JPH0850133A - 免疫化学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】試料中に存在する微生物の内部抗原に対する抗
体を不活化した後、微生物の表面構造物を破壊すること
により微生物内部抗原を放出させ、微生物の内部抗原量
を定量することを特徴とする免疫化学的測定方法。 【効果】 微生物中の抗原量がそれに対する抗体が大量
に含まれる試料中においても簡便に測定できるようにな
り、特にＢ型肝炎Ｄａｎｅ粒子の構成成分であるＨＢｃ
Ａｇを免疫化学的手法で測定することにより、Ｂ型肝炎
ウイルス量の血中内変化を簡便な手法により直接的定量
的に把握することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物内部に存在する
抗原の定量的測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】通常、細菌、ウイルス、酵母、黴などの
微生物はヒト体内では生体内防御機構いわゆる免疫によ
って駆逐され成育できない。その免疫力を発揮する主な
因子の一つが抗体であり、一度感染罹病した病原微生物
や、通常環境中に常在する微生物に対しては、ヒトは血
中にその抗体を有するか、迅速に血中抗体量を上昇させ
ることができる。

【０００３】しかしながら、昨今諸事情により免疫力の
低下した患者が増えており、いわゆる日和見感染が大き
な問題となりつつある。このような病態時には、常在す
る日和見感染病因菌に対する抗体を含む健常者血清から
免疫グロブリンを取得し、抗菌剤の補助療法として、免
疫力の低下した患者に投与されだした。すなわち、人為
的に、自然には生じないような量比の抗原と抗体が一時
的に血中に共存する時期が生み出されている。

【０００４】また、宿主の免疫力の低下を待って盛んに
増殖するウイルスの存在様式は潜伏感染と呼ばれ体内で
抗体反応の及ばない神経系などに巣くっている。この場
合にも、一般に血中抗体量は増えている。ヘルペスウイ
ルスやサイトメガロウイルスがこの感染様式をとる。さ
らに体内で増殖しながら免疫を掻い潜る微生物も存在す
る。持続感染と呼ばれるこの様式は、Ｂ型肝炎ウイル
ス、Ｃ型肝炎ウイルス、歯周病起因細菌などにみられ、
宿主が抗体量を上昇させているその環境下で、それぞれ
異なるメカニズムにより成育を続けて宿主を蝕んでい
く。

【０００５】いずれにしても、抗体が存在すれば異種抗
原である微生物は駆逐されるといった従来のような単純
な機構では説明できない微生物感染が問題視されてお
り、そのような状況下での微生物の定量法が望まれてい
る。

【０００６】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染性粒子
は、直径４２ｎｍの二重構造粒子、Ｄａｎｅ粒子であ
る。その外皮のリポ蛋白質の示す抗原性がＨＢｓ抗原
（ＨＢｓＡｇ）であり、内部の直径２７ｎｍのヌクレオ
カプシドを形成する粒子（コア粒子）の示す抗原性がＨ
Ｂｃ抗原（ＨＢｃＡｇ）である。肝細胞にＨＢＶが感染
すると、細胞質内で外皮が外され、コア粒子中の部分二
本鎖ウイルスＤＮＡの情報が読まれて、ウイルス関連の
蛋白質が合成されたり、ウイルスＤＮＡの複製が行なわ
れ、細胞質内でコア粒子が増幅される。増幅したコア粒
子は、細胞質内で外皮を被ってＤａｎｅ粒子となり、コ
ア粒子を持たない多数の管状粒子、球型粒子（ＨＢｓＡ
ｇ）とともに血液中に放出される。

【０００７】Ｂ型肝炎の診断は、通常、血液中にＢ型肝
炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出することによ
って行なわれる。しかしながら、ＨＢｓＡｇの抗原の存
在または血液中の濃度に関する情報は、Ｂ型肝炎におい
て感染時期や感染性粒子の量を正確に示すものではな
く、慢性の同疾患においてむしろ肝障害の進行によって
血中ＨＢｓＡｇ濃度が下がるなど、ウイルス増殖の判定
に用いることができない。

【０００８】また、ウイルス増殖の判定に用いることが
できる代表的ＨＢＶマーカーがＨＢｅ抗原（ＨＢｅＡ
ｇ）であって、未症候性のキャリアや慢性肝炎の経過を
観察する上でも、治療をモニタリングする上でも最も有
効な指標となってきた。ＨＢｅＡｇはＨＢＶに感染した
肝細胞から持続的に血中に放出され、ＨＢｅＡｇ陽性血
液中には、Ｄａｎｅ粒子が多くウイルスに関連したＤＮ
Ａポリメラーゼの活性も高いことが知られており、ウイ
ルス活動性の間接的定性的指標になってきた。しかしな
がら、ＨＢｅＡｇ陽性からＨＢｅＡｇ陰性・ＨＢｅ抗体
（ＨＢｅＡｂ）陽性へのセロコンバージョンが、常にＨ
ＢｅＡｇの質的変化（変異）に基づく現象である事が明
らかになり、多くの場合ウイルス活動性の減少を反映す
るものの、ウイルスの量的変化を完全に反映できない例
がある事が示唆され問題となっている。またＢ型肝炎治
療法の進歩に伴い、ウイルス活動性の直接的定量的判定
法が望まれるようにもなってきた。

【０００９】感染性を有するウイルス量の血中内変化を
直接的定量的に把握するために、Ｄａｎｅ粒子の構成成
分であるＨＢＶ−ＤＮＡやＤＮＡポリメラーゼを検査す
ることは既に日常的である。しかしながら、これらの方
法は、時間や手間、費用のかかる方法であり、さらに放
射性同位元素を使用する場合もあって、限られた施設で
しか普及していなかった。

【００１０】ウイルス量の血中内変化を直接的定量的に
把握するもう一つの手段は、やはりＤａｎｅ粒子の構成
成分であるＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）を
測定することであり、免疫化学的手法を適用することに
より、時間や手間、費用を減ずる事ができると考えられ
るが、現実的に普及していないのは、以下のような理由
があった。

【００１１】前述のように、ＨＢｃＡｇは血液中におい
てはＨＢｓＡｇの外皮を被って存在するために、そのま
まではＨＢｃＡｇとして測定することはできない。Ｄａ
ｎｅ粒子を界面活性剤などで処理し、外皮を取り除くこ
とができることは判明していたが、一般にＢ型肝炎患者
の血液中にはＨＢｃＡｇに対する抗体（ＨＢｃＡｂ）が
高力価に存在し、血液中でＨＢｃＡｇを放出させると大
過剰のＨＢｃＡｂと抗原抗体反応物を形成して、以後免
疫化学的手法を適用できなくなる。

【００１２】そこでＤａｎｅ粒子と血液中のＨＢｃＡｂ
とを分離するために、Ｄａｎｅ粒子にＨＢｓＡｂとの免
疫凝集物を形成させ、その後に遠心分離洗浄を繰り返す
方法（J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、197
6）、超遠心を利用する方法（Gastroenterology、第80
巻、1420−1427頁、1981）、ＨＢｓＡｇに対する免疫グ
ロブリンを結合させた不溶性担体で一旦Ｄａｎｅ粒子を
分離する方法（特公平５−７６５８２）などが開示され
てきたが、いずれも時間や手間あるいは特別な器具が必
要であり、また試料中のＨＢｃＡｂの除去も不十分であ
った。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物内部中に存在する抗原をそれに対する抗体が大量に存
在する試料中から定量する簡便な方法を提供するもので
あり、たとえば、大量にＨＢｃＡｂを含む試料中に存在
するＨＢｃＡｇを定量的に検出し得る簡便な方法を提供
することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】これを達成するために本
発明による方法は、試料中に存在する微生物の内部抗原
に対する抗体を不活化した後、微生物の表面構造物を破
壊することにより微生物内部抗原を放出させ、微生物の
内部抗原量を定量することを特徴とする免疫化学的測定
方法に関するものである。

【００１５】本発明における微生物とは細菌，ウイル
ス，酵母が好ましく用いられ、例えば日和見感染により
敗血症を起こさせる主原因となる黄色ブドウ球菌、表皮
ブドウ球菌、E.faecalis, 緑膿菌や大腸菌群、歯周病起
因細菌であるP.gingivalisやA.actinomycetemcomitans
，持続感染ウイルスであるＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝
炎ウイルスが挙げられる。

【００１６】本発明は宿主によって以前に免疫反応を受
けたことにより、その抗体価が上昇しているものの試料
中の抗体とは直接的には反応しない微生物の内部に存在
する抗原を定量するために、試料中に存在するその抗体
を不活化した後、微生物表面構造物を破壊し内部抗原を
放出させ、定量するものであるが、この不活化手段とし
ては酵素処理、熱処理、酸・アルカリ処理、変性剤処
理、有機溶剤処理のいずれかあるいはそれらを組み合わ
せ行なうことができる。

【００１７】中でも、本発明の好ましい１例としてＢ型
肝炎ウイルスの内部に存在する抗原であるＢ型肝炎ウイ
ルスコア抗原量を定量する場合を例にあげて本願発明を
説明する。

【００１８】すなわち、試料中に存在するＢ型肝炎ウイ
ルスコア抗原に対する抗体（ＨＢｃＡｂ）を不活化して
から、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）外皮を
破壊することによりＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ
Ａｇ）を放出させ、得られた溶液をＨＢｃＡｇに対する
免疫グロブリンとインキュベーションし、ＨＢｃＡｇに
結合した免疫グロブリン量を測定して、試料中のＨＢｃ
Ａｇ量を定量するものである。

【００１９】試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコア抗
原に対する抗体（ＨＢｃＡｂ）の不活化に際しては、既
に知られている天然型のＨＢｃＡｇの安定性（J. gen.
Virol.，第65巻、 405-414頁、1984）あるいは組換え型
のＨＢｃＡｇの安定性（J. Cliｎ． Microbiol.、第30
巻、1617−1619頁、1992）を考慮して、温度、ｐＨ、界
面活性剤、還元剤、有機溶剤、カオトロピックイオン、
蛋白分解酵素などの条件を変化させることにより、ＨＢ
ｃＡｇを破壊せずにＨＢｃＡｂを破壊する条件を選択し
て、ＨＢｃＡｂの不活化が実施できる事を見出だした。
例えば、J. gen.Virol.，第65巻、 405-414頁、1984
を参考にするならば、３７℃下１０時間処理や５６℃下
４時間などの熱処理、ｐＨ１１．５による処理、還元剤
である０．５Ｍ２−メルカプトエタノール処理、カオト
ロピックイオンである３Ｍチオシアン酸アンモニウムや
６Ｍ尿素処理などによって、天然型のＨＢｃＡｇの抗原
性は保たれる事が示されている。J. Cliｎ． Microbio
l.、第30巻、1617−1619頁、1992 を参考にするなら
ば、７０℃下１時間処理や８０℃下３０分などの熱処
理、ｐＨ１０．５やｐＨ５．０による処理、界面活性剤
である４％ＳＤＳによる２４時間処理、還元剤である４
０ｍＭ２−メルカプトエタノールによる４８時間処理、
有機溶剤である５０％メタノールや５０％エタノール処
理、蛋白分解酵素であるトリプシンやキモトリプシン処
理などによって、組換え型のＨＢｃＡｇの抗原性は保た
れる事が示されている。これらの知見により、一般の蛋
白質にとっては過酷ともいえる条件下でＨＢｃＡｇが安
定であることを利用し、ＨＢｃＡｇを破壊せずにＨＢｃ
Ａｂを破壊する最適の下記条件を見出だした。

【００２０】すなわち、本発明において試料中に存在す
るＨＢｃＡｂを不活化する手段としては、蛋白質分解酵
素処理、熱処理、アルカリ処理のいずれかあるいはそれ
を組合わせることが好ましく行なわれる。例えば蛋白質
分解酵素処理としてはプロナーゼ、プロテアーゼＫ、ト
リプシン、キモトリプシンなどであり、熱処理温度とし
ては好ましくは３７ー８０℃であり、アルカリ処理とし
てはｐＨ９以上が好ましく行なわれる。これらの不活化
手段は各々単独で行なってもよいし、２種以上組み合わ
せても構わない。さらに好ましくは３種の組み合わせで
ある熱処理、蛋白質分解処理およびアルカリ処理を使用
するのが好ましい。

【００２１】本発明で測定する試料は、一般的な生体試
料や人為的に調製された溶液などなんでも良いが、好ま
しくは、人血液あるいはそれに由来する血清や血漿が用
いられる。さらに好適には、Ｂ型肝炎ウイルスのＤａｎ
ｅ粒子を一旦血液由来の他の成分と分離する操作によ
り、ＨＢｃＡｇに対する人由来抗体の濃度を一部減少さ
せた試料が用いられる。Ｄａｎｅ粒子を他の成分と分離
して一部減少させる操作については、前述のように、Ｄ
ａｎｅ粒子にＨＢｓＡｂとの免疫凝集物を形成させ、そ
の後に遠心分離する方法（J. Immunology、第 117巻、 1
02−105 頁、1976）、超遠心を利用する方法（Gastroen
terology、第80巻、1420−1427頁、1981）、ＨＢｓＡｇ
に対する免疫グロブリンを結合させた不溶性担体で一旦
Ｄａｎｅ粒子を分離する方法（特公平５−７６５８２）
などが利用できるが、特殊な装置や器具を使用せずにＤ
ａｎｅ粒子の濃縮効果が期待できる事から、Ｄａｎｅ粒
子にＨＢｓＡｂとの免疫凝集物を形成させ、その後に遠
心分離する方法が好適に利用できる。

【００２２】ＨＢｃＡｂ破壊後にＨＢｓＡｇ外皮を破壊
するのに適する薬剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、ドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウム、臭化セチル
トリメチルアンモニウム、塩化ドデシルピリミジニウ
ム、パルミトイルリソレシチン、ドデシル−Ｎ−ベタイ
ン、ポリオキシエチレン−アルコール、ポリオキシエチ
レン−イソアルコール、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−
オクチルフェノール、ポリオキシエチレン−ノニルフェ
ノール、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオ
キシエチレンソルビトールエステル、ドデシルスルホン
酸ナトリウム、臭化テトラデシルアンモニウムおよびサ
ポニンのような界面活性剤である。これらのうち特に好
適な界面活性剤は、非イオン系の界面活性剤であり、特
にポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Brij）、
トリトン（Triton）、ノニデット（Nonidet ）Ｐ40およ
びツイーン（Ｔｗｅｅｎ）などがあげられる。

【００２３】中でもノニデット（Nonidet ）Ｐ40が好ま
しく用いられる。

【００２４】上述のように、本発明は試料中に存在する
微生物の内部抗原を放出させ、微生物の内部抗原量を定
量するものであるが、その定量方法は内部抗原に対する
免疫グロブリンとインキュベーションさせ、結合した内
部抗原量を免疫化学分析の分野で知られている、例えば
凝集法やサンドイッチ法などの任意の方法である。

【００２５】内部抗原としてＢ型肝炎ウイルスコア抗原
を測定する場合を例にあげ詳細を説明すると、凝集法を
用いる場合、ＨＢｃＡｇに対する免疫グロブリンは一般
に、赤血球やラテックスなどの粒子に結合して使用され
る。ＨＢｃＡｇが存在すれば、これらの粒子の凝集をも
たらし、ＨＢｃＡｇ量を測定することができる。

【００２６】サンドイッチ法を用いる場合、試料中のＨ
ＢｃＡｇは、放射性同位元素あるいは酵素などにより標
識化された抗ＨＢｃＡｇ免疫グロブリンと、不溶性担体
に結合した同一かあるいは別の抗ＨＢｃＡｇ免疫グロブ
リンとに、同時にかあるいは段階的にインキュベート
し、いわゆるサンドイッチ構造物を形成させる。その後
に通常、不溶性担体と結合した標識体の量を測定するこ
とによりＨＢｃＡｇ量が測定できる。

【００２７】

【実施例】

参考例 １．血清中のＨＢｃＡｂの減少 Ａ．検体と試薬 血清中のＨＢＶ−ＤＮＡ量は、小西ら
（医学と薬学、第２８巻、 813-823頁、1992）に開示さ
れた化学発光法によるＨＢＶ−ＤＮＡ定量法で測定し
た。４８８０ｐｇ／ｍｌのＨＢＶ−ＤＮＡを含む慢性Ｂ
型肝炎患者の血清をＨＢＶ−ＤＮＡを含まない正常ヒト
血清で１０倍ずつ２段階に希釈した。それぞれの希釈血
清には、３１１ｐｇ／ｍｌ、４９ｐｇ／ｍｌのＨＢＶ−
ＤＮＡが含まれていた。以下、未希釈の高力価血清を
Ｈ、希釈の順番にＭ、Ｌ血清と記す。ＨＢｃＡｂ量は、
凝集法である三光純薬社製セロクリット−抗ＨＢｃある
いは競合法ＥＩＡである日本ロシュ社製コバスコアAnti
-HBc EIAを用いて測定した。

【００２８】Ｂ．血清中のＨＢｃＡｂの減少 プロナーゼ処理・熱処理 ５０μｌのＨ、Ｍ、Ｌ血
清にＰＢＳに溶解した１２．５μｌの５ｍｇ／ｍｌプロ
ナーゼ（科研製薬社製、商品名アクチナーゼＥ）を加え
て、３７℃で一夜、７０あるいは８０℃で30分間処理し
た。プロナーゼの活性を停止するために１２．５μｌの
５００ｍＭＥＤＴＡを添加後、コバスコアAnti-HBc EIA
でＨＢｃＡｂを測定した。結果を表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】８０℃の処理により、ＨＢｃＡｂ力価に応
じて、血清中のＨＢｃＡｂ力価が減少した。また通常、
血清に６０℃以上の熱処理を施すと、凝固反応が進行し
てその後の処理が困難になるが、プロナーゼを添加する
ことにより、この現象が回避できた。プロナーゼ添加に
より、ＨＢｃＡｂの分解が促進するとともに、血清中の
各種蛋白質が小分子量化して凝固しにくくなったと考え
られる。

【００３１】熱アルカリ処理５０μｌのＨ、Ｍ、Ｌ血
清に、１２．５μｌの０．１規定水酸化ナトリウムを加
えて、７０あるいは８０℃で３０分間処理した。溶液の
ｐＨを中性に戻すために１２．５μｌの０．１規定塩酸
を添加後、セロクリット−抗ＨＢｃでＨＢｃＡｂを測定
した。結果を表２に示す。

【００３２】

【表２】

【００３３】温度上昇に伴い、血清中のＨＢｃＡｂ力価
が減少した。また、プロナーゼ添加の場合に見られたの
と同様に、血清をアルカリ条件下にすることによっても
凝固現象を避ける事ができた。

【００３４】Ｄａｎｅ粒子の濃縮 Ｄａｎｅ粒子
は、外皮にＨＢｓＡｇを有し、これに対する免疫グロブ
リンと反応して凝集物を形成する（Lancet、第１巻、 6
95−698頁、1970）。また、この凝集物を低速遠心分離
で濃縮洗浄を繰り返して、血清中の他の成分を除く試み
もあった（J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、19
76）が、超遠心を繰り返しても血清中に存在していたＨ
ＢｓＡｂを完全に除く事は大変な手間である事も明らか
であった（Gastroenterology、第80巻、1420−1427頁、
1981）。

【００３５】１ｍｌのＨ、Ｍ、Ｌ血清に１μｇの抗ＨＢ
ｓＡｇモノクローナル抗体（日本バイオテスト社製ＨＢ
−０２１）を添加して、３７℃で３０分間インキュベー
トした後に、 12000ｒｐｍ、３０分間の遠心分離操作を
行なった。沈殿を１ｍｌのＰＢＳに懸濁して、そのＨＢ
ｃＡｂ価をセロクリット−抗ＨＢｃとコバスコアAnti-H
Bcで測定した。結果を表３に示した。

【００３６】

【表３】

【００３７】過去の研究例が示すように、Ｄａｎｅ粒子
の濃縮操作だけでは、完全にＨＢｃＡｂを除去できなか
った。

【００３８】Ｄａｎｅ粒子濃縮後の熱処理あるいは熱
アルカリ処理 上記のように調製したDane粒子沈殿
物を、上記あるいはのようにプロナーゼ熱処理ある
いは熱アルカリ処理してＨＢｃＡｂ価を測定した。結果
を表４と表５に示す。

【００３９】

【表４】

【００４０】

【表５】

【００４１】、、それぞれ単独の処理では十分に
ＨＢｃＡｂ価は減少しなかったが、表５に示すように、
Ｄａｎｅ粒子濃縮後に５６〜６５℃の熱アルカリ処理を
組合わせることにより、血清由来のＨＢｃＡｂ価をほぼ
消滅させることが可能になった。

【００４２】参考例 ２．血清中のＤａｎｅ粒子の濃縮 ヒト正常血清で適当に希釈した５００μｌあるいは１ｍ
ｌのＨＢＶ−ＤＮＡ陽性血清に１μｇの抗ＨＢｓＡｇ抗
体（日本バイオテスト社製ＨＢ−０２１）を添加して、
３７℃で３０分間インキュベートした後に、 12000ｒｐ
ｍ、３０分間の遠心分離操作を行なった。沈殿を５０μ
ｌのＰＢＳに懸濁して、その全量を化学発光法によるＨ
ＢＶ−ＤＮＡ定量法で測定した。結果を表６に示す。表
６に示すように、１〜1000倍に希釈したＤａｎｅ粒子含
有血清から、定量的にＤａｎｅ粒子が濃縮されているこ
とが、ＨＢＶ−ＤＮＡを定量することにより判明した。

【００４３】

【表６】

【００４４】実施例１ Ａ．検体と試薬 特開昭６０−１４３７７２号公報に
開示された方法を用いてＤａｎｅ粒子を調製して用い
た。対照として、正常ヒト血清に精製したＤａｎｅ粒子
を添加して用いた。検体中のＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ力
価は、それぞれダイナボット社製オースザイムIIあるい
はダイナボット社製ＨＢｅ・ＥＩＡ「アボット」で測定
した。ＨＢｃＡｂは、セロクリット−抗ＨＢｃを用いて
測定した。またナカネらの方法（J. Histochem. Cytoch
em.、第２２巻、1084−1091頁、1974）にしたがって、Ｈ
ＢｃＡｇに対する免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキ
シダーゼとの結合体を調製して使用した。ｐＨ９．０の
重炭酸塩緩衝液中に溶解したＨＢｃＡｇに対するモノク
ローナル抗体（ＷＢＡＧ社製Ｃ４Ａ７）をポリスチレン
製マイクロタイタープレートで、４℃一夜、さらに０．
５％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳで４℃一夜インキ
ュベートすることにより、固相を調製し、使用直前に
０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄して
使用した。

【００４５】Ｂ．手順 ウイルス濃縮 １ｍｌの血清に１μｇの抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体（日本バイオテスト社製ＨＢ−０２１）を添加し
て、３７℃で３０分間インキュベートした後に、12000
ｒｐｍ、３０分間の遠心分離操作を行なった。

【００４６】ＨＢｃＡｂ破壊 上記沈殿をＰＢＳに
溶解した２５μｌの５ｍｇ／ｍｌプロナーゼに懸濁し
て、５６℃で１５分インキュベートした。２５μｌの
０．０８規定水酸化ナトリウムを加えて、さらに５６℃
で１５分インキュベートした後、１００ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ７．０に溶解した２５μｌの０．０４規定
塩酸と２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添
加した。

【００４７】ウイルス破壊および固相による捕捉
上記抗体破壊液に対して、ＰＢＳに溶解した25μｌの５
％ノニデットＰ４０、０．５％２−メルカプトエタノー
ルを添加して、前記抗体固相化マイクロプレートに移し
て、３７℃で２時間インキュベートした。

【００４８】サンドイッチ検出 上記のマイクロプ
レートを、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ
で２回洗浄してから、０．２５％の牛血清アルブミンを
含むＰＢＳに溶解した１００μｌの１μｇ／ｍｌ西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識抗体を添加して、３７℃で２
時間インキュベートした。０．０２％のＴｗｅｅｎ−２
０を含むＰＢＳで２回洗浄してから、１５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、ｐＨ５．０に溶解した１００μｌの０．２ｍ
ｇ／ｍｌｏ−フェニレンジアミン、０．２ｍｇ／ｍｌ過
酸化水素を添加し、３７℃で３０分インキュベートした
後、１００μｌの０．２規定硫酸を加えて反応を停止し
た。このようにして得られた溶液の４９２ｎｍの吸光度
を光度計で測定した。

【００４９】Ｃ．結果 結果を表７に示した。表７上
段に示したように、Ｄａｎｅ粒子を含む血清中にＨＢｃ
Ａｂが存在しなければ、Ｄａｎｅ粒子を濃縮後に、ウイ
ルス破壊を行なうだけで、ＨＢｃＡｇが検出できた（表
７上段第２列）。さらに抗体破壊の操作を加えることに
より信号量が増大したのは、精製されたＤａｎｅ粒子に
検出限界以下のＨＢｃＡｂがまだ混入しているからかも
しれない。そして表７下段に示したように、実際の臨床
検体には多量のＨＢｃＡｂが含まれており、ウイルス濃
縮後にウイルス破壊を行なっただけでは、全くＨＢｃＡ
ｇは検出されなかった（表７下段第２列）。しかしなが
ら、抗体破壊を行なってからサンドイッチ検出を行なう
ことにより、臨床検体中のＨＢｃＡｇ量が測定できるよ
うになったと結論する事ができる（表７下段第３列）。

【００５０】

【表７】

【００５１】

【発明の効果】本発明において、微生物内部中に存在す
る抗原をそれに対する抗体が大量に存在する試料中から
定量する簡便な方法、特に大量にＨＢｃＡｂを含む試料
中に存在するＨＢｃＡｇを定量的に検出する簡便な方法
を見出だした。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料中に存在する微生物の内部抗原に対す
   る抗体を不活化した後、微生物の表面構造物を破壊する
   ことにより微生物内部抗原を放出させ、微生物の内部抗
   原量を定量することを特徴とする免疫化学的測定方法。
2. 【請求項２】微生物の内部抗原に対する抗体を不活化す
   る手段として、酵素処理、熱処理、酸・アルカリ処理、
   変性剤処理、有機溶剤処理のいずれかあるいはそれを組
   合わせ不活化することを特徴とする請求項１記載の免疫
   化学的測定方法。
3. 【請求項３】微生物が細菌、ウイルス、酵母、または黴
   であることを特徴とする請求項１記載の免疫化学的測定
   方法。
4. 【請求項４】試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコア抗
   原に対する抗体を不活化してから、Ｂ型肝炎ウイルス表
   面抗原外皮を破壊することによりＢ型肝炎ウイルスコア
   抗原を放出させ、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原量を定量す
   ることを特徴とする請求項１〜３記載の免疫化学的測定
   方法。
5. 【請求項５】Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体を
   不活化するに際し、あらかじめＢ型肝炎ウイルス表面抗
   原に対する免疫グロブリンによって処理した対象試料を
   用いることを特徴とする請求項４記載の免疫化学的測定
   方法。
6. 【請求項６】Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体を
   不活化する手段として、蛋白質分解酵素処理、熱処理、
   アルカリ処理のいずれかあるいはそれを組合わせ不活化
   することを特徴とする請求項４記載の免疫化学的測定方
   法。
7. 【請求項７】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原外皮を破壊して
   Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原を放出させる薬剤として、界
   面活性剤を用いることを特徴とする請求項４記載の免疫
   化学的測定方法。
8. 【請求項８】Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原量を測定するに
   際し、酵素を標識試薬として用いることを特徴とする請
   求項４記載の免疫化学的測定方法。