JP2901387B2 - 蛋白質の製造法 - Google Patents
蛋白質の製造法Info
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Description
【産業上の利用分野】本発明は、組み換えＤＮＡ、それ
を含む宿主微生物および該宿主微生物を用いた蛋白質の
製造法に関する。
を含む宿主微生物および該宿主微生物を用いた蛋白質の
製造法に関する。
【従来の技術】従来、黄麹菌の一種であるアスペルギル
ス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
ｅ）由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の構造について
は、全く知られておらず、また、該遺伝子の単離もされ
ていないのが実情である。アルカリプロテアーゼは、蛋
白質又はその部分加水分解物に作用して、ペプタイド結
合を分解する加水分解酵素であって、医薬、飲食品、洗
剤等広範に用いられている。本発明者等は、先にアスペ
ルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子
について種々検討した結果、アスペルギルス・オリゼー
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子及びプレプロ型アル
カリプロテアーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定する
ことに成功し、特許出願を行った（特願昭６３−５１７
７７号及び特願昭６３−１７００１８号）が、これら遺
伝子はアルカリプロテアーゼのｍＲＮＡ由来のものであ
って、アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子を取得しこ
れを構造決定した例は未だない。一方、これまで遺伝子
工学を用いた物質生産のための宿主としては、大腸菌、
枯草菌、酵母、動物細胞等が検討されてきたが、各々長
所と短所があり、特に糖鎖を有する蛋白質やある種の立
体構造を有する蛋白質は大腸菌、枯草菌、酵母では不適
当である。また動物細胞ではその培養コストが高くな
り、現実の製造では問題が多い。そこで最近注目されて
いるのが、かびを宿主とした発現系である。例えばＵｐ
ｓｈａｌｌらの報告・Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
５，１３０１−１３０４（１９８７）によれば、大腸菌
や酵母では活性ある形で発現されなかったＴＰＡ（Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏ
ｒ）が、かび（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａ
ｎｓ）では活性を持った形で発現するとされている。そ
して、このような状況下、かびの宿主−ベクター系にお
いて、有効に機能するプロモーター、ターミネーター等
の開発は重要な意味を持ってきている。そこで、更に本
発明者等は、鋭意研究の結果、黄麹菌の染色体からアル
カリプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに得てその構造
を解析し、該ゲノム遺伝子５’側上流域にあるプロモー
ター領域および３’側下流域にあるターミネーター領域
の解析に成功し、特許出願を行なった。（特願平１−２
３１６６０号明細書参照）
ス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
ｅ）由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子の構造について
は、全く知られておらず、また、該遺伝子の単離もされ
ていないのが実情である。アルカリプロテアーゼは、蛋
白質又はその部分加水分解物に作用して、ペプタイド結
合を分解する加水分解酵素であって、医薬、飲食品、洗
剤等広範に用いられている。本発明者等は、先にアスペ
ルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子
について種々検討した結果、アスペルギルス・オリゼー
由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子及びプレプロ型アル
カリプロテアーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定する
ことに成功し、特許出願を行った（特願昭６３−５１７
７７号及び特願昭６３−１７００１８号）が、これら遺
伝子はアルカリプロテアーゼのｍＲＮＡ由来のものであ
って、アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子を取得しこ
れを構造決定した例は未だない。一方、これまで遺伝子
工学を用いた物質生産のための宿主としては、大腸菌、
枯草菌、酵母、動物細胞等が検討されてきたが、各々長
所と短所があり、特に糖鎖を有する蛋白質やある種の立
体構造を有する蛋白質は大腸菌、枯草菌、酵母では不適
当である。また動物細胞ではその培養コストが高くな
り、現実の製造では問題が多い。そこで最近注目されて
いるのが、かびを宿主とした発現系である。例えばＵｐ
ｓｈａｌｌらの報告・Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
５，１３０１−１３０４（１９８７）によれば、大腸菌
や酵母では活性ある形で発現されなかったＴＰＡ（Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏ
ｒ）が、かび（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａ
ｎｓ）では活性を持った形で発現するとされている。そ
して、このような状況下、かびの宿主−ベクター系にお
いて、有効に機能するプロモーター、ターミネーター等
の開発は重要な意味を持ってきている。そこで、更に本
発明者等は、鋭意研究の結果、黄麹菌の染色体からアル
カリプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに得てその構造
を解析し、該ゲノム遺伝子５’側上流域にあるプロモー
ター領域および３’側下流域にあるターミネーター領域
の解析に成功し、特許出願を行なった。（特願平１−２
３１６６０号明細書参照）
【発明が解決しようとする課題】その後、本発明者等
は、更に鋭意検討した結果、黄麹菌のアルカリプロテア
ーゼのゲノム遺伝子由来のアルカリプロテアーゼプロモ
ーター及び目的とする蛋白質の構造遺伝子をベクターＤ
ＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを、ゲムノ遺伝子中に
含有する微生物を培地に培養すれば、効率よく蛋白質を
製造することができること等の知見を得、本発明を完成
した。すなわち、本発明は、組み換えＤＮＡ、それを含
む宿主微生物および該宿主微生物を用いた蛋白質の製造
法を提供することを目的とするものである。
は、更に鋭意検討した結果、黄麹菌のアルカリプロテア
ーゼのゲノム遺伝子由来のアルカリプロテアーゼプロモ
ーター及び目的とする蛋白質の構造遺伝子をベクターＤ
ＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを、ゲムノ遺伝子中に
含有する微生物を培地に培養すれば、効率よく蛋白質を
製造することができること等の知見を得、本発明を完成
した。すなわち、本発明は、組み換えＤＮＡ、それを含
む宿主微生物および該宿主微生物を用いた蛋白質の製造
法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】本発明は、黄麹菌のアル
カリプロテアーゼのゲノム遺伝子由来のアルカリプロテ
アーゼ プロモーター、蛋白質構造遺伝子をベクターＤ
ＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡである。さらに本発明
は、上記組み換え体ＤＮＡを宿主微生物のゲノム遺伝子
中に導入した形質転換微生物である。さらに本発明は、
上記形質転換微生物を培地に培養し、培養物より組み込
まれた蛋白質構造遺伝子に対応する蛋白質を採取するこ
とを特徴とする蛋白質の製造法である。上記黄麹菌とし
てはアスペルギルス・オリゼーに属する微生物が挙げら
れる。上記蛋白質構造遺伝子としては、自己または外来
の蛋白質構造遺伝子であって、例えば、アルカリプロテ
アーゼ、中性プロテアーゼＩＩ、β−グルクロニダー
ゼ、ウロキナーゼ等の酵素類、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ
抗原、ヒト血清アルブミン、インターフェロンα、イ
ンターフェロンγ、及びその誘導体の遺伝子等が挙げら
れる。また、宿主細胞としては黄麹菌（アスペルギルス
・オリゼー）が挙げられる。以下、本発明について詳述
する。アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子、該ゲノム
遺伝子のプロモーター、ターミネーターは以下のように
調製する。黄麹菌（アスペルギルス・オリゼー）の菌株
から公知の手法〔例えば、Ｏａｋｌｅｙらの報告 Ｇｅ
ｎｅ，６１，３８５−３９９（１９８７）〕に準じて染
色体ＤＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素によって部
分消化し、ｐＵＣ１９などのプラスミドベクターに導入
した後、宿主微生物〔例えば、大腸菌ＪＭ１０９株，Ｈ
Ｂ１０１株（宝酒造製）など〕を形質転換してジェノミ
ックライブラリーを得る。プローブ（例えば、ｃＤＮＡ
プローブ，合成プローブなど）によるスクリーニングに
よって陽性クローンを得、目的とするプラスミドＤＮＡ
を回収する。プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素によっ
て消化し、ｐＵＣ１９などのプラスミドベクターに導入
して宿主（例えば、大腸菌ＪＭ１Ｏ９株）を形質転換し
目的のクローンを得る。上記プロモーターを含む遺伝子
断片を組み込んだプラスミドとしては、ｐＡＰ０１７
（制限酵素地図は図１参照）が挙げられる。また、ター
ミネーターを含む遺伝子断片を組み込んだプラスミドと
しては、ｐＡＰ０２５（制限酵素地図は図１参照）が挙
げられる。ＤＮＡの塩基配列は公知の方法（例えば、キ
ロシークエンス法、マキサム・ギルバート法、ダイデオ
キシ法）によって解析した。上記の様にして取得、構造
決定された黄麹菌のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝
子は図１の制限酵素地図及び配列番号３の塩基配列を有
し、下記のプロモーター、ターミネーター領域のほか、
３つのイントロン配列を有している（図１中、ＩＶＳ１
〜３と表示）。また、プロモーターは、上記ゲノム遺伝
子の５’側上流域に存在し、１１１０のｂｐのＤＮＡを
有している。その塩基配列を配列番号１に示すが、これ
は配列番号３のゲノム遺伝子の塩基配列塩基番号１
（Ｃ）〜１１１０（Ｃ）に相当するものである。しかし
ながら、この配列番号１に示すもののほか、配列番号１
に示した塩基配列と一部分の塩基配列が異なるＤＮＡ、
上記の塩基配列の一部からなるＤＮＡまたは上記の塩基
配列を少なくとも含んでいるＤＮＡであって、上記プロ
モーターと同等の機能を有するものであってもよい。さ
らに、ターミネーターは上記ゲノム遺伝子が３’側下流
域に存在し、５３０ｂｐのＤＮＡを有している。その塩
基配列を、配列番号２に示すが、これは配列番号３のゲ
ノム遺伝子の塩基配列中塩基番号２４５８（Ｇ）〜２９
８８（Ｇ）に相当するものである。また同様に、配列番
号２に示すもののほか、配列番号２に示した塩基配列と
一部分の塩基配列が異なるＤＮＡ、上記の塩基配列の一
部分からなるＤＮＡまたは上記の塩基配列を少なくとも
含んでいるＤＮＡであって、上記ターミネーターと同等
の機能を有するものであってもよい。そして、本発明に
おいて、上記黄麹菌のアルカリプロテアーゼのゲノム遺
伝子由来のアルカリプロテアーゼプロモーター、目的と
する蛋白質構造遺伝子及び必要により上記黄麹菌のアル
カリプロテアーゼのゲノム遺伝子由来のターミネーター
をベクターＤＮＡに挿入して組み換え体ＤＮＡを得る。
目的とする蛋白質構造遺伝子としては、自己または外来
の蛋白質構造遺伝子であって、先に記載した通りの、ア
ルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼＩＩ、β−グル
クロニダーゼ、ウロキナーゼ等の酵素類、Ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓ Ｂ 抗原、ヒト血清アルブミン、インターフェ
ロンα、インターフェロンγ、及びその誘導体の遺伝子
等が挙げられる。また、ベクターＤＮＡとしては、プラ
スミド、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１
１８（いずれも宝酒造製）等が挙げられる。組み換え体
ＤＮＡの構築は、例えば、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１
９８９年）等記載の方法により行なうことができる。次
に宿主微生物としてのアスペルギルス・オリゼー（ＩＡ
Ｍ ２７２０）を変異誘導して得られたアスペルギルス
・オリゼー１９Ｙ−１１−７等を、前記組み換え体ＤＮ
Ａで例えば、モル．ジェン．ジェネト．（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、第２１８巻、第９９〜１０４頁
（１９８９年）記載の方法により形質転換し、同文献記
載の単離法により単離して、ゲノム遺伝子中に組み換え
体ＤＮＡを含有する形質転換微生物を得る。そして、上
記形質転微生物を培地に培養し、培養物より発現した前
記組み込まれた蛋白質構造遺伝子に対応する蛋白質を採
取するものである。培地としては、例えば糸状菌の培養
に用いられるものであれば如何なるものでも良く、例え
ば、通常製麹原料として使用される大豆、脱脂大豆、グ
ルテンなどの蛋白質原料、米、麦、とうもろこしなどの
炭水化物原料並びに醤油粕、味醂粕、酒粕、ふすま、
糠、フィッシュミールなどの食品産業の副産物などが挙
げられる。これらは、単独でも、併用して用いても良
い。そして、上記糸状菌の培養基原料をそのままもしく
は加水したものを、常法により変性もしくはα化する。
また、必要により、上記培地にＫＨ２ＰＯ４、等の無機
塩類を添加しても良い。更に本発明に用いられる培地の
形態としては、例えば、固体、液体もしくは液固体等の
ものが挙げられる。また、培養法としては、静置培養、
通気培養、攪拌通気培養、振盪培養等の培養法が挙げら
れる。また、培養条件としては、例えば、温度は２０〜
４０℃、好ましくは３０℃前後であり、時間は、２〜１
０時間、好ましくは、４日前後であり、更にｐＨは、５
〜８、好ましくは６前後である。培養物より蛋白質を採
取する方法としては、例えば、酵素の場合には、蛋白
質、酵素の基礎実験法、堀尾武一、山下仁平編集記載の
方法等、その他の蛋白質の場合には、日本生化学会編、
生化学実験講座タンパク質の化学Ｉ分離精製（東京化学
同人）及び「バイオ生産物の分離・精製」バイオテクロ
ノジーシリーズ、福井三郎監修、佐田栄三編（講談社
サイエンティフィク）の記載の方法等を組み合せた方法
等が挙げられる。得られる蛋白質のうち酵素の理化学的
性質は、例えば、アルカリプロテアーゼについては、例
えば、林等、日本農芸化学会誌、第４５巻、第３１０頁
（１９７１頁）に、また、β−グルクロニダーゼについ
ては、例えば、アール．エイ．ジェファーソン（Ｒ．
Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、プラント・モレキュラー・
バイオロジー・リポーター（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）、５
（４），ｐ．３８７〜４０５（１９８７年）に記載され
ている。
カリプロテアーゼのゲノム遺伝子由来のアルカリプロテ
アーゼ プロモーター、蛋白質構造遺伝子をベクターＤ
ＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡである。さらに本発明
は、上記組み換え体ＤＮＡを宿主微生物のゲノム遺伝子
中に導入した形質転換微生物である。さらに本発明は、
上記形質転換微生物を培地に培養し、培養物より組み込
まれた蛋白質構造遺伝子に対応する蛋白質を採取するこ
とを特徴とする蛋白質の製造法である。上記黄麹菌とし
てはアスペルギルス・オリゼーに属する微生物が挙げら
れる。上記蛋白質構造遺伝子としては、自己または外来
の蛋白質構造遺伝子であって、例えば、アルカリプロテ
アーゼ、中性プロテアーゼＩＩ、β−グルクロニダー
ゼ、ウロキナーゼ等の酵素類、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ
抗原、ヒト血清アルブミン、インターフェロンα、イ
ンターフェロンγ、及びその誘導体の遺伝子等が挙げら
れる。また、宿主細胞としては黄麹菌（アスペルギルス
・オリゼー）が挙げられる。以下、本発明について詳述
する。アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子、該ゲノム
遺伝子のプロモーター、ターミネーターは以下のように
調製する。黄麹菌（アスペルギルス・オリゼー）の菌株
から公知の手法〔例えば、Ｏａｋｌｅｙらの報告 Ｇｅ
ｎｅ，６１，３８５−３９９（１９８７）〕に準じて染
色体ＤＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素によって部
分消化し、ｐＵＣ１９などのプラスミドベクターに導入
した後、宿主微生物〔例えば、大腸菌ＪＭ１０９株，Ｈ
Ｂ１０１株（宝酒造製）など〕を形質転換してジェノミ
ックライブラリーを得る。プローブ（例えば、ｃＤＮＡ
プローブ，合成プローブなど）によるスクリーニングに
よって陽性クローンを得、目的とするプラスミドＤＮＡ
を回収する。プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素によっ
て消化し、ｐＵＣ１９などのプラスミドベクターに導入
して宿主（例えば、大腸菌ＪＭ１Ｏ９株）を形質転換し
目的のクローンを得る。上記プロモーターを含む遺伝子
断片を組み込んだプラスミドとしては、ｐＡＰ０１７
（制限酵素地図は図１参照）が挙げられる。また、ター
ミネーターを含む遺伝子断片を組み込んだプラスミドと
しては、ｐＡＰ０２５（制限酵素地図は図１参照）が挙
げられる。ＤＮＡの塩基配列は公知の方法（例えば、キ
ロシークエンス法、マキサム・ギルバート法、ダイデオ
キシ法）によって解析した。上記の様にして取得、構造
決定された黄麹菌のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝
子は図１の制限酵素地図及び配列番号３の塩基配列を有
し、下記のプロモーター、ターミネーター領域のほか、
３つのイントロン配列を有している（図１中、ＩＶＳ１
〜３と表示）。また、プロモーターは、上記ゲノム遺伝
子の５’側上流域に存在し、１１１０のｂｐのＤＮＡを
有している。その塩基配列を配列番号１に示すが、これ
は配列番号３のゲノム遺伝子の塩基配列塩基番号１
（Ｃ）〜１１１０（Ｃ）に相当するものである。しかし
ながら、この配列番号１に示すもののほか、配列番号１
に示した塩基配列と一部分の塩基配列が異なるＤＮＡ、
上記の塩基配列の一部からなるＤＮＡまたは上記の塩基
配列を少なくとも含んでいるＤＮＡであって、上記プロ
モーターと同等の機能を有するものであってもよい。さ
らに、ターミネーターは上記ゲノム遺伝子が３’側下流
域に存在し、５３０ｂｐのＤＮＡを有している。その塩
基配列を、配列番号２に示すが、これは配列番号３のゲ
ノム遺伝子の塩基配列中塩基番号２４５８（Ｇ）〜２９
８８（Ｇ）に相当するものである。また同様に、配列番
号２に示すもののほか、配列番号２に示した塩基配列と
一部分の塩基配列が異なるＤＮＡ、上記の塩基配列の一
部分からなるＤＮＡまたは上記の塩基配列を少なくとも
含んでいるＤＮＡであって、上記ターミネーターと同等
の機能を有するものであってもよい。そして、本発明に
おいて、上記黄麹菌のアルカリプロテアーゼのゲノム遺
伝子由来のアルカリプロテアーゼプロモーター、目的と
する蛋白質構造遺伝子及び必要により上記黄麹菌のアル
カリプロテアーゼのゲノム遺伝子由来のターミネーター
をベクターＤＮＡに挿入して組み換え体ＤＮＡを得る。
目的とする蛋白質構造遺伝子としては、自己または外来
の蛋白質構造遺伝子であって、先に記載した通りの、ア
ルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼＩＩ、β−グル
クロニダーゼ、ウロキナーゼ等の酵素類、Ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓ Ｂ 抗原、ヒト血清アルブミン、インターフェ
ロンα、インターフェロンγ、及びその誘導体の遺伝子
等が挙げられる。また、ベクターＤＮＡとしては、プラ
スミド、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１
１８（いずれも宝酒造製）等が挙げられる。組み換え体
ＤＮＡの構築は、例えば、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１
９８９年）等記載の方法により行なうことができる。次
に宿主微生物としてのアスペルギルス・オリゼー（ＩＡ
Ｍ ２７２０）を変異誘導して得られたアスペルギルス
・オリゼー１９Ｙ−１１−７等を、前記組み換え体ＤＮ
Ａで例えば、モル．ジェン．ジェネト．（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、第２１８巻、第９９〜１０４頁
（１９８９年）記載の方法により形質転換し、同文献記
載の単離法により単離して、ゲノム遺伝子中に組み換え
体ＤＮＡを含有する形質転換微生物を得る。そして、上
記形質転微生物を培地に培養し、培養物より発現した前
記組み込まれた蛋白質構造遺伝子に対応する蛋白質を採
取するものである。培地としては、例えば糸状菌の培養
に用いられるものであれば如何なるものでも良く、例え
ば、通常製麹原料として使用される大豆、脱脂大豆、グ
ルテンなどの蛋白質原料、米、麦、とうもろこしなどの
炭水化物原料並びに醤油粕、味醂粕、酒粕、ふすま、
糠、フィッシュミールなどの食品産業の副産物などが挙
げられる。これらは、単独でも、併用して用いても良
い。そして、上記糸状菌の培養基原料をそのままもしく
は加水したものを、常法により変性もしくはα化する。
また、必要により、上記培地にＫＨ２ＰＯ４、等の無機
塩類を添加しても良い。更に本発明に用いられる培地の
形態としては、例えば、固体、液体もしくは液固体等の
ものが挙げられる。また、培養法としては、静置培養、
通気培養、攪拌通気培養、振盪培養等の培養法が挙げら
れる。また、培養条件としては、例えば、温度は２０〜
４０℃、好ましくは３０℃前後であり、時間は、２〜１
０時間、好ましくは、４日前後であり、更にｐＨは、５
〜８、好ましくは６前後である。培養物より蛋白質を採
取する方法としては、例えば、酵素の場合には、蛋白
質、酵素の基礎実験法、堀尾武一、山下仁平編集記載の
方法等、その他の蛋白質の場合には、日本生化学会編、
生化学実験講座タンパク質の化学Ｉ分離精製（東京化学
同人）及び「バイオ生産物の分離・精製」バイオテクロ
ノジーシリーズ、福井三郎監修、佐田栄三編（講談社
サイエンティフィク）の記載の方法等を組み合せた方法
等が挙げられる。得られる蛋白質のうち酵素の理化学的
性質は、例えば、アルカリプロテアーゼについては、例
えば、林等、日本農芸化学会誌、第４５巻、第３１０頁
（１９７１頁）に、また、β−グルクロニダーゼについ
ては、例えば、アール．エイ．ジェファーソン（Ｒ．
Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、プラント・モレキュラー・
バイオロジー・リポーター（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）、５
（４），ｐ．３８７〜４０５（１９８７年）に記載され
ている。
【発明の効果】黄麹菌のアルカリプロテアーゼのゲノム
遺伝子由来のアルカリプロテアーゼプロモーター及び蛋
白質構造遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを、そのゲノム遺伝子中に含有する微生物を培地
に培養することにより、蛋白質を効率良く得ることがで
きる。従って、本発明は産業上極めて有用である。
遺伝子由来のアルカリプロテアーゼプロモーター及び蛋
白質構造遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを、そのゲノム遺伝子中に含有する微生物を培地
に培養することにより、蛋白質を効率良く得ることがで
きる。従って、本発明は産業上極めて有用である。
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。但し、これら実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。
明する。但し、これら実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。
【実施例１】１．アスペルギルス・オリゼー染色体ＤＮＡの調製 アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡ抽出は、以下
に記した方法で行った。まず、アスペルギルス・オリゼ
ーＡＴＣＣ ２０３８６株をスラントから一白金耳と
り、５０ｍｌのＹＰＳ培地（１％イーストエクストラク
ト、２％バクトペプトン、２％可溶性でんぷん）に植菌
し、３０℃で２日間培養した。この培養液をさらに３Ｌ
の三角フラスコに５００ｍｌのＹＰＳ培地を入れたもの
に接種し、３０℃で一昼夜培養した。集菌は３枚に重ね
たガーゼで濾過することにより行い、集めた菌体は２０
ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液で２回洗浄した。さ
らに抽出バッファー溶液（１００ｍＭトリス−塩酸、ｐ
Ｈ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ラウリル硫酸ナト
リウム）で１回洗浄後、濾紙で水分を除去した。この湿
菌体と同重量の滅菌済海砂Ｂ（ナカライテスク社製）を
混合し、冷却した乳ばちで約５分間すりつぶした。６０
ｍｌの抽出バッファー溶液（前記組成）を添加し、さら
に約５分間すりつぶした。すりつぶした菌体を遠心管に
入れて遠心分離し、上清を滅菌した新しい遠心管に移し
た。この上清に最終濃度５μｇ／ｍｌになるようにＲＮ
ａｓｅＡ（シグマ社製）を添加し、６０℃で２０分間反
応させた。１／６倍容の３Ｍ酢酸カリウム溶液を添加
し、室温で１５分間放置後、遠心分離し、上清を滅菌し
た新しい遠心管に移した。同容積のＴＥ飽和フェノール
（同体積の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸）１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，ｐＨ８．０溶液で平衡化させたもの）で２回抽
出し、さらに同容積のエーテルで３回抽出した。抽出後
の溶液に２倍容のエタノールを界面を乱さないようにゆ
っくりと添加し、界面に生じた染色体ＤＮＡをパスツー
ルピペットでまき取った。まき取ったＤＮＡは７０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノールの順
にリンスし、乾燥後、ＴＥバッファー溶液（１０ｍＭ
トリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解
した。２．プローブの合成 一般に、ｃＤＮＡを用いてそのジェノミック遺伝子をク
ローニングする場合、ｃＤＮＡ自体をプローブにしてハ
イブリダイゼーションする場合が多い。ところが目的の
遺伝子がファミリーを形成している場合や、偽遺伝子を
有している場合には、ｃＤＮＡをプローブとして用いる
とその特異性が低くなってしまう。そこでアルカリプロ
テアーゼ遺伝子のクローニングには、ｃＤＮＡの配列
（特願昭６３−１７００１８号）のうち、５’側と３’
側の非翻訳領域を基にした合成オリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いた。合成したオリゴヌクレオチドの配
列を以下に示す。 ＡＰ−２３；５’＞ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＴＣＧＧＡＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＜
３’ ＡＰ−２４；５’＞ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＡＧＴ
ＡＴＡ ＣＴＴ ＡＴＧＧＴＡ ＧＴＡ ＧＴＣ＜３’ ＡＰ−２３は、アルカリプロテアーゼｃＤＮＡ（特願昭
６３−１７００１８号）の５’側非翻訳領域の配列を基
に設計した３０塩基長（ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチド
で、ＡＰ−２４は３’側非翻訳領域の配列を基に設計し
た３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。これらのオ
リゴヌクレオチドは製造業者により指示された試薬と方
法を用いて、ＤＮＡ合成機（３８１Ａ）（アプライド
バイオシステム社製）で合成した。合成オリゴヌクレオ
チドの放射性標識は［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム
社製）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）を
用いて行った。３．サザーン ハイブリダイゼーション 前項で作製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用
い、アスペルギルス・オリゼーＡＴＣＣ２０３８６株の
染色体ＤＮＡに対し、サザーン ハイブリダイゼーショ
ン法によって、アルカリプロテアーゼ遺伝子の解析を行
った。まず、アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡ
をいくつかの制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲ
Ｉなど）で消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し
た。泳動後、サザーン トランスファー法により、ＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターにブロッティングし
た。サザーン トランスファー法としては、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．
（１９８２））に従った。ハイブリダイゼーションは、
６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン
酸三トナリウム）、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム、
５×デンハルツ溶液（０．１％フィコール、０．１％ポ
リビニルビロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、
０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００μｇ／ｍ
ｌトランスファーＲＮＡの溶液中で４２℃で行った。プ
ローブは、約１．０×１０７ｃｐｍ／ｍｌの濃度で添加
した。洗浄は６×ＳＳＣ、０．５％ラウリル硫酸ナトリ
ウムの溶液を用い、４５℃で３回行った。フィルターを
風乾後、−８０℃でＸ線フィルム（富士フィルム製 Ｒ
Ｘ）にかけ、オートラジオグラフ像を得た。その結果、
ＡＰ−２３，ＡＰ−２４の両プローブともアスペルギル
ス・オリゼー染色体制限酵素消化物に対し、単一で明瞭
なバンドが得られた。４．ライブラリーの作製 前項のサザーン ハイブリダイゼーションの結果、ＡＰ
−２３プローブを用いた場合、アスペルギルス・オリゼ
ー染色体ＤＮＡのＢａｌＩＩ消化物に対し、約６．５ｋ
ｂのバンドが見られ、ＡＰ−２４ではＨｉｎｄＩＩＩ消
化物に対し、約４．５ｋｂのバンドが見られた。Ｂｇｌ
ＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩは、アルカリプロテアーゼｃＤ
ＮＡ中に存在する制限酵素であるため、両制限酵素ＤＮ
Ａ断片をクローニングすることで、アルカリプロテアー
ゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニングできると考えられ
る。そこで、これらの制限酵素を用いたアスペルギルス
・オリゼーのジェノミックライブラリーを作製した。ま
ず、第１項で調製したアスペルギルス・オリゼーの染色
体ＤＮＡ約２００μｇを５００ｕｎｉｔのＢｇｌＩＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造製）で３７℃、一夜消化
し、０．８％のアガロースゲル電気泳動（３０Ｖで一
夜）を行い、同時に泳動した分子量マーカーのサイズを
基に、ＢｇＩＩＩ消化物に対しては５．０〜７．０ｋｂ
（キロベース）の大きさのＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ消化物に対しては３．０〜５．０ｋｂのＤＮＡの断片
をそれぞれ抽出、精製した。アガロースゲルからの抽出
精製は、Ｍａｎｉａｔｉｓ（前述）の方法を用いて行う
ことができる。−方、ベクターとしてはｐＵＣ１９を用
い、ＢｇｌＩＩと同じ平滑末端を生じるＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アルカリフォスファターゼ
（宝酒造製）で末端を脱リン酸化して、セルフライゲー
ションを防止した。前記のＢｇｌＩＩ消化物の５．０〜
７．０ｋｂ ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩ消化したｐＵＣ１
９、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物の３．０〜５．０ｋｂ ＤＮ
Ａ断片とＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＵＣ１９をそれぞれ
混合し、“ライゲーションキット（宝酒造製）”により
ライゲーションを行い、その混合物を用いて大腸菌ＨＢ
１０１株のコンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し
た。形質転換した大腸菌は、その一部は形質転換頻度測
定のためにＬ寒天培地（１％トリプトン、０．５％イー
ストエクストラクト、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に
プレーティングを行い、残りはさらに５０倍容のＬ−ブ
ロス（１％トリプトン、０．５％イーストエクストラク
ト、１％ＮａＣｌ）を添加し、３７℃で一夜培養してコ
ロニーを増幅させた後、アスペルギルス・オリゼー ジ
ェノミックライブラリーとして−８０℃で保存した。５．コロニー ハイブリダイゼーション コロニー ハイブリダイゼーションは以下に示した様に
行った。まず、アスペルギルス・オリゼー ジェノミッ
クライブラリーを、直径１５０ｍｍプレートあたり約１
０，０００クローンになるようにブレーティングし、３
７℃で一夜培養した。プレートの培地には５０μｇ／ｍ
ｌの濃度でアンピシリンを添加したＬ寒天培地を用い
た。培養後、ナイロンフィルター（ＮＥＮ製Ｃｏｌｏｎ
ｙ／Ｐｌａｑｕｅ Ｓｃｒｅｅｎ）を寒天の上から静か
に乗せてコロニーをナイロンフィルターに移した。コロ
ニーを移したナイロンフィルターは０．５Ｎ ＮａＯＨ
に浸して溶菌、ＤＮＡを変性させた後、１Ｍトリスー塩
酸（ｐＨ７．５）溶液に浸して中和し、乾燥させて変性
したＤＮＡを固定した。ハイブリダイゼーションは、作
製したフィルターをビニールバックに入れ、サザーンハ
イブリダイゼーションの場合と同じ条件で行った。その
結果、ＡＰ−２３及びＡＰ−２４の両ブローブともハイ
ブリダイズするクローンがいくつか得られた。これらの
クローンよりアルカリ−ＳＤＳ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、
前述）にてプラスミドＤＮＡを抽出し、ジデオキシ法に
よって塩基配列を決定したところアルカリプロテアーゼ
のｃＤＮＡ配列と一致した。 ＡＰ−２３プローブとハイブリダイズする約６．５ｋｂ
の ＢｇｌＩＩ断片を含むプラスミドをｐＡＰＯ１７、
ＡＰ−２４プローブとハイブリダイズする約４．５ｋｂ
のＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を含むプラスミドをｐＡＰＯ２
５として以下解析を進めた。６．アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の取得及びＤ
ＮＡ配列の決定 前項で得たｐＡＯ１７及びｐＡＰＯ２５について、いく
つかの制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動によ
り断片パターン観察することによりそれらの制限酵素断
片地図を作製した。その結果を図１に示す。両プラスミ
ドが含んでいた遺伝子断片は、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌ
ＩＩ部位の間で重複しており、両プラスミドでアルカリ
プロテアーゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニングでき
た。そこで配列番号１に示す様に適当な制限酵素部位を
使ってＤＮＡ配列の決定を行った。ＤＮＡ配列の決定法
としてはジデオキシ法を用い、その反応は“Ｍ１３シー
クエンスキット”（宝酒造製）、ポリアクリルアミド電
気泳動は“ＤＮＡ塩基配列分析用電気泳動装置”（宝酒
造製）を用いて行った。得られたジェノミック遺伝子の
塩基配列と、アルカリプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列
（特願昭６３−１７００１８号）を比較し、アルカリプ
ロテアーゼ遺伝子遺伝子にはそのプレプロ領域に１箇
所、成熟蛋白質領域に２箇所の計３箇所のイントロン配
列が存在している事が分った。７．転写開始点の決定 クローニングしたアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモ
ーター領域を解析するため、転写開始点の決定を行っ
た。転写開始点の決定には、Ｓ１マッピッグ法やプライ
マー エクステンション法があるが、本実験ではプライ
マー エクステンション法で行った。プライマーとして
は、アルカリプロテアーゼ蛋白の１２番目から１７番目
（プレ領域内）のアミノ酸をコードしているＤＮＡの逆
鎖を基に合成したオリゴヌクレオチドを用いた。以下に
その配列を示す。 ＡＰ−２６；５’＞ＣＧＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＡＴ
ＡＧＣ ＴＣＣ＜３’ ＡＰ−２６の配列をアプライド バイオシステム社製
“ＤＮＡ合成機（３８１Ａ）”で合成した。合成したオ
リゴヌクレオチドの精製は、アプライド バイオシステ
ム社製“オリゴヌクレオチド精製カートリッジ”を用い
た。ＡＰ−２６の末端ラベリングは［γ−３２Ｐ］ＡＴ
ＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて行った。反
応は５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０），１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）の溶液中で３７℃，１時間反応させた。ラベルに用
いられなかった［γ−３２Ｐ］ＡＴＰは、“ＮＥＮＳＯ
ＲＢＴＭ２０”カラム（ＮＥＮ製）を使って除去し、以
上の操作で１μｇＤＮＡ当り約１０７ｃｐｍの放射活性
を持つオリゴヌクレオチドが得られた。次に、アルカリ
プロテアーゼｃＤＮＡのクローニングの際に鋳型として
用いたｍＲＮＡ（特願昭６３−１７００１８号）約３μ
ｇと３２Ｐでラベルした上記プライマーＡＰ−２６約１
０ｎｇを混合して６μｌとし、それに１μｌの１０×逆
転写酵素用バッファー（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．
０、５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）を
添加し、７０℃で５分間加熱処理後、室温で２０分間放
置し、プライマーとｍＲＮＡのアニーリングを行った。
次にこの溶液に１０ｍＭ ＤＴＴ １μｌ、２０ｍＭ
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの
等モル混合物）、リボヌクレアーゼインヒビター（１１
７ｕｎｉｔｓ／μｌ，宝酒造製）０．５μｌ、逆転写酵
素（宝酒造製２２ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌを添加
し、４２℃で１時間反応させた後、ホルムアミド溶液
（９５％ホルムアミド、０．１キシレンシアノール、
０．１％ブロムフェノールブルー）１０μｌを添加して
反応を停止した。次に上記で得られた反応液１〜３μｌ
を、６％アクリルアミド−尿素ゲルにアプライした。同
時に、ｐＡＰＯ１７を鋳型とし、ＡＰ−２６をプライマ
ーとしてジデオキシ反応させた液をサイズマーカーとし
て同じゲルに泳動した。この結果、プライマー エクス
テンションした反応液ではバンドが３本見られ、アルカ
リプロテアーゼ遺伝子の転写開始点は３箇所存在する事
がわかった。その結果を配列番号３に示す。決定した最
上流の転写開始点の３０〜４０塩基上流に、いわゆるＴ
ＡＴＡボックスと考えられる配列はＴＡＴＡＡＡＴが存
在しており、８０〜９０塩基上流には、ＣＡＡＴボック
スと考えられる配列ＣＣＡＡＡＴが存在している。８．アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の連結 ２つのＤＮＡ断片（ｐＡＰＯ１７，ｐＡＰＯ２５）にク
ローニングされたアルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を
連結するために図２に示した操作を行った。まず、約５
０μｇのｐＡＰＯ１７をＮｃｏＩ（宝酒造製）で消化
後、“ＤＮＡブランティングキット”（宝酒造製）を用
いて平滑末端化した。この消化断片にＢａｍＨＩリンカ
ー（宝酒造製）５μｇを混合し、“ＤＮＡライゲーショ
ンキット”（宝酒造製）を用いて両者をライゲーション
し、エタノール沈澱でＤＮＡを精製後、ＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造製）で消化した。このＤＮＡ
混合物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ア
ルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の５’側を含む約１２
００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。ゲル
からのＤＮＡ回収法は、前述のＭａｎｉａｔｉｓらの方
法で行うことができる。一方、ｐＡＰ０２５は、約５０
μｇをＰｓｔＩ（宝酒造製）を消化後、“ＤＮＡブラン
ティングキット”（宝酒造製）で平滑末端にし、同様に
ＢａｍＨＩリンカー５μｇを混合して“ＤＮＡライゲー
ションキット”（宝酒造製）を用いてライゲーションし
た。ライゲーション後、エタノール沈澱により精製し、
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このＤＮ
Ａ消化物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、
アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の３’側を含む約１
８００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。前
述のアルカリプロテアーゼ５’側ＤＮＡ断片（約１２０
０ｂｐ，ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片）と３’側Ｄ
ＮＡ断片（約１８００ｂｐ，ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片）をそれぞれ約３μｇずつ混合し、“ＤＮＡライ
ゲーションキット”によりライゲーション後、ＢａｍＨ
Ｉで消化した。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル電
気泳動で分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片（約３ｋｂ
ｐ）を回収、精製した。このアルカリプロテアーゼゲノ
ム遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化した ｐ
ＵＣ１９と混合してライゲーション後、大腸菌ＪＭ１Ｏ
９株コンピテントセル（宝酒造製）に導入し、アンピシ
リン耐性を獲得した形質転換株をスクリーニングするこ
とで目的のプラスミドｐＡＰ１７２５を有するクローン
を得た。ｐＡＰ１７２５は、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部
位に、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子（約３ｋｂ
ｐ）が挿入されたＤＮＡである。９．発現ベクターの作製 アルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター、ターミネ
ーターを用いた発現ベクターの作製は図３に示した手順
に従って行った。まず、ターミネーター領域を単離する
ため、約１０μｇのｐＡＰ０２５をＡｆｌＩＩ（宝酒造
製）で消化後、“ＤＮＡブランティングキット（宝酒造
製）を用いて切断箇所を平滑末端化した。エタノール沈
澱により精製した後、さらにＰｓｔＩ（宝酒造製）で消
化し、１％アガロースゲル電気泳動により消化断片を分
離した。このうちアルカリプロテアーゼのターミネータ
ー領域のＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）をアガロースゲル
より抽出、精製した。一方、ベクターとなるｐＵＣ１９
をＰｓｔＩおよびＨｉｎｃＩＩ（宝酒造製）で消化後、
アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で切断点を脱リ
ン酸化させた。この切断したベクター（約１００ｎｇ）
と前述のターミネーターＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）を
混合し、“ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）で
ライゲーションし、その混合物で大腸菌 ＪＭ１０９株
（宝酒造製）を形質転換した。アンピシリン耐性を獲得
したクローンから、プラスミドＤＮＡを抽出してスクリ
ーニングを行い、目的のプラスミドｐＡＰ０４４ １０
μｇを得た。次にプロモーター領域を単離するため、
約１０μｇのｐＡＰ０１７をＮｃｏＩ（宝酒造製）で消
化後“ＤＮＡブランティングキット”を用いて切断箇所
を平滑末端化した。エタノール沈澱後、 ＥｃｏＲＩリ
ンニカー（宝酒造製）２μｇと混合し“ＤＮＡライゲー
ションキット”を用いてライゲーションした。ライゲー
ションしたＤＮＡ混合物をＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩ
（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉＯｌａｂ 社製）で消化
し、１％アガロースゲル電気作動により消化断片を分離
した。分離したＤＮＡ断片のうち、アルカリプロテアー
ゼ プロモーター領域を含むＤＮＡ断片（約１１００ｂ
ｐ）をアガロースゲルより抽出、精製した。次に、ター
ミネーター領域をサブクローニングしたプラスミドｐＡ
Ｐ０４４約１０μｇをＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ（宝酒
造製）で消化後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸
化したもの（約１００ｎｇ）と前記のプロモーター断片
（約１１００ｂｐ，約１００ｎｇ）を混合し“ＤＮＡラ
イゲーションキット”によりライゲーションし、大腸菌
ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたアンピシリン
耐性株からプラスミドＤＮＡを抽出してスクリーニング
を行い、目的のプラスミドｐＡＰ０４５ １０ μｇを
得た。ｐＡＰ０４５はアルカリプロテアーゼのプロモー
ター、ターミネーターが連結されたプラスミドで、単一
認識部位であるＢａｍＨＩ部位に異種遺伝子を挿入する
事で発現させうるベクターである。 １０．アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテ
アーゼプロモーターによりアスペルギルス・オリゼー中
で蛋白質生成物を発現させるように設計した発現ベクタ
ーの構築 この実施例では、プラスミドをアルカリプロテアーゼプ
ロモーター、及びターミネーター配列の制御下にβ−グ
ルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳと略称する。）を発現す
るように設計して構築した。 ・前記項目９で構築され、アルカリプロテアーゼプロモ
ーター及びターミネーターが連結された組み換え体プラ
スミドｐＡＰＯ４５からのＧＵＳ発現ベクターの作製は
図４に示した手順に従って行った。先ず、組み換え体プ
ラスミドｐＢＩ２２１〔ＧＵＳ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏ
ｎＳｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．東洋
紡社より入手）〕からＧＵＳフラグメントを単離するた
めに組み換え体プラスミドｐＢＩ２２１（約５７００ｂ
ｐ）１０μｇを制限酵素 ＳｍａＩ（宝酒造製）及びＳ
ａｃＩ（宝酒造製）により消化したのち、“ＤＮＡブラ
ンティングキット”（宝酒造製）を用いて切断箇所を平
滑末端化した。エタノール沈澱により精製したのち、１
％アガロースゲル電気泳動により消化断片を分離した。
このうちＧＵＳフラグメントのＤＮＡ断片（約１９００
ｂｐ）をアガロースゲルより抽出、精製した。一方、ア
ルカリプロテアーゼ プロモーター及びターミネーター
領域を含む組み換え体プラスミドｐＡＰＯ４５ １０
μｇ をＳｍａＩを用い、消化後、アルカリフォスファ
ターゼ（宝酒造製）を用い切断点を脱リン酸化させた。
この切断したプラスミド （約１００ｎｇ）及び前述の
ＧＵＳフラグメントＤＮＡ断片（約１００ｎｇ）を混合
し、“ＤＮＡライゲーションキット”（宝酒造製）を用
いライゲーションし、その混合物で大腸菌ＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換した。アンピシリン耐性を獲得
したクローンから、組み換え体プラスミドＤＮＡを抽出
してスクリーニングを行ない組み換え体プラスミドｐＡ
ＰＯ６９（約６９００ｂｐ）１０μｇを得た。次に、こ
のｐＡＰ０６９にマーカー遺伝子として硝酸塩資化性遺
伝子ｎｉａＤを連結した。すなわち、プラスミドｐＳＴ
Ａ１４（約１１０００ｂｐ）〔Ｓ．Ｅ・Ｕｎｋｌｅｓ
ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ Ｖｏｌ．２１８ Ｐ
９９〜１０４（１９８９）〕を ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒
造製）で消化し、エタノール沈澱により精製したのち、
１％アガロース電気泳動法により消化断片を分離した。
このようにしてｎｉａＤを含むＤＮＡ断片（約５５００
ｂｐ）を得、これを前記組み換え体プラスミドｐＡＰ０
６９のＨｉｎｄＩＩＩ消化物をアルカリフォスファター
ゼ（宝酒造製）により切断点を脱リン酸化したベクター
と混合して“ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）
でライゲーションし、その混合物で大腸菌ＪＭ１０９株
（宝酒造製）を形質転換した。アンピシリン耐性を獲得
したクローンから、プラスミドＤＮＡ抽出してスクリー
ニングを行ない目的の組み換え体プラスミドｐＡＰ０７
０及びｐＡＰ０７１（いづれも約１２４００ｂｐ）１０
μｇを得た。組み換え体プラスミドｐＡＰ０７０及びｐ
ＡＰ０７１は、アルカリプロテアーゼ プロモーター及
びターミネーターの間にｎｉａＤ遺伝子断片（約５５０
０ｂｐ）が挿入されたものであるが、ｎｉａｄ遺伝子断
片の向きが夫々逆に組み換え体プラスミドｐＡＰ０６９
に連結されたものである。１１．アスペルギルス・オリゼーの形質転換 Ａ．ｏｒｙｚａｅ（ＩＡＭ ２７２０）の胞子懸濁液を
適当に滅菌水で希釈し、ＫＣｌＯ３（４７０ｍＭ）を含
有する最小培地のＮ源をグルタミン酸ソーダ（１０ｍ
Ｍ）を添加した培地にプレートして３０℃で３〜７日間
培養した。ここで出現したコロニーを最小培地（Ｎ源グ
ルタミン酸ソーダ１０ｍＭ）に植え換えて、この培地で
３０℃で、３〜７日培養する。そして、グルタミン酸ソ
ーダを添加した培地では生育するが、硝酸ソーダを添加
した培地では生育できない株を、硝酸塩資化能欠損（ｎ
ｉａＤ−）株として選択、分離する。本発明では、この
株をＡ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−１１−７と略記する。 Ａ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−１１−７（ｎｉａＤ−）株
を試験管のスラント培地（米麹汁寒天培地）に接種し、
室温で分生胞子の着生が充分になるまで培養し、分生胞
子を得た。次に、この分生胞子を、１×１０７個／ｍｌ
となるように、０．０１％ソルビタン脂肪酸エステル溶
液［ソルゲン ＴＷ−６０（第一工業製薬社製）〕に分
散懸濁した。次に、この分生胞子の分散懸濁液１ｍｌ
を、液体栄養培地［下記のポリペプトン・デキストリン
培地（ｐＨ６．０）］ デキストリン ２％ ポリペプトン １．０％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．５％ ＮａＮＯ３ ０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％ カザミノ酸 ０．１％ ｐＨ ５．５〜６．０ 水道水で調整 ３０ｍｌに接種し、１５０ｍｌ容三角フラスコ内で、３
０℃で、１６〜２４時間振盪培養し、菌糸懸濁液を得、
該懸濁液は更に遠心分離（４５００ｇ、２０分）して、
そこから麹菌体を分離した。次に、こうして得られた麹
菌体は充分水洗浄したのち、これに細胞壁溶解酵素５ｍ
ｌを加え、３０℃で４５分間、ゆるく振盪（毎分５０〜
６０往復）して、Ａ．ｏｒｙｚａｅ １９ Ｙ−１１−
７（ｎｉａＤ−）株のプロトプラストを得た。ここに用
いた細胞壁溶解酵素は、市販のノボザイム２３４（ノボ
・インダストリー社製）を溶液１ｍｌに８ｍｇ溶解し得
られたものである。次に、このようにして得たプロトプ
ラストをＧ−３規格のガラスフィルターにより分離し、
これを高張液（０．８Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１
０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ５．８）で洗浄し、洗浄プ
ロトプラストを得た。次いで、上記高張液にて５ｍｌの
懸濁液とし、これに４倍量の高張液〔１．２Ｍソルビ
トール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、 １０ｍＭ トリス・
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））を添加し、２，０００ｒ．
ｐ．ｍ．で５分間遠心分離し、プロトプラストを洗浄し
た。この洗浄操作を３回行なった。次に、プロトプラス
トを上記高張液中に最終濃度１〜２×１０８／ｍｌと
なるように再懸濁する。この１００μｌの懸濁液を１．
５ｍｌプラスチック製試験管に入れ、前記方法で調製し
たＤＮＡベクター「ｐＡＰ０７０及びｐＡＰ０７１」ま
たは同「ｐＡＰ０７８」のいずれかのＤＮＡ１〜１０μ
ｇ（総容量：ＴＥバッファー溶液１０μｌ中）を添加
し、ＰＥＧ〔５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０（シグ
マ社製）〕５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ、ｐＨ７．５の溶液１２．５μｌを添加し、静か
に攪拌し、氷温にて２０分間インキュベートする。次い
で、前記ＰＥＧ溶液１ｍｌを加えて２秒間ゆるやかに撹
拌して、すぐに前記高張液を２ｍｌ加える。以上のよ
うにして形質転換を行う。形質転換操作の終了したプロ
トプラスト懸濁液を１．２Ｍソルビトールを含む再生最
少培地（Ｎ源は、硝酸ナトリウム）に重層して培養す
る。ＤＮＡベクターｐＡＰ０７１で形質転換された本発
明のアスペルギルス・オリゼー形質転換体はアスペルギ
ルス・オリゼー１１−７−Ｇ７１−１０１として工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２１１１号
として寄託している。次に、このようにして形質転換さ
れたプロトプラスト懸濁液全量を、０．８ＭＫＣｌ、１
０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ，ｐＨ
７．５溶液６ｍｌ混和希釈し、７００ｇで５分間遠心分
離する。更に、分離された形質転換体のプロトプラスト
に同容量の上記希釈液を加え、遠心分離して、洗浄され
たものを得る。次に、洗浄された形質転換体のプロトプ
ラストを１ｍｌの上記希釈液に懸濁し、この１０μｌ〜
１００μｌを、０．６Ｍ ＫＣｌを含む最小培地（Ｎ源
硝酸ソーダ１０ｍＭ、２．０％寒天）にプレートする。
またその上に同培地（但し、０．５％寒天）を重層す
る。次いで３０℃にて３〜１０日間培養する。ｎｉａＤ
＋及びＤＮＡベクターｐＡＰ０７０、ｐＡＰ０７１及び
同ｐＡＰ０７８由来の他のＤＮＡをとりこんだ形質転換
体は、最小培地＋ＫＣｌ（塩化カリウムはプロトプラス
トが破裂するのを防ぐのに必要である）上で増殖する。
未変化の細胞、未変化のプロトプラスト、形質転換体、
および復帰突然変異体を含むあらゆる生存可能な細胞及
びプロトプラストは、最小培地＋アルギニン＋ＫＣｌ上
で増殖する。かかる増殖培地により、生存可能な物質の
生存率を調べることができる。これらの実験において１
０８／ｍｌのうち、上記アルギニンを含む培地で生存可
能な物質の生育できた割合は３０％以上であった。最小
培地＋アルギニン上では、汚染された非プロトプラスト
物質のみが増殖する。この様な非浸透圧感受性細胞での
汚染は、本実験においては１％未満であった。１２．アスペルギルス・オリゼーにおけるＧＵＳの発現 前記形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ １１−７−Ｇ７１−
１０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１１１）のＧＵＳ発現を以
下のようにして調べた。すなわち、ふすま粉末２％、脱
脂大豆粉末０．５％及びＫＨ２ＰＯ４０．１％（ｐＨ
６．５）からなる液体培地１５ｍｌに、形質転換体Ａ．
ｏｒｙｚａｅ １１−７−Ｇ７１−０１を接種して３０
℃で７２時間振盪培養した。該培養物を濾過して培養濾
過と菌体を分別した。菌体を冷却しながらバイオ・ミキ
サー（日本精機社製）で１分間破砕したのち、遠心分離
して菌体内上清液を得た。これら培養濾過と菌体内上清
液についてＧＵＳ発現の有無をウェスタンブロット法に
従って調べたところ、菌体内上清にＧＵＳ抗体とクロス
する蛋白質が認められ、形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ１
１−７−Ｇ７１−１０１にＧＵＳ発現が認められた。
尚、培養濾液にはＧＵＳ抗体とクロスする蛋白質は認め
られず、形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ １１−７−Ｇ７
１−１０１の培養液中にはＧＵＳの分泌発現は認められ
なかった。また、宿主元株Ａ．０ｒｙｚａｅ１９Ｙ−１
１−７を同様に培養して培養濾液と菌体内上清液につい
てＧＵＳ発現の有無を同様に調べたところ、宿主元株
Ａ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−１１−７には、ＧＵＳ発現
は全く認められなかった。前記形質転換体Ａ．ｏｒｙｚ
ａｅ １１−７−Ｇ７１−１０１の菌体上清液１００μ
ｌを用いてＧＵＳ発現量をｐ−ニトログルクロニドと反
応させてＧＵＳ発現量をＧＵＳ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＵＳｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．東
洋紡社より入手）に記載の方法により調べたところその
ＧＵＳ発現量は約１ｍｇ／Ｌブロス（ｂｒｏｔｈ）と算
出された。
に記した方法で行った。まず、アスペルギルス・オリゼ
ーＡＴＣＣ ２０３８６株をスラントから一白金耳と
り、５０ｍｌのＹＰＳ培地（１％イーストエクストラク
ト、２％バクトペプトン、２％可溶性でんぷん）に植菌
し、３０℃で２日間培養した。この培養液をさらに３Ｌ
の三角フラスコに５００ｍｌのＹＰＳ培地を入れたもの
に接種し、３０℃で一昼夜培養した。集菌は３枚に重ね
たガーゼで濾過することにより行い、集めた菌体は２０
ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液で２回洗浄した。さ
らに抽出バッファー溶液（１００ｍＭトリス−塩酸、ｐ
Ｈ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ラウリル硫酸ナト
リウム）で１回洗浄後、濾紙で水分を除去した。この湿
菌体と同重量の滅菌済海砂Ｂ（ナカライテスク社製）を
混合し、冷却した乳ばちで約５分間すりつぶした。６０
ｍｌの抽出バッファー溶液（前記組成）を添加し、さら
に約５分間すりつぶした。すりつぶした菌体を遠心管に
入れて遠心分離し、上清を滅菌した新しい遠心管に移し
た。この上清に最終濃度５μｇ／ｍｌになるようにＲＮ
ａｓｅＡ（シグマ社製）を添加し、６０℃で２０分間反
応させた。１／６倍容の３Ｍ酢酸カリウム溶液を添加
し、室温で１５分間放置後、遠心分離し、上清を滅菌し
た新しい遠心管に移した。同容積のＴＥ飽和フェノール
（同体積の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸）１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，ｐＨ８．０溶液で平衡化させたもの）で２回抽
出し、さらに同容積のエーテルで３回抽出した。抽出後
の溶液に２倍容のエタノールを界面を乱さないようにゆ
っくりと添加し、界面に生じた染色体ＤＮＡをパスツー
ルピペットでまき取った。まき取ったＤＮＡは７０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノールの順
にリンスし、乾燥後、ＴＥバッファー溶液（１０ｍＭ
トリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解
した。２．プローブの合成 一般に、ｃＤＮＡを用いてそのジェノミック遺伝子をク
ローニングする場合、ｃＤＮＡ自体をプローブにしてハ
イブリダイゼーションする場合が多い。ところが目的の
遺伝子がファミリーを形成している場合や、偽遺伝子を
有している場合には、ｃＤＮＡをプローブとして用いる
とその特異性が低くなってしまう。そこでアルカリプロ
テアーゼ遺伝子のクローニングには、ｃＤＮＡの配列
（特願昭６３−１７００１８号）のうち、５’側と３’
側の非翻訳領域を基にした合成オリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いた。合成したオリゴヌクレオチドの配
列を以下に示す。 ＡＰ−２３；５’＞ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＴＣＧＧＡＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＜
３’ ＡＰ−２４；５’＞ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＡＧＴ
ＡＴＡ ＣＴＴ ＡＴＧＧＴＡ ＧＴＡ ＧＴＣ＜３’ ＡＰ−２３は、アルカリプロテアーゼｃＤＮＡ（特願昭
６３−１７００１８号）の５’側非翻訳領域の配列を基
に設計した３０塩基長（ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチド
で、ＡＰ−２４は３’側非翻訳領域の配列を基に設計し
た３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。これらのオ
リゴヌクレオチドは製造業者により指示された試薬と方
法を用いて、ＤＮＡ合成機（３８１Ａ）（アプライド
バイオシステム社製）で合成した。合成オリゴヌクレオ
チドの放射性標識は［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム
社製）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）を
用いて行った。３．サザーン ハイブリダイゼーション 前項で作製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用
い、アスペルギルス・オリゼーＡＴＣＣ２０３８６株の
染色体ＤＮＡに対し、サザーン ハイブリダイゼーショ
ン法によって、アルカリプロテアーゼ遺伝子の解析を行
った。まず、アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡ
をいくつかの制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲ
Ｉなど）で消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し
た。泳動後、サザーン トランスファー法により、ＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターにブロッティングし
た。サザーン トランスファー法としては、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．
（１９８２））に従った。ハイブリダイゼーションは、
６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン
酸三トナリウム）、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム、
５×デンハルツ溶液（０．１％フィコール、０．１％ポ
リビニルビロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、
０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００μｇ／ｍ
ｌトランスファーＲＮＡの溶液中で４２℃で行った。プ
ローブは、約１．０×１０７ｃｐｍ／ｍｌの濃度で添加
した。洗浄は６×ＳＳＣ、０．５％ラウリル硫酸ナトリ
ウムの溶液を用い、４５℃で３回行った。フィルターを
風乾後、−８０℃でＸ線フィルム（富士フィルム製 Ｒ
Ｘ）にかけ、オートラジオグラフ像を得た。その結果、
ＡＰ−２３，ＡＰ−２４の両プローブともアスペルギル
ス・オリゼー染色体制限酵素消化物に対し、単一で明瞭
なバンドが得られた。４．ライブラリーの作製 前項のサザーン ハイブリダイゼーションの結果、ＡＰ
−２３プローブを用いた場合、アスペルギルス・オリゼ
ー染色体ＤＮＡのＢａｌＩＩ消化物に対し、約６．５ｋ
ｂのバンドが見られ、ＡＰ−２４ではＨｉｎｄＩＩＩ消
化物に対し、約４．５ｋｂのバンドが見られた。Ｂｇｌ
ＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩは、アルカリプロテアーゼｃＤ
ＮＡ中に存在する制限酵素であるため、両制限酵素ＤＮ
Ａ断片をクローニングすることで、アルカリプロテアー
ゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニングできると考えられ
る。そこで、これらの制限酵素を用いたアスペルギルス
・オリゼーのジェノミックライブラリーを作製した。ま
ず、第１項で調製したアスペルギルス・オリゼーの染色
体ＤＮＡ約２００μｇを５００ｕｎｉｔのＢｇｌＩＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造製）で３７℃、一夜消化
し、０．８％のアガロースゲル電気泳動（３０Ｖで一
夜）を行い、同時に泳動した分子量マーカーのサイズを
基に、ＢｇＩＩＩ消化物に対しては５．０〜７．０ｋｂ
（キロベース）の大きさのＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ消化物に対しては３．０〜５．０ｋｂのＤＮＡの断片
をそれぞれ抽出、精製した。アガロースゲルからの抽出
精製は、Ｍａｎｉａｔｉｓ（前述）の方法を用いて行う
ことができる。−方、ベクターとしてはｐＵＣ１９を用
い、ＢｇｌＩＩと同じ平滑末端を生じるＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アルカリフォスファターゼ
（宝酒造製）で末端を脱リン酸化して、セルフライゲー
ションを防止した。前記のＢｇｌＩＩ消化物の５．０〜
７．０ｋｂ ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩ消化したｐＵＣ１
９、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物の３．０〜５．０ｋｂ ＤＮ
Ａ断片とＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＵＣ１９をそれぞれ
混合し、“ライゲーションキット（宝酒造製）”により
ライゲーションを行い、その混合物を用いて大腸菌ＨＢ
１０１株のコンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し
た。形質転換した大腸菌は、その一部は形質転換頻度測
定のためにＬ寒天培地（１％トリプトン、０．５％イー
ストエクストラクト、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に
プレーティングを行い、残りはさらに５０倍容のＬ−ブ
ロス（１％トリプトン、０．５％イーストエクストラク
ト、１％ＮａＣｌ）を添加し、３７℃で一夜培養してコ
ロニーを増幅させた後、アスペルギルス・オリゼー ジ
ェノミックライブラリーとして−８０℃で保存した。５．コロニー ハイブリダイゼーション コロニー ハイブリダイゼーションは以下に示した様に
行った。まず、アスペルギルス・オリゼー ジェノミッ
クライブラリーを、直径１５０ｍｍプレートあたり約１
０，０００クローンになるようにブレーティングし、３
７℃で一夜培養した。プレートの培地には５０μｇ／ｍ
ｌの濃度でアンピシリンを添加したＬ寒天培地を用い
た。培養後、ナイロンフィルター（ＮＥＮ製Ｃｏｌｏｎ
ｙ／Ｐｌａｑｕｅ Ｓｃｒｅｅｎ）を寒天の上から静か
に乗せてコロニーをナイロンフィルターに移した。コロ
ニーを移したナイロンフィルターは０．５Ｎ ＮａＯＨ
に浸して溶菌、ＤＮＡを変性させた後、１Ｍトリスー塩
酸（ｐＨ７．５）溶液に浸して中和し、乾燥させて変性
したＤＮＡを固定した。ハイブリダイゼーションは、作
製したフィルターをビニールバックに入れ、サザーンハ
イブリダイゼーションの場合と同じ条件で行った。その
結果、ＡＰ−２３及びＡＰ−２４の両ブローブともハイ
ブリダイズするクローンがいくつか得られた。これらの
クローンよりアルカリ−ＳＤＳ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、
前述）にてプラスミドＤＮＡを抽出し、ジデオキシ法に
よって塩基配列を決定したところアルカリプロテアーゼ
のｃＤＮＡ配列と一致した。 ＡＰ−２３プローブとハイブリダイズする約６．５ｋｂ
の ＢｇｌＩＩ断片を含むプラスミドをｐＡＰＯ１７、
ＡＰ−２４プローブとハイブリダイズする約４．５ｋｂ
のＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を含むプラスミドをｐＡＰＯ２
５として以下解析を進めた。６．アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の取得及びＤ
ＮＡ配列の決定 前項で得たｐＡＯ１７及びｐＡＰＯ２５について、いく
つかの制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動によ
り断片パターン観察することによりそれらの制限酵素断
片地図を作製した。その結果を図１に示す。両プラスミ
ドが含んでいた遺伝子断片は、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌ
ＩＩ部位の間で重複しており、両プラスミドでアルカリ
プロテアーゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニングでき
た。そこで配列番号１に示す様に適当な制限酵素部位を
使ってＤＮＡ配列の決定を行った。ＤＮＡ配列の決定法
としてはジデオキシ法を用い、その反応は“Ｍ１３シー
クエンスキット”（宝酒造製）、ポリアクリルアミド電
気泳動は“ＤＮＡ塩基配列分析用電気泳動装置”（宝酒
造製）を用いて行った。得られたジェノミック遺伝子の
塩基配列と、アルカリプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列
（特願昭６３−１７００１８号）を比較し、アルカリプ
ロテアーゼ遺伝子遺伝子にはそのプレプロ領域に１箇
所、成熟蛋白質領域に２箇所の計３箇所のイントロン配
列が存在している事が分った。７．転写開始点の決定 クローニングしたアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモ
ーター領域を解析するため、転写開始点の決定を行っ
た。転写開始点の決定には、Ｓ１マッピッグ法やプライ
マー エクステンション法があるが、本実験ではプライ
マー エクステンション法で行った。プライマーとして
は、アルカリプロテアーゼ蛋白の１２番目から１７番目
（プレ領域内）のアミノ酸をコードしているＤＮＡの逆
鎖を基に合成したオリゴヌクレオチドを用いた。以下に
その配列を示す。 ＡＰ−２６；５’＞ＣＧＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＡＴ
ＡＧＣ ＴＣＣ＜３’ ＡＰ−２６の配列をアプライド バイオシステム社製
“ＤＮＡ合成機（３８１Ａ）”で合成した。合成したオ
リゴヌクレオチドの精製は、アプライド バイオシステ
ム社製“オリゴヌクレオチド精製カートリッジ”を用い
た。ＡＰ−２６の末端ラベリングは［γ−３２Ｐ］ＡＴ
ＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて行った。反
応は５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０），１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）の溶液中で３７℃，１時間反応させた。ラベルに用
いられなかった［γ−３２Ｐ］ＡＴＰは、“ＮＥＮＳＯ
ＲＢＴＭ２０”カラム（ＮＥＮ製）を使って除去し、以
上の操作で１μｇＤＮＡ当り約１０７ｃｐｍの放射活性
を持つオリゴヌクレオチドが得られた。次に、アルカリ
プロテアーゼｃＤＮＡのクローニングの際に鋳型として
用いたｍＲＮＡ（特願昭６３−１７００１８号）約３μ
ｇと３２Ｐでラベルした上記プライマーＡＰ−２６約１
０ｎｇを混合して６μｌとし、それに１μｌの１０×逆
転写酵素用バッファー（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．
０、５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）を
添加し、７０℃で５分間加熱処理後、室温で２０分間放
置し、プライマーとｍＲＮＡのアニーリングを行った。
次にこの溶液に１０ｍＭ ＤＴＴ １μｌ、２０ｍＭ
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの
等モル混合物）、リボヌクレアーゼインヒビター（１１
７ｕｎｉｔｓ／μｌ，宝酒造製）０．５μｌ、逆転写酵
素（宝酒造製２２ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌを添加
し、４２℃で１時間反応させた後、ホルムアミド溶液
（９５％ホルムアミド、０．１キシレンシアノール、
０．１％ブロムフェノールブルー）１０μｌを添加して
反応を停止した。次に上記で得られた反応液１〜３μｌ
を、６％アクリルアミド−尿素ゲルにアプライした。同
時に、ｐＡＰＯ１７を鋳型とし、ＡＰ−２６をプライマ
ーとしてジデオキシ反応させた液をサイズマーカーとし
て同じゲルに泳動した。この結果、プライマー エクス
テンションした反応液ではバンドが３本見られ、アルカ
リプロテアーゼ遺伝子の転写開始点は３箇所存在する事
がわかった。その結果を配列番号３に示す。決定した最
上流の転写開始点の３０〜４０塩基上流に、いわゆるＴ
ＡＴＡボックスと考えられる配列はＴＡＴＡＡＡＴが存
在しており、８０〜９０塩基上流には、ＣＡＡＴボック
スと考えられる配列ＣＣＡＡＡＴが存在している。８．アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の連結 ２つのＤＮＡ断片（ｐＡＰＯ１７，ｐＡＰＯ２５）にク
ローニングされたアルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を
連結するために図２に示した操作を行った。まず、約５
０μｇのｐＡＰＯ１７をＮｃｏＩ（宝酒造製）で消化
後、“ＤＮＡブランティングキット”（宝酒造製）を用
いて平滑末端化した。この消化断片にＢａｍＨＩリンカ
ー（宝酒造製）５μｇを混合し、“ＤＮＡライゲーショ
ンキット”（宝酒造製）を用いて両者をライゲーション
し、エタノール沈澱でＤＮＡを精製後、ＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造製）で消化した。このＤＮＡ
混合物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ア
ルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の５’側を含む約１２
００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。ゲル
からのＤＮＡ回収法は、前述のＭａｎｉａｔｉｓらの方
法で行うことができる。一方、ｐＡＰ０２５は、約５０
μｇをＰｓｔＩ（宝酒造製）を消化後、“ＤＮＡブラン
ティングキット”（宝酒造製）で平滑末端にし、同様に
ＢａｍＨＩリンカー５μｇを混合して“ＤＮＡライゲー
ションキット”（宝酒造製）を用いてライゲーションし
た。ライゲーション後、エタノール沈澱により精製し、
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このＤＮ
Ａ消化物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、
アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の３’側を含む約１
８００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精製した。前
述のアルカリプロテアーゼ５’側ＤＮＡ断片（約１２０
０ｂｐ，ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片）と３’側Ｄ
ＮＡ断片（約１８００ｂｐ，ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片）をそれぞれ約３μｇずつ混合し、“ＤＮＡライ
ゲーションキット”によりライゲーション後、ＢａｍＨ
Ｉで消化した。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル電
気泳動で分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片（約３ｋｂ
ｐ）を回収、精製した。このアルカリプロテアーゼゲノ
ム遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化した ｐ
ＵＣ１９と混合してライゲーション後、大腸菌ＪＭ１Ｏ
９株コンピテントセル（宝酒造製）に導入し、アンピシ
リン耐性を獲得した形質転換株をスクリーニングするこ
とで目的のプラスミドｐＡＰ１７２５を有するクローン
を得た。ｐＡＰ１７２５は、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部
位に、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子（約３ｋｂ
ｐ）が挿入されたＤＮＡである。９．発現ベクターの作製 アルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター、ターミネ
ーターを用いた発現ベクターの作製は図３に示した手順
に従って行った。まず、ターミネーター領域を単離する
ため、約１０μｇのｐＡＰ０２５をＡｆｌＩＩ（宝酒造
製）で消化後、“ＤＮＡブランティングキット（宝酒造
製）を用いて切断箇所を平滑末端化した。エタノール沈
澱により精製した後、さらにＰｓｔＩ（宝酒造製）で消
化し、１％アガロースゲル電気泳動により消化断片を分
離した。このうちアルカリプロテアーゼのターミネータ
ー領域のＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）をアガロースゲル
より抽出、精製した。一方、ベクターとなるｐＵＣ１９
をＰｓｔＩおよびＨｉｎｃＩＩ（宝酒造製）で消化後、
アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で切断点を脱リ
ン酸化させた。この切断したベクター（約１００ｎｇ）
と前述のターミネーターＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）を
混合し、“ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）で
ライゲーションし、その混合物で大腸菌 ＪＭ１０９株
（宝酒造製）を形質転換した。アンピシリン耐性を獲得
したクローンから、プラスミドＤＮＡを抽出してスクリ
ーニングを行い、目的のプラスミドｐＡＰ０４４ １０
μｇを得た。次にプロモーター領域を単離するため、
約１０μｇのｐＡＰ０１７をＮｃｏＩ（宝酒造製）で消
化後“ＤＮＡブランティングキット”を用いて切断箇所
を平滑末端化した。エタノール沈澱後、 ＥｃｏＲＩリ
ンニカー（宝酒造製）２μｇと混合し“ＤＮＡライゲー
ションキット”を用いてライゲーションした。ライゲー
ションしたＤＮＡ混合物をＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩ
（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉＯｌａｂ 社製）で消化
し、１％アガロースゲル電気作動により消化断片を分離
した。分離したＤＮＡ断片のうち、アルカリプロテアー
ゼ プロモーター領域を含むＤＮＡ断片（約１１００ｂ
ｐ）をアガロースゲルより抽出、精製した。次に、ター
ミネーター領域をサブクローニングしたプラスミドｐＡ
Ｐ０４４約１０μｇをＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ（宝酒
造製）で消化後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸
化したもの（約１００ｎｇ）と前記のプロモーター断片
（約１１００ｂｐ，約１００ｎｇ）を混合し“ＤＮＡラ
イゲーションキット”によりライゲーションし、大腸菌
ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたアンピシリン
耐性株からプラスミドＤＮＡを抽出してスクリーニング
を行い、目的のプラスミドｐＡＰ０４５ １０ μｇを
得た。ｐＡＰ０４５はアルカリプロテアーゼのプロモー
ター、ターミネーターが連結されたプラスミドで、単一
認識部位であるＢａｍＨＩ部位に異種遺伝子を挿入する
事で発現させうるベクターである。 １０．アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテ
アーゼプロモーターによりアスペルギルス・オリゼー中
で蛋白質生成物を発現させるように設計した発現ベクタ
ーの構築 この実施例では、プラスミドをアルカリプロテアーゼプ
ロモーター、及びターミネーター配列の制御下にβ−グ
ルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳと略称する。）を発現す
るように設計して構築した。 ・前記項目９で構築され、アルカリプロテアーゼプロモ
ーター及びターミネーターが連結された組み換え体プラ
スミドｐＡＰＯ４５からのＧＵＳ発現ベクターの作製は
図４に示した手順に従って行った。先ず、組み換え体プ
ラスミドｐＢＩ２２１〔ＧＵＳ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏ
ｎＳｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．東洋
紡社より入手）〕からＧＵＳフラグメントを単離するた
めに組み換え体プラスミドｐＢＩ２２１（約５７００ｂ
ｐ）１０μｇを制限酵素 ＳｍａＩ（宝酒造製）及びＳ
ａｃＩ（宝酒造製）により消化したのち、“ＤＮＡブラ
ンティングキット”（宝酒造製）を用いて切断箇所を平
滑末端化した。エタノール沈澱により精製したのち、１
％アガロースゲル電気泳動により消化断片を分離した。
このうちＧＵＳフラグメントのＤＮＡ断片（約１９００
ｂｐ）をアガロースゲルより抽出、精製した。一方、ア
ルカリプロテアーゼ プロモーター及びターミネーター
領域を含む組み換え体プラスミドｐＡＰＯ４５ １０
μｇ をＳｍａＩを用い、消化後、アルカリフォスファ
ターゼ（宝酒造製）を用い切断点を脱リン酸化させた。
この切断したプラスミド （約１００ｎｇ）及び前述の
ＧＵＳフラグメントＤＮＡ断片（約１００ｎｇ）を混合
し、“ＤＮＡライゲーションキット”（宝酒造製）を用
いライゲーションし、その混合物で大腸菌ＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換した。アンピシリン耐性を獲得
したクローンから、組み換え体プラスミドＤＮＡを抽出
してスクリーニングを行ない組み換え体プラスミドｐＡ
ＰＯ６９（約６９００ｂｐ）１０μｇを得た。次に、こ
のｐＡＰ０６９にマーカー遺伝子として硝酸塩資化性遺
伝子ｎｉａＤを連結した。すなわち、プラスミドｐＳＴ
Ａ１４（約１１０００ｂｐ）〔Ｓ．Ｅ・Ｕｎｋｌｅｓ
ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ Ｖｏｌ．２１８ Ｐ
９９〜１０４（１９８９）〕を ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒
造製）で消化し、エタノール沈澱により精製したのち、
１％アガロース電気泳動法により消化断片を分離した。
このようにしてｎｉａＤを含むＤＮＡ断片（約５５００
ｂｐ）を得、これを前記組み換え体プラスミドｐＡＰ０
６９のＨｉｎｄＩＩＩ消化物をアルカリフォスファター
ゼ（宝酒造製）により切断点を脱リン酸化したベクター
と混合して“ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）
でライゲーションし、その混合物で大腸菌ＪＭ１０９株
（宝酒造製）を形質転換した。アンピシリン耐性を獲得
したクローンから、プラスミドＤＮＡ抽出してスクリー
ニングを行ない目的の組み換え体プラスミドｐＡＰ０７
０及びｐＡＰ０７１（いづれも約１２４００ｂｐ）１０
μｇを得た。組み換え体プラスミドｐＡＰ０７０及びｐ
ＡＰ０７１は、アルカリプロテアーゼ プロモーター及
びターミネーターの間にｎｉａＤ遺伝子断片（約５５０
０ｂｐ）が挿入されたものであるが、ｎｉａｄ遺伝子断
片の向きが夫々逆に組み換え体プラスミドｐＡＰ０６９
に連結されたものである。１１．アスペルギルス・オリゼーの形質転換 Ａ．ｏｒｙｚａｅ（ＩＡＭ ２７２０）の胞子懸濁液を
適当に滅菌水で希釈し、ＫＣｌＯ３（４７０ｍＭ）を含
有する最小培地のＮ源をグルタミン酸ソーダ（１０ｍ
Ｍ）を添加した培地にプレートして３０℃で３〜７日間
培養した。ここで出現したコロニーを最小培地（Ｎ源グ
ルタミン酸ソーダ１０ｍＭ）に植え換えて、この培地で
３０℃で、３〜７日培養する。そして、グルタミン酸ソ
ーダを添加した培地では生育するが、硝酸ソーダを添加
した培地では生育できない株を、硝酸塩資化能欠損（ｎ
ｉａＤ−）株として選択、分離する。本発明では、この
株をＡ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−１１−７と略記する。 Ａ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−１１−７（ｎｉａＤ−）株
を試験管のスラント培地（米麹汁寒天培地）に接種し、
室温で分生胞子の着生が充分になるまで培養し、分生胞
子を得た。次に、この分生胞子を、１×１０７個／ｍｌ
となるように、０．０１％ソルビタン脂肪酸エステル溶
液［ソルゲン ＴＷ−６０（第一工業製薬社製）〕に分
散懸濁した。次に、この分生胞子の分散懸濁液１ｍｌ
を、液体栄養培地［下記のポリペプトン・デキストリン
培地（ｐＨ６．０）］ デキストリン ２％ ポリペプトン １．０％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．５％ ＮａＮＯ３ ０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％ カザミノ酸 ０．１％ ｐＨ ５．５〜６．０ 水道水で調整 ３０ｍｌに接種し、１５０ｍｌ容三角フラスコ内で、３
０℃で、１６〜２４時間振盪培養し、菌糸懸濁液を得、
該懸濁液は更に遠心分離（４５００ｇ、２０分）して、
そこから麹菌体を分離した。次に、こうして得られた麹
菌体は充分水洗浄したのち、これに細胞壁溶解酵素５ｍ
ｌを加え、３０℃で４５分間、ゆるく振盪（毎分５０〜
６０往復）して、Ａ．ｏｒｙｚａｅ １９ Ｙ−１１−
７（ｎｉａＤ−）株のプロトプラストを得た。ここに用
いた細胞壁溶解酵素は、市販のノボザイム２３４（ノボ
・インダストリー社製）を溶液１ｍｌに８ｍｇ溶解し得
られたものである。次に、このようにして得たプロトプ
ラストをＧ−３規格のガラスフィルターにより分離し、
これを高張液（０．８Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１
０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ５．８）で洗浄し、洗浄プ
ロトプラストを得た。次いで、上記高張液にて５ｍｌの
懸濁液とし、これに４倍量の高張液〔１．２Ｍソルビ
トール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、 １０ｍＭ トリス・
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））を添加し、２，０００ｒ．
ｐ．ｍ．で５分間遠心分離し、プロトプラストを洗浄し
た。この洗浄操作を３回行なった。次に、プロトプラス
トを上記高張液中に最終濃度１〜２×１０８／ｍｌと
なるように再懸濁する。この１００μｌの懸濁液を１．
５ｍｌプラスチック製試験管に入れ、前記方法で調製し
たＤＮＡベクター「ｐＡＰ０７０及びｐＡＰ０７１」ま
たは同「ｐＡＰ０７８」のいずれかのＤＮＡ１〜１０μ
ｇ（総容量：ＴＥバッファー溶液１０μｌ中）を添加
し、ＰＥＧ〔５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０（シグ
マ社製）〕５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ、ｐＨ７．５の溶液１２．５μｌを添加し、静か
に攪拌し、氷温にて２０分間インキュベートする。次い
で、前記ＰＥＧ溶液１ｍｌを加えて２秒間ゆるやかに撹
拌して、すぐに前記高張液を２ｍｌ加える。以上のよ
うにして形質転換を行う。形質転換操作の終了したプロ
トプラスト懸濁液を１．２Ｍソルビトールを含む再生最
少培地（Ｎ源は、硝酸ナトリウム）に重層して培養す
る。ＤＮＡベクターｐＡＰ０７１で形質転換された本発
明のアスペルギルス・オリゼー形質転換体はアスペルギ
ルス・オリゼー１１−７−Ｇ７１−１０１として工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２１１１号
として寄託している。次に、このようにして形質転換さ
れたプロトプラスト懸濁液全量を、０．８ＭＫＣｌ、１
０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ，ｐＨ
７．５溶液６ｍｌ混和希釈し、７００ｇで５分間遠心分
離する。更に、分離された形質転換体のプロトプラスト
に同容量の上記希釈液を加え、遠心分離して、洗浄され
たものを得る。次に、洗浄された形質転換体のプロトプ
ラストを１ｍｌの上記希釈液に懸濁し、この１０μｌ〜
１００μｌを、０．６Ｍ ＫＣｌを含む最小培地（Ｎ源
硝酸ソーダ１０ｍＭ、２．０％寒天）にプレートする。
またその上に同培地（但し、０．５％寒天）を重層す
る。次いで３０℃にて３〜１０日間培養する。ｎｉａＤ
＋及びＤＮＡベクターｐＡＰ０７０、ｐＡＰ０７１及び
同ｐＡＰ０７８由来の他のＤＮＡをとりこんだ形質転換
体は、最小培地＋ＫＣｌ（塩化カリウムはプロトプラス
トが破裂するのを防ぐのに必要である）上で増殖する。
未変化の細胞、未変化のプロトプラスト、形質転換体、
および復帰突然変異体を含むあらゆる生存可能な細胞及
びプロトプラストは、最小培地＋アルギニン＋ＫＣｌ上
で増殖する。かかる増殖培地により、生存可能な物質の
生存率を調べることができる。これらの実験において１
０８／ｍｌのうち、上記アルギニンを含む培地で生存可
能な物質の生育できた割合は３０％以上であった。最小
培地＋アルギニン上では、汚染された非プロトプラスト
物質のみが増殖する。この様な非浸透圧感受性細胞での
汚染は、本実験においては１％未満であった。１２．アスペルギルス・オリゼーにおけるＧＵＳの発現 前記形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ １１−７−Ｇ７１−
１０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１１１）のＧＵＳ発現を以
下のようにして調べた。すなわち、ふすま粉末２％、脱
脂大豆粉末０．５％及びＫＨ２ＰＯ４０．１％（ｐＨ
６．５）からなる液体培地１５ｍｌに、形質転換体Ａ．
ｏｒｙｚａｅ １１−７−Ｇ７１−０１を接種して３０
℃で７２時間振盪培養した。該培養物を濾過して培養濾
過と菌体を分別した。菌体を冷却しながらバイオ・ミキ
サー（日本精機社製）で１分間破砕したのち、遠心分離
して菌体内上清液を得た。これら培養濾過と菌体内上清
液についてＧＵＳ発現の有無をウェスタンブロット法に
従って調べたところ、菌体内上清にＧＵＳ抗体とクロス
する蛋白質が認められ、形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ１
１−７−Ｇ７１−１０１にＧＵＳ発現が認められた。
尚、培養濾液にはＧＵＳ抗体とクロスする蛋白質は認め
られず、形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ １１−７−Ｇ７
１−１０１の培養液中にはＧＵＳの分泌発現は認められ
なかった。また、宿主元株Ａ．０ｒｙｚａｅ１９Ｙ−１
１−７を同様に培養して培養濾液と菌体内上清液につい
てＧＵＳ発現の有無を同様に調べたところ、宿主元株
Ａ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−１１−７には、ＧＵＳ発現
は全く認められなかった。前記形質転換体Ａ．ｏｒｙｚ
ａｅ １１−７−Ｇ７１−１０１の菌体上清液１００μ
ｌを用いてＧＵＳ発現量をｐ−ニトログルクロニドと反
応させてＧＵＳ発現量をＧＵＳ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＵＳｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．東
洋紡社より入手）に記載の方法により調べたところその
ＧＵＳ発現量は約１ｍｇ／Ｌブロス（ｂｒｏｔｈ）と算
出された。
【実施例２】１．アルカリプロテアーゼを分泌発現するように設計し
たＡ．ｏｒｙｚａｅ発現用ベクターの構築 Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノム由来アルカリプロテアーゼ遺伝
子ＤＮＡ及び硝酸塩資化性マーカー遺伝子ＤＮＡを連結
させた組み換え体プラスミドベクターｐＡＰ０７８の作
製は、図５に示した手順に従って行った。ｎｉａＤ遺伝
子を含む組み換え体プラスミドｐＳＴＡ１４からｎｉａ
Ｄ遺伝子を含むフラグメントを切り出すため、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化したのち、“ＤＮＡブランティングキッ
ト”（宝酒造製）を用いて平滑末端化した。この消化断
片にＳｍａＩリンカー（宝酒造製）５μｇを混合してｎ
ｉａＤ遺伝子ＤＮＡ断片（ＳｍａＩリンカー付与）を得
た。一方、ベクターとなるプラスミドｐＵＣ１９をＳｍ
ａＩ（宝酒造製）で消化したのち、アルカリフォスファ
ターゼ（宝酒造製）で切断点を脱リン酸化した。この切
断したベクター（約１００ｎｇ）と、前述のｎｉａＤ遺
伝子ＤＮＡ断片（ＳｍａＩリンカーの付与断片）の両者
を“ＤＮＡブランティングキット”（宝酒造製）を用い
てライゲーションし、その混合物で大腸菌 ＪＭ１０９
株（宝酒造社製）を形質転換した。アンピシリン耐性を
獲得したクローンからプラスミドＤＮＡを抽出してスク
リーニングを行い、目的の組み換え体プラスミドｐＡＰ
０７６ １０ μｇを得た。一方、前記組み換え体ｐＡ
Ｐ１７２５をＢａｍＨＩ（宝酒造製）消化したＤＮＡを
１％アガロースゲル電気泳動で分離し、アルカリプロテ
アーゼゲノム遺伝子のＤＮＡ断片（約３ｋｂｐ）を回
収、精製した。該アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を
含むＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１１８
（宝酒造製）と混合してライゲーションしたのち、大腸
菌 ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造製）に導入
し、アンピシリン耐性が付与された形質転換株スクリー
ニングすることにより目的の組み換え体プラスミドｐＡ
Ｐ０７４を得た。この組み換え体プラスミドｐＡＰ０７
４は、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ部位にアルカリプロテア
ーゼゲノム遺伝子（約３ｋｂｐ）が挿入されたＤＮＡで
ある。更に、組み換え体プラスミドｐＡＰ０７４をＳｍ
ａＩにより消化したのち、切断点をアルカリフォスファ
ターゼ処理して脱リン酸化されたＤＮＡ断片及び前記組
み換え体プラスミドｐＡＰ０７６のｓｍａＩ消化物をラ
イゲーションしてアルカリプロテアーゼ遺伝子とｎｉａ
Ｄ遺伝子が連結したアルカリプロテアーゼ発現用組み換
え体プラスミドベクターｐＡＰ０７８（約１１０００ｂ
ｐ）１０μｇを得た。２．Ａ．ｏｒｙｚａｅにおける野性型アルカリプロテア
ーゼの発現 組み換え体プラスミドｐＡＰ０７８を用い前記実施例１
項目１１に記載したようにＡ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−
１１−７を形質転換し、単一Ｎ源として硝酸塩を資化で
きる形質転換体、すなわち、Ａ．ｏｒｙｚａｅ １１−
７−ＴＰ７１を単離した。なお、Ａ．ｏｒｙｚａｅ １
１−７−ＴＰ７１は、夫々工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第１２１１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
１１０）として寄託されている。そして、単一Ｎ源とし
て硝酸ナトリウムを含むツァペック寒天培地上で純化を
繰り返えし、形質転換体の安定化を行なった。アルカリ
プロテアーゼ発現量を調べるために、形質転換体Ａ．ｏ
ｒｙｚａｅ１１−７−ＴＰ７１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１
１０）を夫々８０％撒水しためすま５ｇに接種し、３０
℃にて６４時間培養した。その培養物に水１００ｍｌを
加えて室温で２時間抽出し、濾液を得た。その濾液を用
いて、アゾカゼインを基質とする牛島等の報告（Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４（７）、１６６７〜１
６７６（１９９０）〕に従ってアルカリプロテアーゼ活
性を測定した結果を表１に示した°宿主元株Ａ．ｏｒｙ
ｚａｅ １９Ｙ−１１−７も同様に培養して抽出濾液の
アルカリプロテアーゼを測定した。
たＡ．ｏｒｙｚａｅ発現用ベクターの構築 Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノム由来アルカリプロテアーゼ遺伝
子ＤＮＡ及び硝酸塩資化性マーカー遺伝子ＤＮＡを連結
させた組み換え体プラスミドベクターｐＡＰ０７８の作
製は、図５に示した手順に従って行った。ｎｉａＤ遺伝
子を含む組み換え体プラスミドｐＳＴＡ１４からｎｉａ
Ｄ遺伝子を含むフラグメントを切り出すため、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化したのち、“ＤＮＡブランティングキッ
ト”（宝酒造製）を用いて平滑末端化した。この消化断
片にＳｍａＩリンカー（宝酒造製）５μｇを混合してｎ
ｉａＤ遺伝子ＤＮＡ断片（ＳｍａＩリンカー付与）を得
た。一方、ベクターとなるプラスミドｐＵＣ１９をＳｍ
ａＩ（宝酒造製）で消化したのち、アルカリフォスファ
ターゼ（宝酒造製）で切断点を脱リン酸化した。この切
断したベクター（約１００ｎｇ）と、前述のｎｉａＤ遺
伝子ＤＮＡ断片（ＳｍａＩリンカーの付与断片）の両者
を“ＤＮＡブランティングキット”（宝酒造製）を用い
てライゲーションし、その混合物で大腸菌 ＪＭ１０９
株（宝酒造社製）を形質転換した。アンピシリン耐性を
獲得したクローンからプラスミドＤＮＡを抽出してスク
リーニングを行い、目的の組み換え体プラスミドｐＡＰ
０７６ １０ μｇを得た。一方、前記組み換え体ｐＡ
Ｐ１７２５をＢａｍＨＩ（宝酒造製）消化したＤＮＡを
１％アガロースゲル電気泳動で分離し、アルカリプロテ
アーゼゲノム遺伝子のＤＮＡ断片（約３ｋｂｐ）を回
収、精製した。該アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を
含むＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１１８
（宝酒造製）と混合してライゲーションしたのち、大腸
菌 ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造製）に導入
し、アンピシリン耐性が付与された形質転換株スクリー
ニングすることにより目的の組み換え体プラスミドｐＡ
Ｐ０７４を得た。この組み換え体プラスミドｐＡＰ０７
４は、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ部位にアルカリプロテア
ーゼゲノム遺伝子（約３ｋｂｐ）が挿入されたＤＮＡで
ある。更に、組み換え体プラスミドｐＡＰ０７４をＳｍ
ａＩにより消化したのち、切断点をアルカリフォスファ
ターゼ処理して脱リン酸化されたＤＮＡ断片及び前記組
み換え体プラスミドｐＡＰ０７６のｓｍａＩ消化物をラ
イゲーションしてアルカリプロテアーゼ遺伝子とｎｉａ
Ｄ遺伝子が連結したアルカリプロテアーゼ発現用組み換
え体プラスミドベクターｐＡＰ０７８（約１１０００ｂ
ｐ）１０μｇを得た。２．Ａ．ｏｒｙｚａｅにおける野性型アルカリプロテア
ーゼの発現 組み換え体プラスミドｐＡＰ０７８を用い前記実施例１
項目１１に記載したようにＡ．ｏｒｙｚａｅ １９Ｙ−
１１−７を形質転換し、単一Ｎ源として硝酸塩を資化で
きる形質転換体、すなわち、Ａ．ｏｒｙｚａｅ １１−
７−ＴＰ７１を単離した。なお、Ａ．ｏｒｙｚａｅ １
１−７−ＴＰ７１は、夫々工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第１２１１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
１１０）として寄託されている。そして、単一Ｎ源とし
て硝酸ナトリウムを含むツァペック寒天培地上で純化を
繰り返えし、形質転換体の安定化を行なった。アルカリ
プロテアーゼ発現量を調べるために、形質転換体Ａ．ｏ
ｒｙｚａｅ１１−７−ＴＰ７１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１
１０）を夫々８０％撒水しためすま５ｇに接種し、３０
℃にて６４時間培養した。その培養物に水１００ｍｌを
加えて室温で２時間抽出し、濾液を得た。その濾液を用
いて、アゾカゼインを基質とする牛島等の報告（Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４（７）、１６６７〜１
６７６（１９９０）〕に従ってアルカリプロテアーゼ活
性を測定した結果を表１に示した°宿主元株Ａ．ｏｒｙ
ｚａｅ １９Ｙ−１１−７も同様に培養して抽出濾液の
アルカリプロテアーゼを測定した。
【表１】 上表より明らかな如く、本発明形質転換体は、対照に比
し、約４〜５倍のアルカリプロテアーゼを生成している
ことが判る。そして、前記ふすま培養抽出濾液のアルカ
リプロテアーゼ発現量向上をウェスタンブロット法で確
認した結果、本発明形質転換体は、宿主元株Ａ．ｏｒｙ
ｚａｅ １９Ｙ−１１−７に比較して明らかに多量のア
ルカリプロテアーゼに相当する分子量３６，０００の酵
素蛋白質を生産することが判明した。
し、約４〜５倍のアルカリプロテアーゼを生成している
ことが判る。そして、前記ふすま培養抽出濾液のアルカ
リプロテアーゼ発現量向上をウェスタンブロット法で確
認した結果、本発明形質転換体は、宿主元株Ａ．ｏｒｙ
ｚａｅ １９Ｙ−１１−７に比較して明らかに多量のア
ルカリプロテアーゼに相当する分子量３６，０００の酵
素蛋白質を生産することが判明した。
【配列表】配列番号： １ （１）配列の長さ： １１１０塩基対 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： 一本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名 ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
ｅ （ｂ）株 名： ＡＴＣＣ ２０３８６ （７）配列の特徴 １−１１１０：プロモーター （８）配列： 配列番号： ２ （１）配列の長さ： ５３０塩基対 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： 一本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：Ａｓｐｅｒｇｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ （ｂ）株 名：ＡＴＣＣ ２０３８６ （７）配列の特徴 １−５０６：ターミネーター （８）配列： 配列番号： ３ （１）配列の長さ： ２９８８塩基対 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： 一本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ （ｂ）株 名：ＡＴＣＣ ２０３８６ （７）配列の特徴 １４３５−１４８４： イントロン１ １９２９−１９８８： イントロン２ ２０７７−２１３３： イントロン３ １−１１１０： プロモーター １１１１−２４８７： 成熟蛋白質 ２４８８−２９８８： ターミネーター （８）配列：
ｅ （ｂ）株 名： ＡＴＣＣ ２０３８６ （７）配列の特徴 １−１１１０：プロモーター （８）配列： 配列番号： ２ （１）配列の長さ： ５３０塩基対 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： 一本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：Ａｓｐｅｒｇｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ （ｂ）株 名：ＡＴＣＣ ２０３８６ （７）配列の特徴 １−５０６：ターミネーター （８）配列： 配列番号： ３ （１）配列の長さ： ２９８８塩基対 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： 一本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ （ｂ）株 名：ＡＴＣＣ ２０３８６ （７）配列の特徴 １４３５−１４８４： イントロン１ １９２９−１９８８： イントロン２ ２０７７−２１３３： イントロン３ １−１１１０： プロモーター １１１１−２４８７： 成熟蛋白質 ２４８８−２９８８： ターミネーター （８）配列：
【図１】黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の
制限酵素地図。
制限酵素地図。
【図２】アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の連結手順
を示す図。
を示す図。
【図３】発現ベクター（組み換え体プラスミド）ｐＡＰ
０４５の作製手順を示す図。
０４５の作製手順を示す図。
【図４】組み換え体プラスミドｐＡＰ０４５からのＧＵ
Ｓ発現ベクターの作製手順を示す図。
Ｓ発現ベクターの作製手順を示す図。
【図５】組み換え体プラスミドベクターｐＡＰ０７８の
作製手順を示す図。
作製手順を示す図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 村上 成治 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (72)発明者 茂田井 宏 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (72)発明者 石田 豊 大阪府枚方市招堤大谷２丁目1180番地の １ 株式会社 ミドリ十字 中央研究所 内 (72)発明者 村上 弘次 大阪府枚方市招堤大谷２丁目1180番地の １ 株式会社 ミドリ十字 中央研究所 内 (72)発明者 真崎 厚司 大阪府枚方市招堤大谷２丁目1180番地の １ 株式会社 ミドリ十字 中央研究所 内 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招堤大谷２丁目1180番地の １ 株式会社 ミドリ十字 中央研究所 内 (72)発明者 有村 博文 大阪府枚方市招堤大谷２丁目1180番地の １ 株式会社 ミドリ十字 中央研究所 内 (56)参考文献 特開 昭62−272988（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, 52［７］（1988）ｐ．1887−1888 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
Claims (4)
- 【請求項１】 黄麹菌アスペルギルス・オリゼーＡＴＣ
Ｃ２０３８６株のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子
を由来とし、当該ゲノム遺伝子の５’側上流域からＥｃ
ｏＲＩ及びＦｓｐＩで切り出される、大きさが約１１０
０ｂｐであるアルカリプロテアーゼプロモーターと、蛋
白質構造遺伝子とをベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡ。 - 【請求項２】 アルカリプロテアーゼプロモーターが以
下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる請求項１記載の
組み換え体ＤＮＡ。（ａ）配列番号１に示される塩基配
列からなるＤＮＡ （ｂ）配列番号１に示される塩基配列
からなるＤＮＡにおいて一部の塩基配列が欠失、置換若
しくは付加された塩基配列からなり、かつアルカリプロ
テアーゼプロモーター活性を有するＤＮＡ - 【請求項３】 請求項１又は２記載の組み換え体ＤＮＡ
を宿主微生物のゲノム遺伝子中に導入した形質転換微生
物。 - 【請求項４】 請求項３記載の形質転換微生物を培地に
培養し、培養物より組み込まれた蛋白質構造遺伝子に対
応する蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17629691A JP2901387B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 蛋白質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17629691A JP2901387B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 蛋白質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0538289A JPH0538289A (ja) | 1993-02-19 |
| JP2901387B2 true JP2901387B2 (ja) | 1999-06-07 |
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ID=16011108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17629691A Expired - Fee Related JP2901387B2 (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 蛋白質の製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2901387B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011239681A (ja) * | 2008-09-19 | 2011-12-01 | Kikkoman Corp | 麹菌アルカリプロテアーゼプロモーター |
-
1991
- 1991-04-17 JP JP17629691A patent/JP2901387B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２［７］（１９８８）ｐ．１８８７−１８８８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0538289A (ja) | 1993-02-19 |
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