ES2236698T3 - Anticuerpos contra epitopos con homologia a auto-antigenos, metodos de preparacion y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Un método de obtención en un animal vertebrado no humano de un anticuerpo monoclonal autólogo contra un auto-antígeno, comprendiendo el método: a) la producción de anticuerpos monoclonales utilizando células o material genético procedente de células recogidas de un animal vertebrado no humano, en el que el genoma del animal ha sido alterado con el fin de que no produzca al menos un epítopo de un auto-antígeno, y en el que el animal ha sido inmunizado con el auto-antígeno o uno de sus homólogos para obtener una respuesta inmunitaria al menos a dicho epítopo, en el que el homólogo comprende un antígeno con un alto grado de similitud estructural a un auto-antígeno y no produce una respuesta inmunitaria al epítopo mediada por el anticuerpo en el animal inalterado, y en el que dichas células se producen en respuesta al auto-antígeno, y expresan anticuerpos contra éste, o su homólogo.

Description

Anticuerpos contra epítopos con homología a auto-antígenos, métodos de preparación y sus aplicaciones.

Campo técnico

Esta invención se refiere a los métodos de obtención de anticuerpos monoclonales autólogos (AMAB) a autoantígenos o a sus homólogos, y a la utilización de estos anticuerpos en el análisis de las poblaciones celulares y en las técnicas de separación celular.

Técnica anterior

Se ha demostrado que los anticuerpos son útiles en aplicaciones médicas tanto para el diagnóstico como para la terapia, y en aplicaciones de la biotecnología incluyendo la separación celular. Más generalmente, su alto grado de especificidad de unión facilita su utilización en la identificación y localización de cualquier compuesto contra el que los anticuerpos se pueden generar juntamente con técnicas tan variadas como microscopía electrónica y ensayo inmunosorbente con enzima ligada.

Los anticuerpos están comprendidos tanto por polipéptidos de cadena pesada como ligera unidos por enlaces disulfuro entre cadenas y otras interacciones intramoleculares. Una cadena individual pesada se empareja con una cadena individual ligera mediante estos enlaces disulfuro. De las diferentes clases o isótopos de anticuerpos, tres isótopos (IgD, IgE e IgG) están comprendidos por dos pares cadena pesada/cadena ligera idénticos unidos por un enlace disulfuro y los dos isótopos restantes (IgA e IgM) están comprendidos por polímeros más complicados de idénticos pares cadena pesada/cadena ligera. Cada cadena contiene una zona constante y una zona variable. Las zonas constantes son peculiares para el animal que genera el anticuerpo y el isótopo específico del anticuerpo, mientras que las zonas variables conforman la estructura del epítopo al que se une el anticuerpo.

El término "antígeno" se utiliza en esta memoria para referirse a una sustancia ya sea una molécula íntegra o un dominio en una molécula, que es capaz de obtener la producción de anticuerpos con especificidad de unión a esta sustancia. Además, el término antígeno se aplica en esta memoria a las sustancias, que en los organismos anfitriones naturales no obtendrían la producción de anticuerpos en virtud de su auto-reconocimiento, pero pueden obtener dicha respuesta en un animal anfitrión con la ingeniería genética apropiada.

El término "epítopo" se utiliza en esta memoria para referirse a las zonas discretas, tridimensionales en un antígeno, que son reconocidas por los linfocitos B. Los epítopos son las zonas inmunológicamente activas en un antígeno complejo, las zonas que se unen realmente a un receptor de linfocitos B, y que se unen realmente mediante las moléculas de anticuerpo resultante que son producidas por los linfocitos B. Los antígenos generalmente contienen al menos un epítopo y normalmente más de un epítopo. Los epítopos en los antígenos de proteína pueden ser lineales o no lineales. Los epítopos lineales son aquellos comprendidos por restos de aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de una proteína. Los epítopos lineales pueden o no requerir plegamiento de la conformación para formar la estructura tridimensional natural y obtener una respuesta inmunitaria que produzca anticuerpos con especificidad de unión al antígeno. Los epítopos no lineales están comprendidos por restos de aminoácidos no contiguos. Por lo tanto, los epítopos no lineales requieren siempre algún grado de plegamiento de la proteína para llevar los restos de aminoácidos del requisito a la proximidad uno de otro para formar la estructura natural tridimensional y obtener una respuesta inmunitaria que produzca anticuerpos con especificidad de unión para el antígeno.

El término "auto" se utiliza en esta memoria para describir antígenos o epítopos que no serían reconocidos o serían solamente poco reconocidos por los receptores de los linfocitos B de un miembro natural de la especie del anfitrión, en virtud de estar incluido entre las sustancias que se biosintetizan normalmente por la especie anfitriona, o a la cual la especie anfitriona se expone normalmente. Dichas sustancias inducen tolerancia del sistema inmunitario del anfitrión y el anfitrión se dice que es "tolerado" para las sustancias.

El sistema inmunitario de los vertebrados puede discriminar entre autoantígenos y antígenos extraños, montando una respuesta inmunitaria mediada por el anticuerpo contra este último y no el anterior. La respuesta del anticuerpo es mediada por los linfocitos B. Las transposiciones génicas de la zona variable tienen lugar en una secuencia ordenada durante la maduración de los linfocitos B en la médula ósea. Al final de este proceso, cada linfocito B contiene una sola secuencia de ADN de la zona variable funcional que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina y una sola secuencia de ADN de la zona variable funcional que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina. Este proceso conduce a la generación de linfocitos B incompetentes, maduros, cada uno de los cuales está asignado antigénicamente a un solo epítopo. En un proceso que todavía no se comprende, la tolerancia inmunológica a los "auto" componentes se lleva a cabo mediante el desprendimiento selectivo de los linfocitos B con las zonas variables que están antigénicamente asignadas a auto-epítopos. Esta autotolerancia excluye la producción de anticuerpos específicos para antígenos o epítopos que son sintetizados por un vertebrado anfitrión. Por lo tanto, solamente los antígenos que contienen epítopos que son reconocidos como extraños por el anfitrión pueden utilizarse para generar anticuerpos.

Cuando el autoepítopo y el epítopo extraño son estructuralmente similares u "homólogos", la respuesta inmunitaria del anfitrión es más débil; de este modo es virtualmente imposible obtener anticuerpos con gran afinidad a tales epítopos. Como resultado es extremadamente difícil generar anticuerpos contra los dominios de las proteínas muy conservados (p. ej. N-CAM, citocinas e inmunoglobulinas), porque los animales que comparten los dominios conservados no pueden reconocerles como extraños. Aunque los anticuerpos contra los autoantígenos se producen como resultado de determinadas enfermedades autoinmunitarias, estos anticuerpos presentan especificidades de unión para un conjunto muy restringido de autoantígenos que no se pueden manipular artificialmente y generalmente presentan bajas afinidades de unión. El documento EP-A-286447 describe dicha enfermedad autoinmunitaria y describe la generación de anticuerpos monoclonales contra los autoantígenos implicados en dicha enfermedad autoinmunitaria utilizando técnicas convencionales. De este modo, los animales con enfermedades autoinmunitarias no son generalmente útiles en la producción de anticuerpos con especificidad de unión a los auto-antígenos. El documento EP-A-313156 describe un antígeno de proteína que es reactivo para con un auto-anticuerpo asociado con una enfermedad autoinmunitaria.

En los ratones, las diferencias alogeneicas entre las cepas han permitido la producción de anticuerpos anti-ratón de ratón específicos para las proteínas de los cuales se han producido dichas diferencias alogeneicas. Kessler et al. (1979) J. Immunol. 123:2772-2778; Reif y Allen (1964) J. Exp. Med. 120:413-433; Marshak-Rothstein (1979) J. Immunol. 122:2491-2497; y Oi y Herzenberg (1979) Molec. Immunol. 16:1005-1017. Al principio, los anticuerpos policlonales y después los anticuerpos monoclonales específicos de las proteínas de la superficie de los linfocitos T y los anticuerpos IgD de ratón se obtuvieron de esta manera. Estos anticuerpos, sin embargo, solamente reconocen el producto génico de determinadas cepas de ratones. Estos anticuerpos pueden reconocer solamente aquellos epítopos que no sean estructuralmente homólogos a los auto-antígenos del anfitrión que produce el anticuerpo. Además, los epítopos contra los que se pueden obtener estos anticuerpos están limitados a las diferencias entre las cepas y la disponibilidad de las propias cepas alotípicas y por lo tanto tienen poca utilidad práctica.

Prusiner et al. PNAS, 1993, vol. 90 nº 22, 10608-10612, describe la producción de ratones con insuficiencia de proteínas de priones alterados genéticamente. La inyección de proteínas de priones infecciosos condujo a la generación de anticuerpos en estos ratones.

Se han formulado numerosos métodos para analizar y seleccionar poblaciones de células que incluyen, pero no se limitan a, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), separación magnética (utilizando anticuerpos conjugados con perlas magnéticas) y otros métodos que dependen de la afinidad del anticuerpo a determinadas proteínas de la superficie celular conocidas como "marcadores". Dichos métodos para análisis y separación de células son especialmente útiles para la determinación de estirpes celulares, el aislamiento de células que sean capaces de sintetizar un determinado producto y para el tratamiento de varias enfermedades con tipos de células específicas. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas muy purificadas son esenciales para la implantación hematopoyética que incluye, pero no se limita a, los pacientes de cáncer y el trasplante de otros órganos junto con la implantación hematopoyética. Las poblaciones de células aisladas son también dianas importantes para la terapia génica en el tratamiento de los trastornos genéticos, SIDA y varias formas de cáncer. Por tanto, se han realizado numerosos esfuerzos hacia el aislamiento de determinadas variedades de células en forma pura o sustancialmente pura. En los casos tales como el aislamiento de células madre, la purificación eficaz de células de dicha baja concentración en el cuerpo requiere anticuerpos que reconozcan y se unan a marcadores específicos de células madre con gran especificidad. Dichos anticuerpos son difíciles de obtener debido a la homología entre los marcadores de las células madre humana y murina.

Compendio de la invención

Esta invención intenta proporcionar nuevos métodos de obtención de anticuerpos monoclonales (autólogos) (AMAB) contra un auto-antígeno o su homólogo. El método puede comprender la obtención de un animal anfitrión modificado genéticamente que no biosintetice o sintetice una forma alterada de al menos un epítopo dentro del auto-antígeno y la utilización del anfitrión que carece de auto-tolerancia a por lo menos un epítopo que produce anticuerpos específicos contra este antígeno. La invención también comprende los anticuerpos o cualquiera de sus derivados funcionales producidos por el método. La invención comprende además métodos de aislamiento de células que comprenden la utilización de los anticuerpos obtenidos por el método de la invención que son específicos para un antígeno de la superficie de la célula.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos, que se proporcionan para ilustrar la invención:

la Figura 1 es una fotografía que representa el anticuerpo anti-IgD que se tiñe del tejido del bazo de ratón en áreas ricas en linfocitos B;

la Figura 2 representa los resultados de la valoración de los AMAB \delta1.3 y \delta3.5 en células de bazo de ratón;

la Figura 3 representa los resultados de un análisis FACS de células de bazo de ratón teñidas dos veces con anticuerpos anti-IgM y anti-IgD; y

la Figura 4 representa los resultados de la separación de células de bazo de ratón utilizando anticuerpos anti-IgM conjugados con partículas superparamagnéticas coloidales.

Modos de llevar a cabo la invención

La invención intenta proporcionar nuevos métodos de obtención de AMAB que tengan especificidad de unión con los autoantígenos o sus homólogos. La invención proporciona un medio para superar la limitación en la producción de los AMAB contra antígenos que el anfitrión reconoce como propios, así como un método para obtener "anticuerpos dirigidos" esto es, los AMAB con especificidad de unión a epítopos conocidos, particulares y sumamente precisos. La invención también permite la obtención de AMAB contra moléculas biológicas, o sus epítopos, considerados esenciales para el crecimiento y el desarrollo. Tal como se expuso más en detalle en esta memoria, la sustitución genética dirigida permite la producción de equivalentes funcionales de las moléculas y por tanto permite el crecimiento y el desarrollo suficientes del animal para producir anticuerpos.

El término "homólogo" se utiliza en esta memoria para referirse a un antígeno con una estructura que sea tan similar a un antígeno producido por el animal anfitrión, un "auto-antígeno", como para excluir o impedir gravemente la producción de anticuerpos contra el homólogo. La frase "auto-antígeno o uno de sus homólogos" se utiliza en esta memoria para significar que la invención no se dirige solamente a la obtención de AMAB con especificidad de unión a auto-antígenos, sino que la invención se dirige más bien a la obtención de AMAB contra cualquier compuesto con dicho grado elevado de similitud estructural a un auto-antígeno, que el homólogo es reconocido suficientemente como auto que el animal anfitrión no produce una respuesta inmunitaria adecuada mediada por el anticuerpo. Una respuesta inmunitaria adecuada mediada por el anticuerpo es aquella en que los AMAB no se obtienen o, si se produce, no presenta gran afinidad para el antígeno.

La expresión "antígeno diana" se utiliza en la presente memoria para referirse a la composición a la que se expone el animal anfitrión y contra la que se genera una respuesta inmunitaria. El "epítopo del antígeno diana" es una zona del antígeno diana a la que se unen los AMAB.

La expresión "respuesta inmunitaria" se utiliza en esta memoria para referirse a la producción de los AMAB por los linfocitos B. Estos anticuerpos se unen a un antígeno determinado independientemente de si efectúan un cambio en el antígeno tal como proporcionar inmunidad a un agente causante de enfermedad. Los AMAB pueden estar asociados a la superficie del linfocito B y pueden también circular libremente.

La expresión "estructuralmente no homólogo" se utiliza en esta memoria como una descripción para comparar los auto-antígenos con los antígenos biosintetizados por los animales anfitriones como resultado de la modificación genética. Dos antígenos son estructuralmente no homólogos, cuando se puede generar un antígeno que se una a uno y no a otro. Estructuralmente no homólogo significa que existe alguna diferencia estructural, quizás ligera, entre dos o más antígenos. La diferencia estructuralmente no homóloga entre dos antígenos puede ser tan pequeña como una sola diferencia de aminoácidos, o la presencia o ausencia de un grupo metilo.

La expresión "funcionalmente equivalente" se utiliza en esta memoria como una descripción para comparar auto-antígeno y antígeno diana biosintetizados por animales anfitrión como resultado de la modificación genética. En muchos casos, la síntesis con destrucción de un auto-antígeno puede resultar letal, reducir la supervivencia o la salud general de animales anfitriones modificados genéticamente con el fin de interferir con los anticuerpos obtenidos. Por tanto, como se describe en esta memoria, la ingeniería genética se puede utilizar para eliminar la biosíntesis de un auto-antígeno y dar lugar a la producción de otro antígeno funcionalmente equivalente. Este antígeno funcionalmente equivalente ejerce una cantidad de la función de auto-antígeno suficiente para compensar la eliminación perjudicial del auto-antígeno mejorando la tasa de supervivencia, la salud general o la inmunocompetencia del animal anfitrión hasta el punto en que se puedan obtener los AMAB. Tal como se utiliza en esta memoria, los antígenos funcionalmente equivalentes se entiende que son estructuralmente no homólogos.

La expresión "repertorio biosintético" se utiliza en esta memoria para referirse a la suma total de todos los compuestos biosintetizados por un animal anfitrión dado.

El término "natural" se utiliza en esta memoria para describir los individuos y la cepa del anfitrión que no se han sometido a ingeniería genética en relación con el antígeno diana y no descienden de dicho organismo modificado genéticamente. Por tanto dichos individuos producirán normalmente el auto-antígeno de interés.

La expresión "modificado genéticamente" se utiliza para describir los animales que han tenido uno o más genes alterados o eliminados directamente con el fin de impedir o alterar la síntesis de un antígeno determinado o de un conjunto de antígenos. Dicha alteración o eliminación es en el nivel genético, por ejemplo por mutación genética específica y sustitución. La modificación genética del antígeno diana se limita generalmente hasta el punto en que los anticuerpos se puedan obtener con aumento de especificidad de unión para al menos un epítopo en el antígeno o conjunto de antígenos, como se describe en esta memoria. La expresión "modificada genéticamente" se aplica también a la descendencia de los animales originalmente alterados.

El término "dominio" se utiliza en esta memoria para referirse a cualquier zona o parte de un antígeno, incluyendo el antígeno completo, cualquier parte que sea menor al antígeno completo o cualquier zona que sea más que el antígeno completo en virtud de la adición de componentes que pueden servir para enmascarar al menos un epítopo.

En una realización de la invención, el animal anfitrión está modificado genéticamente de modo que no sintetiza un determinado auto-antígeno. Cuando el huésped modificado genéticamente se inmuniza con el auto-antígeno o uno de sus homólogos, el sistema inmunitario del anfitrión no reconoce el antígeno como propio, y de este modo es capaz de producir una respuesta inmunitaria mediada por el anticuerpo a partir de la cual se pueden obtener los AMAB. Los métodos de obtención de dichos mutantes "modificados genéticamente" se conocen en la técnica y se describen por ejemplo, en Mansour et al. Nature 336:348-352 (1986). Como en los animales anfitriones más genéticamente modificados utilizados en esta memoria, se puede utilizar la reproducción para conseguir un mutante homozigótico o para obtener múltiples animales anfitriones modificados genéticamente. Por tanto, la modificación genética para el huésped puede por último obtenerse mediante la transmisión por la línea germinal.

La descendencia de los ratones modificados genéticamente está también comprendida en la invención. Cualquier otro método conocido en la técnica de creación de animales transgénicos es adecuado para su utilización en esta memoria. Los métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, los descritos por Kitamura et al. (1991) Nature 350:423-426; Shinkai et al. (1993) Science 259:822-825; y Komori et al. (1993) Science 261 :1171-1175. En resumen, en el caso de auto-antígenos del sistema inmunitario, las células madre embrionarias (ES) homozigóticas para la modificación génica se pueden implantar en blastocitos de ratones con inmunoinsuficiencia tales como los ratones con insuficiencia de RAG. El animal reconstituido perderá, en muchos casos, el fenotipo inmunodeficiente y contendrá la modificación génica en sus linfocitos.

En otra realización de la invención, el animal anfitrión se modifica genéticamente de modo que la síntesis de un determinado auto-antígeno se sustituye por la síntesis de un antígeno funcionalmente equivalente. Por tanto, se pueden obtener anticuerpos para antígenos cuya eliminación resultaría letal, reduciría drásticamente la supervivencia o si no dificultaría los esfuerzos para obtener anticuerpos.

El auto-antígeno que se elimina del repertorio biosintético del anfitrión puede ser cualquier compuesto, dominio o uno de sus epítopos, que sea sintetizado normalmente por un miembro natural de la especie anfitriona. Los anticuerpos obtenidos por la invención se pueden dirigir contra cualquier antígeno, incluyendo pero sin limitarse a, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, cofactores enzimáticos o cualquiera de los agregados naturales o una de sus combinaciones unidas por enlace covalente o cualquiera de sus especies fosforiladas o sulfonadas. Para estas realizaciones de la invención, el anfitrión se puede modificar genéticamente de cualquier forma de modo que la biosíntesis del antígeno se elimine o altere. Por ejemplo, la modificación genética de la expresión de una determinada enzima que está implicada en la biosíntesis del antígeno puede dar como resultado la no producción del antígeno o la producción de un antígeno funcionalmente equivalente. Dichas enzimas incluyen, pero no se limitan a, las enzimas implicadas en la polimerización y el acoplamiento de carbohidratos, grupos fosfato, lípidos, grupos que contienen azufre a proteínas podría ser eliminado, dando como resultado la eliminación o el cambio en la estructura de los compuestos que están unidos por enlace covalente a las proteínas, como en la síntesis de las glucoproteínas. De este modo, los anticuerpos con especificidad de unión a determinadas estructuras de auto-glucoproteínas o carbohidratos en las glucoproteínas se pueden obtener por los métodos de la invención.

Se pueden utilizar más métodos globales de eliminación o de cambio de la producción de antígenos. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la eliminación de la síntesis de determinados genes o familias de genes y a la eliminación de determinados tipos de células. Ejemplos de genes adecuados y de familias de genes incluyen los regulados por la presencia de determinados factores tales como esteroides o citocinas o genes que se expresan de una manera específica al tipo de células. Un ejemplo de dicho tipo de células son las células marrones de la grasa.

En la realización preferida de la invención, el antígeno es una proteína. Una mutación por modificación genética para una proteína podría implicar evitar la síntesis de la proteína completa (eliminado el gen completo o alterando los elementos de control de la transcripción o de la traducción) o eliminando la síntesis de solo un dominio antigénico, aunque permitiendo que la parte restante de la proteína se sintetice normalmente. En el caso de un antígeno de proteína, la sustitución del auto-antígeno con un antígeno funcionalmente equivalente, se puede conseguir al menos por tres tipos distintos de sustituciones aunque cualquier sustitución formal conocida en la técnica es adecuada para la utilización en esta memoria.

En primer lugar, el gen que codifica el auto-antígeno se puede sustituir por un gen recombinante derivado del gen que codifica el auto-antígeno. El gen que codifica la proteína se altera de modo que se elimina una zona antigénica, se sustituye por una secuencia de aminoácidos alternativa, o se enmascara mediante la adición de una nueva secuencia de aminoácidos. De este modo, en la modificación de un antígeno de auto-proteína, la eliminación modificada genéticamente del antígeno puede ser tan pequeña como la adición, eliminación o sustitución de un solo aminoácido. Es importante que dichos pequeños cambios en la estructura del antígeno de la auto-proteína permitan obtener AMAB contra epítopos sumamente precisos sin destruir gravemente la función del auto-antígeno. Un solo cambio de aminoácido en un dominio adecuado produciría los AMAB contra epítopos que incluyen el único aminoácido.

En segundo lugar, el gen que codifica al auto-antígeno se puede sustituir por el gen que codifica una proteína homóloga obtenida a partir de un organismo que está relacionado con la especie anfitriona, de modo que la proteína codificada sea funcionalmente equivalente pero al menos en parte antigénicamente no equivalente. Las especies íntimamente relacionadas normalmente presentan un grado elevado de homología de secuencia para la misma proteína, normalmente mayor del 90%. Por tanto esta estrategia es ideal para poner en práctica la invención en los casos en los que la expresión del antígeno es crítica para la salud del organismo, y se desean los AMAB con especificidad de unión a un pequeño número de epítopos. Esta estrategia se puede también poner en práctica sustituyendo solamente una zona del gen que codifica al auto-antígeno con la correspondiente zona del gen que codifica al mismo antígeno de una especie relacionada.

En tercer lugar, el gen que codifica al auto-antígeno se puede sustituir por un gen que codifica una proteína que es conocida porque tiene la misma o similar función, pero es estructuralmente no homóloga. Esta estrategia es particularmente útil cuando la expresión del antígeno sea crítica para la salud del organismo y no se requieran los AMAB con especificidad de unión a determinados epítopos.

Ejemplos de antígenos de proteínas a los que los AMAB obtenidos por la invención se pueden unir de forma específica, incluyen, pero no se limitan a, antígenos de la superficie celular, por ejemplo moléculas adhesivas, moléculas MHC de clase I y clase II, integrina, citocinas, selectinas, receptores de citocina e inmunoglobulinas.

La invención se puede poner en práctica utilizando un animal vertebrado anfitrión no humano, incluyendo peces, reptiles, anfibios, aves y mamíferos. Sin embargo, el anfitrión preferentemente es un mamífero y normalmente pertenece a un orden que incluye, pero no se limita a, rodentia, lagomorpha, primates, carnivora, perissodactyla y artiodactyla. Preferentemente el anfitrión es rodentia o murino y más preferentemente un ratón.

Los métodos de preparación de los AMAB son bien conocidos en la técnica y por eso no se describen con detalle en esta memoria. En esta memoria se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica de la producción de anticuerpos monoclonales. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, la separación de linfocitos B con anticuerpos de la superficie celular de especificidad deseada, clonación del ADN que expresa las zonas variables de las cadenas ligera y pesada y que expresa los genes recombinantes en una célula anfitriona adecuada. Se pueden utilizar técnicas de generación de anticuerpos monoclonales normalizadas en las que se obtienen los AMAB de células de hibridoma que producen anticuerpos inmortales. Estos hibridomas se pueden producir fusionando linfocitos B, preferentemente aislados del bazo del anfitrión inmunizado, con células inmortales, preferentemente un mieloma de linfocitos B.

La invención abarca además composiciones de materia que comprenden los AMAB obtenidos por los métodos descritos en esta memoria. Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "AMAB(s)", "anticuerpo" o "anticuerpos" incluyen el anticuerpo completo así como los fragmentos de anticuerpo que contienen sus partes funcionales. El término "AMAB" incluye cualquier compuesto monoespecífico comprendido por una parte suficiente de la zona variable de la cadena ligera y/o la zona variable de la cadena pesada para efectuar la unión al epítopo en la que el anticuerpo completo presenta especificidad de unión. Los fragmentos pueden incluir la zona variable de al menos un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera, e incluir, pero sin limitarse a, fragmentos de Fab, fragmentos Fab2 y fragmentos Fv.

Además, los dominios específicos se pueden acoplar por cualquier método conocido en la técnica a otra molécula adecuada. El acoplamiento puede ser, por ejemplo, químico o por ingeniería genética. Los AMAB se pueden producir por cualquier medio recombinante conocido en la técnica. Dichos AMAB recombinantes incluyen, pero no se limitan a, fragmentos producidos en bacterias y AMAB en los que la mayoría de las zonas constantes han sido sustituidas por zonas constantes de anticuerpos humanos. Además, dichos AMAB "humanizados" se pueden obtener reproduciendo los vertebrados anfitriones modificados genéticamente descritos en esta memoria con un animal transgénico compatible que exprese los locus Ig humanos funcionales en lugar de los locus Ig naturales. Para una exposición de los animales transgénicos que expresan los locus Ig humanos, véase la publicación WIPO número WO 91/10741 y Rajewsky et al. DE P4228162.8. Con cruces sucesivos, se pueden obtener animales anfitriones que no expresan un determinado auto-antígeno, pero que expresan proteínas Ig humanizadas. Cuando dichos animales están inmunizados producirán AMAB humanizados o parcialmente humanizados contra determinados auto-antígenos. Se prefieren dichos AMAB humanizados para su utilización en las indicaciones terapéuticas.

Los AMAB se pueden conjugar con otros compuestos incluyendo, pero sin limitarse a, enzimas, perlas magnéticas, perlas magnéticas coloidales, haptenos, fluorocromos, compuestos metálicos, compuestos radioactivos, fármacos o haptenos. Las enzimas que se pueden conjugar a los AMAB incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina, peroxidasa, ureasa y \beta-galactosidasa. Los fluorocromos que se pueden conjugar con los AMAB incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de tetrametil-rodamina, ficoeritrina, aloficocianinas y rojo de Texas. Para los fluorocromos adicionales que se pueden conjugar con anticuerpos véase Haugland, R.P. Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994). Los compuestos metálicos que se pueden conjugar con los AMAB incluyen, pero no se limitan a, ferritina, oro coloidal y particularmente, perlas superparamagnéticas coloidales. Los haptenos que se pueden conjugar con los AMAB incluyen, pero no se limitan a, biotinas, digoxigenina, oxazalona y nitrofenol. Los compuestos radioactivos que se pueden conjugar o incorporar a los AMAB son conocidos en la técnica, e incluyen pero no se limitan a tecnecio 99m (^{99}Tc), ^{125}I y aminoácidos que comprenden cualquier radionucleido, incluyendo, pero sin limitarse a, ^{14}C, ^{3}H y ^{35}S. Cualquier fármaco conocido en la técnica que se puede conjugar a una proteína por cualquier método conocido en la técnica es adecuado para su utilización en la presente invención. Dichos fármacos se pueden conjugar con los AMAB para la administración muy específica a la molécula diana.

La invención proporciona además métodos de utilización de los AMAB, que incluyen pero no se limitan a, inmunoanálisis y separación de células. Los inmunoanálisis adecuados son bien conocidos en la técnica y por eso no necesitan ser descritos con detalle en esta memoria. Éstos incluyen, pero no se limitan a, los ELISA y los RIA. Los métodos de separación de células incluyen, pero no se limitan a, la separación basada en la secreción de moléculas y la separación basada en las moléculas de la superficie celular. Los métodos de separación de células basados en la secreción de las moléculas están descritos en la serie nº 07/965.934 y en la solicitud internacional nº PCT/US93/10126. Los métodos para la separación de las células basados en marcadores de la superficie celular específicos incluyen generalmente las etapas de obtención de los AMAB por los métodos descritos en esta memoria, poniendo en contacto los AMAB con una población heterogénea de células y realizando una técnica de separación de células basada en la afinidad de los AMAB por el antígeno de la superficie celular. Para separar o aislar las células se puede emplear cualquier método conocido en la técnica eliminando inicialmente las células con determinados antígenos de la superficie celular o de determinados estirpes.

Los AMAB son particularmente útiles para la identificación de marcadores asociados con determinados estirpes celulares y/o etapas de diferenciación. Los AMAB se pueden unir directamente o indirectamente a un soporte sólido que permita la separación. Las técnicas de separación empleadas deberían maximizar la retención de la viabilidad de la fracción que se debe recoger. Se pueden emplear varias técnicas de diferente eficacia para obtener separaciones. Dichas separaciones son hasta el 10%, normalmente no más de aproximadamente 5%, preferentemente no más de aproximadamente 1%, de las células totales presentes que no tienen el marcador pueden permanecer con la población celular que se debe mantener. La técnica particular empleada dependerá de la eficacia de la separación, de la citotoxicidad de la metodología, de la facilidad y rapidez de la realización y la necesidad de equipo sofisticado y/o de la experiencia en la técnica.

Los procedimientos para la separación de las células incluyen, pero no se limitan a, la separación magnética que utiliza anticuerpos unidos a partículas magnéticas coloidales, cromatografía por afinidad y agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o utilizados junto con cualquier técnica de separación dependiente del anticuerpo conocida en la materia. Además, las células se pueden separar por "apelmazamiento" con anticuerpos unidos a una matriz sólida, p. ej., una placa. Se puede también utilizar la clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS) y puede tener varios grados de sofisticación, incluyendo, pero sin limitarse a, una pluralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de la luz de ángulo bajo y obtusa y canales de impedancia. Se puede utilizar cualquier técnica de separación dependiente de anticuerpos conocida en la materia junto con ambas técnicas de separación positiva y negativa que se basen en las propiedades físicas de la célula más que en la afinidad al anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, la decantación y a la centrifugación por gradiente de densidad.

Los métodos para separar las células están disponibles en el comercio en Dynal, Oslo Noruega, Cellpro, Seattle, o Advanced Magnetics, Boston. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales autólogos se pueden acoplar directamente a partículas de poliestireno magnéticas como Dynal M 450 o partículas magnéticas similares y utilizadas, p. ej., para la separación celular. Como alternativa, se pueden biotinilar anticuerpos o conjugar dioxigenina y utilizarse junto con avidina o anti-digoxigenina recubierta en columnas de afinidad como SEPARATE LC (Cellpro). En una realización preferida, sin embargo, se utilizan anticuerpos monoclonales autólogos junto con micropartículas superparamagnéticas coloidales con un recubrimiento orgánico, p. ej., mediante polisacáridos. Miltenyi et al. (1990) Cytometry 11:231-238. Estas partículas se pueden utilizar con un tamaño de 10 a 200 nm, preferentemente entre 40 y 100 nm y pueden estar conjugadas directamente a anticuerpos autólogos o utilizarse en combinación con anti-inmunoglubulina, avidina o microperlas específicas de anti-hapteno. Las partículas superparamagnéticas recubiertas de polisacárido están disponibles en el comercio en Miltenyi Bistec GMBH, Alemania.

Un procedimiento que se puede utilizar consiste en primer lugar en incubar las células durante un periodo de tiempo corto a temperaturas reducidas, generalmente aproximadamente 4ºC, con concentraciones de saturación de AMAB específicos para un determinado antígeno de la superficie celular, y a continuación lavar las células con PBS y una almohadilla de suero de ternero fetal (FCS). Las células se pueden poner en suspensión a continuación en un medio con tampón como el descrito anteriormente y separarse basándose en los AMAB para determinantes particulares, utilizando varias proteínas específicas para los AMAB o el complejo AMAB-antígeno.

Los AMAB se pueden conjugar con marcadores, incluyendo, pero sin limitarse a, perlas magnéticas, que permiten la separación directa, biotina, que se puede eliminar con avidina o estreptavidina unida a un soporte, digoxigenina detectada por anticuerpos anti-digoxigenina y fluorocromos, que se pueden utilizar con un FACS, o similares, que permitan una fácil separación de un determinado tipo de células. Se puede emplear cualquier técnica que no sea perjudicial en exceso para la viabilidad de las células restantes.

Tras el enriquecimiento sustancial de las células que contienen el antígeno de la superficie celular, generalmente por lo menos aproximadamente el 50%, preferentemente al menos aproximadamente el 70%, de las células se pueden separar a continuación por un FACS u otra metodología conocida en la técnica. Se pueden emplear análisis multi-color, por varios métodos incluyendo, pero sin limitarse a, FACS y microscopía de fluorescencia. Se pueden separar las células basándose en el nivel de coloración de determinados antígenos.

La invención comprende además la obtención de los AMAB contra auto-antígenos que son receptores por el método descrito en esta memoria y utilizando dichos AMAB como agentes farmacéuticos, en la que los AMAB demuestran eficacia como agonistas o antagonistas del receptor.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar, pero no limitar, la invención.

Ejemplo 1 Destrucción dirigida al gen

Se realizó la destrucción dirigida al gen del gen C\delta descrito por Roes y Rajewsky (1993) J. Exp. Med. 177:45-55 (1993); y Roes y Rajewsky Int. Immunol. 3:1367 (1991). En resumen, se transfectaron un total de 10^{8} células ES de E14-1 con el vector de direccionamiento diseñado para reemplazar una gran parte del exón de C\delta1 y para insertar mutaciones con desplazamiento del marco en C\delta3 rellenando las secuencias de restricción presentes en este exón. La introducción de las mutaciones en la línea germinal produjo la inactivación funcional de ambos exones del dominio Ig de la cadena \delta. Esto se consideró importante para excluir la posibilidad de expresión de una cadena \deltaH truncada que podría competir con \mu por las cadenas L y ser segregado. La presencia del marco de desplazamiento en la línea germinal del ratón fue indicada mediante una secuencia de restricción NheI procedente de la secuencia HindIII en C\delta3. El exón de C\delta2 es un pseudoexón debido a un aceptor de corte y empalme no funcional.

La selección de colonias supervivientes se analizaron por PCR y los clones positivos se analizaron además por transferencia Southern para confirmar la estructura del locus dirigido. Se obtuvieron recombinantes homólogos a una frecuencia de 1/17 doble resistentes o clones 1/103 resistentes a G418. Se presentan las cartografías de restricción de los locus de C\delta naturales y mutados así como el análisis de restricción del ADN genómico digerido con HindIII de cinco células individuales recombinantes y de referencia experimentales. Un caso de recombinación homóloga produciría una banda de 4,4 ó 6,0 kb, además de en la banda de 3,8 kb de la línea germinal dependiendo de la presencia y/o ausencia de la mutación por desplazamiento del marco en C\delta3 que produce la pérdida de la secuencia HindIII. 9 de cada 10 clones recombinantes homólogos presentaban el fragmento de 6,0 kb, lo que indica que el punto de rotura de la recombinación estaba situado en 3' del exón C\delta3. Por tanto, los exones C\delta1 y C\delta3 se volvieron no funcionales en estos clones. Un clon conservó la secuencia de restricción HindIII enel exón C\delta3, produciendo un fragmento de restricción para diagnóstico de 4,4 kb. Se confirmó la estructura del locus dirigido utilizando una variedad de otras sondas y enzimas de restricción. Se realizaron análisis de transferencia Southern descritos por Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989).

Ejemplo 2 Generación de ratones con carencia en IgD

Se realizó la generación de ratones con carencia en IgD descrita por Roes y Rajewsky (1993) J. Exp. Med. 177:45-55. En resumen, la estrategia de inactivación del gen C\delta y el procedimiento de identificación de clones positivos fue tal como se describe en el Ejemplo 1. Se inyectaron clones dirigidos de células ES en blastocistos aislados en ratones C57BL/6 y se transfirieron a (C57BL/6 \times BALB/c) hermanas. Se aparearon crías híbridas macho con hembras C57BL/6 para la transmisión de la línea germinal de la mutación \deltaT. Se identificaron crías procedentes de células ES por el color del pelo y se analizó la presencia de la mutación que se denominó \deltaT, por transferencia Southern o por el fenotipo, por citometría de flujo. Se obtuvieron ratones homozigóticos mutantes (\deltaT/\deltaT) por entrecruzamiento de crías heterozigóticas.

Ejemplo 3 Análisis por transferencia Northern de supuestos ratones mutantes (\deltaT/\deltaT)

Se realizó el análisis por transferencia Northern de supuestos ratones mutantes (\deltaT/\deltaT) descrito por Roes y Rajewsky (1993). En resumen, la mutación \deltaT produce la inactivación funcional de ambos exones que codifican los dominios Ig de la cadena H. La transmembrana y los exones de la zona bisagra, sin embargo, permanecen intactos y potencialmente funcionales. Para excluir la posibilidad de que el corte y empalme aberrante del ARN precursor que abarca tanto los genes C\mu como los C\delta produzca la generación de una cantidad significativa de transcritos Ig híbridos que codifican los dominios extracelulares del C\mu y la transmembrana y el fragmento citoplasmático de C\delta, se aisló ARN poli(A)^{+} de bazos de mutantes homozigóticos (\deltaT/\deltaT) y se analizaron ratones naturales por transferencia Northern. Exones C\mu que contienen ARNm cortados y empalmados al exón C\delta con transmembrana serían mayores que los transcritos normales de C\mu de 2,4 (\mus) o 2,7 kb (\mum), porque la zona 3' no traducida del mensaje de \delta es 600 bp mayor que la del mensaje \mu.

La hibridación del poli(A)^{+} ARN del bazo de ratones homozigóticos mutantes con una sonda específica de la transmembrana de C\delta pone de manifiesto bandas de 4,8, 4,0, 3,8 y 3,0 kb. Sin embargo, ninguna de estas bandas se hibridó con la sonda específica de C\delta. El límite de detección de las dos sondas fue similar en un factor de dos (1,2 \times 10^{6} copias para el C\mu y de 0,6 \times 10^{6} para la sonda \deltam) estimado por las señales obtenidas desde la hibridación hasta el ADN del plásmido normal. La sonda C\mu es un fragmento de ADNc de 1 kb con compatibilidad completa con el ARNm y el plásmido normal, mientras que la sonda \deltam se hibrida con el ARNm en todo una extensión de 480 bp, pero de 700 bp en el plásmido normal porque contiene el intrón \deltam1/m2. Por consiguiente, un ARNm que representa los exones C\mu cortados y empalmados a los exones \deltam, si se detecta con la sonda \deltam, debería también ponerse de manifiesto con la sonda C\mu. Debido a que las bandas de 3,0, 3,8, 4,0 y 4,8 kb están claramente por encima del límite de detección de la sonda \deltam, si contienen la secuencia C\mu, deberían también detectarse con la sonda C\mu. Sin embargo, este no es el caso.

Además, la hibridación secuencial de la misma transferencia con un gen neo^{+} y una sonda específica para el exón C\delta_{3} demostró que las bandas de 3,0, 3,8, 4,0 y 4,8 kb también contienen secuencias procedentes del gen neo^{+}, indicando que representan productos aberrantes de corte y empalme. La banda de 3,0 kb se hibridó con la sonda específica para el exón C\delta3 que no es funcional en el alelo dirigido de mutaciones con desplazamiento del marco descritas en el Ejemplo 1. Además, con la sonda neo^{+}, se detectó asimismo, el ARNm de 2,4 kb, que no se hibridó con la sonda \deltam. Los ARNm poco abundantes de 1,6 y 2,0 kb que se hibridan con una sonda específica de C\deltam son detectables en 10 \mug de poli(A)^{+} ARN tanto de ratones normales como mutantes. Estos ARN, sin embargo, son más pequeños que el mensaje normal de C\mu y por consiguiente, es improbable que codifiquen una molécula de Ig funcional.

Consideradas conjuntamente, las especies de ARNm que representan potencialmente moléculas \mu/\delta híbridas funcionales son indetectables en las transferencia Northern utilizando como mucho 10 \mug de poli(A)^{+} ARN de bazo de ratones \deltaT/\deltaT. Debido a que el ARNm que codifica la cadena H de \delta puede detectarse con la sonda específica de C\deltam en una cantidad tan pequeña como 300 ng de poli(A)^{+}ARN de bazos de ratones normales, un ARNm supuesto que codifica los dominios de \mu extracelulares y la parte de la transmembrana de \delta sería por lo menos 30 veces menos abundante que la del mensaje de la cadena H de \delta en ratones normales, si no existe de ningún modo. Por tanto, el ARNm potencialmente capaz de codificar una molécula de tipo IgD es indetectable en ratones homozigóticos mutantes (\deltaT/\deltaT) por análisis de transferencia Northern.

Ejemplo 4 Producción de anticuerpos monoclonales IgD anti-ratón de ratón

Se generaron ratones carentes de IgD por destrucción dirigida al gen como se describió en los Ejemplos 1 y 2. Se inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) un animal obtenido de este modo con anticuerpo monoclonal de ratón de clase IgD (alotipo "a" de \delta de 267,7) precipitado en alúmina.

Después de 6 semanas, se administró un refuerzo i.p. al animal con B1-8 soluble del alotipo "b" para obtener anticuerpos monoclonales que reconocen ambos alotipos.

Después de 3 días, se fundieron las células de bazo del ratón inmunizado con X63 Ag8.6.5.3 utilizando un protocolo de fusión estándar con PEG. Se clonaron los híbridos directamente en ocho placas de 96 pocillos y se seleccionaron utilizando medio HAt selectivo. Se identificó la producción de anticuerpos anti-IgD en los hibridomas obtenidos por ELISA utilizando placas recubiertas con B1-8 (IgD), BSA (albúmina de suero bovino), 267,7 (IgD), R33-24-12 (anti-IgM) y se revelaron utilizando anticuerpos R33-18-10.1-Biotina (anti-ratón Kappa de rata) y R33-60-Biotina (anti-IgM). Diecisiete clones presentaron reactividad a B1-8 (IgD^{b}), trece de éstos presentaron reactividad a 267.7 (IgD^{a}), uno de éstos fue de clase IgM. Otros dos clones presentaron reactividad a IgM pero no a IgD. Los hibridomas se caracterizaron además por la afinidad de unión relativa y el isótopo. Quince de los 21 clones ensayados demostraron ser isótopos de IgG1. Además, se caracterizaron los clones por la unión a las células de bazo de ratón tratadas con tripsina y sin tratar utilizando IgG1 anti-ratón biotinilada y estreptavidina-ficoeritrina. La tripsina corta la IgD superficial y permite la localización del epítopo en las moléculas de IgD.

Se utilizaron tres clones de la mayor afinidad e IgG1 isotipo (\delta1.2, \delta1.3 y \delta3.5) de IgG1 para experimentos adicionales. Se produjeron varios mg de los AMAB purificados producidos por estos clones utilizando frascos rotativos según los métodos normalizados. Se analizaron 16 clones en un análisis por tinción incubando células de bazo de ratón con sobrenadante de cultivo. Se detectó AMAB anti-IgD unido con un IgG1 anti-ratón biotinilado y se reveló con estreptavidina-PE.

Ejemplo 5 Tinción con AMAB de IgD de tejido de bazo de ratón en áreas ricas en linfocitos B

Se tiñeron secciones de bazo congeladas de ratones C57BL/6 con AMAB \delta1.3 de IgD anti-ratón de ratón biotinilado preparado como se describe en el Ejemplo 4 y biotinilado utilizando biotina NHS de Pierce según las instrucciones del proveedor. Los patrones de tinción se revelaron con peroxidasa acoplada a estreptavidina utilizando un kit de tinción AEC de Sigma según las instrucciones del fabricante. Los resultados obtenidos se representan en la Figura 1. El patrón de tinción es idéntico al observado para los antisueros policlonales de IgD anti-ratón de cabra, lo que demuestra que los AMAB de IgD obtenidos por la invención presentan especificidad de fijación al auto-antígeno deseado.

Ejemplo 6 Conjugación de anticuerpos con fluoresceína y tinción de células de bazo a diferentes concentraciones

0,5 mg de AMAB purificado (\delta1.3 y \delta3.5) obtenido cada uno en el Ejemplo 4 se volvieron a tamponar en 1,5 ml de NaHCO_{3} 0,1 M y se hicieron reaccionar durante 1 hora con 15 \mul de éster de carboxilfluoresceína-hidroxisuccinimida (Boehringer Mannheim) disuelto en DMSO (1 mg/ml). Se eliminó por filtración en gel la fluoresceína no ligada. Se determinó la relación F/P que fue aproximadamente 3 a 3,5 para ambos conjugados. Se incubaron un millón de células de bazo de ratón durante 15 minutos con las diferentes diluciones de los AMAB conjugados presentados en la Figura 2 y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados obtenidos están representados en la Figura 2. Los datos demuestran que concentraciones tan bajas como 1 \mug/ml son suficientes para la detección de las células positivas a IgD y que los AMAB presentan gran afinidad.

Ejemplo 7 Tinción con dos colores de células de bazo de ratón

Se tiñeron células de bazo obtenidas de ratón B6 \times 129 con AMAB \delta1.3 conjugado con fluoresceína y anticuerpo de IgM anti-ratón conjugado con ficoeritrina (R33-24), se lavaron y se analizaron en un citómetro de flujo FACScan colando los linfocitos y excluyendo las células muertas mediante tinción con yoduro de propidio.

Los resultados obtenidos se representan en la Figura 3. Los resultados indican que la mayoría de las células que llevan IgM coexpresan IgD; sin embargo, se obtuvieron unas pocas células con IgM^{+} IgD^{-}. Esta tinción está muy de acuerdo con los patrones de tinción esperados para IgD. Se demuestra también que los AMAB se unen a moléculas normalmente presentes en ratones normales y por consiguiente son anticuerpos monoclonales autólogos.

Ejemplo 8 Separación magnética de células utilizando anticuerpos monoclonales autólogos acoplados a partículas coloidales magnéticas Conjugación de anticuerpos a partículas magnéticas

Se conjugaron AMAB \delta1.3 y \delta3.5 purificados con amino-microbolas MACS (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) utilizando la química de acoplamiento SPDP (Pierce) según las instrucciones del proveedor. Se conjugaron aproximadamente 200 \mug de anticuerpo activado con 1 ml de amino-microperlas MACS modificadas por SPDP (OD_{450} = 10). Se purificaron dos veces las perlas conjugadas utilizando una columna MACS A1 y se volvieron a tamponar en PBS hasta una concentración de OD_{450} = 1 (véase; Miltenyi et al. 1990, Cytometry, 11:231-238).

Marcado magnético de células

Se incubaron 10 millones de células de bazo en 80 \mul durante 15 minutos a 4ºC con una dilución 1 a 5 partículas magnéticas conjugadas \delta1.3 y \delta3.5, a continuación se añadió el mismo AMAB conjugado con fluoresceína hasta una concentración final de 8 \mug/ml. Se dejaron reaccionar las células con el anticuerpo durante 5 minutos, a continuación se lavaron una vez utilizando PBS. Se separaron las células marcadas magnéticamente y con fluorescencia utilizando un clasificador magnético de células MACS (Miltenyi Biotec GmbH) según las instrucciones del proveedor. Se aplicaron las células a una columna A2 MACS prerrellena introduciéndolas con un limitador de flujo 25G, se lavó la columna con 4 ml de tampón y las células que pasaban a través de la columna se recogieron como fracción no magnética. Se lavó la columna utilizando un procedimiento en contracorriente utilizando un limitador de flujo 23G y se eluyeron las células retenidas. Se analizaron todas las fracciones por citometría de flujo (FACScan). Las células muertas identificadas mediante tinción con yoduro de propidio se excluyeron del análisis.

La Figura 4 presenta los histogramas de un análisis por FACS de las separaciones. En la Figura 4, la primera fila representa las células antes de la separación, la segunda fila representa la fracción no magnética y la tercera fila representa las células positivas. Los resultados de \delta1.3 están en la columna de la izquierda y los resultados de \delta3.5 están en la columna de la derecha. Los datos indican que al menos el 95% de las células que expresan IgD son retenidas por la columna, mientras que las células con IgD que son retenidas y eluídas de la columna tienen una pureza de al menos el 92%. La tinción de fondo en esta separación y el análisis son producidos principalmente por los macrófagos que absorben anticuerpos de una manera específica.

Ejemplo 9 Obtención de ratones NCAM modificados genéticamente

Las moléculas de adherencia de las células nerviosas (NCAM) son miembros de la superfamilia de la inmunoglobulina que median en las interacciones célula a célula homo- y heterófilas. Las NACM aparecen en varias isoformas generadas mediante corte y empalme alternativo. Hemperly et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3037-3041; Barthels et al. (1987) EMBO J. 6:907-914; y Barthels et al. (1992) Eur. J. Neurosci. 4:327-337. Durante el desarrollo embrionario, las NCAM se expresan en derivados de las tres capas germinales mientras que en un animal adulto están presentes principalmente en el tejido nervioso. Procesos como la nerviación, la excrecencia axonal, la histogénesis de la retina y el desarrollo del sistema olfativo están correlacionados con la expresión regulada de las NCAM. Crossin et al. (1990) Exp. Neurol. 109:5-15; Tosney et al. (1986) Dev. Biol. 114:437-452; Thiery et al. (1977) J. Biol. Chem. 252:6841-6845; Key et al. (1990) J. Cell Biol. 110:1729-1743; y Chung et al. (1991) J. Comp. Neurol. 314:290-305. Los ratones homozigóticos negativos a NCAM generados por destrucción dirigida al gen parecen sanos y fértiles. Los mutantes adultos presentan una reducción del 10% del peso cerebral total y una disminución del 36% en el tamaño del bulbo olfativo. La insuficiencia de NACM coincide con la pérdida casi total de ácido polisiálico unido en \alpha-(2,8) a la proteína, estructura de carbohidrato que se cree que está correlacionada con el desarrollo y plasticidad neuronal. Theodosis et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5494-5498. El ensayo de animales en el laberinto de agua de Morris descrito por Morris (1981) Learn. Motiv. 12:239-260, demostró insuficiencias en el aprendizaje espacial, mientras que la actividad y las capacidades motrices de los ratones mutantes parecieron normales.

Se llevaron a cabo la destrucción dirigida al gen y la generación de ratones mutantes homozigóticos utilizando los protocolos habituales y se confirmaron por transferencia de Southern y por PCR específica del alelo. Ensayos de protección con nucleasa SI, transferencia Northern y Western confirmaron el locus dirigido como un alelo nulo. El análisis inmunocitoquímico de secciones de cerebro para NCAM que utilizan anticuerpos monoclonales y sueros policlonales presentaron la coloración más intensa en los glomérulos y en la capa de células granulares del bulbo olfativo en animales naturales y heterozigóticos. La coloración en conjunto estuvo muy de acuerdo con los informes sobre la expresión de NCAM en el cerebro adulto. Chung et al. (1991). En los ratones mutantes homozigóticos existió una pérdida total de inmunorreactividad como era de esperar.

Se aparearon animales heterozigóticos de dos líneas y dieron lugar a 78 crías. De éstas, 38 animales (49%) eran heterozigóticos, 22 (28%) eran naturales y 18 (23%) eran homozigóticos para el alelo mutado, lo que indica una distribución mendeliana casi perfecta. Los animales homozigóticos mutantes son fértiles y parecen sanos hasta los cuatro meses de edad aún cuando tienen aproximadamente un 10% menos de peso que las camadas natural y heterozigótica. Los cerebros aislados de un animal mutante y de un heterozigótico presentan diferencias anatómicas obvias: El bulbo olfativo se redujo de tamaño en los mutantes en comparación con los animales +/+ y +/-; y el peso del cerebro se redujo en aproximadamente el 10% (tras la corrección por el peso corporal).

Con el fin de generar AMABs para NCAMs con gran afinidad, se inocularon los ratones descritos anteriormente con una cantidad antigénica de un NCAM en suspensión en un adyuvante adecuado. Se administraron dosis de refuerzo según se requería y se midió periódicamente el título de anticuerpos. Una vez el título es suficiente, se sigue un método adecuado para la generación de AMABs.

Si bien la invención precedente se ha descrito con algún detalle a título de ilustración y ejemplo con fines de claridad y comprensión es evidente para los expertos en la materia que se pueden poner en práctica determinadas modificaciones. Por consiguiente, la descripción y ejemplos no deberían considerarse limitantes de la invención, que está definida en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (24)

1. Un método de obtención en un animal vertebrado no humano de un anticuerpo monoclonal autólogo contra un auto-antígeno, comprendiendo el método:

a) la producción de anticuerpos monoclonales utilizando células o material genético procedente de células recogidas de un animal vertebrado no humano, en el que el genoma del animal ha sido alterado con el fin de que no produzca al menos un epítopo de un auto-antígeno, y en el que el animal ha sido inmunizado con el auto-antígeno o uno de sus homólogos para obtener una respuesta inmunitaria al menos a dicho epítopo, en el que el homólogo comprende un antígeno con un alto grado de similitud estructural a un auto-antígeno y no produce una respuesta inmunitaria al epítopo mediada por el anticuerpo en el animal inalterado, y en el que dichas células se producen en respuesta al auto-antígeno, y expresan anticuerpos contra éste, o su homólogo.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el animal produce un equivalente funcional o un homólogo estructural de al menos un epítopo.

3. El método según cualquier reivindicación anterior, en el que el auto-antígeno es un proteína, péptido, carbohidrato, lípido, cofactor enzimático, agregado natural o una de sus combinaciones unidas por enlace covalente.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el auto-antígeno es un antígeno de la superficie celular, una citocina, una molécula de adhesión celular o una inmunoglobulina.

5. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que el auto-antígeno es un anticuerpo de IgD.

6. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que la recogida de las células comprende el enriquecimiento o el aislamiento de los linfocitos B específicos del antígeno.

7. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que los anticuerpos se producen utilizando el material genético mediante la expresión de los genes recombinantes que codifican los anticuerpos.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que los genes recombinantes se aislan utilizando linfocitos B individuales específicos del antígeno pre-enriquecidos y PCR para una sola célula.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los anticuerpos están al menos parcialmente humanizados.

10. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que el animal es un mamífero y es del grupo rodentia, lagomorpha, primates, carnivora, perissodactyla y artiodactyla.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que el animal es rodentia o murino.

12. Un método según cualquier reivindicación anterior, en el que la biosíntesis del auto-antígeno o de su homólogo se impide, se dificulta o se elimina por mutación de un gen que codifica una enzima que afecta el curso metabólico que produce el auto-antígeno o uno de sus homólogos.

13. Un anticuerpo monoclonal que se puede obtener por un método según cualquier reivindicación anterior o un framento de éste que se puede unir al auto-antígeno.

14. Un anticuerpo o un fragmento de éste según la reivindicación 13, en el que el fragmento es un fragmento Fab.

15. Un anticuerpo o un fragmento de éste según la reivindicación 13 ó 14, en el que el anticuerpo está conjugado o acoplado a otra sustancia, marcador o fármaco.

16. Un anticuerpo o un fragmento de éste según la reivindicación 15, en el que la sustancia es una enzima indicadora, fluorocromo, compuesto metálico, toxina, hapteno, partícula magnética, portador sólido, liposoma o partícula fluorescente.

17. Un anticuerpo o un fragmento de éste según la reivindicación 16, en el que la partícula magnética es una partícula superparamagnética coloidal, la enzima es fosfatasa alcalina, peroxidasa o ureasa, el fluorocromo es un isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de tetrametil-rodamina, ficoeritrina, aloficocianina o rojo de Texas o el compuesto metálico es ferritina, oro coloidal o una perla magnética.

18. Un anticuerpo o un fragmento de éste según la reivindicación 15, en el que la sustancia comprende un isótopo radioactivo o es biotina.

19. Un anticuerpo o un fragmento de éste según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, para su utilización en un inmunoanálisis o en ELISA.

20. Un anticuerpo o un fragmento de éste como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, para su utilización en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

21. Un hibridoma que produce un anticuerpo como se define en la reivindicación 13.

22. Un método de separación de células basado en la presencia de antígenos de la superficie celular, método que comprende:

a) la obtención de anticuerpos monoclonales autólogos con una especificidad de unión a un antígeno de la superficie celular por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13;

b) la puesta en contacto de los anticuerpos con una población heterogénea de células, en la que una subpoblación de células expresa el antígeno de la superficie celular con el cual los anticuerpos tienen una especificidad de unión; y

c) la separación de las células reconocidas por el anticuerpo de las células no reconocidas por el anticuerpo.

23. Un método según la reivindicación 22, en el que los anticuerpos se utilizan juntamente con partículas superparamagnéticas coloidales y las células se aislan utilizando separación magnética de alto gradiente.

24. Un método según la reivindicación 23, en el que los anticuerpos se conjugan con las partículas superparamagnéticas coloidales, la subpoblación de células se une a los anticuerpos y los anticuerpos son reconocidos por partículas superparamagnéticas coloidales específicas de anti-inmunoglobulina o los anticuerpos son modificados por un hapteno y las partículas superparamagnéticas coloidales reconocen la modificación del hapteno.