CN1125466A - 生产酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产活性酶的方法，包含在不同于活性酶并能使前酶原转变成活性酶的蛋白水解酶存在时发酵活性酶的前体形式。本发明还涉及宿主细胞、重组表达载体及适用于本方法的宿主细胞。

Description

生产酶的方法
本发明涉及生产酶的方法及适用于该方法的细胞和DNA构建体。使用本发明的方法可使酶产量大量地增加。
酶作为能催化特异性反应的蛋白质分子，在广泛的工业和技术领域已发现有许多用途，这些领域包括去污剂工业、食品和饲料工业、纸浆工业及纺织工业。酶比通常用于同样或类似目的的化学试剂有许多重要的优点，一个优点是它们易于降解，因此，一般和化学试剂相比对环境污染较小。因此，许多目的酶被看作常规使用的化学试剂的具有魅力的替代物。
通常经过发酵具有天然地或作为被编码所述酶的核酸序列转化的结果可产生酶的微生物细胞或其它生物体细胞来生产酶。许多酶以无活性的酶原形式从生产酶的细胞中表达。表达的无活性的酶原典型地经过生产酶的细胞表达的一种或多种蛋白水解酶的作用进行加工转变成有活性的酶。以外部提供的活化剂进行的加工也有报道，例如以真菌金属蛋白酶对小牛凝乳酶前体的活化(Stepanov等，1990)。
虽然在酶的生产中在增加特异性酶的产量方面重组DNA技术的发展和运用是主要的突破，但是仍然有希望在产量方面取得进一步的提高，以此来满足诸如对酶不断增长的需要及改善酶生产的经济性。
现在令人惊奇地发现，当蛋白水解酶存在于发酵细胞的培养基中时，可能获得活性酶产量的大量提高，此活性酶以酶原的形式通过发酵能表达该酶原的细胞来产生。
因此，本发明涉及经过发酵以酶原的形式表达酶的细胞来生产活性酶的方法，该方法包括在能使酶原转变成有活性酶的蛋白水解酶存在的条件下进行发酵；从发酵的培养基中回收有活性的酶，在发酵前和/或发酵过程中，将蛋白水解酶加入发酵培养基中。
比较在蛋白水解酶(即降解蛋白质的酶)存在时预期产生蛋白质的情况，发现蛋白水解酶的存在导致酶产量的大量提高。更具体地说提高两倍多，例如与不加蛋白水解酶和典型地以所述宿主细胞表达的蛋白水解酶进行酶原活化的方法比较，以所述发酵生产的活性酶的量，提高4倍多、甚至高于6或8倍。
在本文中，术语“活性酶”意思是指表现出酶活性的酶的形式，例如成熟酶。酶的活性可以通过本领域已知的用于所述酶的方法来测定。
术语“酶原”意思是指酶的前体或前体形式。典型地，酶原由前肽和包含活性酶的氨基酸序列的多肽部分构成。酶原也可称为前体。在发酵培养基里酶原可以是稳定的，或与生产酶原的发酵培养基里的活性酶相比更不稳定，例如和活性酶相比，在发酵培养基里的酶原降解更快。
术语“蛋白水解酶”或“成熟酶”在本申请中可交替使用，其意思是指能从细胞表达的酶原切掉前肽的酶，以此实现从酶原向活性酶或成熟酶的转换。优选的蛋白水解酶不裂解或只在有限程度上裂解酶活性需要的活性酶的肽序列。蛋白水解酶可以是一种这样的酶，其特征是从所述的酶原切掉前序列以产生活性酶，根据本发明在此情况下，加入更多量的蛋白水解酶，或许不同于天然酶。
术语“发酵”意思是指任何培养细胞导致酶以酶原的形式进行表达的方法，所以发酵可理解为包括在适当的发酵培养基中，在使酶原得以表达的条件下，在实验室或工业发酵罐等水平上进行的摇瓶培养、少量或大规模发酵(包括连续的、成批的和成批加培养液的发酵)。
在第二方面，本发明涉及经发酵以酶原的形式表达酶的细胞来生产活性酶的方法，该方法包括在能将酶原转变成活性酶的蛋白水解酶存在的条件下进行发酵，从发酵培养基中回收活性酶、蛋白水解酶由存在于表达酶原的细胞中的重组DNA序列编码和表达。期望活性酶产量的提高类似于由上面说明的方法获得的那样，这种提高可根据本发明的该方面获得。根据该第二方面的方法有重要的优点在此操作过程中，无需加入蛋白水解酶，尽管它可能象其被下面进一步描述的那样。
在本文中术语“重组DNA序列”意思是指转化表达酶原的细胞所用的外源DNA序列。“术语”“外源”，意思是指表达酶原的细胞本身不含有的，编码蛋白水解酶的所述DNA序列。作为选择术语“重组DNA序列”意思是指在表达酶原的细胞中正常发现的，但被置于一个或多个调节元件(例如：启动子)控制之下的DNA序列，它不同于天然产生的DNA序列相关性序列，并能提高从该DNA序列表达的活性蛋白水解酶的量。而且，此术语意思是指DNA构建体，其中编码蛋白水解酶的DNA序列的拷贝数增加了。
本发明更进一步的方面还涉及包含编码酶原的核酸序列和编码能将酶原转变成活性酶的蛋白水解酶的核酸序列的重组宿主细胞，在所述重组宿主细胞中，至少有一个核酸序列是重组核酸序列。术语“重组”可用上面限定的方式理解。
更进一步地，本发明涉及含有编码前酶原的核酸序列和编码能使酶原转变成活性酶的蛋白水解酶的DNA序列的DNA构建体，本发明还涉及带有该DNA构建体的表达载体。
重组宿主细胞、DNA构建体和表达载体在用于本发明的方法时具有优势，并可根据常规的重组DNA技术来产生。
最后，本发明涉及一种经本发明方法生产的活性酶。
本发明过程中生产的酶原在发酵培养基中是稳定的，即，不受任何实质的降解，因此当存在于发酵培养基中或从其中回收时要经过相当长的一段时间才能转变成活性酶。选择地，原在发酵培养基中可以是不稳定的和迅速被降解，最差的情况发生在回收或转变成活性酶之前。本发明的方法在酶的生产中据设想是特别重要的。其中在发酵培养基中的酶原形式不如活性酶稳定。在此情况下，据认为在其降解之前，蛋白水解酶可以使不稳定的酶原转变成活性酶。
虽然本发明的方法对由表达相应酶原的天然产生的细胞发酵产生的活性酶生产有益，但是它们被认为对重组活性的生产特别重要，此重组活性酶由转化入用于发酵的细胞的核酸序列来编码。
因此，优选用编码酶原的核酸(例如DNA或RNA序列)转化表达酶原的细胞。用选择的本领域中已知的常规方法进行转化以适应于选择的宿主细胞的特征及核酸序列特征。核酸序列可以***宿主细胞的基团组中，例如通过同源或异源重组的方法实现。作为选择，核酸序列可以***能在宿主细胞中自主复制的重组表达载体中。特别地，核酸片段可连接到能指导酶原表达的转录和翻译信号上。
现认为本发明的方法一般可用于在细胞中作为酶原而表达的任何活性酶的生产，而且特别是其相应的酶原在发酵培养基中不如活性酶稳定的酶。例如，以本发明方法生产的酶可以是水解酶、氧化还原酶、异构酶、氧化酶或转移酶。
特别地，所生产的酶可以是蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、过氧化物酶、漆酶、转谷氨酰胺酶。
本文中，所生产的酶可以是天然产生的酶或其遗传工程变异体，后者是通过改变一个或多个氨基酸残基，例如通过常规的或定点突变的方法产生。
使用本发明方法获得的，产量被提高的一种类型的酶是胰蛋白酶样蛋白酶。
本文中术语“胰蛋白酶样蛋白酶”意思是指胰蛋白酶或有类似胰蛋白酶的结构或活性的酶，例如，能在赖氨酸或精氨酸的C—末端一侧切开肽键的酶。胰蛋白酶样蛋白酶的活性可以用一个试验来测定，此试验基于胰蛋白酶底物的裂解。如下面材料和方法部分所述的N—苯甲酰基—L—精氨酸—P—nitroanilide CL—BAPA或L—BAPNA)的裂解。
已发现胰蛋白酶样蛋白酶可由许多不同的生物体(包括哺乳动物、昆虫和微生物)生产。产生胰蛋白酶样蛋白酶的微生物的例子是真菌属Fusarium的一种，参见U.S.Patent No.5,288,627，本文引用作为参考，因此，欲生产的酶可以Fusarium属的菌株获得，例如从F.oxysporum、F.merismoides、F.redolens、F.sambucinum、F.solani或F.verticilloides的菌株获得。
特别地，此酶可从F.oxysporum菌株(例如保藏在DeutscheSamolung von Mikroorganismen，与在U.S.Patent No.5,286,627中公开的发明有关的，保藏号为DSM2672的菌株变异体获得的一种酶，此酶也可来自上述菌株的变异体或其突变体，这种变异体或突变体保留生产酶的能力，此酶有类似上述限定的胰蛋白酶的活性。编码从此菌株分离到的胰蛋白酶样F.oxysporum蛋白酶的核酸序列及胰蛋白酶样F.oxysporum蛋白酶的氨基酸序列，分别描述在所附的序列鉴定号1和2。
由本发明方法生产的酶原可以是酶原前体、因此带有一个与酶原运输出生产细胞相关的信号肽。信号肽一般可以与所述的酶原相连系或是一种与该酶原融合的肽，例如，为了适于选择的表达酶原的宿主细胞的分泌过程使其和酶原融合。
根据本发明的方法，虽然为某些目的发现两种或多种具有类似或不同酶活性的蛋白水解酶联合使用有益处，但是酶原的活化通常是通过一种蛋白水解酶完成的。
能使酶原转变成活性酶的蛋白水解酶的特性主要依赖于被转变的酶原的特性。因此，为特异性酶活化所用的蛋白水解酶的选择依赖于对被裂解的肽序列的分析。
当已知或从已知的或假设的编码酶的核酸序列推导出的酶原或活性酶的氨基酸序列时，使用众所周知的方法，可以鉴别序列中的前肽或可能的前肽的有限数目，并由此确定被裂解的肽序列。鉴于此，可以鉴定一种或多种已知的或假设的能裂解特定肽序列的蛋白水解酶，并且其用途可经实验证实。当然，选择的蛋白水解酶不应该或只在一定限度上裂解活性酶中的肽键，以阻止由此方法生产的活性酶的破坏或活性的大量降低。作为选择地，对上述方法而言，通过实验可以鉴定一种或多种有用的蛋白水解酶。
通过上述方法知道在本发明方法中所用的蛋白水解酶可以是任何有稳定蛋白水解活性的酶。例如，蛋白水解酶可以是金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，无论是具有中性的、碱性的还是具有酸性的特征。酶可以是特异性的或非特异性的。这样的蛋白水解酶的例子可在蛋白酶中发现，此蛋白酶按照1984年的酶的命名法，属于酶的命名分类3.4.21—3.4.24。
为活化胰蛋白酶样蛋白酶，特别是由Fusarium SP(如F.oxyspo-rum)产生的酶，中性金属蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶据认为是特别有用的。当胰蛋白酶样蛋白酶是由F.osysporumDSM2672生产的酶时，蛋白水解酶可使用嗜热菌蛋白酶或产生于杆菌(Zamost等，1990，工业微生物杂志，Vol.5，pp.303—312)的蛋白水解酶，例如，杆菌金属蛋白酶制品。蛋白水解酶也可是从下面的实施例4和6公开的Aspergillus oryzae或Fusarium oxysporum、获得的金属蛋白酶。在一个实施例中，当用F.oxysporum生产时，蛋白水解酶可用于增加胰蛋白酶样F.oxysporum蛋白酶的产量，在此情况下，和常规发酵比较，蛋白水解酶以过量的形式存在。
通过上面的公开，显然蛋白水解酶可因此加到发酵培养基中，在此产生待转变的酶原的细胞得到培养。蛋白水解酶可以成批或持续地加入。加入的蛋白水解酶举例来说可作为市售的酶，例如上述的那些酶之一，或可通过培养重组宿主细胞，此细胞本身携带一种核酸序列或经一种核酸序列转化，此核酸序列编码蛋白水解酶，该细胞在稳定的条件下生产酶)及从培养物中回收酶。
选择地，发酵培养基中蛋白水解酶的产生可以通过构建能表达酶原及蛋白水解酶的细胞，在有助于酶原和蛋白水解酶生产的条件下培养该细胞，接着用蛋白水解酶激活酶原来实现。通过用核酸序列转化构建合适的细胞，此核酸序列选择地存在于一或多种表达载体上，编码酶原和蛋白水解酶。选择地，可以选择已经含有编码例如酶原的核酸序列的细胞并可经重组DNA方法将编码蛋白水解酶的核酸序列***所述的细胞中(或反之亦然)。
在一个选择性实施例中，本发明方法通过使细胞表达酶原和使细胞表达能使酶原变成活性形式的蛋白水解酶，以便在使所述的酶原和所述的蛋白水解酶得以表达和使酶原得以转变成活性酶的合适条件下共同表达；从培养物中回收活性酶。按此实施例，至少一种所述的酶原和蛋白水解酶优选重组体。
根据本发明，产生酶原活化应该有充足量的蛋白水解酶。按本领域已知的方法通过模型实验，可以测定存在的蛋白水解酶的量。例如，适宜量的确定可根据估计的KM值和速度常数。KM值和速度常数分别指降解酶原的酶反应和转变酶原成为活性酶的酶反应而言。
作为选择，通过加入蛋白水解酶进行发酵，凭经验确定必需的蛋白水解酶的量。发酵条件，例如pH和温度对酶原的稳定性及蛋白水解酶的稳定性和活性应该是最适的。
如果认为在发酵培养基中蛋白水解酶易于降解，例如被按本发明方法生产的活性酶降解，那么持续地或分几部分地供应酶是有益的，例如通过使用批量加入的加入方法。
当蛋白水解酶和酶原在同一细胞中表达时，在培养细胞期间，加入更大量的(细胞生产以外的)所述蛋白水解酶到发酵培养基中是有益的。
当使用共表达时，酶原的成熟可在细胞内完成，假如此成熟或活化酶对细胞没有损害，就可以以成熟或活性形式从细胞回收。
现认为通过稳定酶原(特别是当发酵培养基中酶原不稳定时)可获得对经本发明方法生产的活性酶产量增加的积极效果。例如，这种稳定可产生较高的细胞内酶原稳定性及因此产生较高量的用于被蛋白水解酶活化的酶原。这种稳定可以根据众所周知的方法，通过合理修饰编码酶原前肽部分的核酸序列进行，结果导致一个或多个氨基酸加入到前肽C—末端和N—末端的一端或两端；在前肽氨基酸序列中的一个或许多不同位点取代一个或多个氨基酸；在前肽的一端或两个末端，或在氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸；或在前肽的氨基酸序列的一个或多个位点***一个或多个氨基酸，以便获得较高稳定性的酶原。
作为选择地，稳定作用可通过构建融合蛋白获取，此融合蛋白含有能转变成活性的或成熟的具有酶活性的蛋白的酶原或其一部分及一个稳定蛋白或其一部分。
此发明编码酶原和/或蛋白水解酶的核酸序列及DNA构建体可以源于基因组或cDNA，例如，可通过制备合适生物体的基因组或cDNA文库，按照标准方法(参见Sambrook等，1989)使用合成的寡聚核苷酸探针(例如根据酶原或蛋白水解酶的氨基酸序列制备的探针)通过杂交筛选编码酶原或蛋白水解酶的全部或部分的DNA序列获得。
通过建立的标准方法，例如由S.L.Beaucage等(1981)及Matthes等(1984)描述的phosphoamidite方法，也可通过合成来制备本发明的DNA序列及DNA构建体。根据phosphoamidite方法，合成寡核苷酸，例如用自动DNA合成仪，纯化、连接并用合适的载体克隆。
最后，DNA序列和DNA构建体可以是依据标准技术通过连接合成的、基因组的或cDNA来源的(合适的)片段制备的合成的与基因组的、合成的与cDNA的或基因组的和cDNA的连接片段。
在本发明方法中，用于表达酶原和/或蛋白水解酶的细胞是在培养时产生大量酶原和/或蛋白水解酶的适宜细胞。如上所述，此细胞可以是本身生产酶原或蛋白水解酶的细胞，但此发明中优选用编码酶原的核酸和/或编码蛋白水解酶的核酸转化的细胞。此细胞适宜地可以是以前用作宿主生产重组蛋白质的细胞，原核或真核细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞，优选的是微生物，例如细菌或真菌。术语真菌意思是包含丝状真菌和酵母。
合适的细菌的例子是Bacillus属，例如Bacillus subtilis、Bacilluslicheniformis、Bacillus lentus、Nacillus brevis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus coagulans Bacil-lus megaterium、Bacillus Circulans、Bacillus lautus及Streptomyces属，例如Streptomyces lividans的革兰氏阳性菌。合适的革兰氏阴性菌的例子包括Escherichia属菌，例如E.coli。宿主菌细胞的转化例如可通过原生质体转化或经已知方法制备的感受态细胞产生。另一种合适的细菌细胞是Pseudomonasspp例如Pseudomonas cepucia、Pseudomonasfragi、Pseudomonas gladioli、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonasstutzeri、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas Pseudomonas pseudoalcali-genes、Pseudomonas putida、Pseudomonas glumae或Pseudom onas aerug-inosa细胞。
选择地，细胞可以是真菌，即酵母或丝状真菌细胞。例如酵母细胞可以是Saccharomyces属，例如S.cerevisiae的细胞。例如丝状真菌宿主生物体可以是Aspergillus sp、例如A.niger.或A.oryzae菌株。用于转化Aspergillus宿主细胞和表达重组蛋白的技术恰当地叙述于EP238023。选择地，真菌宿主细胞可以是Fusarium SP，例如F.oxysporum菌株，例如其转化可如Malardier等(1989)所述的方法进行。
在此发明的重组细胞中，编码酶原的核酸序列和/或编码蛋白水解酶的核酸核酸序列可由表达载体携带或选择地存在于宿主细胞的基因组中。
为了获得表达，通常将启动子置于编码酶原和/或蛋白水解酶的核酸序列之前。启动子可以是在选择的宿主细胞中呈现强烈转汞活性的任何核酸序列及源于编码细胞外或细胞内蛋白质诸如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶或蛋白水解酶的基因。特别是当使用细菌宿主时，适合的启动子的例子是E.colilac操纵子启动子、Streptomyces coelicolor琼脂酶基因dagA启动子、Bacillus licheni-formisα—淀粉酶基因(amyL)启动子、Bacillus stearothermophilus产生麦芽糖的淀粉酶基因(amyM)启动子、Bacillus Amyloliguefaciensα—淀粉酶(amyQ)启动子、Bacillus subtilis XylA和XinB基因启动子等。为了在真菌宿主中转录，有用的启动子例如是源于编码A.oxyzae TAKA淀粉酶、Rhzomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性淀粉酶、A.niger酸性稳定α—淀粉酶、A niger葡萄糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、A.oryzae碱性蛋白酶、A.oryzae丙糖磷酸异构酶或A.nidulans乙酰胺酶的基因启动子。
其它和酶原表达相关的序列包括终止和多聚腺苷酸化序列及核糖体结合位点，它们可合适地从与启动子同样的来源得到。
载体还可包含在所述宿主细胞中能使载体复制的核酸序列，例如合适的复制起点及选择性标记，如其产物补充宿主细胞缺陷的基因、或给宿主细胞提供抗生素抗性的基团。
在本发明方法中为了培养产生的重组宿主细胞，所用的肉汤或培养基可以是适于所述细胞生长的任何普通培养基。合适的培养基如基础或复合培养基可购自于市场或根据公开的配方(如美国典型培养物保藏中心的目录)制备。
可按常规方法从培养基中回收酶、包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞、必要时在破碎细胞后沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分沉淀可用盐法(如硫酸铵)，接着用各种层析方法(如离子交换层析、亲和层析或类似方法纯化。实际的回收方法依赖于所述酶的种类。附图简述
下列附图进一步解释本发明，其中：
图1说明用于表达在实施例中进一步叙述的重组胰蛋白酶样F.oxysporum蛋白酶的表达质粒PSX183的构建。
图2F.oxysporum蛋白水解酶活性与用于加工F.oxysporum蛋白酶原的Bacillus成熟酶活性的比较。
图3A、3B、3C和3D显示了根据cDNA序列确定的P45的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列。
图4显示了质粒pDM120的图谱。
图5显示质粒pSO2的图谱。
图6显示了包含F.oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶原和F.oxyspo-rum P45蛋白水解酶基因的A.oryzae转化子的SDS—PAGE分析。泳道包含的上清液如下：泳道1，分子量标记，泳道2，对照A.oryzae菌株(未转化的)；泳道3，只用p45转化的A.oryzae；泳道4，只用pSX183胰蛋白酶样蛋白酶转化的A.oryzae；泳道5—10，用p45和F.oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶原转化的A.oryzae菌株。
图7显示了纯化的npIN—末端氨基酸序列与p45的比较
本发明以下列实施例进一步说明，这些实施例无论如何不意味着是对本文限定的本发明范围的限制。实施例实施例1：瓶发酵中的酶活性
使用不同水平的Bacillus stearothermophilus(Bs)蛋白酶对胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶产量的影响可分别用含基础和复合培养基的摇瓶发酵来估计，发酵温度为34℃、30℃和26℃。
材料和方法真菌菌株
Fusarium oxysporum DSM2672按布达佩斯条约的期限于1983年6月6日保藏在德国的Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen，Gottingen，并在美国专利5,288,627中进行了进一步的描述Aspergillus Oryzae IFO4177能表达胰蛋白酶样F.oxysporum蛋白酶的重组A.oryzae菌株的构建
编码胰蛋白酶样F.oxysporum蛋白酶的酶原形式及含有所附SEQ ID NO：1所示的DNA序列的cDNA，***到Noma等(1986)(Nature319：640—646)所述的载体pCDV1—PL中，产生质粒pSX180。cDNA编码区作为NcoI—XbaI酶切片段***到As-pergillus表达质粒p777(EPO489718)，此质粒用BamHI切割并用XbaI部分切割。为将克隆DNA的5’一端连接到载体上将合成接头DNA KFN709/710(图1所述)加入连接反应液中。结果产生的质粒pSX183和带有来自A.Ridulans(WO91/17243)amdS的质粒PToC90一起共转染入A.oryzae(IFO4177)。蛋白水解酶
使用了Zamost等(1990)所述的Bacillus stearothermophilus(BS)蛋白酶TPM—8。对振荡瓶发酵而言用冻干粉末形式，活性为5AU(H)/g、对模型实验(实施例3)而言，用晶体蛋白BS—蛋白酶形式，活性为75AU(H)/g。酶的比活近于100AU(H)/g。发酵液复合培养基：FGAP培养基
        15.0g/l        麦芽糖糊精
        30.0g/l        大豆粉
        5.0g/l         Bacto蛋白胨
        15.0g/l        KH2PO4
        0.4g/lPluronicR，pH6.5
基础培养基：ASPOZ培养基
            琥珀酸        10.0g/l
          MgCl2·6H2O 0.8g/l
          KCl           1.8g/l
          NaH2PO4     1.0g/l
          H2O
          Na2SO4      1.8g/l
          尿素          2.0g/l
          柠檬酸        2.0g/l
          痕量金属sol.  0.5ml/l
          I*
          Pluronic      0.1ml/l
          用5N NaOH调pH至6.0
          灭菌后：20g/l麦芽糖糊精(MD01)
*)痕量金属溶液1：14.3g/l   ZnSO37H2O
                 2.5g/l    CuSO45H2O
                 0.5g/l    NiCl26H2O
                 13.8g/l   FeSO47H2O
                 8.5g/l    MnSO4H3O
                 3.0g/l    柠檬酸H2O
将可变量的BS—蛋白酶以无菌过滤液形式加入到含50ml AS-POZ培养基的250ml无盖聚丙烯摇瓶中。用1ml用表达质粒pSX183(下面进一步描述的构建体)转化的A.oryzae(IFO4177)孢子悬液(大约105孢子/ml)培养摇瓶，并以实施例中指定的300rpm和湿度培养。在第4天分析上清液中胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶的存在。胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶活性的测定
使用特异性的底物N—苯甲酰基—L—精氨酸—P—nitroanilide盐酸(L—BAPNA)分析胰蛋白酶样蛋白酶。缓冲液
0.01M二甲基谷氨酸(Sigma D4379)、0.2M硼酸和0.002MCaCl2，用NaOh调pH为6.5。底物
L—BAPA购自Sigma(B3133)或Merck(Art.10754)。制备0.2M溶于二甲基亚砜中的母液(87mg/ml)冷冻贮存)并用上述缓冲液稀释至0.004M。试验
为了进行试验将胰蛋白酶样蛋白酶稀释至大约15μg/ml。在一个96孔的微滴度板中将200μl0.004ML—BAPA与20μl稀释的胰蛋白样蛋白酶混合。用含20μl缓冲液和200μl0.004ML—BAPA的空白对照作校正。
在Elisa读数器中监测405nm下的吸收率改变(δOD/分)在25℃或室温下每5分钟读数一次，读10分钟计算与胰蛋白酶含量有关的结果作为Fusarium胰蛋白酶样蛋白酶的参考。BS—蛋白酶活性测定
用N，N—二甲基酪蛋白(DMC)为底物测定BS—蛋白酶的活性。在此过程中形成的主要氨基基团和能形成彩色复合物的三硝基苯磺酸反应。在50℃pH8.3反应进行9分钟。为了计算每个时间单位吸光率(在420nm)的变化，反应在原位继续进行。测定时间是3分钟。吸选率的改变是对反应速率和酶活性的测量。此活性是相对于酶的标准品(AlcalaseR)测定的，而且所用的单位与标准品相同。单位定义为AU(H)。
在约200ml煮沸的去离子水中经不断搅拌20分钟，溶解4.0gN，N—二甲基酪蛋白制备N，N—二甲基酪蛋白溶液(0.4％)，结果产生的溶液与以11.92g Hepes缓冲液(Sigma H—3375)、3.69g NaCl进一步含9.0ml4N NaOH、1mmol CaCl2并加入1.5ml Brij35溶液(在1000ml水中含150.0g Brij35(Atlas Chemie))制备的溶液混合。
通过将要分析的0.5—1.0g的酶与导致产生合适酶浓度的Na2SO3溶液量的2％Na2SO3溶液(200gNa2SO3、15ml Brij35溶液、1mmol CaCl2，加去离子水至10L)混合制备酶样品。
通过在200ml去离子水中溶解200mg 2，4，6—三硝基苯磺酸制备与在反应中形成的主要氨基基团反应的2，4，6—三硝基苯磺酸溶液。
从标准品和样品的反应速度确定BS—蛋白酶的活性，此测定是用从6—9分钟OD(幅度)的增加表示，每个测定5秒钟。通过免疫电泳(RIE)测定胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶
通过RIE分析酶学上有活性的胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶及其前体形式。在1％的琼脂糖(Litex HSA/HSB，1∶1)以20μl抗体/ml进行水平火箭免疫电泳。容器中的溶液和凝胶缓冲液由41mMTris(羟甲基)氨基甲烷和13mM甘氨酸缓冲液pH8.6组成。在15℃以2V/cm电泳近18小时。
经标准方法用家兔制备用于本方法中抗纯化的胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶的抗体。用纯化的蛋白酶免疫家兔，剂量为250μg/剂量，每周一次，共10周，实验中用粗制血清。
发现活性酶向正极移动，前体形式向负极移动。结果
从每套发酵条件下获得的结果示于下面表1：
表1
培养基 BS-蛋白酶 温度 pH 胰蛋白酶前体形式Matmg/l            mg/l
 ASPO2(基础培养基)     00.55.000.55.050.000.52.55.020.050.0    34℃30℃26℃ 6.18.36.45.77.16.07.57.97.98.08.18.28.1 53000  1080(24)2013214716347277311320300360
FG4P(复合培养基)     00.55.000.55.050.000.55.020.050.0    34℃30℃26℃ 7.17.37.36.76.86.86.97.17.27.26.56.5 0000  2026627060108176142120192429393
通过PIE估价了胰蛋白酶样Fusariumm蛋白酶(表中称为“胰蛋白酶”)的前体形式。通过RIE和BAPNA酶实验估价了成熟形式。
对于30℃的摇瓶培养，分析了前体形式及成熟形式的酶。由表1显而易见，含基础培养基和BS—蛋白酶的摇瓶检测不到酶原，而在无BS—蛋白酶的摇瓶中测定到53mg/ml的酶原。这些结果表明BS—蛋白酶能切除酶的前序列。
在含20AU(H)/l BS—蛋白酶的复合培养基中26°培养获得429mg/l有活性的或成熟的胰蛋白样蛋白酶，与之相比，经无BS—蛋白酶的对照发酵获得1 42mg/ml(活性酶产量相应增长约3倍)。成熟胰蛋白酶样蛋白酶的水平在基础培养基中略低，和对照47mg/ml相比，产物的最高量是360mg/l(活性酶产量相应增长约8倍)。
可以看出通过使用本发明方法获得的增加在基础培养基中比复合培养基显著地高。设想用于生产Fusariumm胰蛋白酶样蛋白酶的A.oryzae重组宿主细胞本身生产了能活化所述胰蛋白酶样蛋白酶的蛋白水解酶。在复合培养基中获得的明显低的效果可能是由于在复合培养基中合成了由A.oryzae生产的较高水平的自然产生的成熟蛋白酶。应强调的是，虽然设想A.oryzae宿主细胞本身生产了活化的胰蛋白酶样蛋白酶，但是在发酵过程中加入BS—蛋白酶对所获得的活性胰蛋白酶样蛋白酶的产量产生大量增加的影响是可见的。实施例2：模型体系中酶的活化
在模型实验中评价了BS—蛋白酶从胰蛋白酶样Fusatrium蛋白酶的酶原裂解前序列的能力。材料和方法模型体系中酶的活化
在BAPA实验缓冲液(pH6.5)中制备胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶前体形式以及包含BS—蛋白酶或天然产生的F.oxysporum活性蛋白酶P45溶液(下面实施例4叙述了其分离过程)的稀释液。20μl含约15mg/l的胰蛋白酶样酶原稀释液与100μl蛋白水解酶溶液在96孔的微滴度板中混合，并在25℃培养。培养5和40分钟后，使用100μl0.008ML—BAPA底物和上述方法分析活化或成熟胰蛋白酶样蛋白酶的量。在BAPA实验中，为测试蛋白水解酶的未知作用，使用了20μl缓冲液代替胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶的前体形式。结果
使用了来自在不加BS—蛋白酶的基础培养基中含有质粒pSX183转化的A.oryzae4177，摇瓶发酵的发酵上清液。上清液含90mg/l的胰蛋白酶样蛋白酶前体形式。
用三种不同浓度的BS—蛋白酶(0、0.5和5AU(H)/l)孵育18mg/l酶原稀释液。5和40分钟后测定生产的活性胰蛋白酶样蛋白酶的量。根据在表2的结果说明，BS—蛋白酶能切掉胰蛋白酶样蛋白酶酶原的前序列，结果产生活性的胰蛋白酶样蛋白酶。而且，证明在实验中BS—蛋白酶无未知的作用。在实验期间，活性或成熟酶浓度的改变将影响分析结果，在此情况下只进行了粗略的估价(由“～”表示)。
表2
    酶原mg/lt＝0分     BS—蛋白酶AU/lt＝1分 成熟酶mg/l t＝5分t＝40分
    1818180     00.55.05.0   0        0.2～1.7    ～9.0～12.1   18.30.1      0.0
实施例3：发酵培养基中酶和酶原的稳定性材料和方法
评价胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶的稳定性
通过在30℃培养用质粒pSX183转化的A.oryzae在复合培养基中发酵所得的培养基上清液并以适当的时间间隔取样来评价具活性的胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶的稳定性。在实施例1的材料与方法部分描述了转化子和培养基。粗制的胰蛋白酶样Fuserium蛋白酶酶原的生产
HA.oryzae(IFO4177)发酵液制备粗制酶原，IFO4177用实施例1的材料和方法部分所述的质粒pSX183转化，在下述条件下获得了前体形式：500ml无盖摇瓶含100ml YDP(10g/l Bacto酵母提取物、20g/l Bacto胰蛋白胨、30g/l葡萄糖)，与含近106孢子的A.oryzae培养物一起孵育，并在26℃、125rpm下培养2天。通过过滤除去细胞残留成分，通过超滤法从培养基制得粗制前体形式，接着冻干。
胰蛋白酶样Fusarium蛋白酶酶原的稳定性和活化评价。
通过向上述发酵上清液中加入粗制酶原(大约100mg/l)，在30℃培养并以合适的时间间隔取样来估价酶原的稳定性/成熟性。结果
在30℃A.oryzae转化子(IFO4177/pSX183)发酵培养基上清液中活性胰蛋白酶样蛋白酶的稳定性如表3所示。
表3
培养时间30℃ 0 45分 4小时 20小时
蛋白酶mg/ml 75 76 74 66
％残留物活性 ＝100 101 99 88
1)经BAPNA实验估计活性。在发酵液中没测到前体形式。
表3的结果说明在发酵培养基中成熟酶相当稳定。因此，4小时后，实际上没有活性损失，20小时后，只损失10％。
通过加入100mg/l的粗制酶原至表3所述的发酵培养基中估计了胰蛋白酶样蛋白酶酶原的稳定性和成熟程度。结果见表4。
表4
培养时间，30℃     0  15分  30分  45分
成熟胰蛋白酶(源于前体形式) 0 15 38 51
残留前体形式     98  71  23  1
1)其值校正成发酵上清液本身的胰蛋白胰量。
2)由从发酵上清液分离的活化酶激活前体形式，发酵上清液带有F.oxysporum DSM2672，然后经BAPNA试验估测。用在平行实验中测定的成熟酶量校正其值。
从表4的结果看出：A.oryzae(IFO4177能活化前体形式。此外，显然在发酵培养基中前体形式不稳定。加入的前体形式，一半转变成了活性酶，另一半降解了。实施例4：源于Fusarium Oxysporum的p45蛋白水解酶的分离与鉴定材料与方法：纯化：
在以9000rpm离心F.oxysporum培养10分钟，用0.45μm滤膜过滤上清液，将200ml滤液在Amicon cell(PM10 membrane)和Cen-triprep—0(Amicon)上浓缩至0ml。将5ml浓缩液稀释至100ml，并用乙酸将pH调到5，用下列缓冲液通过1ml Monos柱：0.1M硼酸、10mM DMG、2mM氯化钙、pH5.2以NaCl梯度为0—＞0.5M过柱超过70分钟，以1ml/min的流速用上述鉴定的缓冲液洗10分钟后，收集到1.5ml组分并经Centricon—10(Amicon)浓缩。
用0.1M硼酸、10mM DMG、2mM CaCl2、pH6.5，在流速为0.4ml/min的条件下，经Superose12(HR10/30，Pharmacin)进行凝胶过滤。蛋白水解酶实验：
在37℃、0.1M Tris、2mM CaCl2、pH7的溶液中(当pH较低时，使用100mM硼酸、10mM DMG、2mM CaCl2)预孵育30—60分钟后，根据上述实施例1公开的，从重组胰蛋白酶样Fusarium，Oxysporum蛋白酶原释放的胰蛋白酶活性测定蛋白水解酶活性。在微滴度板上测定胰蛋白酶活性，用100μl底物(母液：87mg/ml—BAPNA(sigma)，溶于DMSO中，用缓冲液稀释50倍)和100μl样品混合，使用来自Molecular Devices的Thermomax microplate reader8测定405nm的吸收率。SDS—PAGE和在pVDF上电印迹
按制造商的说明书进行SDS—PAGF(10—27％，Novex)电泳，欲电泳的样品在加入加样缓冲液前与PMSF一起预孵育。用来自Novex的印迹模在3mM Na2CO3、10mM NaHCO3、20％MeOH、pH9.9中以30V、电印迹到前印迹膜(Applied Biosystems)上按Applied Biosys-tems所述染色前印迹。IEF覆盖
按制造商的说明书进行电泳IEF(Amphdine PAG—Plate：pH3.5—9.5，Pharmacia)并染色。在0.1MTris、2mM CaCl2、pH8.1的溶液中首先平衡要覆盖的凝胶15分钟，然后用10ml1％的琼脂糖、0.1M Tris、2mM CaCl2、pH8.1的溶液加入300μl L—BAPNA母液及500μl公开于上述实施例1(～0.25mg/ml)的重组—胰蛋白酶样Fusariumm Oxysporum蛋白酶原后来覆盖。氨基酸分析及氨基酸测序：
使用MDS—2000水解测定仪(CEM)分析了冻干样品的微波易化气相水解。使用含1％酚(脱氧剂)的6N HCl产生气相。在70psi(～148℃)水解20分钟。冻干水解的样品，并重溶于20μl500pmol/μl的肌氨酸和正缬氨酸中作为内标。按制造商的说明书，使用来自Hewlett—Packard的Amino Quat进行分析。注射1μl样品。按制造商的说明，使用来自Applied Biosystems的476A蛋白质测序仪(ProteinSequencer)，测定氨基酸序列。为了运行HPLC使用了预混合缓冲液。结果来自F.oxysporum培养基的p45的纯化
通过使用阳离子交换层析(MonoS)，接着在Superose12上通过凝胶过滤，从浓缩和过滤的发酵培养基中纯化p45蛋白水解酶。通过分析蛋白水解酶的活性从Monos选择馏分，蛋白水解酶活性是上述实施例1公开的来自于胰蛋白酶样Fusarium oxysporum蛋白酶原释放的胰蛋酶样活性。通过使用和分离MonoS—馏分同样的方法鉴定含来自Superose12柱的馏分的蛋白水解酶。在SDS—PAGE纯化的蛋白水解酶似乎为单条带，45KDa。用IEF(pH3.5—9.5)观察了两种异构形式的成熟酶，等电点分别为8.4和8.17。
来自氨基酸分析的结果表明，这种蛋白水解酶如序列表SEQ IDNO：3所示含有N—末端氨基酸序列。纯化的F.oxysporum p45(成熟酶)显示了高比活。
来自凝胶过滤柱的所述的蛋白水解酶(成熟酶)馏分放在一起上样到制备的IEF设备上。稳定安培度后样品以1000V电泳1小时，然后在500V再电泳30分钟，接着每个3ml收集30个馏分。只有一个馏分含在SDS—PAGE上所见的蛋白水解酶。图2所示为P45活性与Bacillusdn成熟馏活性的比较。p45成熟酶是金属蛋白质
金属蛋白酶含有催化的锌金属中心，锌金属中心参与肽类骨架的求解。活性锌中心将这些蛋白酶和活性依赖于钙存在的Calpain区别开来。作为金属蛋白酶的蛋白酶的确定是通过用1，10—phenan-throlin(1mM)去除锌中心，接着经Zn2+(0.1—100μm)滴定恢复全部活性实现的。
表5所示在上述实施例1中公开的胰蛋白酶样Fusarium oxys-porum蛋白酶不受1，10—phenanthroline抑制，因为在有或无抑制剂加入时，产生同样的胰蛋白酶活性，分别为33.S×10-4和34.0×10-4△Abs/min。上面实施例1材料与方法部分描述的胰蛋白酶样Fusarium oxysporum蛋白酶原或Fusarium oxysporumm成熟酶样品单独不含任何胰蛋白酶活性(表1)，然而当联用时，成熟酶裂解上面实施例1材料方法部分描述的重组胰蛋白酶样Fusarium oxysporum蛋白酶原，结果产生活性胰蛋白酶。当加入1mM 1，10—phenanthro-line(表5)时，成熟酶活性受到抑制。然而，一旦加入1mM Zn2+便产生Fusarium成熟酶全部重新活化。当用EDTA(1mM)代替1，10—phenanthroline时产生了类似的结果。
                   表5用1，10—phenanthroline抑制Fusarium成熟酶
蛋白质 1，10-phenanthroline(1mM)     Zn2+(1mM) 蛋白酶活性(ΔAbs/分x10-4)
胰蛋白酶样Foxysporum蛋白酶     -     -     34.0
胰蛋白酶样Foxysporum蛋白酶     +     -     33.8
胰蛋白酶样Foxysporum蛋白酶     -     -     1.26
p45成熟酶     -     -     1.33
胰蛋白酶样Foxysporum蛋白酶原＋P45成熟酶     -     -     54.0
胰蛋白酶样Foxysporum蛋白酶原＋P45成熟酶     +     -     2.9
胰蛋白酶样Foxysporum蛋白酶原＋P45成熟酶     +     +     50.6
实施例5：Fusarium oxysporum p45基因的克隆
通过PCR首先克隆了F.oxysporum p45基因的一部分。使用N末端蛋白质序列(SEQ ID NO：4)设计了一个引物并通过内源成熟酶肽序列(SEQ ID NO：5)设计了反向引物。使用DNA引物和从Fusarium F.oxysporum分离的基因组DNA进行PCR。基因组DNA分离如下：在30℃使近于15g湿重的F.oxysporum接种生长在MY50培养基因(50g/l麦芽糖糊精、2g/l Mg2SO4、10g/l KH2PO4、2g/l柠檬酸、10g/l酵母提取物、3g/l尿素、2g/l K2SO4、0.5ml痕量金属溶液，用5N NaOH调pH至6)。将菌丝体悬于16ml TE(10mMTris·HCl、1mM EDTA pH8.0)中，分为两管、每管中加入约12g0.45—0.52mm的玻璃珠(Thomas Scientific)。每30秒将样品交替涡旋并冰冻一次，直到能看到粘性***物产生。将样品涡旋另外两个30秒，在每份样品中加入2.5ml 20％SDS。反转混合样品，室温孵育10分钟，并再次混合。在室温，3.5K旋转离心样品8分钟。将上清液合并在50ml聚丙烯管中。用等体积经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)平衡过的TE提取样品，然后在10000rpm4℃离心10分钟。在37℃用300μl10mg/ml蛋白酶K处理样品30分钟。如上所述DNA经酚/氯仿/异戊醇(P/C/I)提取、乙醇沉淀并溶于5ml TE中。样品在65℃用150μl 10mg/l RNase A处理15分钟，然后在37℃ 15分钟。样品再用蛋白酶K处理(100μμl 10mg/ml 15小时，37℃)然后经P/C/I抽提两次及乙醇沉淀。将DNA挑取到弯曲的巴斯德吸管上并转移至5ml80％的乙醇中。以10000rpm离心样品3分钟。短暂干燥DNA沉淀物，并溶于1m/TZ中。
如下PCR用于克隆部分F.osysporum p45成熟酶基因：在50μl体积内，将每个约100pmole的合成PCR引物DNA(此DNA溶于1×Taq缓冲液中(Boehringer Mannheim))、每个浓度为100μM的dGTP、dATP、dTTP和dCTP与50—100ng F.oxysporum基因组DNA混合。加入1—5单位Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)。PCR温育为，95℃5分钟，然后进行35个循环(95℃30秒：50℃1分钟：72℃：1分钟)。PCR反应产生两个约1.0和1.3kb量的DNA片段。这些片段经凝胶电泳分离、纯化、克隆进E.Coli复制质粒，并用分子生物学领域中已知的标准方法测序。通过用从直接蛋白质测序获得的氨基酸序列，比较翻译用的DNA发现，1.0kb DNA片段含有F.oxysporum p45基因序列。因此，用PCR产生的1.0kb DNA片段为探针从F.oxysporum基因组DNA文库中克隆整个成熟酶基因。
使用如发现于Sambrook等1989，Molecular Cloning：A LaboraforyManual，Cold Spring Harbor，NY所述的那些方法，从F.oxysporum基因组DNA制备入噬菌体基因组DNA文库。在200μl含10mM Tris(pH7.5)、50mM NaCl、7mM MgCl2、7mM2—巯基乙醇和4单位限制酶Sau 3A的溶液中于37℃消化总共50μg基因组DNA1分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离部分消化的分子大小在10—20Kb的DNA，接着电洗脱到透析膜，并使用Elutip—D柱(Schleicher和Schuell)浓缩。用限制酶BamHI切割并用磷酸酶(Clonetech)处理的的入噬菌体EMBLA臂1μg与300—400μg Sau3A切割的基因组DNA在标准条件下(见Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manaual，COld SPring Harbor，NY)于25μl体积中连接。使用市售试剂盒(Gigapack ColdII，Stratagene)，遵照制造者的说明书，从此连接混合物中制备入噬菌体。使用标准方法(Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)进行约18000个重组入噬菌体铺板并生产滤膜(to N＋filters，Ammersham)。使用制造者提供的说明书，经用于非放射性核酸检测(Boehringer Mannheim)的Genius试剂盒处理滤膜用作杂交使用。用作p45成熟酶探针的DNA如上所述是1.0kb PCR片段。使用制造者提供的DIG标志试剂盒和说明，经PCR dioxigenin(DIG)掺入标记探针。15ng 1.0kb p45片段混合于1×Tag缓冲液(Bochringer Mannheim)、1×DIG标记混合物(Bochringer Mannheim)，此混合物含100pmmmol N—末端引物(SEQID NO：4)和内部反向引物(SEQ ID NO：5)、1—5单位Taq聚合酶(Bochringer Mannheim)，总体积为80μl。反应条件为：95℃ 3分钟、35×[95℃30秒、50℃/分、72℃/分]、72℃5分。使用Genius试剂盒制造者提供的说明、用DIG标记探针进行滤膜杂交并在其条件下洗涤。
按制造者(Bochringer Mannheim)所述，用Lumiphos 530可观察的碱性磷酸酶结合的抗—digoxigenin抗体检测杂交噬菌体。使用Qi-agen Lambda Midi kit(QIAGEN，INc)，从阳性入克隆制备DNA制品。用限制酶EocRI消化来自一个制品的DNA，将6.3kg片段亚克隆进质粒PUC118。此亚克隆的部分DNA序列分析鉴定出p45基因的整个编码区(见图3和SEQ ID NO：6)。克隆p45cDNA
按以前发表的方法(CHirgwin等Biochemistry 18：5294—5299(1989)，Aviv和Leder，Proceedings of the National Aceademy of Sci-ences，USA 69：1408—1412(1972)，Sambrook等1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)，并做下列修改，从F.oXYsporum制备总RNA和Poly—A RNA。特别地，液氮中的菌丝体磨成粉末，此后边搅拌边重悬于含4M硫氰酸胍、0.5的Na—laurylsarcosine、25nM的柠檬酸钠及0.1M 2—巯基乙醇pH7.0的溶肠缓冲液中，在室温放置30分钟。通过低速(5000rpm，30分)离心去除细胞残渣。典型地，使用从Boehringer Mannheim获得的Oligo(dT)纤维素分离Poly—ARNA馏分。
使用发夹/RNaseH方法(Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory MManual，Cold Spring Harbor，NY)，用PolyARNA产生cDNA。
特别地，将5μμl水中的5μg polyRNA于70℃加热，然后置于冰上。制备了50μl总的反应混合物，包括polyARNA、50mMM Tris(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT，每个1mM的dGTP、dATP、dTTP和dCTP、40单位RNasin、10μg Oligo(dT12—18)引物及1000单位SuperScriptII RNase H—逆转录酶(Bethesda ResearchLaboratories)。混合物在45℃温育1小时。然后向沉淀核酸中加入30μl10mM Tris(pH7.5) 1mM EDTA、40μg糖原载体(BoehingerMannheim)、0.2体积10M乙酸铵及2.5体积乙醇。离心后，沉淀重悬于20mM Tris(pH7.4)、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM硫酸铵、16μM βNAD+、每个为100μM的dGTP、dATP、dTTP、dCTP、44单位Ecoli DNA聚合酶I、6.25单位RNaseH及10.5单位DNA连接酶的混合物中。在16℃此溶液中进行第二链DNA合成3小时。经乙醇沉淀浓缩DNA，在30℃将沉淀重悬于30μl30mM NaAC(pH4.6)、300mmM Nace、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油和30单位Mung Bean核酸酶(Bethesda Research Laboratories)中30分钟。用70μl10mM Tris(pH7.5)1mM EDTA中和DNA溶液，经酚抽提及乙醇沉淀。在50μl缓冲液(20mMTris—乙酸pH7.9、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾、1mM DTT、每个0.5mM的dGTP dATP dTTP dCTP)中，37℃用7.5单位T4聚合酶(Invitrogen)处理沉淀。通过加入EDTA至20mmM终止反应，接着用酚抽提及乙醇沉淀。此方法的结果是双链cDNA，带有平末端，适于结合DNA接头及克隆进任何载体。
带EcoRI接头的cDNA在琼脂糖凝胶上使其大小片段分开，以获得分子大小为0.7kb或较大的cDNA。通过电洗脱从凝胶中回收cDNA，并经酚抽提及乙醇沉淀纯化。大小分开的cDNA用于构建入cDNA文库。cDNA克隆进入ZIPLOX壁(Gibco BRL)。用噬菌斑挑选技术和如前面所述的DNA杂文，使用467bp的digoxigenin标记片段作为探针(基因组克隆的bp336—803)鉴定全长cDNA入克隆。在质粒pZLl中如制造商(菌株和质粒来源于Gibco BRL)所述回收全长cDNA。测定全长cDNA序列并和基因组DNA序列比较。基因组DNA长2049bp并含3个内含子。p45蛋白酶原前体的推测的编码区由一个推断的18个氨基酸的信号序列、一个266个氨基酸的前区及一个388个氨基酸成熟区组成，如SEQ ID NO：6及图3所示。实施例6：同一微生物宿主(A.oryzae)中p45蛋白水解酶及胰蛋白酶样蛋白酶的共表达。
在此所述的实施例中，提出了对另一个胰蛋白酶样蛋白酶成熟的分开。
一个2101bp的Bam HI/NruI基因组p45蛋白酶原前体片段***到TAKA淀粉酶启动子和淀粉糖苷酶(AMMMG)终止子之间。为实现此目的，使用PCR技术，直接引入一个BamHI位点此位点在ATG起始密码子上游，修改基因的5’端。在基因的3’端使用了自终止子密码子下游44bp的内源性NruI位点。p45表达质粒称为pDM120(图4)。用质粒pDM120和pSO2共转化pyrG—A.oryzae宿主菌株，质粒pSO2含A.oryzae pyrg标记(见表5)。
通过原生质体方法(Christensen等Biotechnology 6：1419—1422(1988)，Yelton等Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)81：1470—1474(1984))进行A.oryzae转化。典型地，将oryzae菌丝体生长在营养丰富的培养基中。通过如过滤、离心等技术从培养基中分离菌丝体。向渗透性稳定缓冲液(如用磷酸钠缓冲到pH5.8的1.2M MgSO4)中的菌丝体加入酶制品NovozymeR(NovoNordisk)。在30℃搅拌，温育悬液60分。收集原生质体并将其重悬于含钙如STC(1.2M Sorbitol 1 10mM CaCl2、10mM Tris—HCl pH7.5)的渗透性稳定缓冲液中。将转化的DNA加到大约100μl原生质体悬液中，然后加入200μl PEG溶液(60％PEG 4000、10mM CaCl2、10mM Tris·HCl(pH7.5)在室温孵育混合物20分钟。加入另外1mlPEG溶液，在室温再温育20分钟。用8ml STC缓冲液稀释转化的原生质体并涂到选择平板上。使用乙酰胺(作为生长的唯一氮源)平板选择含外源提供的amdS标记的转化子。基础培养基平板能用于含外源提供的pyrG基因的转化子。
在37℃转化子生长在M400D培养基(麦芽糖糊精，50.0g/l、Mg-SO4·7H2O，2.0g/L、KH2PO2，2.0g/l、柠檬酸，4.0g/l、酵母提取物，8.0g/l、尿素，2.0g/l、痕量金属溶液(如上所述)，0.5ml/L、用5N NaOH调pH至6.0)并用SDS—PAGE分析培养基中p45的生产。至少在一个转化子(菌株DLM7)中看见了在约45KD迁移的一条主要带，而在对照培养物中没见到p45。通过蛋白质序列分析分析了DLM7中生产的重组p45，N—末端残基和从F.oxysporumm产生的p45成熟N—末端相匹配。因此，当用A.oryzae生产时，p45被正确地加工。
为了产生能表达p45和胰蛋白酶样蛋白酶的宿主生物体，菌株DLM7经含胰蛋白酶样蛋白酶的质粒pSX233和含作为选择标记的A.nidulans amS基因的pTOC90共转化。质粒pSX233是质粒pSX183的衍生物，使用标准的分子生物学技术，使前体胰蛋白酶样蛋白酶基因起始端的DNA接头从GGATCCTC-GAATTCTCTTCAGATCTCTTCACCATGG(SEQ ID NO：7)变成GGATCC ACCATGG(SEQ ID NO：8)。下面划线的ATG指起始蛋氨酸密码子的位置。将共转化转化子接种在FG4P培养基中生长，使用L—BAPNA实验分析子F.oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶活性。六个转化子比不含p45的菌株生产更多的胰蛋白酶样蛋白酶。经SDS—PAGE(图6)分析了这些转化子培养物(及对照)的上清液。所有转化子表明，胰蛋白酶样蛋白酶和p45成熟酶产生于同样的宿主生物体。结果表明，在相同宿主细胞(A.oryzae)中(前体)胰蛋酶样蛋白酶和F.oxysporum p45成熟酶的共表达使活性胰蛋白酶样蛋白酶的表达明显提高。实施例7：源于Aspergillus oryzae的中性金属蛋白酶(npl)的纯化及起始鉴定材料与方法纯化
收集101A.oryzac1560(7Cl—78)发酵液，经0.1μm中空纤维(Amicon)过滤得91培养基，并在3KDa切好的旋转超滤软片(Ami-con)上浓缩至700ml。
将300ml稀释至1000ml(＜1.5mS，pH7.1)并加样至150ml(2.6cm i.d.)Q—Sepharose柱上，此柱用0.1MM硼酸、10mM DMG、2mmM CaCl2、pH6.2平衡流速为5ml/分。用缓冲液洗涤柱，并以6ml/分的洗脱速度用1050ml0—＞1M NaCl梯度液洗脱。收集到12ml馏分，分析成熟酶活性以获得上述实施例1公开的胰蛋白酶样Fusari-um oxysporum蛋白酶原成熟活性。将合成熟酶的馏分合并，在YM3膜上浓缩。
此后将汇合液稀释至80ml(＜1.5mS，ph7.5)，上样至20mlMonoQ柱(1.6cm i.d.)上，此柱用20mM Tris、20mM CaCl2、pH7.5的溶液平衡并用300ml，梯度为0—＞0.5M NaCl溶液洗脱，流速为6ml/分。收集4.5ml馏分并测试成熟酶活性。合并具有活性的馏分，并在Centriprep—10上浓缩。
使用Hiload Superdex 200 16/60柱，使3ml MQ1进行凝胶过滤，此柱经100mM硼酸、10mM DMF、2mM GaCl2、pH6.2的溶液平衡，流速为1ml/分。收集1ml馏分。合并具有成熟酶活性的馏分。
通过在phenyl—superose5/5(流速为0.5ml/min，1.7—＞OM(NH4)2SO4梯度，60分，25mM Tris pH7，收集1ml馏分)与同CHsepharose4B(15ml柱，1.6cm i.d.，流速为2ml/min，0—＞100％B80分(A：25mM乙酸，pH5，B：0.1M Tris，1M NaCl，25％异丙醇，pH7.5)，收集3ml馏分)联偶的杆菌素上做辅助柱层析建立进一步纯化步骤。每次过柱(用3.5ml各自的缓冲液洗脱)在PD—10上脱盐2ml S2，上样3ml。将有成熟酶活性的馏分混在一起。使用杆菌素柱进行较大量纯化；3ml S12＋3ml S13＋1ml S2在PD—10上脱盐进入25mM乙酸pH5中，上样10ml到柱上。混合有成熟酶活性的馏分并在Centricon—10和Microcon—10上浓缩。肝菌肽的偶联：
根据制造者的说明进行肝菌素与活化CH Sepharose 4B(Pharma-cia)的偶联。使用CH Sepharose(在1mM HCl中溶胀并在偶联缓冲液中洗涤)6.6g和溶于0.1M NaHCO3，0.5M NaCl pH8的溶液中的0.25g(18250单位)杆菌素(Sigma)偶联，室温处理2小时。用0.1MTris，pH8封闭过多的活性基团，接着用0.1M乙酸、0.5M NaCl Ph4洗涤。成熟酶实验：
在0.1M Tris，2mM CaCl2pH7.5(在较低的pH，使用了硼酸/DMG或含CaCl2乙酸缓冲液)，37℃预孵育30分钟后从上述(～25μg/ml)公开的实施例1的胰蛋白酶样Fusarium oxysporum蛋白酶原释放的胰蛋白酶活性测定成熟酶的活性。在微滴度板中测定胰蛋白酶活性：100μl底物(母液87mg/ml L—BAPNA(sigma)，存在于DMS中，用缓冲液稀释50倍)，使用购自Molecular Devices的Ther-momax微板阅读器测定405nm的吸光度。SDS—PAGE和电印迹到PVDF：
根据制造者的指导(125伏2小时)，进行SDS—PAGE(10—27％，Novex)，将欲上样样品在加入上样缓冲液前与PMSF(0.2％)预孵育。使用购自Novex的印迹模在3mM Na2CO3、10mM NaHCO3、20％MeOH，pH9.9溶液中，25伏2.5小时电印迹到前印迹膜(Ap-plied Biosystems)上。根据Applied Biosystems所述染色前印迹。IEF—覆盖：
按制造者说明进行(1500V，50mA，1.25小时)IEF(AmpholinePAG—板：pH3。5—9.5，Pharmacia)和染色。在0.1MM Tris，2mMCaCl2pH7中将欲覆盖的凝胶首先平衡15分钟，然后用1％琼脂糖、0.1M Tris、2mM CaCl2，pH7的溶液加入L—BAPNA的母液(稀释50倍)及公开上述实施例1(粗浓缩内汤1mg/ml，稀释50倍)中的胰蛋白酶样Fusarium oxysporum蛋白酶原后覆盖通过在覆盖缓冲液中加入1％脱脂乳进行酪蛋白覆盖。氨基酸测序：
按制造者的指导，使用购自Applied Biosystems的476A蛋白质测序仪进行氨基酸测序，预混合缓冲液用于HPLC操作中。结果：
上述纯化方法纯化3300多倍(纯度)95％(SDS—PAGE))。从SDS—PAGE得知纯化的npl分子量为46KDa左右并从IEF得知pl为4.5左右。覆盖的IEF—凝胶(用上述公开的实施例1中的胰蛋白酶样Fusarium oxysporum蛋白酶原和L—BAPNA覆盖)。说明成熟酶活性产生于pl4.5。在此也观察到酪蛋白清除。当对纯化的npl进行N—末端氨基酸测序时，获得了一序列(前几个循环含一些背景)。此氨基酸序列对应于N—末端氨基酸序列，此序列从46KDa带获得，此带是从pVDF—膜上SDS—凝胶印迹得到的，图7报道了产生的氨基酸序列。N—末端氨基酸序列和来自F.oxysporum(图7)的p45的N—末端序列64％同源。发现此蛋白酶的最适pH为5.5—6.0。以不同的pH，在稀释缓冲液中，用上述公开于实施例1中的胰蛋白酶样Fusarium oxysporum蛋白酶原孵育。微生物的保藏
下列生物材料保藏Agridlltural Research Seruice Patent CultureCollection(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 UniuersityStreet，Illinois，61604，USA菌株               登记号               保藏日期E.coli含pDM120     NRRL B—21239        4/21/94(p45成熟酶)(EMMMCC0099)E.coli含pSO2(pyrG)(EMCC0100)         NRRL B—21240        4/21/94E.coli含pSX233(EMCC0101)         NRRL B—21241        4/21/94
此菌株保藏情况保证在此专申请未决期间、其培养物对专利和商标官员授权的个人以及按37C.F.R.ξ1.14和35U.S.Cξ122规定，和按布达佩斯条约规定的情况可以得到。
保藏物代表3每个保藏菌株生物学纯的菌株。保藏物根据外国专利法的要求可获得，所说的国家是指本主题申请或其后续中请递交的国家。然而，应该清楚保藏物的可利用性不包含许可，此损害由政府行为所授予的专利权来实施本发明主题。
本文叙述和要求的发明范围不受本文公开的具体实施例限制。因这些实施例是对本发明的几个方面的解释。事实上除了本文说明和叙述的那些外，对本发明的各种修改对本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也落在所附的权利要求范围内。
说明书中引用的参考文献Enzyme Nomenclature，1984，Published for the Intemational Union of Biochemistryby Academic Press，Inc.Zamost et al.，Joumal of Industrial Microbiology，Vol.5，pp.303-312，1990Stepanov et al，FEB 08012，Vol.260，No.2，pp.173-175，1990Malardier et al.，Gene78(1989)，pp.147-156Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor，1989Beaucage et al.(1981)，Tetrahedron Letters22，pp.1859-1869Matthes et al.(1984)，The EMBO J.3，pp.801-805Mortensen，S.B.，Thim，L.，Christensen，T.，Woeldike，H.，Hjortshoej，K.andHansen，M.T.(1989)，J.Chromatogr.476，227-233Noma et al.(1986)，Nature319，640-646INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rule 13bis)
A.The indications made below relate to the microorganism referred to in the descriptionon page       36                            ，line            14
B.IDENTIFICATION OF DEPOSIT    Furtber deposits are identified on an additional sheet□
Name of depositary institutionAgricultural Research Service patent Culture Collection(NRRL)
Address of depositary institution (including postal code country)Northern Regional Research Center1815 University StreetPeoria， IL 61604，USA
Date of deposit21 April 1994 Accession NumberNRRL B-21241
C.ADDITIONAL INDICATIONS(leave blank if not applicable)    This inforrnation is continued on an additional sheet□
In respect of those designations in which a European and/or Australian patentis sought，during the pendency of the patent application，a sample of thedeposited microorganism is only to be provided to an independent expert nominatedby the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC/Regulation 3.25 ofAustralia Statutory Rules 1991 No.71).
D.DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if the indications are not for all designaled States)
E.SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if not applicable
The indications listed below will be submitted to the International Bureau later(specify the general nature of the indications e.g.，＂AccessionNumber of Deposit＂)
Figure A9419247300471
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSTTED MICROORGANISM
               (PCT Rule 13bis)
A.The indications made below relate to the microorganism referred to in the dcscriptionon page        36                           ，line          11
B.IDENTIFICATION OF DEPOSIT                                       Further deposits are identified on an additional sheet□
Name of depositary institutionAgricultural Research Service patent Culture Collection (NRRL)
Address of depositary institution (including postal code and country)Northern Regional Research Center1815 University Streetpeoria， IL 61604，USA
Date of deposit21 April 1994 Accession NumberNRRL B-21240
C.ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable)    This information is continued on an additional sheet□
In respect of those designations in which a European and/or Australian patentis sought，during the pendency of the patent application，a sample of thedeposited microorganism is only to be provided to an independent expert nominatedby the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC/Regulation 3.25 ofAustralia Statutory Rules 1991 No.71).
D.DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE(if the indications are not for all designated States
E.SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS(leave blank if not applicable)
The indications listed below will be submitted to the International Bureau later(specify the general nature of the indications e.g.，＂AccessionNumber of Deposit＂)
Figure A9419247300481
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rule 13bis)
A.The indications made below relate to the microorganism referted to in the descriptionon page       36                            ，line      8
B.IDENTIFICATION OF DEPOSIT                                   Further deposits are identified on an additional sheet□
Name of depositary institutionAgricultural Research Service patent Culture Collection (NRRL)
Address of depositary institution (including postal code and country)Norhern Regional Research Center1815 University Streetpeoria， IL 61604，USA
Date of deposit21 April 1994 Accession NumberNRRL B-21239
C.ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable)    This information is continued on an additional sheet□
In respect of those designations in which a European and/or Australian Patentis sought，during the pendency of the patent application，a sample of thedeposited microorganism is only to be provided to an independent expert nominatedby the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC/Regulation 3.25 ofAustralia Statutory Rules 1991 No.71)
D.DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if the indications are not for all designated States
E.SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if not applicable)
The indications listed below will be submitted to the International Bureau later (specify the general nature of the indications e.g..＂AccessionNumber of Deposit＂)

Claims (25)

1.一种通过发酵以酶原形式表达酶的细胞来生产活性酶的方法，此方法包括在不同于活性酶并能使酶原转变成活性酶的蛋白水解酶存在时进行发酵、从发酵培养基中回收活性酶，其中在发酵前和/或发酵过程中加入蛋白水解酶。
2.一种通过发酵以酶原形式表达酶的细胞来产生活性酶的方法，此方法包括在不同于活性酶并能使酶原转变成活性酶的蛋白水解酶存在时进行发酵、从发酵培养基中回收活性酶，其中蛋白水解酶由表达酶原的细胞中存在的重组DNA序列编码和表达。
3.根据权利要求2的方法，在细胞培养期间，加入更多量的所述蛋白水解酶。
4.根据权利要求1或2的方法，其中细胞表达的酶原在发酵培养基中不如活性酶稳定。
5.根据权利要求1或2的方法，其中用编码酶原的核酸序列转化表达酶原的细胞。
6.根据权利要求1或2的任一权利要求的方法，其中生产的酶是水解酶、氧化还原酶、异构酶、氧化酶或转移酶。
7.根据权利要求6的方法，其中生产的酶是蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、过氧化物酶、漆酶或谷氨酰胺转移酶。
8.根据权利要求7的方法，其中要生产的酶是胰蛋白酶样蛋白酶。
9.根据权利要求8的方法，其中要生产的酶从Fusarium属菌株获得，例如从F.oxysporum、F.merisoides、F.redolens、F.sambucinum、F.solani或F.verticilloides菌株获得。
10.根据权利要求9的方法，其中所要生产的酶是从保藏在Deutsche Sammmlung Von Milroorganismen，Gottingen，Germany，保藏号为DSM2672的F.oxysporumm菌株获得的胰蛋白酶样蛋白酶。
11.根据权利要求1或2，其中酶原以酶原前体表达。
12.根据权利要求1或2的任一权利要求的方法，其中蛋白水解酶是金属蛋白酶丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶。
13.根据权利要求8—10的任一权利要求的方法，其中蛋白水解酶是中性金属蛋白酶、碱性蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。
14.根据权利要求1或3的方法，其中的蛋白水解酶是在合适的条件下培养用编码蛋白水解酶的核酸序列转化的宿主细胞以生产该蛋白水解酶，并从培养物中回收该蛋白水解酶来生产的。
15.根据权利要求1或2的方法，其中表达酶原和/或蛋白水解酶的细胞是微生物。
16.根据权利要求15的方法，其中微生物是细菌或真菌。
17.根据权利要求16的方法，其中的微生物是***，例如Bacillus或Streptomyces属的细菌；***，例如Escherichia属的细菌；酵母，例如Saccharomyces属菌、或丝状真菌、例如Aspergillus或Fusariumm属的真菌。
18.一种含有编码酶原的核酸序列和编码使酶原变成活性酶的蛋白水解酶的核酸序列的重组宿主细胞，酶原石如活性酶稳定；其中在重组宿主细胞中至少有一个核酸序列是重组核酸序列。
19.根据权利要求18的重组宿主细胞，其中编码酶原和/或编码蛋白水解酶的核酸序列由表达载体携带。
20.一种含有编码酶原的DNA序列和编码能使酶原转变为活性酶的蛋白水解酶的DNA序列的DNA构建体，酶原石如活性酶稳定。
21.一种含有如权利要求20限定的DNA构建体的重组表达载体。
22.一种含有根据权利要求20的DNA构建体或根据权利要求21的重组表达载体的重组宿主细胞。
23.根据权利要求18或22的重组宿主细胞，它是细胞或真菌。
24.根据权利要求23的重组宿主细胞是***，例如Bacillus或Streptomyces属细菌；***，例如Escherichia属的细菌；酵母，例如Saccharomyces属菌或丝状真菌，例如Asperigillus或Fusariumm属真菌。
25.根据权利要求1—17任一权利要求的方法生产的活性酶。
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