JPH08509868A

JPH08509868A - 酵素を製造するための方法

Info

Publication number: JPH08509868A
Application number: JP6525523A
Authority: JP
Inventors: ハストループ，スベン; ブラナー，スベン; ラウンヨルゲンセン，ビルス; クリステンセン，トーベ; ボイヤーヨルゲンセン，ビルギッテ; アール．シャスター，ジェフリー; マデン，マーク; エル．モイヤー，ドナ; ヒューゲルサン，クラウス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-05-05
Filing date: 1994-05-04
Publication date: 1996-10-22
Also published as: CA2162022A1; WO1994026925A3; CN1090238C; KR960702008A; EP0698116A1; DK52293D0; AU6825194A; WO1994026925A2; AU678019B2; US5702934A; CN1125466A

Abstract

(57)【要約】本発明は、活性酵素を製造するための方法であってその活性酵素の前駆体をその活性酵素とは異なり、且つそのプロ酵素を活性酵素へと変換できるタンパク質分解酵素の存在下で培養することを含んで成る方法、並びにかかる方法における利用にとって適当な宿主細胞、組換発現ベクター及び宿主細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】酵素を製造するための方法発明の分野本発明は酵素を製造するための方法、並びにこの方法において利用するのに適する細胞及びDNA構築体に関する。本発明の方法の利用により、実質的に高められた酵素収率を獲得することが可能である。発明の背景特定の反応を触媒することのできるタンパク質分子である酵素の幅広い産業及び技術分野、例えば洗浄産業、食品及び飼料産業、紙及びパルプ産業、並びに繊維産業における数多くの用途にとって有用であることが見い出されている。酵素は同じ又は類似の目的のために慣用的に利用されている化学試薬に比べていくつかの重要な利点を有しており、一の利点はそれらが容易に分解し、それ故一般に、化学試薬よりも環境に対する有害性が低いことにある。従って、数多くの目的にとって、酵素は慣用的に利用されている化学試薬にとっての魅力的な代替品であると考えられている。酵素は通常、微生物細胞又はその他の生物の細胞であって、もとから、又は課題の酵素をエンコードする核酸配列により形質転換された結果としてその酵素を生産できる細胞の培養により製造される。数多くの酵素は生産細胞から不活性なプロ酵素の形態において実現され、それは発現後、一般にはその生産細胞により発現される１又は複数種のタンパク質分解酵素の作用によってプロセスを受けることによって活性酵素へと変換される。外因的に供給される活性化剤によるプロセシング、例えば菌類の金属プロテアーゼによる牛プロキモシンの活性化が報告されている（Stepanovら、1990）。酵素の製造における組換DNA工学の開発及び利用は特定の酵素の収率を高める観点における主たる打開策であるにもかかわらず、収率を考慮した場合、それ故、例えば酵素について高まり続けている需要に合わせることができるようにする場合、及び酵素製造の経済性を高めることができるようにする場合に更なる改良を獲得したいという要望が未だ存続している。発明の簡単なる開示この度驚くべきことに、プロ酵素として生産される活性酵素の収率における実質的な向上を、そのプロ酵素を発現できる細胞の培養により獲得することが、タンパク質分解酵素がその細胞を培養する培養液の中に存在しているときに可能であることを見い出した。従って、本発明の活性酵素を、その酵素を発現する細胞の培養によってプロ酵素の形態で製造するための方法に関連し、この方法は、そのプロ酵素を活性酵素に変換できるタンパク質分解酵素の存在下でその培養を行い、次いでその活性酵素をその培養液から回収することを含んで成り、ここでこのタンパク質分解酵素はその培養の前及び／又は最中にその培養液に加えるものとする。タンパク質分解酵素の存在下でタンパク質を製造することから予測されることに反して、タンパク質分解酵素の存在は実質的に高められた酵素収率をもたらし、より詳しくはタンパク質分解酵素を加えておらず、それ故プロ酵素の活性化が課題の宿主細胞により発現されるタンパク質分解酵素により一般に行われる方法と比べたときに、一定の培養液より生産される活性酵素の量よりも２倍より高い、例えば４倍より高い、そして６又は８倍より高い収率をもたらす。本明細書における「活性酵素」なる語は、酵素活性を示す形態の酵素、例えば成熟酵素を意味することを意図している。この酵素活性は課題の酵素について当業界に知られているアッセイにより決定されうる。「プロ酵素」なる語は酵素の前駆体又は前形態を意味することを意図する。一般には、プロ酵素はプロペプチド部及びこの活性酵素のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドより成る。このプロ酵素はチモゲン又は前駆体とも呼ばれることがある。このプロ酵素はそれが生産される培養液の中で安定であることがあるか、又は例えばその培養液の中で活性酵素よりも迅速に分解されることにより、培養液の中で活性酵素よりも安定性が低いことがある。「タンパク質分解酵素」又は「メーチャラーゼ（maturase）」なる語は本願において同義語として使用しており、そして細胞から発現されるプロ酵素からプロペプチドを解裂させることのできる酵素を意味することを意図しており、これによりプロ酵素から活性又は成熟酵素への「変換」が成し遂げられる。好ましくは、このタンパク質分解酵素は酵素活性にとって必要とされる活性酵素のペプチド配列を解裂させないか又は限定の度合いでしか解裂させない。このタンパク質分解酵素は、天然において課題のプロ酵素からプロ配列を解裂せしめて活性酵素を生成するもの（この場合、本発明に従って追加の量のそれを加える）であるか、又は天然酵素とは異なるものでありうる。「培養」なる語はプロ酵素の形態で酵素の発現をもたらす細胞の任意の培養方法を意味することを意図している。即ち、この培養は適当な培養培地において、且つプロ酵素を発現させる条件下で実施する実験室又は工業培養槽の中での振盪フラスコ培養、小スケール又は大小スケール培養（連続、バッチ及び供給−バッチ式培養を含む）を含んで成るものとして理解されうる。第二の観点において、本発明はプロ酵素の形態において酵素を発現する細胞の培養により活性酵素を製造するための方法に関連し、この方法はそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素の存在下で培養を行い、そしてその活性酵素を培養液から回収することを含んで成り、このタンパク質分解酵素はそのプロ酵素を実現する細胞の中に存在している組換DNA配列によりエンコードされ、且つ発現されるものとする。先に説明した方法により得られるものと類似の活性酵素収率の上昇が本発明のこの観点に従って得られうることが考えられる。この第二の観点に係る方法は、その工程中にタンパク質分解酵素を加える必要がないという重要な利点を有し、それは以下に更に説明する。本明細書において、「組換DNA配列」なる語は外来DNA配列を意味することを意図し、それによりプロ酵素を発現する細胞を形質転換させる。「外来」なる語は、そのプロ酵素を発現する細胞が、天然ではそのプロ酵素をエンコードする前記 DNA配列を含んで成らないことを意味することを意図している。他方、「組換DNA 配列」なる語はDNA配列であって、プロ酵素を発現する細胞において通常見い出されるが、しかし天然DNA配列に一体化しているものとは異なり、且つそのDNA配列から発現される活性タンパク質分解酵素の量を増大できる１又は複数の調節要素、例えばプロモーターのコントロール下に置かれているDNA配列を意味することを意図している。更に、その語はDNA構築体であってその中のタンパク質分解酵素をエンコードするDNA配列のコピー数が増大しているものを意味することを意図している。更なる観点において、本発明をプロ酵素をエンコードする核酸配列及びそのプロ酵素を活性酵素へと変換することのできるタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列を抱えている組換宿主細胞に関連しており、ここでこの組換宿主細胞における核酸配列の少なくとも一つは組換核酸配列である。「組換」なる語は以上の定義で理解されることと思われる。更なる別の観点において、本発明はプロ酵素をエンコードする核酸配列及びこのプロ酵素を活性酵素に変換できるタンパク質分解酵素をエンコードするDNA配列を抱えているDNA構築体、並びにかかるDNA構築体を運搬する発現ベクターに関する。この組換宿主細胞、DNA構築体及び発現ベクターは本発明の方法において好適に利用でき、そして慣用の組換DNA技術に従って作ることができうる。最後に、本発明は本発明の本発明により製造した活性酵素に関する。発明の詳細な開示本発明の方法の最中に製造されるプロ酵素は培養液の中で安定であることがある。即ち、任意の実質的な分解を受けず、それ故培養液中に存在している間にかなり長期にわたって活性酵素へと変換されうるか、又は培養液から回収されうる。他方、このプロ酵素は培養液の中で不安定であり、そして迅速に分解してしまうことがあり、最悪の場合は回収される前又は活性酵素に変換する前に分解してしまいうる。本発明の方法は、酵素の製造において、培養液中でのその酵素のプロ酵素の形態が活性酵素よりも安定性が低い場合において特に重要であると考えられる。かかるケースにおいて、このタンパク質分解酵素は不安定なプロ酵素を分解前に活性酵素に変換することができるものと信じられている。本発明の方法は対応のプロ酵素を発現する天然細胞の培養による活性酵素の製造にとって好都合でありうるが、それらは活性組換酵素、即ち培養に委ねる細胞に形質転換する核酸配列によりエンコードされる酵素の製造において特に重要であると考えられる。従って、プロ酵素を発現する細胞はプロ酵素をエンコードする核酸、例えばDN A又はRNA細胞により形質転換されていることが好ましい。この形質転換は、選定の宿主細胞の性質及び核酸配列の性質と合致するように選定する当業界に公知の慣用の方法により成し遂げられうる。この核酸配列は例えば相同又は異種組換により宿主細胞のゲノムの中に挿入できうる。他方、この核酸配列は宿主細胞の中で自己複製できる組換発現ベクターに挿入してよい。詳しくは、この核酸フラグメントを、そのプロ酵素の発現を誘導することのできる転写及び翻訳シグナルに作動連結させる。本発明の方法は、細胞においてプロ酵素として発現される任意の活性酵素、そして特に、対応のプロ酵素が培養液の中でその活性酵素よりも安定性の低い酵素の製造にとって一般に適用できうる。例えば、本発明の方法により製造する酵素のヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、オキシダーゼ又はトランスフェラーゼでありうる。特に、製造すべき酵素はプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ又はトランスグルタミナーゼでありうる。本明細書において、製造すべき酵素は天然酵素であるか、又は１もしくは複数のアミノ酸残基が例えば慣用のもしくは部位特異的突然変異誘発により変更されている、その遺伝子操作された変異体でありうる。本発明の方法の利用により向上した収率を得るための一のタイプの酵素はトリプシン様プロテアーゼである。本明細書において、「トリプシン様プロテアーゼ」なる語はトリプシンのそれと類似の構造又は活性を有するトリプシン又は酵素、例えばリジン又はアルギニンのＣ末端側にあるペプチド結合を解裂できる酵素を意味することを意図している。このトリプシン様プロテアーゼ活性は、例えば以下の材料及び方法の欄に記載の通り、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（L-BAPA又は L-BAPNA）の如くのトリプシン基質の解裂に基づくアッセイにおいて決定されうる。トリプシン様プロテアーゼは哺乳類、昆虫及び微生物を含む多種多様な生物により生産されることが見い出されている。トリプシン様プロテアーゼを生産する微生物の例はフサリウム（Fusarium）属の菌類のいずれか（引用することで本明細書に組入れる米国特許第5,288,627号を参照のこと）であり、従って生産すべき酵素はフサリウム属の株、例えばＦ．オキシスポルム（F.oxysporum）、Ｆ．メリスモイデス（F.merismoides）、Ｆ．レドレンス（F.redolens）、Ｆ．サムビュシナム（F.sambucinum）、Ｆ．ソラニ（F.solani）又はＦ．バーチシロイデス（F.verticilloides）の株より得られうる。特に、この酵素はＦ．オキシスポルムの株、例えば寄託番号DSN2672により米国特許第5,288,627号において開示されている発明に関連してドイッツェ・サムルング・フォン・マイクロオルガニズメン（Deutsch Sammlung von Mikroorgani smen）に寄託された株に由来するものであるか、又は上記のトリプシンのそれと類似の活性を有する酵素を生産する能力を保持しているその誘導体もしくは突然変異体に由来するものである。この株から単離したトリプシン様Ｆ．オキシスポルムプロテアーゼをコードする核酸配列及びアミノ酸配列はそれぞれそれに添付のSEQ ID No.１及び２に示す。本発明の方法により製造されるプロ酵素はプレプロ酵素であってよく、それ故プロ酵素をそれが製造される細胞の外に輸送するのに関与するシグナルペプチドを担持している。このシグナルペプチドは課題のプロ酵素に通常一体化しているものであるか、又は例えばプロ酵素の発現のために選定の宿主細胞の排出過程に適合させるようにプロ酵素に融合されたものでありうる。本発明の方法に関し、このプロ酵素の活性化は一のタンパク質分解酵素により通常達成されるが、いくつかの目的のためには、類似又は異なる酵素活性を有する二種以上のタンパク質分解酵素の組合せを利用することが好都合であることが見い出されていることがある。プロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素の種類は変換すべきプロ酵素の種類に強く依存する。即ち、特定の酵素の活性化のために用いるタンパク質分解酵素は解裂すべきペプチド配列の分析に基づいて選定されうる。プロ酵素又は活性酵素のアミノ酸配列が知られているか、又は公知のもしくはその酵素をエンコードするものと考えられている核酸配列から推定できるものであるとき、公知の手順を利用してその配列におけるポリペプチド又は限定された数の考えられるプロペプチドを同定でき、それ故解裂するペプチド配列を決定することができうる。これに基づき、特定のペプチド配列を解裂できることが知られている又はそう考えられている１又は複数のタンパク質分解酵素を同定することができ、そしてその利用は実験的に確認できる。むろん、選定のタンパク質分解酵素は、活性酵素において存在しているペプチド結合を解裂すべきでないか又は限定された度合いでしか解裂すべきでなく、これによりこの方法により製造される活性酵素の活性の崩壊又は実質的な低減は回避される。上記の手順とは別に、実験的に１又は複数種の有用なタンパク質分解酵素を同定することができうる。以上より、本発明の方法において利用すべきタンパク質分解酵素は適切なタンパク質分解活性を有する任意の酵素であってよい。例えば、このタンパク質分解酵素は金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼであってよく、中性、アルカリ性又は酸性のいづれでもよい。この酵素は特異性又は非特異性であってよい。かかるタンパク質分解酵素の例はEnzyme Nomenclature 1984に従い、酵素命名分類3.4.21−3.4.24に属するプロテイナーゼのうちから見い出せうる。トリプシン様プロテアーゼ、特にフサリウム種、例えばＦ．オキシスポルムにより製造されるものの活性化にとっては、中性金属プロテアーゼ、スブチリシン又はアスパラギン酸プロテアーゼが特に有用であると期待される。トリプシン様プロテアーゼがＦ．オキシスポルムDSN 2672により製造されるものであるとき、タンパク質分解酵素サーモリジン又はバチルス（Bacillus）由来のタンパク質分解酵素（Zamostら、1990，Journal of Industrial Microbiology,第５巻、頁303 -312）、例えばバチルス金属プロテアーゼ調製品が利用されうる。このタンパク質分解酵素は前掲の文献のExample ４及び６に開示されているアスペルギルスオリザ（Aspergillus oryzae）又はフサリウム・オキシスポルムに由来する金属プロテアーゼであってもよい。一の態様において、このタンパク質分解酵素はＦ．オキシスポルムにより製造されるとき、トリプシン様Ｆ．オキシスポルムの収率を高めるのに利用されうる。この場合、タンパク質分解酵素は慣用の培養に比べて過大な量で存在している。上記の開示から、タンパク質分解酵素を、変換すべきプロ酵素を製造する細胞を培養する培養液に加えてよいことがわかるであろう。このタンパク質分解酵素はバッチ式又は連続式であってよい。加えるべきタンパク質分解酵素は例えば商業的に入手できる酵素、例えば上記のもののいづれかであるか、又はタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列をもとから抱えているもしくはそれにより形質転換されている組換宿主細胞をその酵素が製造される適当な条件下で培養し、次いでその酵素を培養液から回収することにより製造されるものであってよい。他方、培養液中のタンパク質分解酵素の存在は、そのプロ酵素及びタンパク質分解酵素を発現できる細胞を構築し、次いでその細胞をそのプロ酵素及びそのタンパク質分解酵素の製造、更にはそのタンパク質分解酵素によるプロ酵素のその後の活性化を誘発する条件下で培養することにより成し遂げられうる。適切な細胞は、任意的に１又は複数の発現ベクターの上に存在しているそのプロ酵素及びタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列により形質転換されることにより構築されうる。他方、例えばそのプロ酵素をエンコードする核酸配列を予め抱えている細胞を選び、次いでタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列を組換 DNA法により挿入してよい（又はその逆）。別の態様において、本発明の方法はプロ酵素を発現する細胞及びそのプロ酵素を活性形態に変換することができるタンパク質分解酵素を発現する細胞を、前記プロ酵素と前記タンパク質分解酵素との発現及びそのプロ酵素の活性酵素に至る変換を可能にする適当な条件のもとでの同時発現に委ね、次いでその活性酵素をその培地から回収することにより実施できうる。この態様に従うと、前記プロ酵素及びタンパク質分解酵素の少なくとも一方が組換体であることが好ましい。本発明に従うと、このタンパク質分解酵素はプロ酵素の活性化が行われるのに十分な量で存在しているべきである。存在しているべきタンパク質分解酵素の量は当業界に公知の方法に従うモデル実験により決定されうる。例えば、適量の決定はプロ酵素を分解する酵素反応及びそのプロ酵素を活性酵素に変換する酵素反応のそれぞれについてのKm値及び速度定数の評価に基づきうる。他方、必要なタンパク質分解酵素の量はタンパク質分解酵素の投与を伴う培養を実施することにより実験的に決定されうる。培養条件、例えばpH及び温度は、プロ酵素の安定性並びにタンパク質分解酵素の安定性及び活性にとって最適であるべきとする。もしタンパク質分解酵素が培養液中で、例えば本発明の方法に従って製造される活性酵素によって容易に分解されるものと予測されるなら、酵素を連続的に、又は数回に分けて、例えばバッチ式供給を利用して供給することが好都合でありうる。タンパク質分解酵素がプロ酵素と同一の細胞から発現されるとき、細胞の培養中に培養液に追加量の前記タンパク質分解酵素（その細胞から製造されるものに加えて）を加えることが好都合でありうる。同時発現を利用するとき、プロ酵素の成熟は、これによる成熟又は活性化酵素が細胞にとって有害でなく、そして細胞から成熟又は活性形態で回収されることを条件に、細胞内で成し遂げられてよい。本発明の方法により製造される活性酵素の収率に対する追加の陽性的効果は、特にそのプロ酵素及び培養液の中で不安定なとき、そのプロ酵素を安定化することにより獲得されるものと現状信じられている。例えば、かかる安定化はプロ酵素の高めの細胞内安定性をもたらし、それ故タンパク質分解酵素による活性化にとって有用なより多量のプロ酵素をもたらしうる。この安定化は、公知の手順に従ってプロ酵素のプロペプチド部をコードする核酸配列を適当に改変し、このプロペプチドのＣ−及びＮ−末端のいづれかもしくは両者に対する１もしくは複数のアミノ酸を付加、このプロポリペプチドのアミノ酸配列における１もしくは複数の異なる部位にある１もしくは複数のアミノ酸の置換、プロペプチドのいづれかもしくは両末端にある１もしくは複数のアミノ酸又はアミノ酸配列中の１又は複数部位の欠失、あるいはこのプロペプチドのアミノ酸配列における１もしくは複数の部位にある１もしくは複数のアミノ酸の挿入をもたらし、より安定性の高いプロ酵素を得ることにより実施できうる。他方、安定効果はプロ酵素、又は酵素活性を有する活性又は成熟タンパク質へと変換できるその一部と、安定化性タンパク質又はその一部とを含んで成る融合タンパク質を構築することにより得られうる。このプロ酵素及び／又はタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列並びに本発明のDNA構築体はゲノム又はcDNA起源であってよく、例えば適当な生物のゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、次いでこのプロ酵素又はタンパク質分解酵素の全体又は一部をコードするDNA配列を、例えばこのプロ酵素又はタンパク質分解酵素のアミノ酸配列に基づいて調製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる標準技術に従うハイブリダイゼーション（Sambrookら、1989参照）によりスクリーニングすることによって得られるものでありうる。本発明のDNA配列及びDNA構築体は確立された標準方法、例えばS.L.Beaucageら（1981）Matthesら（1984）に記載のホスホアミジット法により合成的にも調製できうる。このホスホアミジット法に従うと、オリゴヌクレオチドを自動DNA合成装置で合成し、精製し、リゲートし、そして適当なベクターの中にクローンする。最後に、DNA配列及びDNA構築体は、合成、ゲノム又はcDNA起源（適宜）のフラグメントを標準の技術に従ってリゲートすることにより調製される合成とゲノムの複合起源、合成とcDNAの複合起源又はゲノムとcDNAの複合起源であってよく、これらのフラグメントは全DNA構築体の様々な部分に対応している。本発明の方法におけるプロ酵素及び／又はタンパク質分解酵素の発現のために利用する細胞は、培養すると、大量のプロ酵素及び／又はタンパク質分解酵素を製造する適当な細胞とする。上記の通り、この細胞は天然でプロ酵素又はタンパク質分解酵素を製造するものであってよいが、しかし好ましくは、このプロ酵素をエンコードする核酸配列及び／又はこのタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列により形質転換されている本発明の細胞とする。この細胞は好都合には組換タンパク質を製造するための宿主として従来から利用されている原核又は真核細胞であってよく、例えば限定することなく、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は菌類細胞であり、そして好ましくは細菌又は菌類の如くの微生物とする。「菌類」なる語は糸状菌及び酵母を含んで成ることを意図している。適当な細菌の例は、バチルス属のグラム陽性菌、例えばバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リシェニホルミス（Bacillus licheniformi s）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・メガテリウム（Bacil lus megaterium）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）及びストレプトマイセス（Streptomyces）属、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）である。適当なグラム陰極菌の例には、エッシェリヒア属の細菌、例えばＥ．コリ（E.co li）が含まれる。細菌宿主細胞の形質転換は例えばプロトプラスト形質転換により、又は公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行われうる。別の適当な細菌細胞はシュードモナス種の細胞、例えばシュードモナス・セパシア（Ps eudomonas cepacia）、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・グラジオリ（Pseudomonas gladioli）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・スタッシェリ（Pseudom onas stutzeri）、シュードモナス・アルカリゲンス（Pseudomonas alcaligenes ）、シュードモナス・シュードアルカリゲンス（Pseudomonas pseudoalcaligens ）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・グルメ（Pseudomonas glumae）又はシュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas ae ruginosa）である。他方、この細胞は菌類、即ち酵母又は糸状菌の細胞であってよい。酵母細胞は例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）属の細胞、例えばＳ．セレビジエ（S .cerevisiae）であってよい。糸状菌宿主生物は例えばアスペルギルス（Aspergi llus）種の株、例えばＡ．ニガー（A.niger）、Ａ・ニドゥランス（A.nidulans ）又はＡ．オリザであってよい。アスペルギルス宿主細胞を形質転換する及び組換タンパク質の発現を得るために利用する技術は適切にはEP 238,023号に記載の通りであってよい。他方、この菌類宿主細胞はフサリウム種の株、例えばＦ．オキシスポルムであってよく、その形質転換は例えば Malardierら、1989に記載の通りに実施してよい。本発明の組換宿主細胞において、プロ酵素をエンコードする核酸配列及び／又はタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列は発現ベクター上で担持されているか、又はそうでなければ宿主細胞のゲノムにおいて存在していてよい。発現を得るため、プロ酵素及び／又はタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列にはプロモーターが通常先行している。このプロモーターは選定の宿主細胞の中で強力な翻訳活性を発揮し、且つアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖系酵素の如くの細胞外又は細胞内タンパク質をエンコードする遺伝子に由来しうる任意の核酸配列であってよい。特に細菌宿主を用いるときに適当なプロモーターの例は、Ｅ．コリのlacオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アミラーゼ遺伝子dag Aプロモーター、バチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amy L）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトジェンアミラーゼ遺伝子（amy M）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ（amy Q）のプロモーター、バチルス・スブチリスxyl A及びxin B遺伝子のプロモーター、等である。菌類宿主における転写にとって、有用なプロモーターの例はＡ．オリザTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー中性α− アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、Ａ．オリザアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリザトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニドゥランスアセトアミダーゼをエンコードする遺伝子に由来するものである。プロ酵素の発現に関与するその他の配列には終止及びポリアデニル化配列、並びにリボソーム結合部位が含まれ、そしてプロモーターと同一の起源に由来するのが適当でありうる。このベクターは更にベクターが課題の宿主細胞の中で発現できるようにする核酸配列、例えば適当な複製起点、並びに選択マーカー、例えば遺伝子であってその生成物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、又は宿主細胞に抗生物質耐性を与える遺伝子を含んで成りうる。得られる組換宿主細胞の培養のために本発明の方法において利用する培養液又は培地は課題の細胞を増殖するのに適当な任意の慣用の培地であってよい。適当な培地、例えば最少培地又は複合培地は商業的供給者から入手するか、又は公開の処方に従って調製できうる（例えばAmerican Type Culture Collection中のカタログにおいて）。酵素は培養液から、遠心又は濾過によってその培養液から細胞を分離し、必要ならば細胞の破壊後、上清液又は濾液のタンパク質性成分を塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿させ、次いで様々なクロマトグラフィー手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製することによる慣用の手順によって回収することができ、その実際の回収法は課題の酵素の種類に依存する。図面の簡単な説明本発明は添付図面に更に例示するが、ここで図１は、添付図面に更に説明してある組換トリプシン様Ｆ．オキシスポリウムプロテアーゼの発現のために利用する発現プラスミドpSX183の構築を示す。図２はプロＦ．オキシスポルムプロテアーゼをプロセスするのに用いた、Ｆ．オキシスポルムのタンパク質分解酵素活性とバチルスメーチャラーゼのそれとの対比を示す。図３Ａ，３Ｂ，３Ｃ及び３Ｄは、cDNAの配列決定により決定した、ｐ45のゲノムDNA配列及び推定アミノ酸配列を示す。図４はプラスミドpDM120の地図を示す。図５はプラスミドpSO2の地図を示す。図６はプロＦ．オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ及びＦ．オキシスポルムｐ45タンパク質分解酵素の遺伝子の両方を含むＡ．オリザ形質転換体のSDS- PAGE分析を示す。それらのレーンは下記のもの由来の上清液を含む：レーン１、分子量マーカー；レーン２、コントロールＡ．オリザ株（未形質転換）；レーン３、ｐ45のみで形質転換されたＡ．オリザ；レーン４、pSX183トリプシン様プロテアーゼのみで形質転換されたＡ．オリザ；レーン５−10、ｐ45及びプロＦ．オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼの両方で形質転換されたＡ．オリザ株。図７はｐ45との精製np１のＮ−末端アミノ酸配列の対比を示す。本発明は、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例により更に説明する。実施例実施例１：振盪フラスコ培養における酵素活性化トリプシン様フサリウムプロテアーゼの収率に対するバチルス・ステアロサーモフィルス（BS）プロテアーゼの種々のレベルの効果を、最少及び複合培地のそれぞれを伴う34℃，30℃及び26℃の培養温度での振盪フラスコ培養により評価する。材料及び方法菌類株 1983年６月６日にドイッツェ・サムルング・フォン・マイクロオ寄託した、米国特許第 5,288,627号に更に詳細してあるフサリウム・オキシスポルムDSN 2672。アスペルギルス・オリザIFO 4177 トリプシン様Ｆ．オキシスポルム・プロテアーゼを発現できる組換Ａ．オリザ株の構築トリプシン様Ｆ．オキシスポルムのプロ酵素形態をエンコードし、且つ添付の SEQ ID NO：１に示しているDNA配列を有するcDNAを、Nomaら（1986），Nature31 9：640-646に記載のベクターpCDV1-PLに挿入して、プラスミドpSX180を得る。cD NAのコード領域をNco Ｉ−Xba Ｉフラグメントとして、BamHＩ及び部分的にXba Ｉで切っておいたアスペルギルス発現プラスミドp777（EP 0,489,718）の中に挿入する。クローンしたDNAの５′末端をベクターにつなぐため、合成リンカーDNA KFN 709／710（図１に示す）をリゲーション反応物に加える。得られるプラスミドpSX183をＡ．オリザ（IFO 4177）の中に、Ａ．ニドゥランス由来のamd Sを担持しているプラスミドpToC90と一緒に形質転換せしめる（WO 91／17243）。形質転換体をアセトアミド上での増殖のために選択する。タンパク質分解酵素 Zamostら（1990）に記載のバチルス・ステアロサーモフィルス（BS）プロテアーゼTPM-8を使用した。振盪フラスコ培養にとっては5.0AU（H）／ｇの活性をもつ凍結乾燥粉末形態；モデル実験（実施例３）にとっては75AU（H）／ｇをもつ結晶性BS−プロテアーゼの形態。この酵素の比活性は約100AU（H）／ｇである。培養複合培地：FG4P培地 15.0ｇ／ｌマルトデキストリン 30.0ｇ／ｌダイズ粉 5.0ｇ／ｌ Bactoペプトン 15.0ｇ／ｌ KH2PO4 0.4ｇ／ｌ Pluronic（商標），pH 6.5最少培地：ASPO2培地コハク酸 10.0ｇ／ｌ MgCl₂6H₂O 0.8ｇ／ｌ KCl 1.8ｇ／ｌ NaH₂PO₄H₂O 1.0ｇ／ｌ Na₂SO₄ 1.8ｇ／ｌ尿素 2.0ｇ／ｌクエン酸 2.0ｇ／ｌ微量の金属溶液Ｉ^* 0.5ml／ｌ Pluronic 0.1ml／ｌ pH 6.0、5N NaOHによる滅菌後：20ｇ／ｌのマルトデキストリン（MDO 1）^* ）微量金属溶液Ｉ：14.3ｇ／ｌ ZnSO₄7H₂O 2.5ｇ／ｌ CuSO₄5H₂O 0.5ｇ／ｌ NiCl₂6H₂O 13.8ｇ／ｌ FeSO₄7H₂O 8.5ｇ／ｌ MnSO₄H₂O 3.0ｇ／ｌクエン酸H₂O 様々な量のBS−プロテアーゼを、ASP02培地50mlを含むバフル抜きの250mlのポリプロピレン振盪フラスコに滅菌濾過形態で加える。この振盪フラスコに発現プラスミドpSX183（その構築を更に以下に説明する）で形質転換しておいたＡ．オリザ（IFO 4177）の１mlの胞子懸濁物（約10⁵胞子／ml）を接種し、そして300rp mで実施例に表示の温度でインキュベートする。４日目、上清液をトリプシン様フサリウムプロテアーゼの存在について分析する。トリプシン様フサリウムプロテアーゼ活性の決定トリプシン様プロテアーゼは特異的な基質Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ −ニトロアニリド塩酸塩（L-BAPNA）を用いてアッセイする。バッファー NaOHでpH 6.5に合わせた0.01Ｍのジメチルグルタリン酸（Sigma D4379）、0.2 Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウム。基質 L-BAPAはSigma（B3133）又はMerck（Art.10754）より入手できる。ジメチルスルホキシド中の0.2Ｍのストック溶液を調製し（87mg／ml）（凍結保存）、そして上記のバッファーで0.004Ｍに希釈する。アッセイアッセイのためにトリプシン様プロテアーゼを約15μｇ／mlに希釈する。20μ ｌの希釈トリプシン様プロテアーゼを96穴マイクロタイタープレートの中で0.00 4ＭのL-BAPA 200μｌと混合する。20μｌのバッファー及び200μｌの0.004ＭのL -BAPAを有するブランクを較正のために用いる。吸収変化（デルタOD／min）はElisaリーダーで405nmにおいて10分間、25℃又は室温で５分毎に測定することでモニターする。その結果を対照フサリウムトリプシン様プロテアーゼのトリプシン含有量に相対して計算する。 BS−プロテアーゼ活性の決定 BS−プロテアーゼの活性は基質としてのＮ，Ｎ−ジメチルカゼイン（DMC）により決定する。この工程において形成される第一アミノ基ハトリニトロベンゼンスルホン酸と反応して発色複合体を形成する。この反応を50℃、pH 8.3で９分間行う。その反応をin situにおいて、時間単位当りの吸収の変化（420nm）が計算できるように追跡する。測定時間は３分とする。吸収変化は反応速度及び酵素活性の尺度である。この活性は酵素標準品（Alcalase〔商標〕）に相対して、且つ標準品にとっての同じ単位で決定する。単位はAU（H）と呼ぶ。Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼイン溶液（0.4％）は、4.0ｇのＮ，Ｎ−ジメチルカゼインを約200mlの沸騰中の脱鉱水の中に20分間一定に撹拌しながら溶解し、得られる溶液を9.0mlの4.0ＮのNaOH及び１mmoleのCaCl₂を更に含んで成る11.92ｇ Hepe sバッファー（SigmaH-3375）及び3.69ｇのNaClから調製した溶液と混合し、そして1.5mlのBrij 35溶液（1000mlの水中の150.0ｇのBrij 35（Atlas Chemic））を加えることにより調製する。酵素サンプルは分析すべき0.5〜1.0ｇの酵素を、２％のNa₂SO₃溶液（200ｇのN a₂SO₃、15mlの Brij 35溶液及び１mmoleの CaCl₂、10ｌに至るまで脱鉱水）及び適当な酵素濃度をもたらす量のNa₂SO₃溶液と混合することにより作る。その反応中に第一アミノ基と反応させる２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸溶液（0.1％）は、200mgの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸を 200mlの脱鉱水に溶解することにより調製する。 BS−プロテアーゼ活性は標準品及びサンプルの反応速度から決定し、それは６から９minにかけての５秒毎での測定によるODの上昇（傾き）として決定する。免疫電気泳動によるトリプシン様フサリウムプロテアーゼの決定酵素的に活性なトリプシン様フサリウムプロテアーゼ及びその前駆体はRIEにより分析する。水平ロケット免疫電気泳動は20μｌの抗体／mlを用い、１％のアガロース（Litex HSA／HSB，1：1）で実施する。その槽及びゲルバッファーは、41mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び 13mMのグリシンバッファー、pH 8.6より成る。電気泳動は15℃、２Ｖ／cmで約18 時間かけて行う。この方法において利用する抗体は標準の手順によりウサギにおける精製トリプシン様フサリウムプロテアーゼに対して生起させている。ウサギには精製プロテアーゼを、週一回 250μｇ／投与を10週間かけて感作する。粗血清をアッセイに用いる。活性酵素は陽極に向って泳動し、前駆体は陰極に向う。結果各培養条件セットについて得られた結果を以下の表１に示す：トリプシン様フサリウムプロテアーゼ（表では「トリプシン」と表示）の前駆体はRIEにより評価した。成熟形態はRIE及びBAPNA酵素アッセイで評価した。 30℃で培養する振盪フラスコに関し、前駆体及び成熟酵素を分析する。表１から、最少培地及びBS−プロテアーゼを含んで成る振盪フラスコにおいて、プロ酵素は検出できず、一方、BS−プロテアーゼのない振盪フラスコにおいては、53mg ／ｌのプロ酵素が決定される。これらの結果は、BS−プロテアーゼが酵素のプロ配列を解裂できることを示唆している。 20AU（H）／ｌのBS−プロテアーゼを含んで成る複合培地の中での26℃での培養により、429mg／ｌの活性又は成熟トリプシン様プロテアーゼが得られ、それに対してBS−プロテアーゼ抜きのコントロール培養では142mg／ｌであった（活性酵素の収率の約３倍の上昇に相当する）。成熟トリプシン様プロテアーゼのレベルは最少培地においては若干低く、最大生成物量はコントロールにおいては47 mg／ｌであるのに対し、360mg／ｌであった（活性酵素の収率の約８倍の上昇に相当する）。本発明の方法により得られるこの上昇は複合培地よりも最少培地において有意に高いことがわかる。フサリウムトリプシン様プロテアーゼの製造のために用いたＡ．オリザ組換宿主細胞自体が前記トリプシン様プロテアーゼを活性化できるタンパク質分解酵素を生成するものと考えられる。複合培地において得られるこの見かけ上の低い効果はおそらくは、Ａ．オリザにより生成される高レベルの天然成熟プロテアーゼが複合培地の中で合成される事実に基づくのであろう。Ａ．オリザ宿主細胞はおそらくもとから活性化トリプシン様プロテアーゼを生成するにもかかわらず、培養中のBS−プロテアーゼの添加の実質的な付加効果が得られる活性トリプシン様プロテアーゼの収率に関して認められることを強調すべきである。実施例２：モデル系における酵素活性化トリプシン様フサリウムプロテアーゼのプロ酵素からプレ配列を解裂するBS− プロテアーゼの能力をモデル実験において評価する。材料及び方法モデル系における酵素活性化 BS−プロテアーゼ又は天然Ｆ．オキシスポルム活性化性プロテアーゼｐ45（その単離は以降の実施例４に記載）のいづれかを含んで成るトリプシン様フサリウムプロテアーゼ前駆体及びタンパク質分解酵素溶液の希釈物をBAPA −アッセイバッファー（pH 6.5）の中で調製する。約15mg／ｌをトリプシン様プロ酵素を含む希釈物20μｌを96穴マイクロタイタープレートの中で100μｌのタンパク質分解酵素溶液と混合し、次いで25℃でインキュベートする。５及び40分のインキュベーション後、活性又は成熟トリプシン様プロテアーゼの量を0.008 ＭのL-BAPA−基質100μｌ及び上記の方法を利用してアッセイする。BAPA−アッセイにおけるタンパク質分解酵素のかくれた効果を試験するため、20μｌのバッファーをトリプシン様フサリウムプロテアーゼ前駆体の代わりに使用する。結果 BS−プロテアーゼ抜きの最少培地中のプラスミドpSX183で形質転換されているＡ．オリザIFO 4177の振盪フラスコ培養由来の培養上清液を使用する。この上清液は90mg／ｌのトリプシン様プロテアーゼ前駆体を含む。 18mg／ｌのプロ酵素を有する希釈物を３通りの濃度のBS−プロテアーゼ（0，0 .5及び５AU（H）／ｌ）とインキュベートする。生成される活性トリプシン様プロテアーゼの量を５及び40分後に測定する。表２にまとめたその結果は、BS−プロテアーゼがトリプシン様プロテアーゼのプロ酵素のプロ配列を解裂することができ、活性トリプシン様プロテアーゼをもたらすことを示している。更に、このアッセイにおいてBS−プロテアーゼのかくれた効果はないことが示された。アッセイ期間中での活性又は成熟酵素の濃度変化は分析結果を左右し、従ってこのケースにおいては大雑把な評価のみが得られた（「〜」で示している）。実施例３：培養液中の酵素及びプロ酵素の安定性材料及び方法トリプシン様フサリウムプロテアーゼの安定性の評価活性トリプシン様フサリウムプロテアーゼの安定性は、プラスミドpSX183により形質転換されたＡ．オリザの複合培地における培養由来の培養液の上清液の30 ℃でのインキュベーション及び関連のインターバルでのサンプリングにより評価する。形質転換及び培地は実施例１の材料及び方法の欄に記載してある。粗トリプシン様フサリウムプロテアーゼプロ酵素の製造粗プロ酵素は、前駆体が得られる条件下で、実施例１の材料及び方法の欄に記載のプラスミドpSX183により形質転換されているＡ．オリザ（IFO 4177）の培養より調製する：100mlのYDP（10ｇ／ｌのBacto酵母抽出物、20ｇ／ｌのBactoペプトン、30ｇ／ｌのデキストロース）を含むバッフル抜きの500mlの振盪フラスコに約10⁶個のＡ．オリザ培養胞子を接種し、そして125rpmで26℃で２日間インキュベートする。濾過により細胞材料を取り出し、そして粗前駆体を限外濾過及びその後の凍結乾燥により培地から調製する。トリプシン様フサリウムプロテアーゼプロ酵素の安定性及び活性化の評価プロ酵素の安定性／成熟化は上記の培養上清液に粗プロ酵素を添加し、30℃でインキュベートし、そして関連のインターバルでサンプリングすることにより評価する。結果Ａ．オリザ形質転換体（IFO 4177／pSX183）の培養液の上清液中での活性トリプシン様プロテアーゼの30℃での安定性を表３に示す。表３における結果は、成熟酵素は培養液中でやや安定であることを示す。即ち、４時間後では活性は実質的に失われず、そして20時間後に約10％のみが失われた。トリプシン様プロテアーゼプロ酵素の安定性及び成熟は、表３に記載の培養液への100mg／ｌの粗プロ酵素の添加により評価した。その結果を表４に示す。表４における結果から、Ａ．オリザ（IFO 4177）は前駆体を活性化できることが明らかである。この明白さの他、その前駆体は培養液の中で不安定である。添加した前駆体の半分が活性酵素に変換し、残り半分は分解した。実施例４：フサリウム・オキシスポルムからのｐ45タンパク質分解酵素の単離及び特性化材料及び方法精製：Ｆ．オキシスポルムを9000rpmで10分遠心し、そしてその上清液を0.45μｍのフィルターで濾過する。200mlの濾液をAmiconセル（PM膜）及びCentriprep-0（A micon）で０mlにまで濃縮する。５mlの濃縮物を100mlに希釈し、そして酢酸でpH を５にし、そして１mlのMono Sカラムに、以下のバッファーで流す：0.1Ｍのボレート、10mMのDMG、２mMの塩化カルシウム、pH 5.2、0→0.5Ｍの塩化ナトリウムの70minにわたる勾配、それに続く、１ml／minの流速での上記のバッファーによる10分の洗浄。1.5mlの画分を集め、そして Centricon-10（Amicon）で評価する。 Superose12（HR 10／30，Pharmacia）を用いるゲル濾過を、次の条件で行う： 0.1Ｍのボレート、10mMのDMG、２mMのCaCl₂、pH 6.5；流速0.4ml／min；0.4mlづつの画分を集める；200μｌのサンプルをインジェクトする。タンパク質分解酵素アッセイ：タンパク質分解酵素活性は、0.1Ｍのトリス、２mMのCaCl₂、pH７（低めのpHにおいては、100mMのボレート、10mMのDMG、２mMのCaCl₂を使用）中での37℃で30 〜60分のプレインキュベーションの後、実施例１に開示の組換プロートリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼから放出されるトリプシン活性として測定する。トリプシン活性はマイクロタイタープレートで測定する；100μｌのサンプルを100μｌの基質（ストック：DMSO中の87mg／mlのL-BAPNA（Sigma）、バッファーの中で50倍に希釈）と混合し、そして405nmでの吸収をMolecular D evices由来のThermomaxマイクロプレートリーダーを用いて測定する。 SDS-PAGE及びPVDFへのエレクトロブロッティング： SDS-PAGE（10〜27％、Novex）を製造者の仕様に従って行う：泳動すべきサンプルをサンプルバッファーに加える前にPMSFとプレインキュベートする。プローブロット膜（Applied Biosystems）上へのエレクトロブロッティングはNovex由来のブロッティングモジュールを用い、３mMのNa₂CO₃、10mMのNaHCO₃、20％のMe OH、pH 9.9の中で30Ｖで２時間行う。プロブロットをApplied Biosystemsによる説明の通りに染色する。 IEF−上層： IEF（Ampholine PAG−プレート：pH 3.5〜9.5、Pharmacia）を行い、そして製造者の仕様に従って染色する。上層を付するゲルをまず 0.1Ｍのトリス、２mMのCaCl₂、pH 8.1の中で15分平衡にし、次いで10mlの１％のアガロース、0.1Ｍのトリス、２mMのCaCl₂、pH８.1を加えた300μｌのL-BAPNA 及び実施例１に開示の500μｌの組換プロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ（〜0.25mg／ml）を上にかぶせる。アミノ酸分析及びアミノ酸配列決定：凍結乾燥サンプルのマイクロ波促進蒸気相加水分解はMDS-2000加水分解ステーション（CEM）を用いて行う。１％のフェノール（スキャベンジャー）を含む６ＮのHClを、蒸気相を作り上げるために用いる。加水分解時間は70psiで20分とする（〜148℃）。加水分解したサンプルを凍結乾燥し、そして内部標準品としての500pmol／μｌのサクロシン及びノルバリン20μｌの中に再溶解させる。分析はHewlett-Packard由来のAmino Quantを用い、その製造者の仕様に従って行う；１mlのサンプルをインジェクトする。アミノ酸配列決定はApplied Biosystems由来の476 A Protein Sequencerを用い、その製造者の仕様に従って行う；オンラインHPLCのために予備混合バッファーを使用する。結果Ｆ．オキシスポルム培養液からのｐ45の精製ｐ45タンパク質分解酵素を、陽イオン交換クロマトグラフィー（Mono S）、それに続くSuperose 12でのゲル濾過を利用し、濃縮及び濾過培養液から精製する。Mono S由来の画分を、実施例１に開示のプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼからのトリプシン様活性の放出としてタンパク質分解酵素活性をアッセイすることにより選定する。Superose 12カラム由来のタンパク質分解酵素含有画分をMono S−画分についてと同一のアッセイ手順を利用して同定する。精製したタンパク質分解酵素はSDS-PAGE上で 45kDaの単一バンドとして認められた。メーチャラーゼの２つのアイソフォームがIEF（pH3.5〜9.5）において、pI 8.4及び8.17のそれぞれにおいて認められた。アミノ酸分析からの結果は、このタンパク質分解酵素（ｐ45）が配列表の中の SEQ ID N0：３で示しているＮ−末端アミノ酸配列を有することを示唆している。精製Ｆ．オキシスポルムｐ45（メーチャラーゼ）は高い比活性を示す。ゲル濾過カラム由来の所望のタンパク質分解酵素（メーチャラーゼ）画分をプールし、そして調製IEF装置の上に載せる。アンペアが安定したらサンプルを100 0Ｖで１時間流し、次いで500Ｖで更に30分流し、その後３mlのフラクション30本を集める。一本の画分のみがSDS-PAGEで認められるタンパク質分解酵素を含んでいた。ｐ45の活性のバチルスメーチャラーゼのそれとの対比を図２に示す。ｐ45 メーチャラーゼは金属タンパク質である。金属プロテアーゼはペプチド骨格の加水分解に関与する触媒性亜鉛金属中枢を含む。この活性亜鉛中枢はこれらのプロテアーゼを、活性がカルシウムの存在に依存しているカルパインと区別せしめる。金属プロテアーゼとしてのプロテアーゼの確認は、１，10−フェナントロリン（１mM）による亜鉛中枢の除去、それに続く全活性を復帰するためのZn²⁺（0.1〜100μＭ）による滴定により成し遂げられる。表５は実施例１に開示されているトリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼが１，10−フェナントロリンにより阻害されないことを示しており、その理由はインヒビターを添加してもしなくても、それぞれ33.8×10^-4及び34.0 ×10^-4Abs／minという類似のトリプシン活性結果による。実施例１の材料及び方法に開示のプロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ又はフサリウム・オキシスポルムメーチャラーゼサンプルは単独ではトリプシン活性を全く含まないが（表１）、組合せると、メーチャラーゼは実施例１の材料及び方法の欄に開示の組換プロ−トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼを解裂させ、活性トリプシンプロテアーゼをもたらす（表５）。しかしながら、フサリウムメーチャラーゼの完全なる再生は１mMのZn²⁺の添加により起こる。EDTA（１mM ）を１，10−フェナントロリンの代わりに用いても類似の結果が得られる。実施例５：フサリウム・オキシスポルムｐ45遺伝子のクローニングＦ．オキシスポルムｐ45遺伝子の一部をPCRにより先ずクローンする。一のプライマーはＮ末端タンパク質配列（SEQ ID N0：４）を用いてデザインし、そしてリバースプライマーは内部メーチャラーゼペプチド配列（SEQ ID N0：５）よりデザインする。PCRはフサリウム・オキシスポルムから単離したDNAプライマー及びゲノムD NAを用いて実施する。ゲノムDNAは以下のようにして単離する。約15ｇのウェット重量のＦ．オキシスポルムをMY50培地（50ｇ／ｌのマルトデキストリン、２ｇ／ｌの MgSO₄、10ｇ／ｌのKH₂PO₄、２ｇ／ｌのクエン酸、10ｇ／ｌの酵母抽出物、２ｇ／ｌの尿素、２ｇ／ｌのK₂SO₄、0.5mlの微量金属溶液；５ＮのNaOHでpH＝６）中で増殖させる。菌糸体を16mlのTE（10mMのトリス・HCl、１mMのEDTApH＝8 .0）に懸濁し、２本のチューブに分け、そして約12ｇの0.45〜0.52mmのガラスビーズ（Thomas Scientific）を各チューブに加える。これらのサンプルを粘度の著しい低下が起こるまで30秒間の間隔でボルテックス及び氷冷に交互にかける。更にこれらのサンプルを２回、30秒間隔でボルテックスにかける。2.5mlの20％のSDSを各サンプルに加える。これらのサンプルを反転により混合し、室温で10 分インキュベートし、そして再び混合する。サンプルを室温で3.5Ｋで８分間遠心する。上清液を50μｌのポリプロピレンチューブの中で合わせる。このサンプルをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）で平衡にした等容量のTEで抽出し、次いで10,000rpm、4℃で10分遠心する。その上清液を 300μｌの10mg／mlのプロテイナーゼＫで37℃で30分処理する。そのDNAを上記のようにしてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｐ／Ｃ／Ｉ）抽出し、エタノール沈殿させ、そして５mlのTEに溶かす。そのサンプルを150μｌの10mg／ｌのRNAase Aで65℃で15分処理し、次いで37℃で15分処理する。このサンプルを再びプロテイナーゼＫで処理し10mg／ml 100μｌ、1.5時間、37℃）、次いでＰ／Ｃ／Ｉで２回抽出し、そしてエタノール沈殿させる。そのDNAを曲ったパスツールピペット上に巻き取り、そして80％のエタノール５mlに移す。このサンプルを10,000rpmで３分遠心する。そのDNAペレットを簡単に乾かし、次いで１mlのTEに溶かす。 PCRを以下の通りにして、Ｆ．オキシスポルムｐ45メーチャラーゼ遺伝子の一部をクローンするために用いる：50〜100ngのＦ．オキシスポルムゲノムDNAを１ ×Taqバッファー（Boehringer Mannheim）中の約100pmoleづつの合成PCRプライマーDNA並びに50μｌの容量における100mMづつの濃度のdGTP，dATP，dTTP及びdC TPと混合する。Taq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）１〜５単位を加え、そしてPCRインキュベーションは95℃で5分、次いで35サイクルの〔95℃で30秒：50℃で１分：72℃で１分〕とする。このPCR反応は長さ約1.0及び1.3kbの2本の DNAフラグメントを生成する。これらのフラグメントをゲノム電気泳動により単離し、精製し、そしてＥ．コリ複製プラスミドの中にクローンし、次いで分子生物学の当業者に公知の標準方法を利用して配列決定する。1.0kbのDNAフラグメントは、DNAの翻訳物と直接的にタンパク質配列決定から得られるアミノ酸配列との対比により、Ｆ．オキシスポルムｐ45遺伝子を含むことが見い出された。従って、この1.0kbのPCR作製DNAフラグメントを、Ｆ．オキシスポルムゲノム DNAライブラリーから成熟遺伝子全体をクローンするプローブとして用いる。ラムダファージ中のゲノムDNAライブラリーを、Ｆ．オキシスポルムゲノムDNA から、Sambrookら、1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spri ng Harbor，NYに見い出せるかの如くの方法を利用して調製する。全部で50μｇのゲノムDNAを10mMのトリス（pH＝7.5）、50mMのNaCl、７mMのMgCl₂、７mMの２ −メルカプトエタノール及び４単位の制限酵素Sau3Aを含む200μｌの容量の中で 37℃で１分消化させる。分子サイズ10〜20kbの部分消化DNAをアガロースゲル電気泳動により単離し、次いで透析膜に電気溶離させ、そしてElutip-Dカラム（Sc hleicher and Schuell）を用いて濃縮する。制限酵素BamHＩで切断、且つホスファターゼ（Clonetech ）で処理したEMBL4のファージのラムダアーム１μｇを25μｌの容量で、標準条件下で（Sambrookら、1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Sp ring Harbor，NY）300〜400μｇのSau3A切断ゲノムDNAとリゲートさせる。ラムダファージはこのリゲーション混合物から、市販のキット（Gigapack Go1d II， Stratagene）を用い、製造者の仕様に従って調製した。約18,000個の組換ラムダファージのプレート培養及びフィルターリフトの生成（Ｎ＋filter，Amersham）は標準の方法を利用して行う（Sambrookら、1989，Molecular Cloning：A Labor atory Manual，Cold Spring Harbor，NY）。これらのフィルターを非放射能核酸検出のため、Genius Kit（Boehringer Mannheim）とのハイブリダイゼーションのために製造者により供給された仕様を利用して処理した。ｐ45メーチャラーゼプローブとして用いたDNAは上記の1.0kbのPCRフラグメントである。そのプローブをDIGラベリングキット及びその製造者により供給される仕様を用い、ジオキシゲニン（DIG）のPCR組込みによりラベルする。15ngの1.0kbのｐ45フラグメントを１×のTaqバッファー（Boehringer Mannheim）、100pmoleづつのＮ−末端プライマー（SEQ ID NO：４）及び内部リバースプライマー（SEQ ID NO：５）を含む１×のDIGラベリング混合物（Boehringer Mannheim）並びに１〜５単位のTaq ポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）〔全容量80μｌ〕の中で混合する。反応条件は：95℃で３分；35×〔95℃、30秒；50℃、１分；72℃、１分〕とする。DI Gラベルプローブを用いるフィルターハイブリダイゼーション及び洗浄条件はGen ius Kit製造者により提出の仕様を利用して行った。ハイブリダイズ用ファージはLumiphos 530により製造者（Boehringer Mannhei m）に記載の通りにして識別化させたアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート化抗−ジゴキシゲニン抗体により検出する。DNA調製品はQiagen Lamda Midi Kit（QIAGEN.Inc.）を用いて陽性ラムダクローンから作る。一の調製品由来のDNAを制限酵素EcoRＩで消化し、そして6.3kbのフラグメントをプラスミドpUC118にサブクローンする。このサブクローン部分の DNA配列の分析はｐ45遺伝子の全コード領域を同定せしめる（図3及びSEQID N0：６を参照のこと）。 p45 cDNAのクローニング全RNA及びポリーA RNAを既に公開されているプロトコール（ChirgwinらBioche mistry 18：5294-5299（1989），Aviv and Leder，Proceedings of the Nationa l Academy of Sciences，USA 69：1408-1412（1972），Sambrookら、1989，Mole cular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY）に従い、以下の改良を伴って、Ｆ．オキシスポルムから調製する。詳しくは、菌糸体を液体窒素の中で微粉末へと粉砕し、次いで４Ｍのグアニジウムチオシアネート、0.5％のNa−ラウリルサルコシン、25mMのNa−クエン酸塩及び0.1Ｍの２−メルカプトエタノール pH＝7.0を含む溶解バッファーの中で室温で30分撹拌して再懸濁させる。細胞塊を低速遠心（5000rpmで30分）により除去する。一般に、ポリ−A R NA画分はBoehringer Mannheimから得られるオリゴ（dT）セルロースを用いて単離する。ポリA RNAはヘアーピン／RNase H法（Sambrookら、1989，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY）を利用してcDNAを作るのに用いる。詳しくは、５μｌの水の中の５μｇのポリA RNAを70℃に熱し、次いで氷の上に置く。ポリA RNA、50mMのトリス（pH＝8.3）、75mMのKCl、３mMのMgCl₂、10mM のDTT、１mMづつのdGTP dATP dTTP及びdCTP、40単位のRNasin 10μｇオリゴ（dT 12-18）プライマー、並びに1000単位のSuperScript II RNase H-逆転写酵素（Bethesda Research Lab oratories）を含む全部で50μｌの反応混合物を調製する。この混合物を45℃で１時間インキュベートする。次に30μｌの10mMのトリス（pH＝7.5）、１mMのEDT A、40μｇのグリコーゲン担体（Boehringer Mannheim）、0.2容量の10Ｍの酢酸アンモニウム及び2.5容量のエタノールを加えて核酸を沈殿させる。遠心後、そのペレットを20mMのトリス（pH＝7.4）、90mMの KCl、4.6mMの MgCl₂、10mMの硫酸アンモニウム、16μＭのβNAD⁺、100ｐＭづつのdGTP dATP dTTP dCTP、44単位のＥ．コリDNAポリメラーゼＩ、N 6.25単位のRNase H、並びに10.5単位の DNAリガーゼの中に再懸濁させる。第二鎖のDNA合成をこの溶液の中で16゜Cで３時間行う。このDNAをエタノール沈殿により濃縮し、次いでそのペレットを30mMのNa− 酢酸塩（pH=4.6）、300mMのNaCl、１mMのZnSO₄、0.35mMの DTT、２％のグリセロール及び30単位のMung Beanヌクレアーゼ（Bethesda Research Laboratories）3 0μｌの中に30℃で30分かけて再懸濁する。このDNA溶液を70μｌの10mMのトリス（pH＝7.5）、１mMのEDTAで中和し、フェノール抽出し、そしてエタノール沈殿させる。このペレットを7.5単位のＴ４ポリメラーゼ（Invitrogen）で37℃で15 分、50μｌのバッファー（20mMのトリス−酢酸塩pH7.9、10mMのMg−酢酸塩、50m MのＫ−酢酸塩、１mMのDTT、0.5mMづつのdGTP dATP dTTP dCTP）中で処理する。この手順の結果はDNAリンカーの付加にとって及び任意のベクターへのクローニングにとって適切であるブラント末端を有する二本鎖cDNAである。 EcoRＩリンカーを有するcDNAをアガロースゲル上でサイズ分画して分子サイズ 0.7kb以上のcDNAを得る。このcDNAをゲルから電気溶離により回収し、そしてフェノール抽出及びエタノール沈殿により精製する。サイズ分画したcDNAをラムダ cDNAライブラリーを構築するのに用いる。このcDNAをラムダZIPLOXアーム（Gibco BRL）にクローンする。全長cDNAラムダクローンはプローブとして467bpのジゴキシゲニンラベル化フラグメント（ゲノムクローンのbp 336−803）を用い、従来述べられているプラークリフト及びDNAハイブリダイゼーションの技術を用いて同定する。全長cDNAをプラスミドpZL1において、その製造者により述べられている通りに回収する（株及びプラスミドはGibco BRL由来）。このゲノムDNAは長さ2049bpであり、そして３つのイントロンを含む。推定18個のアミノ酸のシグナル配列、226個のアミノ酸のプロ領域及び388個のアミノ酸の成熟領域より成るプレプロ−ｐ45プロテアーゼの推定コード領域をSEQ ID NO：６及び図３に示す。実施例６：ｐ45タンパク質分解酵素及びトリプシン様プロテアーゼの両者の同一の微生物宿主（Ａ．オリザ）における同時発現ここに記載の実施例において、トリプシン様プロテアーゼのその他の成熟化の開示を記載する。 2102bpのBamHＩ／NruＩゲノムプレプロ−ｐ45プロテアーゼフラグメントをTAK Aアミラーゼプロモーターとアミログルコシダーゼ（AMG）ターミネーターとの間に挿入する。これを成し遂げるため、この遺伝子の５′末端をPCR技術を利用して改変させてBamHＩ部位をATG開始コドンのすぐ上流に導入する。この遺伝子の３′末端には、終止コドンの下流の内因性NruＩ部位を利用する。ｐ45発現プラスミドをpDM120と呼ぶ（図４）。pyr G−Ａ．オリザ宿主株をプラスミドpDM120 及びpSO2で同時形質転換させる。プラスミドpSO2はＡ．オリザpyr Gマーカーを含む（図５参照のこと）。Ａ．オリザの形質転換はプロトプラスト法により行う（Christensenら Biote chnology 6：1419-1422（1988），Yeltonら Proceedings of the National Acad emy of Sciences（USA）81：1470-1474（198 4）。一般的には、Ａ．オリザ菌糸体をリッチな栄養培養液の中で増殖させる。菌糸体を濾過、遠心等の技術によって培養液から分離させる。酵素調製品Novozy me（商標）（Novo Nordisk）を、リン酸ナトリウムでpH＝5.8に緩衝された1.2Ｍの MgSO₄の如くの浸透圧安定化性バッファー中の菌糸体に加える。その懸濁物を 30℃で60分、撹拌しながらインキュベートする。このプロトプラストを回収し、そしてそのプロトプラストをSTC（1.2Ｍのソルビトール、10mMのCaCl₂、10mMのトリス−HCl pH＝7.5）の如くのカルシウム含有浸透圧安定化性バッファーの中に再懸濁させる。形質転換用DNAを約100μｌのプロトプラスト懸濁物に加え、次いで200μｌのPEG溶液（60％のPEG4000、10mMのCaCl₂、10mMのトリス−HCl、pH ＝7.5）を加え、そしてこの混合物を室温で20分インキュベートする。更に１ml のPEG溶液を加え、そしてこの溶液を再び室温で20分インキュベートする。形質転換させたプロトプラストを8mlのSTCバッファーで希釈し、そして選択プレートにまく。アセトアミド（増殖のための唯一の窒素源）プレートを、外性的に供給されたamd Sマーカーを含む形質転換体を選択するのに利用できうる。外性的に供給されたpyr G遺伝子を含む形質転換体にとっては最少プレートを利用できうる。形質転換体をM400Da培地（マルトデキストリン50.0ｇ／Ｌ；MgSO₄・7H₂O、2.0 ｇ／Ｌ；KH₂PO₄、2.0ｇ／Ｌ；クエン酸、4.0ｇ／Ｌ；酵母抽出物、8.0ｇ／Ｌ；尿素、2.0ｇ／Ｌ；微量金属溶液（前記）、0.5ml／Ｌ；５ＮのNaOHでpH＝6.0）の中で37℃で増殖させ、次いで培養液をｐ45の生産についてSDS／PAGEにより分析する。約45kDにおいて泳動する主要バンドは少なくとも一の形質転換体DLM7種において決められ、そしてｐ45はコントロール培養物においては認められない。 DLM7において生産された組換ｐ45はタンパク質配列分析によって分析し、そしてＮ−末端残基はＦ．オキシスポルムから生成されたｐ45の成熟Ｎ末端と一致していた。従って、ｐ45はＡ．オリザにおいて作られたときは適正にプロセスされている。ｐ45及びトリプシン様プロテアーゼの両方を発現する宿主生物を作るため、株 DLM7をトリプシン様プロテアーゼを含むプラスミドpSX233及び選択マーカーとしてのＡ．ニドゥランスamd S遺伝子を含むpToC90で同時形質転換させる。プラスミドpSX233はプラスミドpSX183の誘導体であり、それにおけるトリプシン様プロテアーゼ前駆体遺伝子の始まりにあるDNAリンカーはGGATCCTCGAATTCTCTTCAGATCT CTTCACCATGG（SEQ ID N0：７）からGGATCCACCATGG（SEQ ID N0：８）へと標準の分子生物学技術を利用して改変されている。下線を付したATGはメチオニン開始コドンの位置を示している。共形質転換体をFG4P培地の中で増殖させ、次いでL- BAPNAアッセイを利用してＦ．オキシスポリウムトリプシン様プロテアーゼ活性について分析する。６つの形質転換体が、ｐ45を含まないコントロール株よりも有意に多くのトリプシン様プロテアーゼを作った。これらの形質転換体培養物（及びコントロール）由来の上清液をSDS／PAGEにより分析する（図６）。全ての形質転換体が、同一の宿主生物由来のトリプシン様プロテアーゼ及びｐ45メーチャラーゼの両方の生産を示した。この結果は、トリプシン様プロテアーゼ及びＦ．オキシスポルムｐ45メーチャラーゼの同一の宿主細胞（Ａ．オリザ）における同時発現が、活性トリプシン様プロテアーゼの有意に高まった発現をもたらすことを示している。実施例７：アスペルギルス・オリザ由来の中性金属プロテアーゼ（npＩ）の精製及び一次特性化材料及び方法精製： 10ｌのＡ．オリザ1560（7Cl-58）培養液を回収する。９ｌの培養液を獲得し、そして0.1μｍの中空ファイバー（Amicon）で濾過し、そしてカットオフ値５kDa のスパイラル式限外濾過カートリッジ（Amicon）で700mlにまで濃縮する。 300mlを1000m1（＜1.5mS、pH7.1）にまで希釈し、そして0.1Ｍのボレート、10 mMのDMG、２mMのCaCl₂、pH 6.2で５ml／minの流速で平衡にしておいた150ml（直径2.6cm）のQ-Sepharoseカラムの上に載せる。このカラムを1050mlの０→１Ｍに至るNaCl勾配６ml／minを用いてバッファー洗浄及び溶離させる。12mlの画分を集め、そして実施例１に開示のプロートリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ成熟活性についてアッセイする。メーチャラーゼ含有画分をプールし、そしてYM３膜で濃縮する。次にこのプールを80mlに希釈し（＜1.5mS,，pH7.5）、20mMのトリス、２mMのC aCl₂、pH 7.5で平衡にした20mlのMono Qカラム（直径1.6cm）に載せ、そして300 mlの０→0.5Ｍに至るNaCl勾配で６ml／minの流速で溶離させる。4.5mlの画分を集め、そしてメーチャラーゼ活性について試験する。活性を有する画分をプールし、そしてCentriprep-10で濃縮する。３mlのMQ１を、 100mMのボレート、10mMのDMG、２mMのCaCl₂、pH 6.2、流速１ml／minで平衡にしたHiLoad Superdex 200 16／60カラムを用いてゲル濾過にかける。１mlの画分を集める。メーチャラーゼ活性を有する画分をプールする。更なる精製工程は、フェニル−Superose 5／5（流速0.5ml／min、1.7→０Ｍに至る60分かけての（NH₄）₂SO₄勾配〔25mMのトリスpH7中〕、１mlづつの画分の回収）又はCH Superose 4Bに複合させたバシトラシン（15mlのカラム、直径1.6cm 、流速２ml／min、０→100％のＢ、80分（Ａ：25mM酢酸塩 pH５；Ｂ：0.1Ｍのトリス、１ＭのNaCl、25％のイソプロパノール、pH7.5）、３mlづつの画分の回収）のいづれかに基づくパイロット実験により確立する。２mlのＳ２を各実験のためにPD -10で脱塩し（3.5mlの対応バッファーで溶離）、３mlを載せる。メーチャラーゼ活性を有する画分をプールする。バシトラシンーカラムを用いて多めの量を精製する；３mlのＳ12＋３mlのＳ13＋１mlのＳ２をPD-10で25mMの酢酸塩、pH５に脱塩し、そして10mlをカラムに載せる。メーチャラーゼ活性を有する画分をプールし、そしてCentricon-10及びMicrocon-10で濃縮する。バシトラシンのカップリング：バシトラシンの活性化CH Sepharose 4B（Pharmacia）へのカップリングは製造者の説明に従って行う。6.6ｇのCH Sepharose（１mMのHClの中で膨潤させ、そしてカップリングバッファーの中で洗浄）を使用し、そして0.1ＭのNaHCO₃、0.5ＭのNaCl pH８中の0.25ｇ（18250単位）のバシトラシン（Sigma）に室温で２時間かけて複合させる。余計な活性基は0.1Ｍのトリス、pH８でブロックし、そして0 .1Ｍの酢酸塩、0.5ＭのNaCl、pH４で洗う。メーチャラーゼアッセイ：メーチャラーゼ活性は0.1Ｍのトリス、２mMのCaCl₂、pH7.5（低めのpHでは、C aCl₂を含むボレート／DMG又は酢酸バッファーのいづれかを使用）中での37℃での30分のプレインキュベーション後、実施例１に開示のプロートリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ（〜25μｇ／ml）からのトリプシン活性の放出として測定する。トリプシン活性はマイクロタイタープレート：100μlの基質（ストック：DMSO中の87mg／mlのL-BAPNA（Sigma）、バッファー中で50倍希釈）の中で測定し、そして405nmでの吸収はMolecular Devices由来のThermomaxマイクロプレートリーダーを用いて測定する。 SDS-PAGE及びPVDFへのエレクトロブロッティング： SDS-PAGE（10〜27％、Novex）を製造者の仕様に従って行う（125Ｖ、２時間）：泳動すべきサンプルをサンプルバッファーに加える前にPMSFとプレインキュベートする。プローブロット膜（Applied Biosystems）上へのエレクトロブロッティングはNovex由来のブロッティングモジュールを用い、３mMのNa₂CO₃、10mMのN aHCO₃、20％のMeOH、pH9.9の中で25Ｖで2.5時間行う。プロブロットをApplied B iosystemsによる説明の通りに染色する。 IEF−上層： IEF（Ampholine PAG−プレート：pH3.5〜9.5、Pharmacia）を行い（1500Ｖ、5 0mA、1.25時間）、そして製造者の仕様に従って染色する。上層を付するゲルはまず0.1Ｍのトリス、２mMのCaCl₂、pH７の中で15分平衡にし、次いで１％のアガロース、0.1Ｍのトリス、２mMのCaCl₂、pH７を加えたL-BAPNAストック（50倍希釈）及び実施例１に開示のプロートリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ（粗濃縮培養液１mg／ml；50倍希釈）を上にかぶせる。カゼイン上層は上層バッファー中に１％のスキムミルクを施すことにより行う。アミノ酸配列決定：アミノ酸配列決定はApplied Biosystems由来の476A Protein Sequencerを用い、その製造者の仕様に従って行う；予備混合バッファーをオンライHPLCのために用いる。結果上記の精製手順は3300倍以上の精製度をもたらす（純度＞95％（SDS-PAGE））。精製npＩはSDS-PAGEで46kD前後の分子量、そしてIEFで4.5前後のpIを有する。上層IEF−ゲル（実施例１に開示のプロ −トリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼ及びL-BAPNAを上層に付した）はメーチャラーゼ活性がpI4.5前後で生じることを示し、そこではカゼインの清浄化も認められる。精製npＩをＮ−末端アミノ酸配列決定にかけると、一種の配列が得られる（最初数サイクルでは多少のバッグランドが含まれる）。このアミノ酸配列はSDS−ゲルからPVDF−膜にブロットした46kDaバンドから得られるＮ−末端アミノ酸配列に対応する。図７に報告のアミノ酸配列を示す。Ｎ− 末端アミノ酸配列はＦ．オキシスポルム由来のｐ45についてのＮ−末端配列と64 ％相同性である（図７）。プロテアーゼpH最適性は5.0〜6.0前後であることが見い出せた。実施例１に開示のプロートリプシン様フサリウム・オキシスポルムプロテアーゼとのインキュベーションを様々なpHの希釈バッファー中で行う。微生物の寄託以下の生物学的材料はアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション（NRRL）、ノーザン・レジオナル・リサーチ・センター，1815，ユニバーシティーストリート，ペオリア，イリノイ，61604，米国に寄託してある。これらの種は、本特許出願の係属中に特許及び商標庁により37 C.F.R．§1.14 及び35 U.S.C．§122並びにブダペスト条約の条件のもとで資格の与えられるものと決定された者が、その培養物を確実に入手できる条件のもとで寄託されている。この寄託物は各寄託株の生物学的に純粋な培養物を示す。この寄託物は本願又はその関連出願の提出される国における特許法が必要とするならば入手できる。しかしながら、寄託物の入手性は、政府当局により認められる特許権に反して本発明を実施する承諾であると解釈してはならない。本発明を詳しく説明したきたが、本発明はそれらの具体例に限定されない。任意の均等態様も本発明に属する。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく様々な改良を本発明に施すことができることを理解するであろう。かかる改良も本発明の範囲に属する。明細書中の引用文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年４月２５日【補正内容】請求の範囲１．プロ酵素の形態において酵素を発現する細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、その活性酵素とは異なり、且つそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできる、糸状菌から入手できるタンパク質分解酵素の存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は培養の前及び／又は最中にその培養液に加えるものとする、前記方法。２．プロ酵素の形態において酵素を発現する糸状菌細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、その活性酵素とは異なり、且つそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素の存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は培養の前及び／又は最中にその培養液に加えるものとする、前記方法。３．プロ酵素の形態において酵素を発現する細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、亜鉛ベース金属プロテアーゼの存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は培養の前及び／又は最中にその培養液に加えるものとする、前記方法。４．プロ酵素の形態において酵素を発現する細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、その活性酵素とは異なり、且つそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできる、糸状菌から入手できるタンパク質分解酵素の存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は前記プロ酵素を発現する細胞の中に存在している組換DNA配列によりエンコードされ、且つ発現されるものとする、前記方法。５．プロ酵素の形態において酵素を発現する糸状菌宿主細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、その活性酵素とは異なり、且つそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素の存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は前記プロ酵素を発現する細胞の中に存在している組換DNA配列によりエンコードされ、且つ発現されるものとする、前記方法。６．プロ酵素の形態において酵素を発現する細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、亜鉛ベース金属プロテアーゼの存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は前記プロ酵素を発現する細胞の中に存在している組換DNA配列によりエンコードされ、且つ発現されるものとする、前記方法。７．前記細胞の培養の最中に異なる量の前記タンパク質分解酵素を加える、請求項４，５又は６記載の方法。８．前記細胞から発現される前記プロ酵素が、培養液中で、前記活性酵素よりも安定性が低い、請求項１〜７記載の方法。９．前記プロ酵素を発現する細胞が前記プロ酵素をエンコードする核酸配列により形質転換されている、請求項１〜８記載の方法。 10．製造すべき前記酵素がヒドロラーゼ、オキシドリダクターゼ、イソメラーゼ、オキシダーゼ又はトランスフェラーゼである、請求項１〜９記載の方法。 11．製造すべき前記酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ又はトランスグルタミナーゼである、請求項１〜９記載の方法。 12．製造すべき前記酵素がトリプシン様プロテアーゼである、請求項11記載の方法。 13．製造すべき前記酵素が、フサリウム属の株、例えばＦ．オキシスポリウム、Ｆ．メリスモイデス、Ｆ．レドレンス、Ｆ．サムビュシナム、Ｆ．ソラニ又はＦ．バーチシロイデスの株に由来する、請求項１〜12記載の方法。 14．製造すべき前記酵素が番号DSM 2672のもとでドイッツェ・サ国に寄託されているＦ．オキシスポルムの株に由来する、請求項１〜13記載の方法。 15．前記プロ酵素がプレプロ酵素として発現される、請求項１〜14記載の方法。 16．前記タンパク質分解酵素が金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ又はシステインプロテアーゼである、請求項１，２，４又は５記載の方法。 17．前記タンパク質分解酵素が中性金属プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ又はスブチリシンである、請求項１，２，４又は５のいづれか１項記載の方法。 18．前記タンパク質分解酵素が、前記タンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列により形質転換されている宿主細胞をそのタンパク質分解酵素を製造するのに適する条件下で培養し、次いでその培養物からそのタンパク質分解酵素を回収することにより製造される、請求項１〜７記載の方法。 19．前記プロ酵素及び／又はタンパク質分解酵素を発現する細胞が微生物である、請求項１〜18記載の方法。 20．前記微生物が細菌又は菌類である、請求項19記載の方法。 21．前記微生物がグラム陽性菌、例えばバチルス又はストレプトマイセス属の細菌、グラム陰性菌、例えばエッシェリヒア属の細菌、酵母、例えばサッカロマイセス属の酵母、又は糸状菌、例えばアスペルギルスもしくはフサリウム属の糸状菌である、請求項19記載の方法。 22．プロ酵素をエンコードする核酸配列及びそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできる糸状菌から入手できるタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列を抱えている組換宿主細胞であって、そのプロ酵素はこの活性酵素よりも安定性が低く、ここでこの組換宿主細胞におけるこれらの核酸配列のうちの少なくとも一方が組換核酸配列である、前記細胞。 23．プロ酵素をエンコードする核酸配列及びそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列を抱えている組換糸状菌宿主細胞であって、そのプロ酵素はこの活性酵素よりも安定性が低く、ここでこの組換宿主細胞におけるこれらの核酸配列のうちの少なくとも一方が組換核酸配列である、前記細胞。 24．プロ酵素をエンコードする核酸配列及びその亜鉛ベース金属プロテアーゼをエンコードする核酸配列を抱えている組換宿主細胞であって、そのプロ酵素はこの活性酵素よりも安定性が低く、ここでこの組換宿主細胞におけるこれらの核酸配列のうちの少なくとも一方が組換核酸配列である、前記細胞。 25．前記プロ酵素をエンコードする核酸配列及び／又はタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列が発現ベクター上で担持されている、請求項22〜24記載の組換宿主細胞。 26．プロ酵素をエンコードするDNA配列及びそのプロ酵素を活性酵素に変換できる糸状菌から入手できるタンパク質分解酵素を抱え、そのプロ酵素がその活性酵素よりも安定性が低い、DNA構築体。 27．プロ酵素をエンコードするDNA配列及びそのプロ酵素を活性酵素に変換できる亜鉛ベース金属プロテアーゼをエンコードするDNA配列を抱え、そのプロ酵素がその活性酵素よりも安定性が低い、DNA構築体。 28．請求項27記載のDNA構築体を抱えている組換発現ベクター。 29．細菌又は菌類である、請求項22又は24記載の組換宿主細胞。 30．グラム陽性菌、例えばバチルス又はストレプトマイセス属の細菌、グラム陰性菌、例えばエッシェリヒア属の細菌、酵母、例えばサッカロマイセス属の酵母、又は糸状菌、例えばアスペルギルスもしくはフサリウム属の糸状菌である、請求項29記載の組換宿主細胞。 31．請求項１〜30のいづれか１項記載の方法により製造された活性酵素。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者ハストループ，スベンデンマーク国，デーコー―2400 コベンハウンベー．，フレデリクスボルウバイ 10 ３テーホー (72)発明者ブラナー，スベンデンマーク国，デーコー―2800 リングビー，ベトスメデバッケン７アー (72)発明者ヨルゲンセン，ビルスラウンデンマーク国，デーコー―2860 ソボルゥ，フルーバイ 18 (72)発明者クリステンセン，トーベデンマーク国，デーコー―2800 リングビー，ノデバエント３ (72)発明者ヨルゲンセン，ビルギッテボイヤーデンマーク国，デーコー―2980 コッケダル，ブロムステラガー 206 (72)発明者シャスター，ジェフリーアール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，リガッタレーン 2619 (72)発明者マデン，マークアメリカ合衆国，カリフォルニア 94523, プレザントヒル，オールドクオリーロード＃25 688 (72)発明者モイヤー，ドナエル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，コーウェルブールバード 5219 (72)発明者ヒューゲルサン，クラウスデンマーク国，デーコー―2400 コペンハーゲンナームロゼフェンノートシャップ，ティングスクリベルバイ 16 ３．テーベー.

Claims

【特許請求の範囲】１．プロ酵素の形態において酵素を発現する細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、その活性酵素とは異なり、且つそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素の存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は培養の前及び／又は最中にその培養液に加えるものとする、前記方法。２．プロ酵素の形態において酵素を発現する細胞の培養により活性酵素を製造するための方法であって、その活性酵素とは異なり、且つそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素の存在下において前記培養を行い、次いでその培養液から前記活性酵素を回収することを含んで成り、ここで前記タンパク質分解酵素は前記プロ酵素を発現する細胞の中に存在している組換DNA 配列によりエンコードされ、且つ発現されるものとする、前記方法。３．前記細胞の培養の最中に異なる量の前記タンパク質分解酵素を加える、請求項２記載の方法。４．前記細胞から発現される前記プロ酵素が、培養液中で、前記活性酵素よりも安定性が低い、請求項１又は２記載の方法。５．前記プロ酵素を発現する細胞が前記プロ酵素をエンコードする核酸配列により形質転換されている、請求項１又は２記載の方法。６．製造すべき前記酵素がヒドロラーゼ、オキシドリダクターゼ、イソメラーゼ、オキシダーゼ又はトランスフェラーゼである、請求項１又は２記載の方法。７．製造すべき前記酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ又はトランスグルタミナーゼである、請求項６記載の方法。８．製造すべき前記酵素がトリプシン様プロテアーゼである、請求項７記載の方法。９．製造すべき前記酵素が、フサリウム属の株、例えばＦ．オキシスポリウム、Ｆ．メリスモイデス、Ｆ．レドレンス、Ｆ．サムビュシナム、Ｆ．ソラニ又はＦ．バーチシロイデスの株に由来する、請求項８記載の方法。 10．製造すべき前記酵素が番号DSM 2672のもとでドイッツェ・サ国に寄託されているＦ．オキシスポルムの株に由来する、請求項９記載の方法。 11．前記プロ酵素がプレプロ酵素として発現される、請求項１又は２記載の方法。 12．前記タンパク質分解酵素が金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ又はシステインプロテアーゼである、請求項１又は２記載の方法。 13．前記タンパク質分解酵素が中性金属プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ又はスブチリシンである、請求項８〜10のいづれか１項記載の方法。 14．前記タンパク質分解酵素が、前記タンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列により形質転換されている宿主細胞をそのタンパク質分解酵素を製造するのに適する条件下で培養し、次いでその培養物からそのタンパク質分解酵素を回収することにより製造される、請求項１又は３記載の方法。 15．前記プロ酵素及び／又はタンパク質分解酵素を発現する細胞が微生物である、請求項１又は２記載の方法。 16．前記微生物が細菌又は菌類である、請求項15記載の方法。 17．前記微生物がグラム陽性菌、例えばバチルス又はストレプトマイセス属の細菌、グラム陰性菌、例えばエッシェリヒア属の細菌、酵母、例えばサッカロマイセス属の酵母、又は糸状菌、例えばアスペルギルスもしくはフサリウム属の糸状菌である、請求項16記載の方法。 18．プロ酵素をエンコードする核酸配列及びそのプロ酵素を活性酵素に変換することのできるタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列を抱えている組換宿主細胞であって、そのプロ酵素はこの活性酵素よりも安定性が低く、ここでこの組換宿主細胞におけるこれらの核酸配列のうちの少なくとも一方が組換核酸配列である、前記細胞。 19．前記プロ酵素をエンコードする核酸配列及び／又はタンパク質分解酵素をエンコードする核酸配列が発現ベクター上で担持されている、請求項18記載の組換宿主細胞。 20．プロ酵素をエンコードするDNA配列及びそのプロ酵素を活性酵素に変換できるタンパク質分解酵素をエンコードするDNA配列を抱え、そのプロ酵素がその活性酵素よりも安定性が低い、DNA構築体。 21．請求項20記載のDNA構築体を抱えている組換発現ベクター。 22．請求項20記載のDNA構築体又は請求項21記載の組換発現ベクターを抱えている組換宿主細胞。 23．細菌又は菌類である、請求項18又は22記載の組換宿主細胞。 24．グラム陽性菌、例えばバチルス又はストレプトマイセス属の細菌、グラム陰性菌、例えばエッシェリヒア属の細菌、酵母、例えばサッカロマイセス属の酵母、又は糸状菌、例えばアスペルギルスもしくはフサリウム属の糸状菌である、請求項23記載の組換宿主細胞。 25．請求項1〜17のいづれか１項記載の方法により製造された活性酵素。