操作された宿主動物を得ること、お
よび少なくとも１つのエピトープに対する宿主の自己寛
容の欠如を利用して抗原に特異的な抗体を産生すること
を包含する。本発明はまた、本方法により産生される抗
体またはそのあらゆる機能性誘導体を包含する。本発明
はさらに、本明細書に記載された方法により得られる、
細胞表面抗原に対して特異的な抗体を利用することを含
む、細胞の単離方法を包含する。
【００１２】
【発明の構成】本発明は、自己抗原またはそのホモログ
に対して結合特異性を有するＡＭＡＢを得る新規の方法
を提供する。本発明は、宿主が自己として認識する抗原
に対するＡＭＡＢの産生の限界を克服する手段、ならび
に、「標的化抗体」、すなわち公知の特定の極めて正確
なエピトープに結合特異性を有するＡＭＡＢを得る方法
を提供する。本発明ではまた、成長および発育に不可欠
と考えられる生物学的分子またはそのエピトープに対す
るＡＭＡＢが得られる。本明細書中でさらに十分に議論
されているように、標的化遺伝的置換はその分子の機能
的等価物を産生させ、こうして動物が抗体を産生するに
十分に成長および発育させる。
に対して結合特異性を有するＡＭＡＢを得る新規の方法
を提供する。本発明は、宿主が自己として認識する抗原
に対するＡＭＡＢの産生の限界を克服する手段、ならび
に、「標的化抗体」、すなわち公知の特定の極めて正確
なエピトープに結合特異性を有するＡＭＡＢを得る方法
を提供する。本発明ではまた、成長および発育に不可欠
と考えられる生物学的分子またはそのエピトープに対す
るＡＭＡＢが得られる。本明細書中でさらに十分に議論
されているように、標的化遺伝的置換はその分子の機能
的等価物を産生させ、こうして動物が抗体を産生するに
十分に成長および発育させる。
【００１３】用語「ホモログ」とは、本明細書中では、
宿主動物により産生される抗原、すなわち「自己抗原」
に非常に似ているため、ホモログに対する抗体の産生を
排除するまたは顕著に妨げる構造を有する抗原を意味す
る。用語「自己抗原またはそのホモログ」とは、本明細
書中では、本発明は、自己抗原に対する結合特異性を有
するＡＭＡＢを得ることに関するだけでなく、むしろ自
己抗原に対して非常に高度な構造類似性のためあらゆる
化合物に対するＡＭＡＢを得ることに関すること、およ
びホモログは自己として十分に認識され、適切な抗体を
介する免疫応答を宿主動物が生じないことを意味するた
めに用いる。適切な抗体を介する免疫応答では、ＡＭＡ
Ｂが得られないか、あるいは、産生される場合、ＡＭＡ
Ｂが抗原に高い親和性を有さないかのいずれかのうちの
１つである。
宿主動物により産生される抗原、すなわち「自己抗原」
に非常に似ているため、ホモログに対する抗体の産生を
排除するまたは顕著に妨げる構造を有する抗原を意味す
る。用語「自己抗原またはそのホモログ」とは、本明細
書中では、本発明は、自己抗原に対する結合特異性を有
するＡＭＡＢを得ることに関するだけでなく、むしろ自
己抗原に対して非常に高度な構造類似性のためあらゆる
化合物に対するＡＭＡＢを得ることに関すること、およ
びホモログは自己として十分に認識され、適切な抗体を
介する免疫応答を宿主動物が生じないことを意味するた
めに用いる。適切な抗体を介する免疫応答では、ＡＭＡ
Ｂが得られないか、あるいは、産生される場合、ＡＭＡ
Ｂが抗原に高い親和性を有さないかのいずれかのうちの
１つである。
【００１４】用語「標的抗原」とは、本明細書では、宿
主動物がそれに曝され、かつそれに対する免疫応答が生
じるような組成物を意味する。「標的抗原エピトープ」
とはＡＭＡＢが結合する標的抗原上の領域である。
主動物がそれに曝され、かつそれに対する免疫応答が生
じるような組成物を意味する。「標的抗原エピトープ」
とはＡＭＡＢが結合する標的抗原上の領域である。
【００１５】用語「免疫応答」とは、本明細書中では、
Ｂ細胞によるＡＭＡＢの産生を意味する。これらの抗体
は、病気を引き起こす因子へ免疫性を与えるような抗原
変化をもたらすかどうかに関係なく特定の抗原に結合す
る。ＡＭＡＢはＢ細胞表面に会合し得、そしてまた自由
に循環し得る。
Ｂ細胞によるＡＭＡＢの産生を意味する。これらの抗体
は、病気を引き起こす因子へ免疫性を与えるような抗原
変化をもたらすかどうかに関係なく特定の抗原に結合す
る。ＡＭＡＢはＢ細胞表面に会合し得、そしてまた自由
に循環し得る。
【００１６】用語「構造的に非相同」とは、本明細書中
では、遺伝的に操作した結果、宿主動物により生合成さ
れた抗原と自己抗原とを比較する記述として用いられ
る。一方に結合するが他方に結合しない抗体が生じ得る
とき、２つの抗原は構造的に非相同である。構造的に非
相同とは、２つまたはそれ以上の抗原間でいくつかの構
造的な差異、おそらくわずかな差異があることを意味す
る。２つの抗原間の構造的に非相同な差異は、ただ１つ
のアミノ酸の差異、あるいはメチル基の存在または非存
在のような小さなものであり得る。
では、遺伝的に操作した結果、宿主動物により生合成さ
れた抗原と自己抗原とを比較する記述として用いられ
る。一方に結合するが他方に結合しない抗体が生じ得る
とき、２つの抗原は構造的に非相同である。構造的に非
相同とは、２つまたはそれ以上の抗原間でいくつかの構
造的な差異、おそらくわずかな差異があることを意味す
る。２つの抗原間の構造的に非相同な差異は、ただ１つ
のアミノ酸の差異、あるいはメチル基の存在または非存
在のような小さなものであり得る。
【００１７】用語「機能的に等価」とは、本明細書中で
は、遺伝的に操作した結果、宿主動物により生合成され
た標的抗原と自己抗原とを比較する記述として用いられ
る。多くの場合、抗体の獲得を妨害することにより、自
己抗原の合成を中断させるように遺伝的に操作した宿主
動物が致死的であるか、生存が低減しているか、または
全身的に健康かが証明され得る。したがって、本明細書
中に記載するように、遺伝的に操作することは、自己抗
原の生合成を排除するために用い得、そして他の機能的
に等価な抗原の産生を引き起こし得る。この機能的に等
価な抗原は、ＡＭＡＢが得られ得る程度にまで宿主動物
の生存率、全身的な健康、または免疫適格性を改良する
ことにより、自己抗原の有害な排除を補うに十分な量の
自己抗原機能をもたらす。本明細書で用いられるよう
に、機能的に等価な抗原は、構造的に非相同であること
が理解される。
は、遺伝的に操作した結果、宿主動物により生合成され
た標的抗原と自己抗原とを比較する記述として用いられ
る。多くの場合、抗体の獲得を妨害することにより、自
己抗原の合成を中断させるように遺伝的に操作した宿主
動物が致死的であるか、生存が低減しているか、または
全身的に健康かが証明され得る。したがって、本明細書
中に記載するように、遺伝的に操作することは、自己抗
原の生合成を排除するために用い得、そして他の機能的
に等価な抗原の産生を引き起こし得る。この機能的に等
価な抗原は、ＡＭＡＢが得られ得る程度にまで宿主動物
の生存率、全身的な健康、または免疫適格性を改良する
ことにより、自己抗原の有害な排除を補うに十分な量の
自己抗原機能をもたらす。本明細書で用いられるよう
に、機能的に等価な抗原は、構造的に非相同であること
が理解される。
【００１８】用語「生合成レパートリー」とは、本明細
書中では、所定の宿主動物により生合成される化合物全
体を意味する。
書中では、所定の宿主動物により生合成される化合物全
体を意味する。
【００１９】用語「野生型」とは、本明細書中では、標
的抗原に関しては遺伝的に操作されておらず、そしてこ
のような遺伝的に操作された生物系統ではない、宿主種
および宿主系統の個体を意味する。
的抗原に関しては遺伝的に操作されておらず、そしてこ
のような遺伝的に操作された生物系統ではない、宿主種
および宿主系統の個体を意味する。
【００２０】用語「遺伝的に操作する」とは、特定の抗
原または特定の一群の抗原の合成を防止または改変する
ように直接的に改変または排除された１つまたはそれ以
上の遺伝子を有する動物を記述するのに用いられる。こ
のような改変または削除（例えば特異的な遺伝的なノッ
クアウトおよび置換による）は、遺伝的レベルにある。
標的抗原の遺伝的操作は、一般に、本明細書中に記載さ
れているように、抗原または一連の抗原上の少なくとも
１つのエピトープに対して増強した結合特異性を有する
抗体が得られ得る範囲にまで限定される。用語「遺伝的
に操作された」はまた、初めから改変されている動物の
子孫に適用される。
原または特定の一群の抗原の合成を防止または改変する
ように直接的に改変または排除された１つまたはそれ以
上の遺伝子を有する動物を記述するのに用いられる。こ
のような改変または削除（例えば特異的な遺伝的なノッ
クアウトおよび置換による）は、遺伝的レベルにある。
標的抗原の遺伝的操作は、一般に、本明細書中に記載さ
れているように、抗原または一連の抗原上の少なくとも
１つのエピトープに対して増強した結合特異性を有する
抗体が得られ得る範囲にまで限定される。用語「遺伝的
に操作された」はまた、初めから改変されている動物の
子孫に適用される。
【００２１】用語「ドメイン」とは、本明細書中では、
抗原のあらゆる領域または部分を意味し、これには、抗
体全体、抗原全体よりも少ないあらゆる領域、または少
なくとも１つのエピトープをマスクするように作用し得
る追加成分によって抗原全体よりも大きくなるあらゆる
領域を包含する。
抗原のあらゆる領域または部分を意味し、これには、抗
体全体、抗原全体よりも少ないあらゆる領域、または少
なくとも１つのエピトープをマスクするように作用し得
る追加成分によって抗原全体よりも大きくなるあらゆる
領域を包含する。
【００２２】本発明は、自己抗原に対するモノクローナ
ル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を非ヒト脊椎動物宿主から得
る方法に関する。
ル性自己抗体（ＡＭＡＢ）を非ヒト脊椎動物宿主から得
る方法に関する。
【００２３】本発明の好ましい実施態様では、以下の工
程を包含する： ａ）該自己抗原の少なくとも１つのエピトープを産生し
ないように該宿主動物のゲノムを改変する工程； ｂ）該自己抗原またはそのホモログを含有する組成物で
該宿主動物を免疫する工程； ｃ）該自己抗原またはそのホモログに応答して産生され
る宿主細胞であって、該自己抗原またはそのホモログに
対する抗体を発現する該宿主細胞を収集する工程；およ
び ｄ）該収集した細胞または該細胞由来の遺伝学的材料を
用いて抗体を産生する工程。
程を包含する： ａ）該自己抗原の少なくとも１つのエピトープを産生し
ないように該宿主動物のゲノムを改変する工程； ｂ）該自己抗原またはそのホモログを含有する組成物で
該宿主動物を免疫する工程； ｃ）該自己抗原またはそのホモログに応答して産生され
る宿主細胞であって、該自己抗原またはそのホモログに
対する抗体を発現する該宿主細胞を収集する工程；およ
び ｄ）該収集した細胞または該細胞由来の遺伝学的材料を
用いて抗体を産生する工程。
【００２４】本発明の１つの局面では、上記宿主動物は
少なくとも１つのエピトープの機能的等価物を産生す
る。
少なくとも１つのエピトープの機能的等価物を産生す
る。
【００２５】本発明の他の局面では、上記宿主動物は少
なくとも１つのエピトープの構造的ホモログを産生す
る。
なくとも１つのエピトープの構造的ホモログを産生す
る。
【００２６】本発明の１つの局面では、上記抗体は、単
一の予め富化した抗原特異的Ｂ細胞および単一細胞ＰＣ
Ｒを用いて単離された、この抗体をコードする組換え遺
伝子を発現することにより産生される。
一の予め富化した抗原特異的Ｂ細胞および単一細胞ＰＣ
Ｒを用いて単離された、この抗体をコードする組換え遺
伝子を発現することにより産生される。
【００２７】本発明の１つの実施態様では、宿主動物は
特定の自己抗原を合成しないように遺伝的に操作されて
いる。遺伝的に改変された宿主が自己抗原またはそのホ
モログで免疫される場合、宿主の免疫系は、自己抗原を
自己として認識せず、したがってＡＭＡＢが得られ得る
抗体媒介免疫応答を生じ得る。このような「ノックアウ
ト」変異体を得る方法は当該技術分野で公知であり、例
えば、Mansourら、Nature 336:348-352（1986）に記載
されている。本明細書中で用いられるほとんどの遺伝的
に操作された宿主動物では、ホモ接合変異体を得るため
に、または何回も遺伝的に操作した宿主動物を得るため
に繁殖が用いられ得る。したがって、宿主に対する遺伝
的改変は最終的に生殖系列伝達を介して得られ得る。
特定の自己抗原を合成しないように遺伝的に操作されて
いる。遺伝的に改変された宿主が自己抗原またはそのホ
モログで免疫される場合、宿主の免疫系は、自己抗原を
自己として認識せず、したがってＡＭＡＢが得られ得る
抗体媒介免疫応答を生じ得る。このような「ノックアウ
ト」変異体を得る方法は当該技術分野で公知であり、例
えば、Mansourら、Nature 336:348-352（1986）に記載
されている。本明細書中で用いられるほとんどの遺伝的
に操作された宿主動物では、ホモ接合変異体を得るため
に、または何回も遺伝的に操作した宿主動物を得るため
に繁殖が用いられ得る。したがって、宿主に対する遺伝
的改変は最終的に生殖系列伝達を介して得られ得る。
【００２８】遺伝的に操作されたマウスの子孫もまた本
発明に包含される。トランスジェニック動物を産生する
当該技術分野で公知のあらゆる他の方法も、本明細書中
での使用に適切である。適切な方法には、Ｋｉｔａｍｕ
ｒａら、（1991）Nature 350:423-426；Shinkaiら、（1
993）Science 259:822-825；およびKomoriら、（1993）
Science 261:1171-1175の記載が包含されるがこれらに
限定されない。簡単に述べると、免疫系の自己抗原の場
合では、遺伝子改変がホモ接合の胚幹（ＥＳ）細胞を、
ＲＡＧ−欠失マウスのような免疫不全マウスの未分化胚
芽細胞に移植し得る。多くの場合、再形成した動物は免
疫欠失の表現型を欠き、そのリンパ球に遺伝子改変を含
む。
発明に包含される。トランスジェニック動物を産生する
当該技術分野で公知のあらゆる他の方法も、本明細書中
での使用に適切である。適切な方法には、Ｋｉｔａｍｕ
ｒａら、（1991）Nature 350:423-426；Shinkaiら、（1
993）Science 259:822-825；およびKomoriら、（1993）
Science 261:1171-1175の記載が包含されるがこれらに
限定されない。簡単に述べると、免疫系の自己抗原の場
合では、遺伝子改変がホモ接合の胚幹（ＥＳ）細胞を、
ＲＡＧ−欠失マウスのような免疫不全マウスの未分化胚
芽細胞に移植し得る。多くの場合、再形成した動物は免
疫欠失の表現型を欠き、そのリンパ球に遺伝子改変を含
む。
【００２９】本発明の他の実施態様では、宿主動物を特
定の自己抗原の合成が機能的に等価な抗原の合成により
置換されるように遺伝的に操作する。従って、排除され
ることによって致死的になり、劇的に生存が低減するこ
とが証明される抗原に対して抗体が得られ得るか、さも
なくば抗体を獲得する努力を妨げ得る。
定の自己抗原の合成が機能的に等価な抗原の合成により
置換されるように遺伝的に操作する。従って、排除され
ることによって致死的になり、劇的に生存が低減するこ
とが証明される抗原に対して抗体が得られ得るか、さも
なくば抗体を獲得する努力を妨げ得る。
【００３０】宿主の生合成レパートリーから除かれる自
己抗原は、あらゆる化合物、ドメイン、またはそれらの
エピトープであり得、通常は野生型宿主種により合成さ
れる。本発明により得られる抗体は、タンパク質、ペプ
チド、炭水化物、脂質、核酸、酵素補因子、あるいはあ
らゆる天然に生じる凝集物またはそれらの共有結合複合
物、あるいはそれらのあらゆるリン酸化種または硫酸化
種を含むがこれらに限定されないあらゆる抗原に対す
る。本発明のこれらの実施態様では、宿主は抗原の生合
成が排除または改変されるようなあらゆる方法で遺伝的
に操作され得る。例えば、抗原の生合成に包含される特
定の酵素の発現をノックアウトすることで、抗原の非産
生または機能的に等価な抗原の産生が生じ得る。例え
ば、自己抗原またはそのホモログの生合成は、この抗原
またはそのホモログを産生する代謝経路に影響を与える
酵素をコードする遺伝子の変異により排除される。この
ような酵素には重合化に含まれる酵素が含まれるがそれ
らに限定されず、糖タンパク質の合成におけるような炭
水化物、リン酸基、脂質、硫黄含有基のタンパク質への
付加が排除される結果、タンパク質に共有結合する化合
物の構造を除去または変化させる。従って、特定の自己
糖タンパク質または糖タンパク質上の炭水化物構造に結
合特性を有する抗体が、本発明の方法により得られ得
る。また、このような酵素には、自己抗原またはそのホ
モログを産生する代謝経路に影響を与える酵素が包含さ
れる。
己抗原は、あらゆる化合物、ドメイン、またはそれらの
エピトープであり得、通常は野生型宿主種により合成さ
れる。本発明により得られる抗体は、タンパク質、ペプ
チド、炭水化物、脂質、核酸、酵素補因子、あるいはあ
らゆる天然に生じる凝集物またはそれらの共有結合複合
物、あるいはそれらのあらゆるリン酸化種または硫酸化
種を含むがこれらに限定されないあらゆる抗原に対す
る。本発明のこれらの実施態様では、宿主は抗原の生合
成が排除または改変されるようなあらゆる方法で遺伝的
に操作され得る。例えば、抗原の生合成に包含される特
定の酵素の発現をノックアウトすることで、抗原の非産
生または機能的に等価な抗原の産生が生じ得る。例え
ば、自己抗原またはそのホモログの生合成は、この抗原
またはそのホモログを産生する代謝経路に影響を与える
酵素をコードする遺伝子の変異により排除される。この
ような酵素には重合化に含まれる酵素が含まれるがそれ
らに限定されず、糖タンパク質の合成におけるような炭
水化物、リン酸基、脂質、硫黄含有基のタンパク質への
付加が排除される結果、タンパク質に共有結合する化合
物の構造を除去または変化させる。従って、特定の自己
糖タンパク質または糖タンパク質上の炭水化物構造に結
合特性を有する抗体が、本発明の方法により得られ得
る。また、このような酵素には、自己抗原またはそのホ
モログを産生する代謝経路に影響を与える酵素が包含さ
れる。
【００３１】抗原の産生を排除または変化させるより全
体的な方法が利用され得る。これらの方法には、特定の
遺伝子または遺伝子ファミリーの合成を排除すること、
および特定の細胞タイプを除去することが包含されるが
これらに限定されない。適切な遺伝子または遺伝子ファ
ミリーの例には、ステロイドまたはサイトカインのよう
な特定の因子の存在により調節されるものあるいは細胞
タイプ特異的に発現される遺伝子が含まれる。これらの
細胞タイプの１例は、褐色脂肪細胞である。
体的な方法が利用され得る。これらの方法には、特定の
遺伝子または遺伝子ファミリーの合成を排除すること、
および特定の細胞タイプを除去することが包含されるが
これらに限定されない。適切な遺伝子または遺伝子ファ
ミリーの例には、ステロイドまたはサイトカインのよう
な特定の因子の存在により調節されるものあるいは細胞
タイプ特異的に発現される遺伝子が含まれる。これらの
細胞タイプの１例は、褐色脂肪細胞である。
【００３２】本発明の好ましい実施態様では、抗原はタ
ンパク質である。タンパク質についてのノックアウト変
異には、完全なタンパク質の合成を妨げること（完全な
遺伝子を除去することによって、あるいは転写制御因子
または翻訳制御因子を改変することによって）、または
唯一の抗原性ドメインの合成を排除することが包含され
るが、残りのタンパク質部分は正常に合成される。当該
技術分野で公知のあらゆる形態の置換が本明細書中での
使用に適切であるが、タンパク質抗原の場合では、自己
抗原と機能的に等価な抗原との置換は少なくとも３つの
異なるタイプの置換を伴う。
ンパク質である。タンパク質についてのノックアウト変
異には、完全なタンパク質の合成を妨げること（完全な
遺伝子を除去することによって、あるいは転写制御因子
または翻訳制御因子を改変することによって）、または
唯一の抗原性ドメインの合成を排除することが包含され
るが、残りのタンパク質部分は正常に合成される。当該
技術分野で公知のあらゆる形態の置換が本明細書中での
使用に適切であるが、タンパク質抗原の場合では、自己
抗原と機能的に等価な抗原との置換は少なくとも３つの
異なるタイプの置換を伴う。
【００３３】第１に、自己抗原をコードする遺伝子が、
自己抗原をコードする遺伝子に由来する組換え遺伝子に
より置換され得る。タンパク質をコードする遺伝子は、
抗原領域が欠失し、改変アミノ酸配列により置換される
ように改変されるか、または新規アミノ酸配列の追加に
よりマスクされるように改変される。従って、自己タン
パク質抗原の改変における遺伝的に操作された抗原の除
去は、単一のアミノ酸の追加、排除、または置換のよう
な小さなことであり得る。重要なことは、自己タンパク
質抗原の構造におけるこのような小さな変化により、エ
ピトープに対して非常に正確なＡＭＡＢが自己抗原の機
能を大きく妨害することなく得られ得る。適切なドメイ
ンにおける単一のアミノ酸の変化の結果、その単一のア
ミノ酸を含むエピトープに対するＡＭＡＢを生じる。
自己抗原をコードする遺伝子に由来する組換え遺伝子に
より置換され得る。タンパク質をコードする遺伝子は、
抗原領域が欠失し、改変アミノ酸配列により置換される
ように改変されるか、または新規アミノ酸配列の追加に
よりマスクされるように改変される。従って、自己タン
パク質抗原の改変における遺伝的に操作された抗原の除
去は、単一のアミノ酸の追加、排除、または置換のよう
な小さなことであり得る。重要なことは、自己タンパク
質抗原の構造におけるこのような小さな変化により、エ
ピトープに対して非常に正確なＡＭＡＢが自己抗原の機
能を大きく妨害することなく得られ得る。適切なドメイ
ンにおける単一のアミノ酸の変化の結果、その単一のア
ミノ酸を含むエピトープに対するＡＭＡＢを生じる。
【００３４】第２に、自己抗原をコードする遺伝子が、
コードするタンパク質が機能的に等価だが少なくとも一
部は抗原的に非等価となるように、宿主種に関連のある
生物から得られる相同なタンパク質をコードする遺伝子
により置換され得る。非常に関連のある種は、通常同じ
タンパク質に高度な配列相同性（典型的には９０％より
大きい）を有する。従ってこの方法は、抗原の発現が生
物の健康に重要である場合に本発明を実施するには理想
的であり、そして少数のエピトープに結合特異性を有す
るＡＭＡＢが望ましい。この方法はまた、自己抗原をコ
ードする遺伝子の１つの領域のみを、関連する種に由来
する同じ抗原をコードする遺伝子の対応する領域に置換
することにより実施され得る。
コードするタンパク質が機能的に等価だが少なくとも一
部は抗原的に非等価となるように、宿主種に関連のある
生物から得られる相同なタンパク質をコードする遺伝子
により置換され得る。非常に関連のある種は、通常同じ
タンパク質に高度な配列相同性（典型的には９０％より
大きい）を有する。従ってこの方法は、抗原の発現が生
物の健康に重要である場合に本発明を実施するには理想
的であり、そして少数のエピトープに結合特異性を有す
るＡＭＡＢが望ましい。この方法はまた、自己抗原をコ
ードする遺伝子の１つの領域のみを、関連する種に由来
する同じ抗原をコードする遺伝子の対応する領域に置換
することにより実施され得る。
【００３５】第３に、自己抗原をコードする遺伝子が、
同じかまたは類似の機能を有するが構造的に非相同であ
ることが知られているタンパク質をコードする遺伝子に
より置換され得る。この方法は、抗原の発現が生物の健
康に重要であり、特定のエピトープに結合特異性を有す
るＡＭＡＢが必要ではない場合に特に有用である。
同じかまたは類似の機能を有するが構造的に非相同であ
ることが知られているタンパク質をコードする遺伝子に
より置換され得る。この方法は、抗原の発現が生物の健
康に重要であり、特定のエピトープに結合特異性を有す
るＡＭＡＢが必要ではない場合に特に有用である。
【００３６】本発明により得られるＡＭＡＢが結合特異
性を有し得るタンパク質抗原の例には、細胞表面抗原が
包含されるが、これに限定されない。細胞表面抗原に
は、細胞接着分子、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII
分子、インテグリン、サイトカイン、セレクチン、サイ
トカインレセプター、およびイムノグロブリン（例えば
ＩｇＤ抗体）が包含されるがこれらに限定されない。
性を有し得るタンパク質抗原の例には、細胞表面抗原が
包含されるが、これに限定されない。細胞表面抗原に
は、細胞接着分子、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII
分子、インテグリン、サイトカイン、セレクチン、サイ
トカインレセプター、およびイムノグロブリン（例えば
ＩｇＤ抗体）が包含されるがこれらに限定されない。
【００３７】本発明は、魚類、は虫類、両生類、鳥類、
および哺乳類を包含する任意の、非ヒト脊椎動物宿主を
用いて実施され得る。しかし、宿主はほとんどの場合、
哺乳類であり、通常、齧歯類、兎類、霊長類、食肉類、
奇蹄類、および偶蹄類が包含されるがこれらに限定され
ない種類に属する。好ましくは、宿主はネズミであり、
より好ましくはマウスである。
および哺乳類を包含する任意の、非ヒト脊椎動物宿主を
用いて実施され得る。しかし、宿主はほとんどの場合、
哺乳類であり、通常、齧歯類、兎類、霊長類、食肉類、
奇蹄類、および偶蹄類が包含されるがこれらに限定され
ない種類に属する。好ましくは、宿主はネズミであり、
より好ましくはマウスである。
【００３８】ＡＭＡＢを作製する方法は当該技術分野で
公知であり、本明細書中では詳細に述べない。モノクロ
ーナル抗体産生の分野で公知のあらゆる方法を、ここで
使用し得る。このような方法には、所望の特異性を有す
る細胞表面抗体によりＢ細胞を分離すること、軽鎖およ
び重鎖の可変部を発現するＤＮＡをクローニングするこ
と、および適切な宿主細胞中で組換え遺伝子を発現させ
ることが包含されるがこれらに限定されない。標準モノ
クローナル抗体産生手法を使用し得、ここで、ＡＭＡＢ
は不死化抗体産生ハイブリドーマ細胞から得られる。こ
れらのハイブリドーマは、Ｂリンパ球、好ましくは免疫
された宿主の脾臓から単離されたＢリンパ球と、それと
適合する不死化細胞、好ましくはＢ細胞ミエローマとを
融合することにより産生され得る。
公知であり、本明細書中では詳細に述べない。モノクロ
ーナル抗体産生の分野で公知のあらゆる方法を、ここで
使用し得る。このような方法には、所望の特異性を有す
る細胞表面抗体によりＢ細胞を分離すること、軽鎖およ
び重鎖の可変部を発現するＤＮＡをクローニングするこ
と、および適切な宿主細胞中で組換え遺伝子を発現させ
ることが包含されるがこれらに限定されない。標準モノ
クローナル抗体産生手法を使用し得、ここで、ＡＭＡＢ
は不死化抗体産生ハイブリドーマ細胞から得られる。こ
れらのハイブリドーマは、Ｂリンパ球、好ましくは免疫
された宿主の脾臓から単離されたＢリンパ球と、それと
適合する不死化細胞、好ましくはＢ細胞ミエローマとを
融合することにより産生され得る。
【００３９】本発明はさらに、本明細書中に記載された
方法によって得られるＡＭＡＢを含有する物質の組成物
をも包含する。本明細書中で用いるように、「ＡＭＡ
Ｂ」または「抗体」という用語は、抗体全体、およびそ
の機能性部分を含む抗体フラグメントを包含する。「Ａ
ＭＡＢ」という用語は、抗体全体が結合特異性を有して
いるエピトープへ結合するに充分な、軽鎖可変部および
／または重鎖可変部の部分から構成される、あらゆる単
一特異性化合物を包含する。上記フラグメントは少なく
とも１つの重鎖イムノグロブリンポリペプチドまたは軽
鎖イムノグロブリンポリペプチドの可変部を含み得、そ
してＦａｂフラグメント、Ｆａｂ2フラグメント、およ
びＦvフラグメントを包含するがこれらに限定されな
い。
方法によって得られるＡＭＡＢを含有する物質の組成物
をも包含する。本明細書中で用いるように、「ＡＭＡ
Ｂ」または「抗体」という用語は、抗体全体、およびそ
の機能性部分を含む抗体フラグメントを包含する。「Ａ
ＭＡＢ」という用語は、抗体全体が結合特異性を有して
いるエピトープへ結合するに充分な、軽鎖可変部および
／または重鎖可変部の部分から構成される、あらゆる単
一特異性化合物を包含する。上記フラグメントは少なく
とも１つの重鎖イムノグロブリンポリペプチドまたは軽
鎖イムノグロブリンポリペプチドの可変部を含み得、そ
してＦａｂフラグメント、Ｆａｂ2フラグメント、およ
びＦvフラグメントを包含するがこれらに限定されな
い。
【００４０】さらに、単一特異性ドメインは、当該技術
分野で公知のあらゆる方法により、他の適切な分子に付
着し得る。この付着は、例えば、化学的あるいは遺伝学
的操作によって行われ得る。ＡＭＡＢは、当該技術分野
で公知のあらゆる組換え手段によって産生され得る。こ
のような組換えＡＭＡＢには、細菌において産生された
フラグメント、そしてその定常部の大部分がヒト抗体の
定常部によって置換されたＡＭＡＢが包含されるがこれ
らに限定されない。さらに、このような「ヒト化」ＡＭ
ＡＢは、本明細書中に記載の遺伝的に操作された宿主脊
椎動物を、野生型Ｉｇ遺伝子座の代わりに機能性ヒトＩ
ｇ遺伝子座を発現する適合するトランスジェニック動物
で作り出すことによって得られ得る。ヒトＩｇ遺伝子座
を発現するトランスジェニック動物に関しては、WIPO公
開公報WO 91/10741号、およびRajewskyらのDE P422816
2.8を参照のこと。うまく交配すると、特別に自己抗原
を発現しないが、ヒト化Ｉｇタンパク質を発現する宿主
動物が得られ得る。このような動物が免疫されると、こ
の動物は特定の自己抗原に対するヒト化ＡＭＡＢまたは
部分ヒト化ＡＭＡＢを産生する。このようなヒト化ＡＭ
ＡＢは、治療指示薬（therapeutic indication）に使用
するのに好ましい。
分野で公知のあらゆる方法により、他の適切な分子に付
着し得る。この付着は、例えば、化学的あるいは遺伝学
的操作によって行われ得る。ＡＭＡＢは、当該技術分野
で公知のあらゆる組換え手段によって産生され得る。こ
のような組換えＡＭＡＢには、細菌において産生された
フラグメント、そしてその定常部の大部分がヒト抗体の
定常部によって置換されたＡＭＡＢが包含されるがこれ
らに限定されない。さらに、このような「ヒト化」ＡＭ
ＡＢは、本明細書中に記載の遺伝的に操作された宿主脊
椎動物を、野生型Ｉｇ遺伝子座の代わりに機能性ヒトＩ
ｇ遺伝子座を発現する適合するトランスジェニック動物
で作り出すことによって得られ得る。ヒトＩｇ遺伝子座
を発現するトランスジェニック動物に関しては、WIPO公
開公報WO 91/10741号、およびRajewskyらのDE P422816
2.8を参照のこと。うまく交配すると、特別に自己抗原
を発現しないが、ヒト化Ｉｇタンパク質を発現する宿主
動物が得られ得る。このような動物が免疫されると、こ
の動物は特定の自己抗原に対するヒト化ＡＭＡＢまたは
部分ヒト化ＡＭＡＢを産生する。このようなヒト化ＡＭ
ＡＢは、治療指示薬（therapeutic indication）に使用
するのに好ましい。
【００４１】ＡＭＡＢは他の化合物と複合体化し得る。
この化合物には、酵素、リポーター酵素、リポソーム、
磁性ビーズ、コロイド磁性ビーズ、固体キャリア、毒
素、ハプテン、蛍光色素、蛍光粒子、金属化合物、放射
性の化合物、薬剤、またはハプテンが包含されるがこれ
らに限定されない。ＡＭＡＢに複合体化し得る酵素に
は、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレ
アーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼが包含されるがこ
れらに限定されない。ＡＭＡＢに複合体化し得る蛍光色
素には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメ
チルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリ
ン、アロフィコシアニン類（allophycocyanins）、およ
びテキサスレッドが包含されるがこれらに限定されな
い。抗体に複合体化し得るその他の蛍光色素に関して
は、Haugland, R. P. Molecular Probes: Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-19
94)を参照のこと。ＡＭＡＢに複合体化し得る金属化合
物には、フェリチン、金コロイド、および特にコロイド
超常磁性粒子（ビーズ）が包含されるが、これらに限定
されない。ＡＭＡＢに複合体化し得るハプテンには、ビ
オチン、ジゴキシゲニン、オキサゾロン（oxazalon
e）、およびニトロフェノールが包含されるが、これら
に限定されない。ＡＭＡＢに複合体化し得るかまたは導
入し得る放射性化合物は当該技術分野で公知であり、放
射性同位元素のテクネチウム９９ｍ（99ＴＣ）、
125Ｉ、および任意の放射性核（14Ｃ、3Ｈおよび35Ｓが
包含されるが、これらに限定されない）を含有するアミ
ノ酸が包含されるが、これらに限定されない。当該技術
分野で公知の任意の方法によってタンパク質に複合体化
し得る当該技術分野で公知のあらゆる薬剤が、本発明に
おける使用に適している。このような薬剤は、この薬剤
を標的分子へ高度に特異的に送達するために、ＡＭＡＢ
に複合体化され得る。
この化合物には、酵素、リポーター酵素、リポソーム、
磁性ビーズ、コロイド磁性ビーズ、固体キャリア、毒
素、ハプテン、蛍光色素、蛍光粒子、金属化合物、放射
性の化合物、薬剤、またはハプテンが包含されるがこれ
らに限定されない。ＡＭＡＢに複合体化し得る酵素に
は、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレ
アーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼが包含されるがこ
れらに限定されない。ＡＭＡＢに複合体化し得る蛍光色
素には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメ
チルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリ
ン、アロフィコシアニン類（allophycocyanins）、およ
びテキサスレッドが包含されるがこれらに限定されな
い。抗体に複合体化し得るその他の蛍光色素に関して
は、Haugland, R. P. Molecular Probes: Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-19
94)を参照のこと。ＡＭＡＢに複合体化し得る金属化合
物には、フェリチン、金コロイド、および特にコロイド
超常磁性粒子（ビーズ）が包含されるが、これらに限定
されない。ＡＭＡＢに複合体化し得るハプテンには、ビ
オチン、ジゴキシゲニン、オキサゾロン（oxazalon
e）、およびニトロフェノールが包含されるが、これら
に限定されない。ＡＭＡＢに複合体化し得るかまたは導
入し得る放射性化合物は当該技術分野で公知であり、放
射性同位元素のテクネチウム９９ｍ（99ＴＣ）、
125Ｉ、および任意の放射性核（14Ｃ、3Ｈおよび35Ｓが
包含されるが、これらに限定されない）を含有するアミ
ノ酸が包含されるが、これらに限定されない。当該技術
分野で公知の任意の方法によってタンパク質に複合体化
し得る当該技術分野で公知のあらゆる薬剤が、本発明に
おける使用に適している。このような薬剤は、この薬剤
を標的分子へ高度に特異的に送達するために、ＡＭＡＢ
に複合体化され得る。
【００４２】本発明はさらにＡＭＡＢを使用する方法を
提供し、この方法にはイムノアッセイおよび細胞分離が
包含されるがこれらに限定されない。適切なイムノアッ
セイは当該技術分野で公知であり、本明細書中で詳細に
記述する必要はない。イムノアッセイには、ＥＬＩＳＡ
およびＲＩＡが包含されるがこれらに限定されない。細
胞の分離方法には、分子の分泌に基づく分離方法および
細胞表面分子に基づく分離方法が包含されるがこれらに
限定されない。分子の分泌に基づく細胞の分離方法は、
米国特許出願第07/965,934号および国際出願番号PCT/US
93/10126に記載されている。特異的な細胞表面マーカー
に基づいて細胞を分離する方法は一般に、本明細書中に
記載される方法によってＡＭＡＢを得る工程、ＡＭＡＢ
を異種細胞集団に接触させる工程、および細胞表面抗原
に対するＡＭＡＢの親和性に基づく細胞分離手法を行う
工程を包含する。まず特定の細胞表面抗原を有する細胞
を除去するか、あるいは特定の細胞系統を除去すること
による、当該技術分野で公知のあらゆる方法が、細胞の
分離または単離のために用いられ得る。
提供し、この方法にはイムノアッセイおよび細胞分離が
包含されるがこれらに限定されない。適切なイムノアッ
セイは当該技術分野で公知であり、本明細書中で詳細に
記述する必要はない。イムノアッセイには、ＥＬＩＳＡ
およびＲＩＡが包含されるがこれらに限定されない。細
胞の分離方法には、分子の分泌に基づく分離方法および
細胞表面分子に基づく分離方法が包含されるがこれらに
限定されない。分子の分泌に基づく細胞の分離方法は、
米国特許出願第07/965,934号および国際出願番号PCT/US
93/10126に記載されている。特異的な細胞表面マーカー
に基づいて細胞を分離する方法は一般に、本明細書中に
記載される方法によってＡＭＡＢを得る工程、ＡＭＡＢ
を異種細胞集団に接触させる工程、および細胞表面抗原
に対するＡＭＡＢの親和性に基づく細胞分離手法を行う
工程を包含する。まず特定の細胞表面抗原を有する細胞
を除去するか、あるいは特定の細胞系統を除去すること
による、当該技術分野で公知のあらゆる方法が、細胞の
分離または単離のために用いられ得る。
【００４３】ＡＭＡＢは、特定の細胞系統および／また
は特定の分化段階に関連するマーカーを同定するために
特に有用である。ＡＭＡＢは固体支持体に直接または間
接に付着し分離を可能とする。使用する分離手法は、採
集する画分の生存率を最大限に保持するような方法であ
るべきである。分離するために、異なる効果を有する種
々の手法が用いられ得る。このような分離では、マーカ
ーを持たないで存在する細胞全体の、10％まで、通常約
５％以下、好ましくは約１％以下が、保持される細胞集
団と共に残存し得る。用いられる所定の手法は、分離効
率、方法の細胞毒性、実行の容易さおよび速さ、そして
精巧な器具および／または技術の必要性に依存する。
は特定の分化段階に関連するマーカーを同定するために
特に有用である。ＡＭＡＢは固体支持体に直接または間
接に付着し分離を可能とする。使用する分離手法は、採
集する画分の生存率を最大限に保持するような方法であ
るべきである。分離するために、異なる効果を有する種
々の手法が用いられ得る。このような分離では、マーカ
ーを持たないで存在する細胞全体の、10％まで、通常約
５％以下、好ましくは約１％以下が、保持される細胞集
団と共に残存し得る。用いられる所定の手法は、分離効
率、方法の細胞毒性、実行の容易さおよび速さ、そして
精巧な器具および／または技術の必要性に依存する。
【００４４】細胞分離の手順には、コロイド磁性粒子に
結合した抗体を用いる磁性分離、アフィニティークロマ
トグラフィー、およびモノクローナル抗体に結合した細
胞毒性試薬、または当該技術分野で公知の任意の抗体依
存性分離手法と共に用いられる細胞毒性試薬が包含され
るがこれらに限定されない。さらに、細胞は固体マトリ
ックス（例えばプレート）に付着した抗体を用いる「パ
ンニング」によって分離し得る。蛍光標示式細胞分取器
（ＦＡＣＳ）もまた使用し得る。これは、異なる程度の
精巧さを有し得、複数のカラーチャネル、鋭角（low an
gle）および鈍角（obtuse）光散乱検出チャネル、およ
びインピーダンスチャネルが包含されるがこれらに限定
されない。当該技術分野で公知のあらゆる抗体依存性分
離手法を、抗体の親和性よりもむしろ細胞の物理的性質
に依存するポジティブおよびネガティブ両方の分離手法
と共に使用し得る。このような細胞の物理的性質に依存
する分離手法には、溶離および密度勾配遠心分離法が包
含されるがこれらに限定されない。
結合した抗体を用いる磁性分離、アフィニティークロマ
トグラフィー、およびモノクローナル抗体に結合した細
胞毒性試薬、または当該技術分野で公知の任意の抗体依
存性分離手法と共に用いられる細胞毒性試薬が包含され
るがこれらに限定されない。さらに、細胞は固体マトリ
ックス（例えばプレート）に付着した抗体を用いる「パ
ンニング」によって分離し得る。蛍光標示式細胞分取器
（ＦＡＣＳ）もまた使用し得る。これは、異なる程度の
精巧さを有し得、複数のカラーチャネル、鋭角（low an
gle）および鈍角（obtuse）光散乱検出チャネル、およ
びインピーダンスチャネルが包含されるがこれらに限定
されない。当該技術分野で公知のあらゆる抗体依存性分
離手法を、抗体の親和性よりもむしろ細胞の物理的性質
に依存するポジティブおよびネガティブ両方の分離手法
と共に使用し得る。このような細胞の物理的性質に依存
する分離手法には、溶離および密度勾配遠心分離法が包
含されるがこれらに限定されない。
【００４５】細胞の分離方法は、Dynal（Oslo、Norwa
y）、Cellpro（Seattle）、またはAdvanced Magnetics
（Boston）から市販されている。例えば、モノクローナ
ル性自己抗体は、Dynal M 450のような磁性ポリスチレ
ン粒子または同様の磁性粒子に直接結合し得、そして例
えば、細胞分離に使用され得る。あるいは、抗体はビオ
チン化され得、あるいはジゴキシゲニンと結合し得、そ
してアビジンコーティングまたは抗ジゴキシゲニンコー
ティングされた、SEPARATE LC（Cellpro）のようなアフ
ィニティーカラムと共に使用し得る。しかし、好ましい
実施態様では、モノクローナル性自己抗体は、例えば多
糖類による有機コーティングを有するコロイド超常磁性
粒子と組み合わせて使用される。Miltenyiら、（1990）
Cytometry11:231-238を参照のこと。これらの粒子の大
きさは１０ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは４０ｎｍと１
００ｎｍとの間であり得、そして自己抗体に直接結合し
ていてもよく、または抗イムノグロブリン、アビジン、
または抗ハプテン特異的マイクロビーズと組み合わせて
使用されてもよい。例えば、抗体をハプテンにより修飾
し、そしてコロイド超常磁性粒子がハプテン修飾物を認
識する。多糖類コーティングされた超常磁性粒子はMilt
enyi Biotec GmbH、Germanyから市販されている。ま
た、抗体結合コロイド超常磁性粒子は、目的の細胞に結
合し、この細胞が高勾配磁性分離を用いて単離される。
また、細胞の亜群が上記抗体に結合し、さらにこの抗体
は、抗イムノグロブリン特異的コロイド超常磁性粒子に
より認識される。
y）、Cellpro（Seattle）、またはAdvanced Magnetics
（Boston）から市販されている。例えば、モノクローナ
ル性自己抗体は、Dynal M 450のような磁性ポリスチレ
ン粒子または同様の磁性粒子に直接結合し得、そして例
えば、細胞分離に使用され得る。あるいは、抗体はビオ
チン化され得、あるいはジゴキシゲニンと結合し得、そ
してアビジンコーティングまたは抗ジゴキシゲニンコー
ティングされた、SEPARATE LC（Cellpro）のようなアフ
ィニティーカラムと共に使用し得る。しかし、好ましい
実施態様では、モノクローナル性自己抗体は、例えば多
糖類による有機コーティングを有するコロイド超常磁性
粒子と組み合わせて使用される。Miltenyiら、（1990）
Cytometry11:231-238を参照のこと。これらの粒子の大
きさは１０ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは４０ｎｍと１
００ｎｍとの間であり得、そして自己抗体に直接結合し
ていてもよく、または抗イムノグロブリン、アビジン、
または抗ハプテン特異的マイクロビーズと組み合わせて
使用されてもよい。例えば、抗体をハプテンにより修飾
し、そしてコロイド超常磁性粒子がハプテン修飾物を認
識する。多糖類コーティングされた超常磁性粒子はMilt
enyi Biotec GmbH、Germanyから市販されている。ま
た、抗体結合コロイド超常磁性粒子は、目的の細胞に結
合し、この細胞が高勾配磁性分離を用いて単離される。
また、細胞の亜群が上記抗体に結合し、さらにこの抗体
は、抗イムノグロブリン特異的コロイド超常磁性粒子に
より認識される。
【００４６】用い得る手順の１つは、まず細胞を低温
（通常約４℃）で短時間、所定の細胞表面抗原に特異的
な飽和レベルのＡＭＡＢと共にインキュベートし、次い
でその細胞をＰＢＳおよびウシ胎児血清（ＦＣＳ）緩衝
剤（cushion）で洗浄する方法である。次いで、細胞を
上記のような緩衝液に懸濁し、そして、ＡＭＡＢまたは
ＡＭＡＢ抗原複合体に特異的な種々のタンパク質を用い
て、特定の抗原決定基に対するＡＭＡＢに基づいて細胞
を分離する。
（通常約４℃）で短時間、所定の細胞表面抗原に特異的
な飽和レベルのＡＭＡＢと共にインキュベートし、次い
でその細胞をＰＢＳおよびウシ胎児血清（ＦＣＳ）緩衝
剤（cushion）で洗浄する方法である。次いで、細胞を
上記のような緩衝液に懸濁し、そして、ＡＭＡＢまたは
ＡＭＡＢ抗原複合体に特異的な種々のタンパク質を用い
て、特定の抗原決定基に対するＡＭＡＢに基づいて細胞
を分離する。
【００４７】ＡＭＡＢは、特定の細胞タイプの分離を容
易にするマーカーと複合体化され得る。このマーカーに
は、磁性ビーズ（これは直接分離される）、ビオチン
（これは支持体に結合したアビジンまたはストレプトア
ビジンで除去し得る）、ジゴキシゲニン（これは抗ジゴ
キシゲニン抗体で検出される）、蛍光色素（これはＦＡ
ＣＳに使用され得る）などが包含されるがこれらに限定
されない。残留する細胞の生存率を過度に損なわない限
り、いかなる手法も使用し得る。
易にするマーカーと複合体化され得る。このマーカーに
は、磁性ビーズ（これは直接分離される）、ビオチン
（これは支持体に結合したアビジンまたはストレプトア
ビジンで除去し得る）、ジゴキシゲニン（これは抗ジゴ
キシゲニン抗体で検出される）、蛍光色素（これはＦＡ
ＣＳに使用され得る）などが包含されるがこれらに限定
されない。残留する細胞の生存率を過度に損なわない限
り、いかなる手法も使用し得る。
【００４８】細胞表面抗原を含む細胞（例えば抗原特異
的Ｂ細胞）の実質的な富化（一般に少なくとも約50％、
好ましくは少なくとも約70％）後、細胞は、ＦＡＣＳま
たは当該技術分野で公知の他の方法によって分離され得
る。種々の方法による多色分析を使用し得、これらには
ＦＡＣＳおよび蛍光顕微鏡が包含されるがこれらに限定
されない。この細胞は、特定の抗原に対する染色の程度
に基づいて分離され得る。
的Ｂ細胞）の実質的な富化（一般に少なくとも約50％、
好ましくは少なくとも約70％）後、細胞は、ＦＡＣＳま
たは当該技術分野で公知の他の方法によって分離され得
る。種々の方法による多色分析を使用し得、これらには
ＦＡＣＳおよび蛍光顕微鏡が包含されるがこれらに限定
されない。この細胞は、特定の抗原に対する染色の程度
に基づいて分離され得る。
【００４９】本発明はさらに、本明細書中に記載された
方法によって、レセプターである自己抗原に対するＡＭ
ＡＢを得ること、およびこのようなＡＭＡＢを薬剤とし
て使用することを包含し、ここでＡＭＡＢはレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストとしての有効性を示
す。
方法によって、レセプターである自己抗原に対するＡＭ
ＡＢを得ること、およびこのようなＡＭＡＢを薬剤とし
て使用することを包含し、ここでＡＭＡＢはレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストとしての有効性を示
す。
【００５０】以下の実施例により本発明を説明するが、
限定はしない。
限定はしない。
【００５１】
（実施例１） （遺伝子の標的化）Ｃδ遺伝子の標的化を、Roesおよび
Rajewsky、J. Exp. Med. 177：45-55（1993）；ならび
にRoesおよびRajewsky、Int. Immunol. ３：1367（199
1）に記載されるように行った。簡単に述べると、全部
で１０8個のＥ１４−１ ＥＳ細胞を、Ｃδ１エキソンの
大部分を置換するように、そしてこのエキソンに存在す
る制限部位を充たすことによって、Ｃδ３中にフレーム
シフト変異を挿入するように設計された標的化ベクター
を用いてトランスフェクトした。生殖系列へ変異を導入
した結果、両方のδ鎖Ｉｇドメインエキソンを機能的に
不活性化した。これは、Ｌ鎖のμと競合し得る、かつ分
泌され得る短縮型δＨ鎖の発現の可能性を除くのに重要
であると考えられた。マウス生殖系列におけるフレーム
シフトの存在が、Ｃδ３中のＨｉｎｄIII部位を充たし
た結果生じるＮｈｅＩ制限部位により示された。Ｃδ２
エキソンは、非機能性スプライシングアクセプターに帰
因する偽エキソンである。
Rajewsky、J. Exp. Med. 177：45-55（1993）；ならび
にRoesおよびRajewsky、Int. Immunol. ３：1367（199
1）に記載されるように行った。簡単に述べると、全部
で１０8個のＥ１４−１ ＥＳ細胞を、Ｃδ１エキソンの
大部分を置換するように、そしてこのエキソンに存在す
る制限部位を充たすことによって、Ｃδ３中にフレーム
シフト変異を挿入するように設計された標的化ベクター
を用いてトランスフェクトした。生殖系列へ変異を導入
した結果、両方のδ鎖Ｉｇドメインエキソンを機能的に
不活性化した。これは、Ｌ鎖のμと競合し得る、かつ分
泌され得る短縮型δＨ鎖の発現の可能性を除くのに重要
であると考えられた。マウス生殖系列におけるフレーム
シフトの存在が、Ｃδ３中のＨｉｎｄIII部位を充たし
た結果生じるＮｈｅＩ制限部位により示された。Ｃδ２
エキソンは、非機能性スプライシングアクセプターに帰
因する偽エキソンである。
【００５２】選択で生き残ったコロニーをＰＣＲで分析
し、そして陽性クローンをさらにサザンブロッティング
により分析して、標的化された遺伝子座の構造を確認し
た。相同組換え体は、二重耐性クローンの１／１７また
はＧ４１８耐性クローンの１／１０３の頻度で得られ
た。野生型Ｃδ遺伝子座および変異型Ｃδ遺伝子座の制
限マップ、ならびに５つの別個の組換え体候補およびコ
ントロール細胞に由来するＨｉｎｄIII消化したゲノム
ＤＮＡの制限分析が示された。相同組換えの結果、Ｈｉ
ｎｄIII部位の欠損を生じるＣδ３中のフレームシフト
変異の存在または欠如に依って、３．８ｋｂ生殖系列バ
ンドに加えて、４．４ｋｂまたは６．０ｋｂのバンドを
生じた。１０個の相同組換え体クローンのうちの９個が
６．０ｋｂのフラグメントを示し、組換えの開始点がＣ
δ３エキソンの３’に位置することが示された。このよ
うに、Ｃδ１エキソンおよびＣδ３エキソンは、これら
のクローン中で機能しなかった。１つのクローンは、Ｃ
δ３エキソン中にＨｉｎｄIII制限部位を保持し、４．
４ｋｂの診断用制限フラグメントを生じた。標的化され
た遺伝子座の構造を、種々の他のプローブおよび制限酵
素を用いて確認した。サザンブロット分析を、Sambroo
k、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning, A L
aboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Labor
atory、NY（1989）に記載のように行った。
し、そして陽性クローンをさらにサザンブロッティング
により分析して、標的化された遺伝子座の構造を確認し
た。相同組換え体は、二重耐性クローンの１／１７また
はＧ４１８耐性クローンの１／１０３の頻度で得られ
た。野生型Ｃδ遺伝子座および変異型Ｃδ遺伝子座の制
限マップ、ならびに５つの別個の組換え体候補およびコ
ントロール細胞に由来するＨｉｎｄIII消化したゲノム
ＤＮＡの制限分析が示された。相同組換えの結果、Ｈｉ
ｎｄIII部位の欠損を生じるＣδ３中のフレームシフト
変異の存在または欠如に依って、３．８ｋｂ生殖系列バ
ンドに加えて、４．４ｋｂまたは６．０ｋｂのバンドを
生じた。１０個の相同組換え体クローンのうちの９個が
６．０ｋｂのフラグメントを示し、組換えの開始点がＣ
δ３エキソンの３’に位置することが示された。このよ
うに、Ｃδ１エキソンおよびＣδ３エキソンは、これら
のクローン中で機能しなかった。１つのクローンは、Ｃ
δ３エキソン中にＨｉｎｄIII制限部位を保持し、４．
４ｋｂの診断用制限フラグメントを生じた。標的化され
た遺伝子座の構造を、種々の他のプローブおよび制限酵
素を用いて確認した。サザンブロット分析を、Sambroo
k、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning, A L
aboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Labor
atory、NY（1989）に記載のように行った。
【００５３】（実施例２） （ＩｇＤ欠損マウスの作製）ＩｇＤ欠損マウスの作製
を、RoesおよびRajewsky（1993）、J. Exp. Med. 177：
45-55に記載のように行った。簡単に述べると、Ｃδ遺
伝子不活性化の方法および陽性クローンのスクリーニン
グ手順は、実施例１に記載のようにした。標的化ＥＳ細
胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した胚盤
胞に注入し、そして（Ｃ５７ＢＬ／６×ＢＡＬＢ／ｃ）
の里親（foster）に移した。雄のキメラの子を、δＴ変
異の生殖系列伝達のためにＣ５７ＢＬ／６の雌とつがい
にした。ＥＳ細胞由来の子を毛色により識別し、そして
δＴと呼ばれる変異の存在についてサザンブロッティン
グによるかまたは表現型をフローサイトメトリーにより
分析した。ホモ接合変異マウス（δＴ／δＴ）を、ヘテ
ロ接合の子の異種交配により得た。
を、RoesおよびRajewsky（1993）、J. Exp. Med. 177：
45-55に記載のように行った。簡単に述べると、Ｃδ遺
伝子不活性化の方法および陽性クローンのスクリーニン
グ手順は、実施例１に記載のようにした。標的化ＥＳ細
胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した胚盤
胞に注入し、そして（Ｃ５７ＢＬ／６×ＢＡＬＢ／ｃ）
の里親（foster）に移した。雄のキメラの子を、δＴ変
異の生殖系列伝達のためにＣ５７ＢＬ／６の雌とつがい
にした。ＥＳ細胞由来の子を毛色により識別し、そして
δＴと呼ばれる変異の存在についてサザンブロッティン
グによるかまたは表現型をフローサイトメトリーにより
分析した。ホモ接合変異マウス（δＴ／δＴ）を、ヘテ
ロ接合の子の異種交配により得た。
【００５４】（実施例３） （推定（δＴ／δＴ）変異マウスのノーザンブロット分
析）推定（δＴ／δＴ）変異マウスのノーザンブロット
分析を、RoesおよびRajewsky（1993）による記載のよう
に行った。簡単に述べると、δＴ変異の結果、Ｈ鎖のＩ
ｇドメインをコードする両方のエキソンが機能的に不活
性化される。しかし、トランスメンブレンエキソンおよ
びヒンジ部エキソンは、完全なままであり、かつ潜在的
に機能性を維持する。ＣμおよびＣδ遺伝子の両方を含
有する前駆体ＲＮＡの異常なスプライシングの結果、Ｃ
μ遺伝子の細胞外ドメインならびにＣδのトランスメン
ブレン部分および細胞質部分をコードするかなりの量の
キメラＩｇ転写物が産生される可能性を除くために、ホ
モ接合変異（δＴ／δＴ）マウスおよび野生型マウスの
脾臓から単離したポリ（Ａ）+ＲＮＡを、ノーザンブロ
ッティングで分析した。Ｃδトランスメンブレンエキソ
ンにスプライシングされたＣμエキソンを含むｍＲＮＡ
は、２．４ｋｂ（μｓ）または２．７ｋｂ（μｍ）の正
常なＣμ転写物よりも大きい。なぜなら、δメッセージ
の３’非翻訳領域は、μメッセージのものよりも６００
ｂｐ長いからである。
析）推定（δＴ／δＴ）変異マウスのノーザンブロット
分析を、RoesおよびRajewsky（1993）による記載のよう
に行った。簡単に述べると、δＴ変異の結果、Ｈ鎖のＩ
ｇドメインをコードする両方のエキソンが機能的に不活
性化される。しかし、トランスメンブレンエキソンおよ
びヒンジ部エキソンは、完全なままであり、かつ潜在的
に機能性を維持する。ＣμおよびＣδ遺伝子の両方を含
有する前駆体ＲＮＡの異常なスプライシングの結果、Ｃ
μ遺伝子の細胞外ドメインならびにＣδのトランスメン
ブレン部分および細胞質部分をコードするかなりの量の
キメラＩｇ転写物が産生される可能性を除くために、ホ
モ接合変異（δＴ／δＴ）マウスおよび野生型マウスの
脾臓から単離したポリ（Ａ）+ＲＮＡを、ノーザンブロ
ッティングで分析した。Ｃδトランスメンブレンエキソ
ンにスプライシングされたＣμエキソンを含むｍＲＮＡ
は、２．４ｋｂ（μｓ）または２．７ｋｂ（μｍ）の正
常なＣμ転写物よりも大きい。なぜなら、δメッセージ
の３’非翻訳領域は、μメッセージのものよりも６００
ｂｐ長いからである。
【００５５】Ｃδトランスメンブレン特異的プローブを
用いるホモ接合変異マウスの脾臓ポリ（Ａ）+ＲＮＡの
ハイブリダイゼーションでは、４．８ｋｂ、４．０ｋ
ｂ、３．８ｋｂ、および３．０ｋｂのバンドが示され
た。しかし、これらのバンドはいずれも、Ｃμ特異的プ
ローブとハイブリダイズしなかった。２つのプローブの
検出限界は、標準プラスミドＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーションから得られたシグナルにより判断されるよう
に、２つの因子（Ｃμでは１．２×１０6コピーおよび
δｍプローブでは０．６×１０6コピー）の限りでは類
似していた。Ｃμプローブは、ｍＲＮＡおよび標準プラ
スミドに完全に適合する１ｋｂのｃＤＮＡフラグメント
であるが、δｍプローブはδｍ１／ｍ２イントロンを含
むため、標準プラスミドにおける７００ｂｐ以外は４８
０ｂｐの長さを越えるｍＲＮＡとハイブリダイズするに
すぎない。従って、δｍエキソンにスプライシングされ
たＣμエキソンを示すｍＲＮＡは、δｍプローブで検出
される場合は、Ｃμプローブでも表れるべきである。な
ぜなら、３．０ｋｂ、３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、および
４．８ｋｂのバンドは明らかにδｍプローブの検出限界
を上回るため、それらがＣμ配列を含む場合は、さらに
Ｃμプローブでも検出されるべきだからである。しか
し、これはその場合ではない。
用いるホモ接合変異マウスの脾臓ポリ（Ａ）+ＲＮＡの
ハイブリダイゼーションでは、４．８ｋｂ、４．０ｋ
ｂ、３．８ｋｂ、および３．０ｋｂのバンドが示され
た。しかし、これらのバンドはいずれも、Ｃμ特異的プ
ローブとハイブリダイズしなかった。２つのプローブの
検出限界は、標準プラスミドＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーションから得られたシグナルにより判断されるよう
に、２つの因子（Ｃμでは１．２×１０6コピーおよび
δｍプローブでは０．６×１０6コピー）の限りでは類
似していた。Ｃμプローブは、ｍＲＮＡおよび標準プラ
スミドに完全に適合する１ｋｂのｃＤＮＡフラグメント
であるが、δｍプローブはδｍ１／ｍ２イントロンを含
むため、標準プラスミドにおける７００ｂｐ以外は４８
０ｂｐの長さを越えるｍＲＮＡとハイブリダイズするに
すぎない。従って、δｍエキソンにスプライシングされ
たＣμエキソンを示すｍＲＮＡは、δｍプローブで検出
される場合は、Ｃμプローブでも表れるべきである。な
ぜなら、３．０ｋｂ、３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、および
４．８ｋｂのバンドは明らかにδｍプローブの検出限界
を上回るため、それらがＣμ配列を含む場合は、さらに
Ｃμプローブでも検出されるべきだからである。しか
し、これはその場合ではない。
【００５６】さらに、Ｃδ3エキソンに対して特異的な
ｎｅｏ+遺伝子およびｎｅｏ+プローブを用いた同じブロ
ッティングの一連のハイブリダイゼーションにより、
３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、および４．８ｋｂのバンド
も、ｎｅｏ+遺伝子由来の配列を含むことが示され、そ
れらが異常なスプライシング産物を表すことが示され
た。３．０ｋｂのバンドは、実施例１に記載のフレーム
シフト変異のために、標的化対立遺伝子中で機能しない
Ｃδ３エキソンに対して特異的なプローブとハイブリダ
イズした。さらに、ｎｅｏ+プローブを用いて、２．４
ｋｂのｍＲＮＡ（これはδｍプローブとハイブリダイズ
しなかった）もまた検出された。Ｃδｍ特異的プローブ
とハイブリダイズする１．６ｋｂおよび２．０ｋｂの少
量のｍＲＮＡが、正常マウスおよび変異マウスの両方に
由来する１０μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡ中で検出可能で
ある。しかし、これらのｍＲＮＡは、正常のＣμメッセ
ージよりも小さく、従って、機能性Ｉｇ分子をコードし
そうにない。
ｎｅｏ+遺伝子およびｎｅｏ+プローブを用いた同じブロ
ッティングの一連のハイブリダイゼーションにより、
３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、および４．８ｋｂのバンド
も、ｎｅｏ+遺伝子由来の配列を含むことが示され、そ
れらが異常なスプライシング産物を表すことが示され
た。３．０ｋｂのバンドは、実施例１に記載のフレーム
シフト変異のために、標的化対立遺伝子中で機能しない
Ｃδ３エキソンに対して特異的なプローブとハイブリダ
イズした。さらに、ｎｅｏ+プローブを用いて、２．４
ｋｂのｍＲＮＡ（これはδｍプローブとハイブリダイズ
しなかった）もまた検出された。Ｃδｍ特異的プローブ
とハイブリダイズする１．６ｋｂおよび２．０ｋｂの少
量のｍＲＮＡが、正常マウスおよび変異マウスの両方に
由来する１０μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡ中で検出可能で
ある。しかし、これらのｍＲＮＡは、正常のＣμメッセ
ージよりも小さく、従って、機能性Ｉｇ分子をコードし
そうにない。
【００５７】潜在的な機能性キメラμ／δ分子を表すｍ
ＲＮＡ種は、１０μｇ程度のδＴ／δＴマウスの脾臓ポ
リ（Ａ）+ＲＮＡを用いるノーザンブロットで検出し得
なかった。δＨ鎖をコードするｍＲＮＡは、Ｃδｍ特異
的プローブを用いて、３００ｎｇ程度の少量の正常マウ
スの脾臓ポリ（Ａ）+ＲＮＡで検出され得るので、μの
細胞外ドメインおよびδのトランスメンブレン部分をコ
ードする推定ｍＲＮＡは、それが少しでも存在するな
ら、正常マウスのδＨ鎖メッセージよりも少なくとも３
０倍より少ない。従って、ＩｇＤ様分子をコードし得る
可能性のあるｍＲＮＡは、ノーザンブロット分析により
ホモ接合変異マウス（δＴ／δＴ）中で検出不可能であ
る。
ＲＮＡ種は、１０μｇ程度のδＴ／δＴマウスの脾臓ポ
リ（Ａ）+ＲＮＡを用いるノーザンブロットで検出し得
なかった。δＨ鎖をコードするｍＲＮＡは、Ｃδｍ特異
的プローブを用いて、３００ｎｇ程度の少量の正常マウ
スの脾臓ポリ（Ａ）+ＲＮＡで検出され得るので、μの
細胞外ドメインおよびδのトランスメンブレン部分をコ
ードする推定ｍＲＮＡは、それが少しでも存在するな
ら、正常マウスのδＨ鎖メッセージよりも少なくとも３
０倍より少ない。従って、ＩｇＤ様分子をコードし得る
可能性のあるｍＲＮＡは、ノーザンブロット分析により
ホモ接合変異マウス（δＴ／δＴ）中で検出不可能であ
る。
【００５８】（実施例４） （マウス−抗マウス−ＩｇＤモノクローナル抗体の産
生）ＩｇＤ欠損マウスを、実施例１および２に記載のよ
うに遺伝子の標的化により作製した。こうして得られた
１匹の動物を、ミョウバン中に沈降したＩｇＤクラス
（２６７．７δ「ａ」アロタイプ）のマウスモノクロー
ナル抗体で、腹腔内（i.p.）に免疫した。
生）ＩｇＤ欠損マウスを、実施例１および２に記載のよ
うに遺伝子の標的化により作製した。こうして得られた
１匹の動物を、ミョウバン中に沈降したＩｇＤクラス
（２６７．７δ「ａ」アロタイプ）のマウスモノクロー
ナル抗体で、腹腔内（i.p.）に免疫した。
【００５９】６週間後、この動物に、「ｂ」アロタイプ
の可溶性Ｂ１−８で、腹腔内に追加免疫を行い、両アロ
タイプを認識するモノクローナル抗体を得た。
の可溶性Ｂ１−８で、腹腔内に追加免疫を行い、両アロ
タイプを認識するモノクローナル抗体を得た。
【００６０】３日後、免疫したマウスの脾臓細胞を、標
準ＰＥＧ融合プロトコルを用いて、Ｘ６３ Ａｇ８．
６．５．３と融合した。ハイブリッドを、８枚の９６ウ
ェルプレートに、直接クローニングし、そしてＨＡＴ選
択培地を用いて選択した。得られたハイブリドーマを、
Ｂｌー８（ＩｇＤ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、
２６７．７（ＩｇＤ）、Ｒ３３−２４−１２（抗Ｉｇ
Ｍ）でコートしたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡによる
抗ＩｇＤ抗体の産生についてスクリーニングを行い、そ
して、Ｒ３３−１８−１０．１−ビオチン抗体（ラット
抗マウスκ）およびＲ３３−６０−ビオチン抗体（抗Ｉ
ｇＭ）を用いて発色させた。１７個のクローンがＢ１−
８（ＩｇＤb）への反応性を示し、これらのうち１３個
のクローンが２６７．７（ＩｇＤa）への反応性を示
し、これらのうちの１個がＩｇＭクラスのものであっ
た。他の２つのクローンは、ＩｇＭへの反応性を示した
が、ＩｇＤには反応性を示さなかった。さらに、ハイブ
リドーマを、相対結合親和性およびアイソタイプについ
て特徴付けた。試験した２１個のクローンのうち１５個
は、ＩｇＧｌアイソタイプを示した。さらに、このクロ
ーンを、ビオチン化抗マウスＩｇＧｌとストレプトアビ
ジン−フィコエリトリンとを用いてトリプシン処理およ
びトリプシン未処理のマウス脾臓細胞への結合を特徴付
けた。トリプシンは表面のＩｇＤをカットし、そしてＩ
ｇＤ分子上のエピトープを制限し得る。
準ＰＥＧ融合プロトコルを用いて、Ｘ６３ Ａｇ８．
６．５．３と融合した。ハイブリッドを、８枚の９６ウ
ェルプレートに、直接クローニングし、そしてＨＡＴ選
択培地を用いて選択した。得られたハイブリドーマを、
Ｂｌー８（ＩｇＤ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、
２６７．７（ＩｇＤ）、Ｒ３３−２４−１２（抗Ｉｇ
Ｍ）でコートしたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡによる
抗ＩｇＤ抗体の産生についてスクリーニングを行い、そ
して、Ｒ３３−１８−１０．１−ビオチン抗体（ラット
抗マウスκ）およびＲ３３−６０−ビオチン抗体（抗Ｉ
ｇＭ）を用いて発色させた。１７個のクローンがＢ１−
８（ＩｇＤb）への反応性を示し、これらのうち１３個
のクローンが２６７．７（ＩｇＤa）への反応性を示
し、これらのうちの１個がＩｇＭクラスのものであっ
た。他の２つのクローンは、ＩｇＭへの反応性を示した
が、ＩｇＤには反応性を示さなかった。さらに、ハイブ
リドーマを、相対結合親和性およびアイソタイプについ
て特徴付けた。試験した２１個のクローンのうち１５個
は、ＩｇＧｌアイソタイプを示した。さらに、このクロ
ーンを、ビオチン化抗マウスＩｇＧｌとストレプトアビ
ジン−フィコエリトリンとを用いてトリプシン処理およ
びトリプシン未処理のマウス脾臓細胞への結合を特徴付
けた。トリプシンは表面のＩｇＤをカットし、そしてＩ
ｇＤ分子上のエピトープを制限し得る。
【００６１】最も親和性が高くかつＩｇＧｌアイソタイ
プの３個のクローン（δ１．２、δ１．３、およびδ
３．５）を、さらなる実験のために用いた。これらのク
ローンにより産生された数ｍｇの精製ＡＭＡＢを、標準
の方法によりローラーボトルを用いて産生した。１６個
のクローンを、培養上清でマウス脾臓細胞をインキュベ
ートすることによる染色アッセイで試験した。結合した
抗ＩｇＤ ＡＭＡＢを、ビオチン化抗マウスＩｇＧｌを
用いて検出し、そしてストレプトアビジン−ＰＥにより
発色させた。
プの３個のクローン（δ１．２、δ１．３、およびδ
３．５）を、さらなる実験のために用いた。これらのク
ローンにより産生された数ｍｇの精製ＡＭＡＢを、標準
の方法によりローラーボトルを用いて産生した。１６個
のクローンを、培養上清でマウス脾臓細胞をインキュベ
ートすることによる染色アッセイで試験した。結合した
抗ＩｇＤ ＡＭＡＢを、ビオチン化抗マウスＩｇＧｌを
用いて検出し、そしてストレプトアビジン−ＰＥにより
発色させた。
【００６２】（実施例５） （Ｂ細胞富化領域でのマウス脾臓組織のＩｇＤ ＡＭＡ
Ｂ染色）Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の凍結脾臓切片を、
実施例４に記載のように調製したビオチン化マウス抗マ
ウスＩｇＤ ＡＭＡＢ δ１．３を用いて染色し、そして
供給者の指示に従ってPierce NHSビオチンを用いてビオ
チン化した。染色パターンを、製造者の指示に従って、
SigmaのＡＥＣ染色キットを用い、ストレプトアビジン
に結合したペルオキシダーゼを用いて発色させた。得ら
れた結果を図１に示す。染色パターンは、ポリクローナ
ルヤギ抗マウスＩｇＤ抗血清について見られるパターン
と一致し、本発明により得られたＩｇＤ ＡＭＡＢが所
望の自己抗原に対して結合特異性を有することを示す。
Ｂ染色）Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の凍結脾臓切片を、
実施例４に記載のように調製したビオチン化マウス抗マ
ウスＩｇＤ ＡＭＡＢ δ１．３を用いて染色し、そして
供給者の指示に従ってPierce NHSビオチンを用いてビオ
チン化した。染色パターンを、製造者の指示に従って、
SigmaのＡＥＣ染色キットを用い、ストレプトアビジン
に結合したペルオキシダーゼを用いて発色させた。得ら
れた結果を図１に示す。染色パターンは、ポリクローナ
ルヤギ抗マウスＩｇＤ抗血清について見られるパターン
と一致し、本発明により得られたＩｇＤ ＡＭＡＢが所
望の自己抗原に対して結合特異性を有することを示す。
【００６３】（実施例６） （フルオレセインに対する抗体の複合体化および種々の
濃度下での脾臓細胞の染色）実施例４からそれぞれ得ら
れた０．５ｍｇの精製ＡＭＡＢ（δ１．３およびδ３．
５）を、１．５ｍｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中に再緩衝
化させ、そしてＤＭＳＯ中に溶解させた１５μｌのカル
ボキシルフルオレセイン−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル（Boehringer Mannheim）（１ｍｇ／ｍｌ）と
１時間反応させた。非結合フルオレセインを、ゲル濾過
により除去した。Ｆ／Ｐ比は、両方の結合について約３
〜３．５であることが示された。１００万個のマウス脾
臓細胞を、図２に示す複合体化ＡＭＡＢの種々の希釈液
と１５分間インキュベートし、そしてフローサイトメト
リーにより分析した。δ１．３について得られた結果を
図２（ａ）に示し、そしてδ３．５について得られた結
果を、図２（ｂ）に示す。データは、ＩｇＤ陽性細胞の
検出には１μｇ／ｍｌほどの低濃度で充分であること、
およびＡＭＡＢが高い親和性を有することを示す。
濃度下での脾臓細胞の染色）実施例４からそれぞれ得ら
れた０．５ｍｇの精製ＡＭＡＢ（δ１．３およびδ３．
５）を、１．５ｍｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中に再緩衝
化させ、そしてＤＭＳＯ中に溶解させた１５μｌのカル
ボキシルフルオレセイン−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル（Boehringer Mannheim）（１ｍｇ／ｍｌ）と
１時間反応させた。非結合フルオレセインを、ゲル濾過
により除去した。Ｆ／Ｐ比は、両方の結合について約３
〜３．５であることが示された。１００万個のマウス脾
臓細胞を、図２に示す複合体化ＡＭＡＢの種々の希釈液
と１５分間インキュベートし、そしてフローサイトメト
リーにより分析した。δ１．３について得られた結果を
図２（ａ）に示し、そしてδ３．５について得られた結
果を、図２（ｂ）に示す。データは、ＩｇＤ陽性細胞の
検出には１μｇ／ｍｌほどの低濃度で充分であること、
およびＡＭＡＢが高い親和性を有することを示す。
【００６４】（実施例７） （マウス脾臓細胞の二重染色）Ｂ６×１２９マウス由来
の脾臓細胞を、フルオレセイン複合体化ＡＭＡＢ δ
１．３およびフィコエリトリン複合体化抗マウスＩｇＭ
抗体（Ｒ３３−２４）を用いて染色し、洗浄し、そして
リンパ球についてゲート（gate）し、そしてヨウ化プロ
ピジウム染色により死細胞を除外するFACScanフローサ
イトメーターで分析した。
の脾臓細胞を、フルオレセイン複合体化ＡＭＡＢ δ
１．３およびフィコエリトリン複合体化抗マウスＩｇＭ
抗体（Ｒ３３−２４）を用いて染色し、洗浄し、そして
リンパ球についてゲート（gate）し、そしてヨウ化プロ
ピジウム染色により死細胞を除外するFACScanフローサ
イトメーターで分析した。
【００６５】得られた結果を図３に示す。この結果によ
り、ほとんどのＩｇＭ産生細胞はＩｇＤを共発現する
が、わずかなＩｇＭ+ ＩｇＤ-細胞が得られたことが示
される。この染色は、ＩｇＤの予想された染色パターン
によく一致する。またこれにより、ＡＭＡＢが正常マウ
スに通常存在する分子に結合し、従って、モノクローナ
ル性自己抗体であることが示される。
り、ほとんどのＩｇＭ産生細胞はＩｇＤを共発現する
が、わずかなＩｇＭ+ ＩｇＤ-細胞が得られたことが示
される。この染色は、ＩｇＤの予想された染色パターン
によく一致する。またこれにより、ＡＭＡＢが正常マウ
スに通常存在する分子に結合し、従って、モノクローナ
ル性自己抗体であることが示される。
【００６６】（実施例８） （コロイド磁性粒子複合体化モノクローナル性自己抗体
を用いた細胞の磁性分離） 抗体の磁性粒子への複合体化：精製ＡＭＡＢ δ１．３
およびδ３．５を、供給者の指示に従って、ＳＰＤＰ
（Pierce）カップリング化学物質を用いてＭＡＣＳアミ
ノマイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch G
ladbach、Germany）に複合体化させた。約２００μｇの
活性化した抗体を、１ｍｌのＳＰＤＰ修飾ＭＡＣＳアミ
ノマイクロビーズ（ＯＤ４５０＝１０）に複合体化させ
た。結合したビーズを、ＭＡＣＳ Ａ１カラムを用いて
２回精製し、そしてＰＢＳでＯＤ４５０＝１の濃度に再
緩衝化させた（Miltenyiら, 1990, Cytometry, 11：231
-238を参照のこと）。
を用いた細胞の磁性分離） 抗体の磁性粒子への複合体化：精製ＡＭＡＢ δ１．３
およびδ３．５を、供給者の指示に従って、ＳＰＤＰ
（Pierce）カップリング化学物質を用いてＭＡＣＳアミ
ノマイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch G
ladbach、Germany）に複合体化させた。約２００μｇの
活性化した抗体を、１ｍｌのＳＰＤＰ修飾ＭＡＣＳアミ
ノマイクロビーズ（ＯＤ４５０＝１０）に複合体化させ
た。結合したビーズを、ＭＡＣＳ Ａ１カラムを用いて
２回精製し、そしてＰＢＳでＯＤ４５０＝１の濃度に再
緩衝化させた（Miltenyiら, 1990, Cytometry, 11：231
-238を参照のこと）。
【００６７】細胞の磁性標識：８０μｌ中１千万個の脾
臓細胞を、δ１．３およびδ３．５複合体化磁性粒子の
１〜５の希釈した液と４℃で１５分間インキュベートし
た。次いで、同じフルオレセイン複合体化ＡＭＡＢを添
加して最終濃度を８μｇ／ｍｌにした。細胞を抗体と５
分間反応させ、次いで、ＰＢＳで１回洗浄した。磁性標
識およびフルオレセイン標識された細胞を、供給者の指
示に従って、ＭＡＣＳ磁性細胞分取器（Miltenyi Biote
c GmbH）を用いて分離した。細胞を、２５Ｇフローリス
トリクター（flow ristrictor）で動作する予め充填さ
れたＡ２ ＭＡＣＳカラムに付与し、カラムを４ｍｌの
緩衝液で洗浄し、そしてカラムを通過する細胞を非磁性
画分として収集した。カラムを、２３Ｇフローレジスタ
ー(flow resistor)を用いて、１回の逆流手順を用いて
洗浄し、そして残った細胞を溶離した。すべての画分
を、フローサイトメトリー（FACScan）により分析し
た。死細胞をヨウ化プロピジウム染色により同定し、分
析から除外した。
臓細胞を、δ１．３およびδ３．５複合体化磁性粒子の
１〜５の希釈した液と４℃で１５分間インキュベートし
た。次いで、同じフルオレセイン複合体化ＡＭＡＢを添
加して最終濃度を８μｇ／ｍｌにした。細胞を抗体と５
分間反応させ、次いで、ＰＢＳで１回洗浄した。磁性標
識およびフルオレセイン標識された細胞を、供給者の指
示に従って、ＭＡＣＳ磁性細胞分取器（Miltenyi Biote
c GmbH）を用いて分離した。細胞を、２５Ｇフローリス
トリクター（flow ristrictor）で動作する予め充填さ
れたＡ２ ＭＡＣＳカラムに付与し、カラムを４ｍｌの
緩衝液で洗浄し、そしてカラムを通過する細胞を非磁性
画分として収集した。カラムを、２３Ｇフローレジスタ
ー(flow resistor)を用いて、１回の逆流手順を用いて
洗浄し、そして残った細胞を溶離した。すべての画分
を、フローサイトメトリー（FACScan）により分析し
た。死細胞をヨウ化プロピジウム染色により同定し、分
析から除外した。
【００６８】図４（ａ）〜（ｆ）は、分離前または分離
後のＦＡＣＳ分析のヒストグラムを示す。図４（ａ）お
よび（ｂ）は分離前の細胞を示し、図４（ｃ）および
（ｄ）は非磁性画分を示し、そして図４（ｅ）および
（ｆ）は陽性細胞を示す。図（ａ）、（ｃ）、および
（ｅ）は、δ１．３の結果を示し、図（ｂ）、（ｄ）、
および（ｆ）が、δ３．５の結果を示す。データによ
り、少なくとも９５％のＩｇＤ発現細胞がカラムによっ
て保持され、保持されてカラムから溶離されるＩｇＤ細
胞は少なくとも９２％の純度を有することが示される。
この分離および分析におけるバックグラウンド染色は、
主に非特異的に抗体を取り込むマクロファージにより生
じる。
後のＦＡＣＳ分析のヒストグラムを示す。図４（ａ）お
よび（ｂ）は分離前の細胞を示し、図４（ｃ）および
（ｄ）は非磁性画分を示し、そして図４（ｅ）および
（ｆ）は陽性細胞を示す。図（ａ）、（ｃ）、および
（ｅ）は、δ１．３の結果を示し、図（ｂ）、（ｄ）、
および（ｆ）が、δ３．５の結果を示す。データによ
り、少なくとも９５％のＩｇＤ発現細胞がカラムによっ
て保持され、保持されてカラムから溶離されるＩｇＤ細
胞は少なくとも９２％の純度を有することが示される。
この分離および分析におけるバックグラウンド染色は、
主に非特異的に抗体を取り込むマクロファージにより生
じる。
【００６９】（実施例９） （ＮＣＡＭノックアウトマウス）神経細胞接着分子（Ｎ
ＣＡＭ）は、同種親和性および異種親和性の細胞−細胞
相互作用を媒介するイムノグロブリンスーパーファミリ
ーのメンバーである。ＮＣＡＭは、異なるスプライシン
グにより発生した種々のイソ体である。Hemperlyら、
（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83：3037-3041；
Barthelsら、（1987）EMBO J. 6：907-914；およびBart
helsら、（1992）Eur. J. Neurosci. 4：327-337を参照
のこと。胚発生の間は、ＮＣＡＭは３つの全胚葉(germ
layer)の派生部で発現するが、成熟した動物では、主に
神経組織中に存在する。神経胚形成、軸索成長(outgrow
th)、網膜の組織形成、および嗅覚系の発達のようなプ
ロセスが、ＮＣＡＭの制御発現と関連付けられる。Cros
sinら、（1990）Exp. Neurol.,109：5-15；Tosneyら、
（1986）Dev. Biol., 114：437-452；Thieryら、（197
7）J. Biol. Chem., 252：6841-6845；Keyら、（1990）
J. Cell Biol., 110：1729-1743；およびChungら、（19
91）J. Comp. Neurol．, 314：290-305を参照のこと。
遺伝子標的化により作製されたホモ接合ＮＣＡＭ陰性マ
ウスは、健康で、繁殖性である。成熟した変異体は、全
脳重量の１０％の減少、および３６％の嗅球の大きさの
減衰を示す。ＮＣＡＭの欠失は、神経発生および神経形
成性と関連すると考えられる炭水化物構造である、タン
パク質結合α−（２，８）−連結ポリシアル酸のほとん
どすべての欠損を伴う。Theodosisら、（1991）Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88：5494-5498を参照のこと。Mor
ris、（1981）Learn. Motiv. 12：239-260に記載される
ようなMorris水迷路中での動物試験により、空間学習の
欠落が示されたが、変異マウスの活動および運動能は正
常であった。
ＣＡＭ）は、同種親和性および異種親和性の細胞−細胞
相互作用を媒介するイムノグロブリンスーパーファミリ
ーのメンバーである。ＮＣＡＭは、異なるスプライシン
グにより発生した種々のイソ体である。Hemperlyら、
（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83：3037-3041；
Barthelsら、（1987）EMBO J. 6：907-914；およびBart
helsら、（1992）Eur. J. Neurosci. 4：327-337を参照
のこと。胚発生の間は、ＮＣＡＭは３つの全胚葉(germ
layer)の派生部で発現するが、成熟した動物では、主に
神経組織中に存在する。神経胚形成、軸索成長(outgrow
th)、網膜の組織形成、および嗅覚系の発達のようなプ
ロセスが、ＮＣＡＭの制御発現と関連付けられる。Cros
sinら、（1990）Exp. Neurol.,109：5-15；Tosneyら、
（1986）Dev. Biol., 114：437-452；Thieryら、（197
7）J. Biol. Chem., 252：6841-6845；Keyら、（1990）
J. Cell Biol., 110：1729-1743；およびChungら、（19
91）J. Comp. Neurol．, 314：290-305を参照のこと。
遺伝子標的化により作製されたホモ接合ＮＣＡＭ陰性マ
ウスは、健康で、繁殖性である。成熟した変異体は、全
脳重量の１０％の減少、および３６％の嗅球の大きさの
減衰を示す。ＮＣＡＭの欠失は、神経発生および神経形
成性と関連すると考えられる炭水化物構造である、タン
パク質結合α−（２，８）−連結ポリシアル酸のほとん
どすべての欠損を伴う。Theodosisら、（1991）Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88：5494-5498を参照のこと。Mor
ris、（1981）Learn. Motiv. 12：239-260に記載される
ようなMorris水迷路中での動物試験により、空間学習の
欠落が示されたが、変異マウスの活動および運動能は正
常であった。
【００７０】ホモ接合変異マウスの遺伝子標的化および
作製を、標準プロトコルを用いて行い、そしてサザンブ
ロッティングおよび対立遺伝子特異的ＰＣＲにより確認
した。ヌクレアーゼＳＩ保護アッセイ、ノーザンブロッ
ティング、およびウエスタンブロッティングにより、標
的化遺伝子座が無効対立遺伝子として確認された。モノ
クローナル抗体およびポリクローナル血清を用いた、Ｎ
ＣＡＭについての脳切片の免疫細胞化学分析により、野
生型動物およびヘテロ接合動物中の嗅球の糸球体および
顆粒細胞層に最も強い染色が示された。すべての染色
は、成熟した脳におけるＮＣＡＭ発現についての報告と
よく一致した。Chungら、（1991）を参照のこと。ホモ
接合変異マウスでは、予想通りＮＣＡＭ免疫反応性が全
欠損していた。
作製を、標準プロトコルを用いて行い、そしてサザンブ
ロッティングおよび対立遺伝子特異的ＰＣＲにより確認
した。ヌクレアーゼＳＩ保護アッセイ、ノーザンブロッ
ティング、およびウエスタンブロッティングにより、標
的化遺伝子座が無効対立遺伝子として確認された。モノ
クローナル抗体およびポリクローナル血清を用いた、Ｎ
ＣＡＭについての脳切片の免疫細胞化学分析により、野
生型動物およびヘテロ接合動物中の嗅球の糸球体および
顆粒細胞層に最も強い染色が示された。すべての染色
は、成熟した脳におけるＮＣＡＭ発現についての報告と
よく一致した。Chungら、（1991）を参照のこと。ホモ
接合変異マウスでは、予想通りＮＣＡＭ免疫反応性が全
欠損していた。
【００７１】２種の系統のヘテロ接合動物をつがいに
し、そして７８匹の子を得た。これらのうち交配した対
立遺伝子について、３８匹の動物（４９％）がヘテロ接
合型であり。２２匹（２８％）が野生型であり、そして
１８匹（２３％）がホモ接合型であり、ほとんど完全な
メンデル分配を示した。ホモ接合変異動物は繁殖性であ
り、そして、これらの動物は野生型およびヘテロ接合体
の同腹子よりも約１０重量％小さいが、生後４カ月まで
健康である。変異体およびヘテロ接合動物から分離した
脳は、明らかに解剖学的差異を有した：嗅球は、＋／＋
動物および＋／−動物と比較して、変異体では大きさが
減少し；そして脳重量は体重の補正後約１０％まで減少
した。
し、そして７８匹の子を得た。これらのうち交配した対
立遺伝子について、３８匹の動物（４９％）がヘテロ接
合型であり。２２匹（２８％）が野生型であり、そして
１８匹（２３％）がホモ接合型であり、ほとんど完全な
メンデル分配を示した。ホモ接合変異動物は繁殖性であ
り、そして、これらの動物は野生型およびヘテロ接合体
の同腹子よりも約１０重量％小さいが、生後４カ月まで
健康である。変異体およびヘテロ接合動物から分離した
脳は、明らかに解剖学的差異を有した：嗅球は、＋／＋
動物および＋／−動物と比較して、変異体では大きさが
減少し；そして脳重量は体重の補正後約１０％まで減少
した。
【００７２】ＮＣＡＭに対して高親和性のＡＭＡＢを生
成させるために、上記のマウスに適切なアジュバントに
懸濁した抗原量のＮＣＡＭを接種した。追加免疫注射を
必要に応じて与え、そして抗体力価を定期的に測定す
る。一旦、力価が充分であると、ＡＭＡＢ生成のための
適切な方法が続けられる。
成させるために、上記のマウスに適切なアジュバントに
懸濁した抗原量のＮＣＡＭを接種した。追加免疫注射を
必要に応じて与え、そして抗体力価を定期的に測定す
る。一旦、力価が充分であると、ＡＭＡＢ生成のための
適切な方法が続けられる。
【００７３】本明細書中に引用したすべての刊行物およ
び特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的か
つ個別に参考として援用されているのと同じ程度まで、
参考として本明細書中に援用されている。
び特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的か
つ個別に参考として援用されているのと同じ程度まで、
参考として本明細書中に援用されている。
【００７４】上記発明は、明瞭にそして理解されること
を目的とする例示および実施例により詳細に記載されて
いるが、所定の改変が実施され得ることは当業者に明ら
かである。従って、説明および実施例は本発明の範囲を
限定するように解釈されるべきではなく、本発明の範囲
は添付の請求の範囲により記載される。
を目的とする例示および実施例により詳細に記載されて
いるが、所定の改変が実施され得ることは当業者に明ら
かである。従って、説明および実施例は本発明の範囲を
限定するように解釈されるべきではなく、本発明の範囲
は添付の請求の範囲により記載される。
【図１】 Ｂ細胞富化領域中のマウス脾臓組織の抗Ｉｇ
Ｄ抗体染色を表す。
Ｄ抗体染色を表す。
【図２】 （ａ）は、マウス脾臓組織におけるδ１．３
ＡＭＡＢの滴定の結果を表し、（ｂ）は、マウス脾臓
細胞におけるδ３．５ ＡＭＡＢの滴定の結果を表す。
ＡＭＡＢの滴定の結果を表し、（ｂ）は、マウス脾臓
細胞におけるδ３．５ ＡＭＡＢの滴定の結果を表す。
【図３】 抗ＩｇＭ抗体および抗ＩｇＤ抗体で二重染色
したマウス脾臓細胞のＦＡＣＳ分析の結果を表す。
したマウス脾臓細胞のＦＡＣＳ分析の結果を表す。
【図４】 （ａ）はδ１．３におけるコロイド超常磁性
粒子に結合した抗ＩｇＤ抗体を用いたマウス脾臓細胞の
分離前の結果を表し、（ｂ）はδ３．５における分離前
の結果を表し、（ｃ）はδ１．３における分離後の陰性
画分の結果を表し、（ｄ）はδ３．５における分離後の
陰性画分の結果を表し、（ｅ）はδ１．３における分離
後の陽性画分の結果を表し、そして（ｆ）はδ３．５に
おける分離後の陽性画分の結果を表す。
粒子に結合した抗ＩｇＤ抗体を用いたマウス脾臓細胞の
分離前の結果を表し、（ｂ）はδ３．５における分離前
の結果を表し、（ｃ）はδ１．３における分離後の陰性
画分の結果を表し、（ｄ）はδ３．５における分離後の
陰性画分の結果を表し、（ｅ）はδ１．３における分離
後の陽性画分の結果を表し、そして（ｆ）はδ３．５に
おける分離後の陽性画分の結果を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ 33/53 Ｙ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ベルナー ミューラー ドイツ国 ケルン 50931，シャルストル. ６ (72)発明者 ユエルゲン ロエス ドイツ国 ケルン 50931，インスティチ ュート フォー ジェネティクス（番地な し)
Claims (35)
- 【請求項１】 以下の工程を包含する、自己抗原に対す
るモノクローナル性自己抗体を非ヒト脊椎動物宿主から
得る方法： ａ）該自己抗原の少なくとも１つのエピトープを産生し
ないように該宿主動物のゲノムを改変する工程； ｂ）該自己抗原またはそのホモログを含有する組成物で
該宿主動物を免疫する工程； ｃ）該自己抗原またはそのホモログに応答して産生され
る宿主細胞であって、該自己抗原またはそのホモログに
対する抗体を発現する該宿主細胞を収集する工程；およ
び ｄ）該収集した細胞または該細胞由来の遺伝学的材料を
用いて抗体を産生する工程。 - 【請求項２】 前記宿主動物が少なくとも１つのエピト
ープの機能的等価物を産生する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 前記宿主動物が少なくとも１つのエピト
ープの構造的ホモログを産生する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項４】 前記自己抗原が、タンパク質、ペプチ
ド、炭水化物、脂質、酵素補因子、および天然に生じる
凝集物またはそれらの共有結合複合物からなる群より選
択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記自己抗原が細胞表面抗原である、請
求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記自己抗原がサイトカインである、請
求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 前記自己抗原が細胞接着分子およびイム
ノグロブリンからなる群より選択される、請求項５に記
載の方法。 - 【請求項８】 前記自己抗原がＩｇＤ抗体である、請求
項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記自己抗原が細胞接着分子である、請
求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記細胞の収集が、抗原特異的Ｂ細胞
を富化または単離する工程をさらに包含する、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記抗体が、さらに該抗体をコードす
る組換え遺伝子を発現することにより産生される、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記組換え遺伝子が、単一の予め富化
した抗原特異的Ｂ細胞および単一細胞ＰＣＲを用いて単
離される、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記抗体が少なくとも一部でヒト化さ
れている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記宿主動物が哺乳類であり、そし
て、齧歯類、兎類、霊長類、食肉類、奇蹄類、および偶
蹄類からなる群より選択される、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１５】 前記宿主動物が齧歯類またはネズミで
ある、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記宿主動物がマウスである、請求項
１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 遺伝的改変が生殖系列伝達を介して得
られるように、前記工程ｂ）の前に、遺伝的に操作され
た宿主動物を繁殖させる工程をさらに包含する、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記抗原またはそのホモログの生合成
が、該抗原またはそのホモログを産生する代謝経路に影
響を与える酵素をコードする遺伝子の変異により排除さ
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】 請求項１に記載の方法により得られる
抗体を含有する組成物。 - 【請求項２０】 ＥＬＩＳＡに使用するための、請求項
１９に記載の組成物。 - 【請求項２１】 請求項１に記載の方法により得られる
抗体フラグメントを含有する組成物であって、該フラグ
メントが前記自己抗原に結合するに十分である、組成
物。 - 【請求項２２】 前記フラグメントがＦａｂフラグメン
トである、請求項２１に記載の組成物。 - 【請求項２３】 前記抗体が他の化合物と複合体化され
る、請求項２０に記載の組成物。 - 【請求項２４】 前記化合物が、リポーター酵素、蛍光
色素、金属化合物、毒素、ハプテン、磁性粒子、固体キ
ャリア、リポソーム、および蛍光粒子からなる群より選
択される、請求項２３に記載の組成物。 - 【請求項２５】 前記磁性粒子がコロイド超常磁性粒子
である、請求項２４に記載の組成物。 - 【請求項２６】 前記化合物が、アルカリホスファター
ゼ、ペルオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群よ
り選択される酵素である、請求項２４に記載の組成物。 - 【請求項２７】 前記化合物が、フルオレセインイソチ
オシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネ
ート、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、および
テキサスレッドからなる群より選択される蛍光色素であ
る、請求項２４に記載の組成物。 - 【請求項２８】 前記化合物が、フェリチン、金コロイ
ド、および磁性ビーズからなる群より選択される金属化
合物である、請求項２４に記載の組成物。 - 【請求項２９】 前記化合物が放射性同位元素を含有す
る、請求項２３に記載の組成物。 - 【請求項３０】 前記化合物がビオチンである、請求項
２３に記載の組成物。 - 【請求項３１】 以下の工程を包含する、細胞表面抗原
の存在に基づいて細胞を分離する方法： ａ）請求項１に記載の方法により細胞表面抗原に対する
結合特異性を有するモノクローナル性自己抗体を得る工
程； ｂ）該抗体を異種細胞集団と接触させる工程であって、
ここで、該細胞の亜群が、該抗体が結合特異性を有する
該細胞表面抗原を発現する、工程；および ｃ）該抗体により認識される細胞を、該抗体により認識
されない細胞から分離する工程。 - 【請求項３２】 前記抗体がコロイド超常磁性粒子とと
もに用いられ、そして前記細胞が高勾配磁性分離を用い
て単離される、請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記抗体がコロイド超常磁性粒子に結
合される、請求項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 前記細胞の亜群が前記抗体に結合さ
れ、そして該抗体が抗イムノグロブリン特異的コロイド
超常磁性粒子により認識される、請求項３２に記載の方
法。 - 【請求項３５】 前記抗体がハプテンにより改変され、
そして前記コロイド超常磁性粒子が該ハプテン改変物を
認識する、請求項３２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/226,168 | 1994-04-12 | ||
| US08/226,168 US7119248B1 (en) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | Antibodies against epitopes with homology to self antigens, methods of preparation and applications thereof |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005263046A Division JP2006061158A (ja) | 1994-04-12 | 2005-09-09 | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 |
| JP2006004229A Division JP4362121B2 (ja) | 1994-04-12 | 2006-01-11 | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856692A true JPH0856692A (ja) | 1996-03-05 |
| JP3797680B2 JP3797680B2 (ja) | 2006-07-19 |
Family
ID=22847844
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08726995A Expired - Fee Related JP3797680B2 (ja) | 1994-04-12 | 1995-04-12 | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 |
| JP2005263046A Withdrawn JP2006061158A (ja) | 1994-04-12 | 2005-09-09 | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 |
| JP2006004229A Expired - Fee Related JP4362121B2 (ja) | 1994-04-12 | 2006-01-11 | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005263046A Withdrawn JP2006061158A (ja) | 1994-04-12 | 2005-09-09 | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 |
| JP2006004229A Expired - Fee Related JP4362121B2 (ja) | 1994-04-12 | 2006-01-11 | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7119248B1 (ja) |
| EP (1) | EP0677533B1 (ja) |
| JP (3) | JP3797680B2 (ja) |
| AT (1) | ATE286913T1 (ja) |
| CA (1) | CA2146693C (ja) |
| DE (1) | DE69533912T2 (ja) |
| DK (1) | DK0677533T3 (ja) |
| ES (1) | ES2236698T3 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2004091476A1 (ja) * | 2003-04-16 | 2006-07-06 | 小野薬品工業株式会社 | 心臓疾患治療物質のスクリーニング方法および心臓疾患治療医薬組成物 |
| JP2009192228A (ja) * | 2008-02-12 | 2009-08-27 | Fujifilm Corp | 断片化抗体を標識物質に固定した標識粒子 |
| JP2009197008A (ja) * | 1998-01-23 | 2009-09-03 | F Hoffmann La Roche Ag | ヒトｉｌ−１２に対する抗体 |
| JP2019518454A (ja) * | 2016-05-20 | 2019-07-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 複数のガイドｒｎａを使用して免疫寛容を破綻させるための方法 |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7119248B1 (en) * | 1994-04-12 | 2006-10-10 | Miltenyi Biotec Gmbh | Antibodies against epitopes with homology to self antigens, methods of preparation and applications thereof |
| US7026456B1 (en) | 1998-01-23 | 2006-04-11 | Hoffman-La Roche, Inc. | Antibodies against human IL-12 |
| EP2336187B8 (en) * | 2000-06-19 | 2016-07-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Compositions and methods of monoclonal and polyclonal antibodies specific for T cell subpopulations |
| WO2003092615A2 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Use of anti-cd1 antibodies for the modulation of immune responses |
| CA2517519A1 (en) * | 2003-03-04 | 2004-09-16 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Vectors used to create hybrid constant regions |
| WO2007080404A2 (en) * | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Asterion Limited | Leptin ligand |
| WO2007106448A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Lexicon Genetics Incorporated | Methods for making antibodies in genetically engineered mice |
| CA2939492C (en) | 2009-05-13 | 2019-03-19 | Genzyme Corporation | Anti-human cd52 immunoglobulins |
| CA2761885A1 (en) | 2009-05-13 | 2010-11-18 | Genzyme Corporation | Methods and compositions for treating lupus |
| US8790916B2 (en) | 2009-05-14 | 2014-07-29 | Genestream, Inc. | Microfluidic method and system for isolating particles from biological fluid |
| US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| HUE055817T2 (hu) | 2009-07-08 | 2021-12-28 | Kymab Ltd | Állatmodellek és terápiás molekulák |
| US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| SI3095871T1 (sl) | 2010-02-08 | 2019-06-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Miš z navadno lahko verigo |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| US8695618B2 (en) | 2010-12-22 | 2014-04-15 | Carnegie Mellon University | 3D chemical pattern control in 2D fluidics devices |
| RS61946B1 (sr) | 2011-08-05 | 2021-07-30 | Regeneron Pharma | Humanizovani miševi univerzalnog lakog lakca |
| CA2846319A1 (en) | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains & chains tailored for human use |
| WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
| CA2853719A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-02 | Nkt Therapeutics Inc. | Humanized antibodies to inkt |
| GB2496375A (en) * | 2011-10-28 | 2013-05-15 | Kymab Ltd | A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof |
| US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
| GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| AR095199A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Genzyme Corp | Anticuerpos anti-cd52 |
| US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
| US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
| US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
| US20140331339A1 (en) * | 2013-05-03 | 2014-11-06 | Kymab Limited | Transgenic Non-Human Assay Vertebrates, Assays and Kits |
| TW201546284A (zh) | 2013-10-01 | 2015-12-16 | Kymab Ltd | 動物模式及治療分子 |
| US10881085B2 (en) | 2014-03-21 | 2021-01-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that make single domain binding proteins |
| EP3271403A1 (en) | 2015-03-19 | 2018-01-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
| SG11201806427WA (en) | 2016-02-16 | 2018-08-30 | Regeneron Pharma | Non-human animals having a mutant kynureninase gene |
| CN113361141B (zh) * | 2021-07-11 | 2022-02-18 | 西南石油大学 | 一种dna图谱算法的改进试验方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ230723A (en) | 1988-09-21 | 1992-07-28 | Cambridge Animal Biotech | Pluripotential embryonic stem cells isolated from an embryonic disc, methods of producing transgenic cells and a chimeric foetus |
| ES2191677T3 (es) | 1992-10-21 | 2003-09-16 | Stefan Miltenyi | Seleccion directa de celulas mediante un producto de secrecion. |
| GB9308271D0 (en) | 1993-04-21 | 1993-06-02 | Univ Edinburgh | Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method |
| US7119248B1 (en) * | 1994-04-12 | 2006-10-10 | Miltenyi Biotec Gmbh | Antibodies against epitopes with homology to self antigens, methods of preparation and applications thereof |
-
1994
- 1994-04-12 US US08/226,168 patent/US7119248B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-10 CA CA2146693A patent/CA2146693C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-12 EP EP95302440A patent/EP0677533B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-12 DK DK95302440T patent/DK0677533T3/da active
- 1995-04-12 JP JP08726995A patent/JP3797680B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-12 ES ES95302440T patent/ES2236698T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-12 DE DE69533912T patent/DE69533912T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-12 AT AT95302440T patent/ATE286913T1/de active
-
2005
- 2005-09-09 JP JP2005263046A patent/JP2006061158A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-01-11 JP JP2006004229A patent/JP4362121B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-10 US US11/546,539 patent/US20070101446A1/en not_active Abandoned
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009197008A (ja) * | 1998-01-23 | 2009-09-03 | F Hoffmann La Roche Ag | ヒトｉｌ−１２に対する抗体 |
| JP2013139458A (ja) * | 1998-01-23 | 2013-07-18 | F Hoffmann La Roche Ag | ヒトｉｌ−１２に対する抗体 |
| JPWO2004091476A1 (ja) * | 2003-04-16 | 2006-07-06 | 小野薬品工業株式会社 | 心臓疾患治療物質のスクリーニング方法および心臓疾患治療医薬組成物 |
| JP2009192228A (ja) * | 2008-02-12 | 2009-08-27 | Fujifilm Corp | 断片化抗体を標識物質に固定した標識粒子 |
| JP2019518454A (ja) * | 2016-05-20 | 2019-07-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 複数のガイドｒｎａを使用して免疫寛容を破綻させるための方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006151991A (ja) | 2006-06-15 |
| JP4362121B2 (ja) | 2009-11-11 |
| EP0677533B1 (en) | 2005-01-12 |
| EP0677533A2 (en) | 1995-10-18 |
| JP3797680B2 (ja) | 2006-07-19 |
| ATE286913T1 (de) | 2005-01-15 |
| CA2146693C (en) | 2010-09-14 |
| CA2146693A1 (en) | 1995-10-13 |
| US7119248B1 (en) | 2006-10-10 |
| JP2006061158A (ja) | 2006-03-09 |
| DK0677533T3 (da) | 2005-05-30 |
| EP0677533A3 (en) | 2000-04-12 |
| ES2236698T3 (es) | 2005-07-16 |
| DE69533912D1 (de) | 2005-02-17 |
| US20070101446A1 (en) | 2007-05-03 |
| DE69533912T2 (de) | 2005-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4362121B2 (ja) | 自己抗原と相同性を有するエピトープに対する抗体、その調製方法およびその適用 | |
| Kitamura et al. | A critical role of λ5 protein in B cell development | |
| Hardardottir et al. | T cells with two functional antigen-specific receptors. | |
| Schubart et al. | B-cell-specif ic coactivator OBF-1/OCA-B/Bob1 required for immune response and germinal centre formation | |
| Jumaa et al. | Abnormal development and function of B lymphocytes in mice deficient for the signaling adaptor protein SLP-65 | |
| AU718138B2 (en) | Chimeric animal and method for constructing the same | |
| JP4308217B2 (ja) | トランスジェニック関節炎マウス | |
| JP2013198489A (ja) | ヒトＩｇλ軽鎖遺伝子を保有するトランスジェニック動物 | |
| Born et al. | Expression and role of the T cell receptor in early thymocyte differentiation in vitro. | |
| Takeda et al. | Impaired motor coordination in mice lacking neural recognition molecule NB‐3 of the contactin/F3 subgroup | |
| EP0815213A1 (en) | An immortalized mammal hybridoma fusion partner | |
| Gonzalez-Gay et al. | Protective role of major histocompatibility complex class II Ebd transgene on collagen-induced arthritis. | |
| Johansson et al. | The Genotype Determines the B Cell Response in Mercury–Treated Mice | |
| Rüther et al. | C-fos expression interferes with thymus development in transgenic mice | |
| US20060021069A1 (en) | Antibody production methods related to disruption of peripheral tolerance in B lymphocytes | |
| JPH11512284A (ja) | 単クローン性リンパ球及び利用方法 | |
| Kemp et al. | A bovine monoclonal antibody detecting a class I BoLA antigen | |
| CA2563677A1 (en) | Use of a monoclonal antibody that specifically binds stem cells | |
| EP0956508B1 (en) | Icam-4 and diagnostic uses thereof | |
| Glimcher et al. | Protective Role of Major Histocompatibility Complex Class H Eb d Transgene on Collagen-induced Arthritis By Miguel A. Gonzalez-Gay, Gerald H. Nabozny, Michael J. Bull, Eric Zanelli, John Douhan III,~ Marie M. Griffiths, g | |
| JP2004121211A (ja) | 哺乳類細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いた抗原分子同定法 | |
| Li | The importance of the intracytoplasmic domain of CD3 epsilon in thymocyte development | |
| JPH11313576A (ja) | キメラ動物およびその作製法 | |
| WO1997047655A9 (en) | Methods for the detection of a mutant receptor diagnostic for hemochromatosis | |
| WO2003029818A2 (en) | Methods and animal models for tumor formation involving dutti |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040730 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20041027 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20041101 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050310 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050601 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050606 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050909 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051014 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060111 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20060117 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060324 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060418 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090428 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100428 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110428 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120428 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120428 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130428 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |