JPH0850133A - 免疫化学的測定方法 - Google Patents
免疫化学的測定方法Info
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- JPH0850133A JPH0850133A JP18447494A JP18447494A JPH0850133A JP H0850133 A JPH0850133 A JP H0850133A JP 18447494 A JP18447494 A JP 18447494A JP 18447494 A JP18447494 A JP 18447494A JP H0850133 A JPH0850133 A JP H0850133A
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- Japan
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- hepatitis
- virus
- antigen
- microorganism
- hbcag
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】試料中に存在する微生物の内部抗原に対する抗
体を不活化した後、微生物の表面構造物を破壊すること
により微生物内部抗原を放出させ、微生物の内部抗原量
を定量することを特徴とする免疫化学的測定方法。 【効果】 微生物中の抗原量がそれに対する抗体が大量
に含まれる試料中においても簡便に測定できるようにな
り、特にB型肝炎Dane粒子の構成成分であるHBc
Agを免疫化学的手法で測定することにより、B型肝炎
ウイルス量の血中内変化を簡便な手法により直接的定量
的に把握することが可能となった。
体を不活化した後、微生物の表面構造物を破壊すること
により微生物内部抗原を放出させ、微生物の内部抗原量
を定量することを特徴とする免疫化学的測定方法。 【効果】 微生物中の抗原量がそれに対する抗体が大量
に含まれる試料中においても簡便に測定できるようにな
り、特にB型肝炎Dane粒子の構成成分であるHBc
Agを免疫化学的手法で測定することにより、B型肝炎
ウイルス量の血中内変化を簡便な手法により直接的定量
的に把握することが可能となった。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物内部に存在する
抗原の定量的測定方法に関するものである。
抗原の定量的測定方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】通常、細菌、ウイルス、酵母、黴などの
微生物はヒト体内では生体内防御機構いわゆる免疫によ
って駆逐され成育できない。その免疫力を発揮する主な
因子の一つが抗体であり、一度感染罹病した病原微生物
や、通常環境中に常在する微生物に対しては、ヒトは血
中にその抗体を有するか、迅速に血中抗体量を上昇させ
ることができる。
微生物はヒト体内では生体内防御機構いわゆる免疫によ
って駆逐され成育できない。その免疫力を発揮する主な
因子の一つが抗体であり、一度感染罹病した病原微生物
や、通常環境中に常在する微生物に対しては、ヒトは血
中にその抗体を有するか、迅速に血中抗体量を上昇させ
ることができる。
【0003】しかしながら、昨今諸事情により免疫力の
低下した患者が増えており、いわゆる日和見感染が大き
な問題となりつつある。このような病態時には、常在す
る日和見感染病因菌に対する抗体を含む健常者血清から
免疫グロブリンを取得し、抗菌剤の補助療法として、免
疫力の低下した患者に投与されだした。すなわち、人為
的に、自然には生じないような量比の抗原と抗体が一時
的に血中に共存する時期が生み出されている。
低下した患者が増えており、いわゆる日和見感染が大き
な問題となりつつある。このような病態時には、常在す
る日和見感染病因菌に対する抗体を含む健常者血清から
免疫グロブリンを取得し、抗菌剤の補助療法として、免
疫力の低下した患者に投与されだした。すなわち、人為
的に、自然には生じないような量比の抗原と抗体が一時
的に血中に共存する時期が生み出されている。
【0004】また、宿主の免疫力の低下を待って盛んに
増殖するウイルスの存在様式は潜伏感染と呼ばれ体内で
抗体反応の及ばない神経系などに巣くっている。この場
合にも、一般に血中抗体量は増えている。ヘルペスウイ
ルスやサイトメガロウイルスがこの感染様式をとる。さ
らに体内で増殖しながら免疫を掻い潜る微生物も存在す
る。持続感染と呼ばれるこの様式は、B型肝炎ウイル
ス、C型肝炎ウイルス、歯周病起因細菌などにみられ、
宿主が抗体量を上昇させているその環境下で、それぞれ
異なるメカニズムにより成育を続けて宿主を蝕んでい
く。
増殖するウイルスの存在様式は潜伏感染と呼ばれ体内で
抗体反応の及ばない神経系などに巣くっている。この場
合にも、一般に血中抗体量は増えている。ヘルペスウイ
ルスやサイトメガロウイルスがこの感染様式をとる。さ
らに体内で増殖しながら免疫を掻い潜る微生物も存在す
る。持続感染と呼ばれるこの様式は、B型肝炎ウイル
ス、C型肝炎ウイルス、歯周病起因細菌などにみられ、
宿主が抗体量を上昇させているその環境下で、それぞれ
異なるメカニズムにより成育を続けて宿主を蝕んでい
く。
【0005】いずれにしても、抗体が存在すれば異種抗
原である微生物は駆逐されるといった従来のような単純
な機構では説明できない微生物感染が問題視されてお
り、そのような状況下での微生物の定量法が望まれてい
る。
原である微生物は駆逐されるといった従来のような単純
な機構では説明できない微生物感染が問題視されてお
り、そのような状況下での微生物の定量法が望まれてい
る。
【0006】B型肝炎ウイルス(HBV)の感染性粒子
は、直径42nmの二重構造粒子、Dane粒子であ
る。その外皮のリポ蛋白質の示す抗原性がHBs抗原
(HBsAg)であり、内部の直径27nmのヌクレオ
カプシドを形成する粒子(コア粒子)の示す抗原性がH
Bc抗原(HBcAg)である。肝細胞にHBVが感染
すると、細胞質内で外皮が外され、コア粒子中の部分二
本鎖ウイルスDNAの情報が読まれて、ウイルス関連の
蛋白質が合成されたり、ウイルスDNAの複製が行なわ
れ、細胞質内でコア粒子が増幅される。増幅したコア粒
子は、細胞質内で外皮を被ってDane粒子となり、コ
ア粒子を持たない多数の管状粒子、球型粒子(HBsA
g)とともに血液中に放出される。
は、直径42nmの二重構造粒子、Dane粒子であ
る。その外皮のリポ蛋白質の示す抗原性がHBs抗原
(HBsAg)であり、内部の直径27nmのヌクレオ
カプシドを形成する粒子(コア粒子)の示す抗原性がH
Bc抗原(HBcAg)である。肝細胞にHBVが感染
すると、細胞質内で外皮が外され、コア粒子中の部分二
本鎖ウイルスDNAの情報が読まれて、ウイルス関連の
蛋白質が合成されたり、ウイルスDNAの複製が行なわ
れ、細胞質内でコア粒子が増幅される。増幅したコア粒
子は、細胞質内で外皮を被ってDane粒子となり、コ
ア粒子を持たない多数の管状粒子、球型粒子(HBsA
g)とともに血液中に放出される。
【0007】B型肝炎の診断は、通常、血液中にB型肝
炎ウイルス表面抗原(HBsAg)を検出することによ
って行なわれる。しかしながら、HBsAgの抗原の存
在または血液中の濃度に関する情報は、B型肝炎におい
て感染時期や感染性粒子の量を正確に示すものではな
く、慢性の同疾患においてむしろ肝障害の進行によって
血中HBsAg濃度が下がるなど、ウイルス増殖の判定
に用いることができない。
炎ウイルス表面抗原(HBsAg)を検出することによ
って行なわれる。しかしながら、HBsAgの抗原の存
在または血液中の濃度に関する情報は、B型肝炎におい
て感染時期や感染性粒子の量を正確に示すものではな
く、慢性の同疾患においてむしろ肝障害の進行によって
血中HBsAg濃度が下がるなど、ウイルス増殖の判定
に用いることができない。
【0008】また、ウイルス増殖の判定に用いることが
できる代表的HBVマーカーがHBe抗原(HBeA
g)であって、未症候性のキャリアや慢性肝炎の経過を
観察する上でも、治療をモニタリングする上でも最も有
効な指標となってきた。HBeAgはHBVに感染した
肝細胞から持続的に血中に放出され、HBeAg陽性血
液中には、Dane粒子が多くウイルスに関連したDN
Aポリメラーゼの活性も高いことが知られており、ウイ
ルス活動性の間接的定性的指標になってきた。しかしな
がら、HBeAg陽性からHBeAg陰性・HBe抗体
(HBeAb)陽性へのセロコンバージョンが、常にH
BeAgの質的変化(変異)に基づく現象である事が明
らかになり、多くの場合ウイルス活動性の減少を反映す
るものの、ウイルスの量的変化を完全に反映できない例
がある事が示唆され問題となっている。またB型肝炎治
療法の進歩に伴い、ウイルス活動性の直接的定量的判定
法が望まれるようにもなってきた。
できる代表的HBVマーカーがHBe抗原(HBeA
g)であって、未症候性のキャリアや慢性肝炎の経過を
観察する上でも、治療をモニタリングする上でも最も有
効な指標となってきた。HBeAgはHBVに感染した
肝細胞から持続的に血中に放出され、HBeAg陽性血
液中には、Dane粒子が多くウイルスに関連したDN
Aポリメラーゼの活性も高いことが知られており、ウイ
ルス活動性の間接的定性的指標になってきた。しかしな
がら、HBeAg陽性からHBeAg陰性・HBe抗体
(HBeAb)陽性へのセロコンバージョンが、常にH
BeAgの質的変化(変異)に基づく現象である事が明
らかになり、多くの場合ウイルス活動性の減少を反映す
るものの、ウイルスの量的変化を完全に反映できない例
がある事が示唆され問題となっている。またB型肝炎治
療法の進歩に伴い、ウイルス活動性の直接的定量的判定
法が望まれるようにもなってきた。
【0009】感染性を有するウイルス量の血中内変化を
直接的定量的に把握するために、Dane粒子の構成成
分であるHBV−DNAやDNAポリメラーゼを検査す
ることは既に日常的である。しかしながら、これらの方
法は、時間や手間、費用のかかる方法であり、さらに放
射性同位元素を使用する場合もあって、限られた施設で
しか普及していなかった。
直接的定量的に把握するために、Dane粒子の構成成
分であるHBV−DNAやDNAポリメラーゼを検査す
ることは既に日常的である。しかしながら、これらの方
法は、時間や手間、費用のかかる方法であり、さらに放
射性同位元素を使用する場合もあって、限られた施設で
しか普及していなかった。
【0010】ウイルス量の血中内変化を直接的定量的に
把握するもう一つの手段は、やはりDane粒子の構成
成分であるB型肝炎ウイルスコア抗原(HBcAg)を
測定することであり、免疫化学的手法を適用することに
より、時間や手間、費用を減ずる事ができると考えられ
るが、現実的に普及していないのは、以下のような理由
があった。
把握するもう一つの手段は、やはりDane粒子の構成
成分であるB型肝炎ウイルスコア抗原(HBcAg)を
測定することであり、免疫化学的手法を適用することに
より、時間や手間、費用を減ずる事ができると考えられ
るが、現実的に普及していないのは、以下のような理由
があった。
【0011】前述のように、HBcAgは血液中におい
てはHBsAgの外皮を被って存在するために、そのま
まではHBcAgとして測定することはできない。Da
ne粒子を界面活性剤などで処理し、外皮を取り除くこ
とができることは判明していたが、一般にB型肝炎患者
の血液中にはHBcAgに対する抗体(HBcAb)が
高力価に存在し、血液中でHBcAgを放出させると大
過剰のHBcAbと抗原抗体反応物を形成して、以後免
疫化学的手法を適用できなくなる。
てはHBsAgの外皮を被って存在するために、そのま
まではHBcAgとして測定することはできない。Da
ne粒子を界面活性剤などで処理し、外皮を取り除くこ
とができることは判明していたが、一般にB型肝炎患者
の血液中にはHBcAgに対する抗体(HBcAb)が
高力価に存在し、血液中でHBcAgを放出させると大
過剰のHBcAbと抗原抗体反応物を形成して、以後免
疫化学的手法を適用できなくなる。
【0012】そこでDane粒子と血液中のHBcAb
とを分離するために、Dane粒子にHBsAbとの免
疫凝集物を形成させ、その後に遠心分離洗浄を繰り返す
方法(J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、197
6)、超遠心を利用する方法(Gastroenterology、第80
巻、1420−1427頁、1981)、HBsAgに対する免疫グ
ロブリンを結合させた不溶性担体で一旦Dane粒子を
分離する方法(特公平5−76582)などが開示され
てきたが、いずれも時間や手間あるいは特別な器具が必
要であり、また試料中のHBcAbの除去も不十分であ
った。
とを分離するために、Dane粒子にHBsAbとの免
疫凝集物を形成させ、その後に遠心分離洗浄を繰り返す
方法(J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、197
6)、超遠心を利用する方法(Gastroenterology、第80
巻、1420−1427頁、1981)、HBsAgに対する免疫グ
ロブリンを結合させた不溶性担体で一旦Dane粒子を
分離する方法(特公平5−76582)などが開示され
てきたが、いずれも時間や手間あるいは特別な器具が必
要であり、また試料中のHBcAbの除去も不十分であ
った。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物内部中に存在する抗原をそれに対する抗体が大量に存
在する試料中から定量する簡便な方法を提供するもので
あり、たとえば、大量にHBcAbを含む試料中に存在
するHBcAgを定量的に検出し得る簡便な方法を提供
することにある。
物内部中に存在する抗原をそれに対する抗体が大量に存
在する試料中から定量する簡便な方法を提供するもので
あり、たとえば、大量にHBcAbを含む試料中に存在
するHBcAgを定量的に検出し得る簡便な方法を提供
することにある。
【0014】
【課題を解決するための手段】これを達成するために本
発明による方法は、試料中に存在する微生物の内部抗原
に対する抗体を不活化した後、微生物の表面構造物を破
壊することにより微生物内部抗原を放出させ、微生物の
内部抗原量を定量することを特徴とする免疫化学的測定
方法に関するものである。
発明による方法は、試料中に存在する微生物の内部抗原
に対する抗体を不活化した後、微生物の表面構造物を破
壊することにより微生物内部抗原を放出させ、微生物の
内部抗原量を定量することを特徴とする免疫化学的測定
方法に関するものである。
【0015】本発明における微生物とは細菌,ウイル
ス,酵母が好ましく用いられ、例えば日和見感染により
敗血症を起こさせる主原因となる黄色ブドウ球菌、表皮
ブドウ球菌、E.faecalis, 緑膿菌や大腸菌群、歯周病起
因細菌であるP.gingivalisやA.actinomycetemcomitans
,持続感染ウイルスであるB型肝炎ウイルスやC型肝
炎ウイルスが挙げられる。
ス,酵母が好ましく用いられ、例えば日和見感染により
敗血症を起こさせる主原因となる黄色ブドウ球菌、表皮
ブドウ球菌、E.faecalis, 緑膿菌や大腸菌群、歯周病起
因細菌であるP.gingivalisやA.actinomycetemcomitans
,持続感染ウイルスであるB型肝炎ウイルスやC型肝
炎ウイルスが挙げられる。
【0016】本発明は宿主によって以前に免疫反応を受
けたことにより、その抗体価が上昇しているものの試料
中の抗体とは直接的には反応しない微生物の内部に存在
する抗原を定量するために、試料中に存在するその抗体
を不活化した後、微生物表面構造物を破壊し内部抗原を
放出させ、定量するものであるが、この不活化手段とし
ては酵素処理、熱処理、酸・アルカリ処理、変性剤処
理、有機溶剤処理のいずれかあるいはそれらを組み合わ
せ行なうことができる。
けたことにより、その抗体価が上昇しているものの試料
中の抗体とは直接的には反応しない微生物の内部に存在
する抗原を定量するために、試料中に存在するその抗体
を不活化した後、微生物表面構造物を破壊し内部抗原を
放出させ、定量するものであるが、この不活化手段とし
ては酵素処理、熱処理、酸・アルカリ処理、変性剤処
理、有機溶剤処理のいずれかあるいはそれらを組み合わ
せ行なうことができる。
【0017】中でも、本発明の好ましい1例としてB型
肝炎ウイルスの内部に存在する抗原であるB型肝炎ウイ
ルスコア抗原量を定量する場合を例にあげて本願発明を
説明する。
肝炎ウイルスの内部に存在する抗原であるB型肝炎ウイ
ルスコア抗原量を定量する場合を例にあげて本願発明を
説明する。
【0018】すなわち、試料中に存在するB型肝炎ウイ
ルスコア抗原に対する抗体(HBcAb)を不活化して
から、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)外皮を
破壊することによりB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc
Ag)を放出させ、得られた溶液をHBcAgに対する
免疫グロブリンとインキュベーションし、HBcAgに
結合した免疫グロブリン量を測定して、試料中のHBc
Ag量を定量するものである。
ルスコア抗原に対する抗体(HBcAb)を不活化して
から、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)外皮を
破壊することによりB型肝炎ウイルスコア抗原(HBc
Ag)を放出させ、得られた溶液をHBcAgに対する
免疫グロブリンとインキュベーションし、HBcAgに
結合した免疫グロブリン量を測定して、試料中のHBc
Ag量を定量するものである。
【0019】試料中に存在するB型肝炎ウイルスコア抗
原に対する抗体(HBcAb)の不活化に際しては、既
に知られている天然型のHBcAgの安定性(J. gen.
Virol.,第65巻、 405-414頁、1984)あるいは組換え型
のHBcAgの安定性(J. Clin. Microbiol.、第30
巻、1617−1619頁、1992)を考慮して、温度、pH、界
面活性剤、還元剤、有機溶剤、カオトロピックイオン、
蛋白分解酵素などの条件を変化させることにより、HB
cAgを破壊せずにHBcAbを破壊する条件を選択し
て、HBcAbの不活化が実施できる事を見出だした。
例えば、J. gen.Virol.,第65巻、 405-414頁、1984
を参考にするならば、37℃下10時間処理や56℃下
4時間などの熱処理、pH11.5による処理、還元剤
である0.5M2−メルカプトエタノール処理、カオト
ロピックイオンである3Mチオシアン酸アンモニウムや
6M尿素処理などによって、天然型のHBcAgの抗原
性は保たれる事が示されている。J. Clin. Microbio
l.、第30巻、1617−1619頁、1992 を参考にするなら
ば、70℃下1時間処理や80℃下30分などの熱処
理、pH10.5やpH5.0による処理、界面活性剤
である4%SDSによる24時間処理、還元剤である4
0mM2−メルカプトエタノールによる48時間処理、
有機溶剤である50%メタノールや50%エタノール処
理、蛋白分解酵素であるトリプシンやキモトリプシン処
理などによって、組換え型のHBcAgの抗原性は保た
れる事が示されている。これらの知見により、一般の蛋
白質にとっては過酷ともいえる条件下でHBcAgが安
定であることを利用し、HBcAgを破壊せずにHBc
Abを破壊する最適の下記条件を見出だした。
原に対する抗体(HBcAb)の不活化に際しては、既
に知られている天然型のHBcAgの安定性(J. gen.
Virol.,第65巻、 405-414頁、1984)あるいは組換え型
のHBcAgの安定性(J. Clin. Microbiol.、第30
巻、1617−1619頁、1992)を考慮して、温度、pH、界
面活性剤、還元剤、有機溶剤、カオトロピックイオン、
蛋白分解酵素などの条件を変化させることにより、HB
cAgを破壊せずにHBcAbを破壊する条件を選択し
て、HBcAbの不活化が実施できる事を見出だした。
例えば、J. gen.Virol.,第65巻、 405-414頁、1984
を参考にするならば、37℃下10時間処理や56℃下
4時間などの熱処理、pH11.5による処理、還元剤
である0.5M2−メルカプトエタノール処理、カオト
ロピックイオンである3Mチオシアン酸アンモニウムや
6M尿素処理などによって、天然型のHBcAgの抗原
性は保たれる事が示されている。J. Clin. Microbio
l.、第30巻、1617−1619頁、1992 を参考にするなら
ば、70℃下1時間処理や80℃下30分などの熱処
理、pH10.5やpH5.0による処理、界面活性剤
である4%SDSによる24時間処理、還元剤である4
0mM2−メルカプトエタノールによる48時間処理、
有機溶剤である50%メタノールや50%エタノール処
理、蛋白分解酵素であるトリプシンやキモトリプシン処
理などによって、組換え型のHBcAgの抗原性は保た
れる事が示されている。これらの知見により、一般の蛋
白質にとっては過酷ともいえる条件下でHBcAgが安
定であることを利用し、HBcAgを破壊せずにHBc
Abを破壊する最適の下記条件を見出だした。
【0020】すなわち、本発明において試料中に存在す
るHBcAbを不活化する手段としては、蛋白質分解酵
素処理、熱処理、アルカリ処理のいずれかあるいはそれ
を組合わせることが好ましく行なわれる。例えば蛋白質
分解酵素処理としてはプロナーゼ、プロテアーゼK、ト
リプシン、キモトリプシンなどであり、熱処理温度とし
ては好ましくは37ー80℃であり、アルカリ処理とし
てはpH9以上が好ましく行なわれる。これらの不活化
手段は各々単独で行なってもよいし、2種以上組み合わ
せても構わない。さらに好ましくは3種の組み合わせで
ある熱処理、蛋白質分解処理およびアルカリ処理を使用
するのが好ましい。
るHBcAbを不活化する手段としては、蛋白質分解酵
素処理、熱処理、アルカリ処理のいずれかあるいはそれ
を組合わせることが好ましく行なわれる。例えば蛋白質
分解酵素処理としてはプロナーゼ、プロテアーゼK、ト
リプシン、キモトリプシンなどであり、熱処理温度とし
ては好ましくは37ー80℃であり、アルカリ処理とし
てはpH9以上が好ましく行なわれる。これらの不活化
手段は各々単独で行なってもよいし、2種以上組み合わ
せても構わない。さらに好ましくは3種の組み合わせで
ある熱処理、蛋白質分解処理およびアルカリ処理を使用
するのが好ましい。
【0021】本発明で測定する試料は、一般的な生体試
料や人為的に調製された溶液などなんでも良いが、好ま
しくは、人血液あるいはそれに由来する血清や血漿が用
いられる。さらに好適には、B型肝炎ウイルスのDan
e粒子を一旦血液由来の他の成分と分離する操作によ
り、HBcAgに対する人由来抗体の濃度を一部減少さ
せた試料が用いられる。Dane粒子を他の成分と分離
して一部減少させる操作については、前述のように、D
ane粒子にHBsAbとの免疫凝集物を形成させ、そ
の後に遠心分離する方法(J. Immunology、第 117巻、 1
02−105 頁、1976)、超遠心を利用する方法(Gastroen
terology、第80巻、1420−1427頁、1981)、HBsAg
に対する免疫グロブリンを結合させた不溶性担体で一旦
Dane粒子を分離する方法(特公平5−76582)
などが利用できるが、特殊な装置や器具を使用せずにD
ane粒子の濃縮効果が期待できる事から、Dane粒
子にHBsAbとの免疫凝集物を形成させ、その後に遠
心分離する方法が好適に利用できる。
料や人為的に調製された溶液などなんでも良いが、好ま
しくは、人血液あるいはそれに由来する血清や血漿が用
いられる。さらに好適には、B型肝炎ウイルスのDan
e粒子を一旦血液由来の他の成分と分離する操作によ
り、HBcAgに対する人由来抗体の濃度を一部減少さ
せた試料が用いられる。Dane粒子を他の成分と分離
して一部減少させる操作については、前述のように、D
ane粒子にHBsAbとの免疫凝集物を形成させ、そ
の後に遠心分離する方法(J. Immunology、第 117巻、 1
02−105 頁、1976)、超遠心を利用する方法(Gastroen
terology、第80巻、1420−1427頁、1981)、HBsAg
に対する免疫グロブリンを結合させた不溶性担体で一旦
Dane粒子を分離する方法(特公平5−76582)
などが利用できるが、特殊な装置や器具を使用せずにD
ane粒子の濃縮効果が期待できる事から、Dane粒
子にHBsAbとの免疫凝集物を形成させ、その後に遠
心分離する方法が好適に利用できる。
【0022】HBcAb破壊後にHBsAg外皮を破壊
するのに適する薬剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、ドデシルN−サルコシン酸ナトリウム、臭化セチル
トリメチルアンモニウム、塩化ドデシルピリミジニウ
ム、パルミトイルリソレシチン、ドデシル−N−ベタイ
ン、ポリオキシエチレン−アルコール、ポリオキシエチ
レン−イソアルコール、ポリオキシエチレン−p−t−
オクチルフェノール、ポリオキシエチレン−ノニルフェ
ノール、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオ
キシエチレンソルビトールエステル、ドデシルスルホン
酸ナトリウム、臭化テトラデシルアンモニウムおよびサ
ポニンのような界面活性剤である。これらのうち特に好
適な界面活性剤は、非イオン系の界面活性剤であり、特
にポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ(Brij)、
トリトン(Triton)、ノニデット(Nonidet )P40およ
びツイーン(Tween)などがあげられる。
するのに適する薬剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、ドデシルN−サルコシン酸ナトリウム、臭化セチル
トリメチルアンモニウム、塩化ドデシルピリミジニウ
ム、パルミトイルリソレシチン、ドデシル−N−ベタイ
ン、ポリオキシエチレン−アルコール、ポリオキシエチ
レン−イソアルコール、ポリオキシエチレン−p−t−
オクチルフェノール、ポリオキシエチレン−ノニルフェ
ノール、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオ
キシエチレンソルビトールエステル、ドデシルスルホン
酸ナトリウム、臭化テトラデシルアンモニウムおよびサ
ポニンのような界面活性剤である。これらのうち特に好
適な界面活性剤は、非イオン系の界面活性剤であり、特
にポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ(Brij)、
トリトン(Triton)、ノニデット(Nonidet )P40およ
びツイーン(Tween)などがあげられる。
【0023】中でもノニデット(Nonidet )P40が好ま
しく用いられる。
しく用いられる。
【0024】上述のように、本発明は試料中に存在する
微生物の内部抗原を放出させ、微生物の内部抗原量を定
量するものであるが、その定量方法は内部抗原に対する
免疫グロブリンとインキュベーションさせ、結合した内
部抗原量を免疫化学分析の分野で知られている、例えば
凝集法やサンドイッチ法などの任意の方法である。
微生物の内部抗原を放出させ、微生物の内部抗原量を定
量するものであるが、その定量方法は内部抗原に対する
免疫グロブリンとインキュベーションさせ、結合した内
部抗原量を免疫化学分析の分野で知られている、例えば
凝集法やサンドイッチ法などの任意の方法である。
【0025】内部抗原としてB型肝炎ウイルスコア抗原
を測定する場合を例にあげ詳細を説明すると、凝集法を
用いる場合、HBcAgに対する免疫グロブリンは一般
に、赤血球やラテックスなどの粒子に結合して使用され
る。HBcAgが存在すれば、これらの粒子の凝集をも
たらし、HBcAg量を測定することができる。
を測定する場合を例にあげ詳細を説明すると、凝集法を
用いる場合、HBcAgに対する免疫グロブリンは一般
に、赤血球やラテックスなどの粒子に結合して使用され
る。HBcAgが存在すれば、これらの粒子の凝集をも
たらし、HBcAg量を測定することができる。
【0026】サンドイッチ法を用いる場合、試料中のH
BcAgは、放射性同位元素あるいは酵素などにより標
識化された抗HBcAg免疫グロブリンと、不溶性担体
に結合した同一かあるいは別の抗HBcAg免疫グロブ
リンとに、同時にかあるいは段階的にインキュベート
し、いわゆるサンドイッチ構造物を形成させる。その後
に通常、不溶性担体と結合した標識体の量を測定するこ
とによりHBcAg量が測定できる。
BcAgは、放射性同位元素あるいは酵素などにより標
識化された抗HBcAg免疫グロブリンと、不溶性担体
に結合した同一かあるいは別の抗HBcAg免疫グロブ
リンとに、同時にかあるいは段階的にインキュベート
し、いわゆるサンドイッチ構造物を形成させる。その後
に通常、不溶性担体と結合した標識体の量を測定するこ
とによりHBcAg量が測定できる。
【0027】
参考例 1.血清中のHBcAbの減少 A.検体と試薬 血清中のHBV−DNA量は、小西ら
(医学と薬学、第28巻、 813-823頁、1992)に開示さ
れた化学発光法によるHBV−DNA定量法で測定し
た。4880pg/mlのHBV−DNAを含む慢性B
型肝炎患者の血清をHBV−DNAを含まない正常ヒト
血清で10倍ずつ2段階に希釈した。それぞれの希釈血
清には、311pg/ml、49pg/mlのHBV−
DNAが含まれていた。以下、未希釈の高力価血清を
H、希釈の順番にM、L血清と記す。HBcAb量は、
凝集法である三光純薬社製セロクリット−抗HBcある
いは競合法EIAである日本ロシュ社製コバスコアAnti
-HBc EIAを用いて測定した。
(医学と薬学、第28巻、 813-823頁、1992)に開示さ
れた化学発光法によるHBV−DNA定量法で測定し
た。4880pg/mlのHBV−DNAを含む慢性B
型肝炎患者の血清をHBV−DNAを含まない正常ヒト
血清で10倍ずつ2段階に希釈した。それぞれの希釈血
清には、311pg/ml、49pg/mlのHBV−
DNAが含まれていた。以下、未希釈の高力価血清を
H、希釈の順番にM、L血清と記す。HBcAb量は、
凝集法である三光純薬社製セロクリット−抗HBcある
いは競合法EIAである日本ロシュ社製コバスコアAnti
-HBc EIAを用いて測定した。
【0028】B.血清中のHBcAbの減少 プロナーゼ処理・熱処理 50μlのH、M、L血
清にPBSに溶解した12.5μlの5mg/mlプロ
ナーゼ(科研製薬社製、商品名アクチナーゼE)を加え
て、37℃で一夜、70あるいは80℃で30分間処理し
た。プロナーゼの活性を停止するために12.5μlの
500mMEDTAを添加後、コバスコアAnti-HBc EIA
でHBcAbを測定した。結果を表1に示す。
清にPBSに溶解した12.5μlの5mg/mlプロ
ナーゼ(科研製薬社製、商品名アクチナーゼE)を加え
て、37℃で一夜、70あるいは80℃で30分間処理し
た。プロナーゼの活性を停止するために12.5μlの
500mMEDTAを添加後、コバスコアAnti-HBc EIA
でHBcAbを測定した。結果を表1に示す。
【0029】
【表1】
【0030】80℃の処理により、HBcAb力価に応
じて、血清中のHBcAb力価が減少した。また通常、
血清に60℃以上の熱処理を施すと、凝固反応が進行し
てその後の処理が困難になるが、プロナーゼを添加する
ことにより、この現象が回避できた。プロナーゼ添加に
より、HBcAbの分解が促進するとともに、血清中の
各種蛋白質が小分子量化して凝固しにくくなったと考え
られる。
じて、血清中のHBcAb力価が減少した。また通常、
血清に60℃以上の熱処理を施すと、凝固反応が進行し
てその後の処理が困難になるが、プロナーゼを添加する
ことにより、この現象が回避できた。プロナーゼ添加に
より、HBcAbの分解が促進するとともに、血清中の
各種蛋白質が小分子量化して凝固しにくくなったと考え
られる。
【0031】熱アルカリ処理50μlのH、M、L血
清に、12.5μlの0.1規定水酸化ナトリウムを加
えて、70あるいは80℃で30分間処理した。溶液の
pHを中性に戻すために12.5μlの0.1規定塩酸
を添加後、セロクリット−抗HBcでHBcAbを測定
した。結果を表2に示す。
清に、12.5μlの0.1規定水酸化ナトリウムを加
えて、70あるいは80℃で30分間処理した。溶液の
pHを中性に戻すために12.5μlの0.1規定塩酸
を添加後、セロクリット−抗HBcでHBcAbを測定
した。結果を表2に示す。
【0032】
【表2】
【0033】温度上昇に伴い、血清中のHBcAb力価
が減少した。また、プロナーゼ添加の場合に見られたの
と同様に、血清をアルカリ条件下にすることによっても
凝固現象を避ける事ができた。
が減少した。また、プロナーゼ添加の場合に見られたの
と同様に、血清をアルカリ条件下にすることによっても
凝固現象を避ける事ができた。
【0034】Dane粒子の濃縮 Dane粒子
は、外皮にHBsAgを有し、これに対する免疫グロブ
リンと反応して凝集物を形成する(Lancet、第1巻、 6
95−698頁、1970)。また、この凝集物を低速遠心分離
で濃縮洗浄を繰り返して、血清中の他の成分を除く試み
もあった(J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、19
76)が、超遠心を繰り返しても血清中に存在していたH
BsAbを完全に除く事は大変な手間である事も明らか
であった(Gastroenterology、第80巻、1420−1427頁、
1981)。
は、外皮にHBsAgを有し、これに対する免疫グロブ
リンと反応して凝集物を形成する(Lancet、第1巻、 6
95−698頁、1970)。また、この凝集物を低速遠心分離
で濃縮洗浄を繰り返して、血清中の他の成分を除く試み
もあった(J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、19
76)が、超遠心を繰り返しても血清中に存在していたH
BsAbを完全に除く事は大変な手間である事も明らか
であった(Gastroenterology、第80巻、1420−1427頁、
1981)。
【0035】1mlのH、M、L血清に1μgの抗HB
sAgモノクローナル抗体(日本バイオテスト社製HB
−021)を添加して、37℃で30分間インキュベー
トした後に、 12000rpm、30分間の遠心分離操作を
行なった。沈殿を1mlのPBSに懸濁して、そのHB
cAb価をセロクリット−抗HBcとコバスコアAnti-H
Bcで測定した。結果を表3に示した。
sAgモノクローナル抗体(日本バイオテスト社製HB
−021)を添加して、37℃で30分間インキュベー
トした後に、 12000rpm、30分間の遠心分離操作を
行なった。沈殿を1mlのPBSに懸濁して、そのHB
cAb価をセロクリット−抗HBcとコバスコアAnti-H
Bcで測定した。結果を表3に示した。
【0036】
【表3】
【0037】過去の研究例が示すように、Dane粒子
の濃縮操作だけでは、完全にHBcAbを除去できなか
った。
の濃縮操作だけでは、完全にHBcAbを除去できなか
った。
【0038】Dane粒子濃縮後の熱処理あるいは熱
アルカリ処理 上記のように調製したDane粒子沈殿
物を、上記あるいはのようにプロナーゼ熱処理ある
いは熱アルカリ処理してHBcAb価を測定した。結果
を表4と表5に示す。
アルカリ処理 上記のように調製したDane粒子沈殿
物を、上記あるいはのようにプロナーゼ熱処理ある
いは熱アルカリ処理してHBcAb価を測定した。結果
を表4と表5に示す。
【0039】
【表4】
【0040】
【表5】
【0041】、、それぞれ単独の処理では十分に
HBcAb価は減少しなかったが、表5に示すように、
Dane粒子濃縮後に56〜65℃の熱アルカリ処理を
組合わせることにより、血清由来のHBcAb価をほぼ
消滅させることが可能になった。
HBcAb価は減少しなかったが、表5に示すように、
Dane粒子濃縮後に56〜65℃の熱アルカリ処理を
組合わせることにより、血清由来のHBcAb価をほぼ
消滅させることが可能になった。
【0042】参考例 2.血清中のDane粒子の濃縮 ヒト正常血清で適当に希釈した500μlあるいは1m
lのHBV−DNA陽性血清に1μgの抗HBsAg抗
体(日本バイオテスト社製HB−021)を添加して、
37℃で30分間インキュベートした後に、 12000rp
m、30分間の遠心分離操作を行なった。沈殿を50μ
lのPBSに懸濁して、その全量を化学発光法によるH
BV−DNA定量法で測定した。結果を表6に示す。表
6に示すように、1〜1000倍に希釈したDane粒子含
有血清から、定量的にDane粒子が濃縮されているこ
とが、HBV−DNAを定量することにより判明した。
lのHBV−DNA陽性血清に1μgの抗HBsAg抗
体(日本バイオテスト社製HB−021)を添加して、
37℃で30分間インキュベートした後に、 12000rp
m、30分間の遠心分離操作を行なった。沈殿を50μ
lのPBSに懸濁して、その全量を化学発光法によるH
BV−DNA定量法で測定した。結果を表6に示す。表
6に示すように、1〜1000倍に希釈したDane粒子含
有血清から、定量的にDane粒子が濃縮されているこ
とが、HBV−DNAを定量することにより判明した。
【0043】
【表6】
【0044】実施例1 A.検体と試薬 特開昭60−143772号公報に
開示された方法を用いてDane粒子を調製して用い
た。対照として、正常ヒト血清に精製したDane粒子
を添加して用いた。検体中のHBsAg、HBeAg力
価は、それぞれダイナボット社製オースザイムIIあるい
はダイナボット社製HBe・EIA「アボット」で測定
した。HBcAbは、セロクリット−抗HBcを用いて
測定した。またナカネらの方法(J. Histochem. Cytoch
em.、第22巻、1084−1091頁、1974)にしたがって、H
BcAgに対する免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキ
シダーゼとの結合体を調製して使用した。pH9.0の
重炭酸塩緩衝液中に溶解したHBcAgに対するモノク
ローナル抗体(WBAG社製C4A7)をポリスチレン
製マイクロタイタープレートで、4℃一夜、さらに0.
5%の牛血清アルブミンを含むPBSで4℃一夜インキ
ュベートすることにより、固相を調製し、使用直前に
0.02%のTween−20を含むPBSで洗浄して
使用した。
開示された方法を用いてDane粒子を調製して用い
た。対照として、正常ヒト血清に精製したDane粒子
を添加して用いた。検体中のHBsAg、HBeAg力
価は、それぞれダイナボット社製オースザイムIIあるい
はダイナボット社製HBe・EIA「アボット」で測定
した。HBcAbは、セロクリット−抗HBcを用いて
測定した。またナカネらの方法(J. Histochem. Cytoch
em.、第22巻、1084−1091頁、1974)にしたがって、H
BcAgに対する免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキ
シダーゼとの結合体を調製して使用した。pH9.0の
重炭酸塩緩衝液中に溶解したHBcAgに対するモノク
ローナル抗体(WBAG社製C4A7)をポリスチレン
製マイクロタイタープレートで、4℃一夜、さらに0.
5%の牛血清アルブミンを含むPBSで4℃一夜インキ
ュベートすることにより、固相を調製し、使用直前に
0.02%のTween−20を含むPBSで洗浄して
使用した。
【0045】B.手順 ウイルス濃縮 1mlの血清に1μgの抗HBsA
g抗体(日本バイオテスト社製HB−021)を添加し
て、37℃で30分間インキュベートした後に、12000
rpm、30分間の遠心分離操作を行なった。
g抗体(日本バイオテスト社製HB−021)を添加し
て、37℃で30分間インキュベートした後に、12000
rpm、30分間の遠心分離操作を行なった。
【0046】HBcAb破壊 上記沈殿をPBSに
溶解した25μlの5mg/mlプロナーゼに懸濁し
て、56℃で15分インキュベートした。25μlの
0.08規定水酸化ナトリウムを加えて、さらに56℃
で15分インキュベートした後、100mMリン酸ナト
リウム、pH7.0に溶解した25μlの0.04規定
塩酸と25μlの500mMEDTA、pH8.0を添
加した。
溶解した25μlの5mg/mlプロナーゼに懸濁し
て、56℃で15分インキュベートした。25μlの
0.08規定水酸化ナトリウムを加えて、さらに56℃
で15分インキュベートした後、100mMリン酸ナト
リウム、pH7.0に溶解した25μlの0.04規定
塩酸と25μlの500mMEDTA、pH8.0を添
加した。
【0047】ウイルス破壊および固相による捕捉
上記抗体破壊液に対して、PBSに溶解した25μlの5
%ノニデットP40、0.5%2−メルカプトエタノー
ルを添加して、前記抗体固相化マイクロプレートに移し
て、37℃で2時間インキュベートした。
上記抗体破壊液に対して、PBSに溶解した25μlの5
%ノニデットP40、0.5%2−メルカプトエタノー
ルを添加して、前記抗体固相化マイクロプレートに移し
て、37℃で2時間インキュベートした。
【0048】サンドイッチ検出 上記のマイクロプ
レートを、0.02%のTween−20を含むPBS
で2回洗浄してから、0.25%の牛血清アルブミンを
含むPBSに溶解した100μlの1μg/ml西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識抗体を添加して、37℃で2
時間インキュベートした。0.02%のTween−2
0を含むPBSで2回洗浄してから、150mM酢酸ナ
トリウム、pH5.0に溶解した100μlの0.2m
g/mlo−フェニレンジアミン、0.2mg/ml過
酸化水素を添加し、37℃で30分インキュベートした
後、100μlの0.2規定硫酸を加えて反応を停止し
た。このようにして得られた溶液の492nmの吸光度
を光度計で測定した。
レートを、0.02%のTween−20を含むPBS
で2回洗浄してから、0.25%の牛血清アルブミンを
含むPBSに溶解した100μlの1μg/ml西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識抗体を添加して、37℃で2
時間インキュベートした。0.02%のTween−2
0を含むPBSで2回洗浄してから、150mM酢酸ナ
トリウム、pH5.0に溶解した100μlの0.2m
g/mlo−フェニレンジアミン、0.2mg/ml過
酸化水素を添加し、37℃で30分インキュベートした
後、100μlの0.2規定硫酸を加えて反応を停止し
た。このようにして得られた溶液の492nmの吸光度
を光度計で測定した。
【0049】C.結果 結果を表7に示した。表7上
段に示したように、Dane粒子を含む血清中にHBc
Abが存在しなければ、Dane粒子を濃縮後に、ウイ
ルス破壊を行なうだけで、HBcAgが検出できた(表
7上段第2列)。さらに抗体破壊の操作を加えることに
より信号量が増大したのは、精製されたDane粒子に
検出限界以下のHBcAbがまだ混入しているからかも
しれない。そして表7下段に示したように、実際の臨床
検体には多量のHBcAbが含まれており、ウイルス濃
縮後にウイルス破壊を行なっただけでは、全くHBcA
gは検出されなかった(表7下段第2列)。しかしなが
ら、抗体破壊を行なってからサンドイッチ検出を行なう
ことにより、臨床検体中のHBcAg量が測定できるよ
うになったと結論する事ができる(表7下段第3列)。
段に示したように、Dane粒子を含む血清中にHBc
Abが存在しなければ、Dane粒子を濃縮後に、ウイ
ルス破壊を行なうだけで、HBcAgが検出できた(表
7上段第2列)。さらに抗体破壊の操作を加えることに
より信号量が増大したのは、精製されたDane粒子に
検出限界以下のHBcAbがまだ混入しているからかも
しれない。そして表7下段に示したように、実際の臨床
検体には多量のHBcAbが含まれており、ウイルス濃
縮後にウイルス破壊を行なっただけでは、全くHBcA
gは検出されなかった(表7下段第2列)。しかしなが
ら、抗体破壊を行なってからサンドイッチ検出を行なう
ことにより、臨床検体中のHBcAg量が測定できるよ
うになったと結論する事ができる(表7下段第3列)。
【0050】
【表7】
【0051】
【発明の効果】本発明において、微生物内部中に存在す
る抗原をそれに対する抗体が大量に存在する試料中から
定量する簡便な方法、特に大量にHBcAbを含む試料
中に存在するHBcAgを定量的に検出する簡便な方法
を見出だした。
る抗原をそれに対する抗体が大量に存在する試料中から
定量する簡便な方法、特に大量にHBcAbを含む試料
中に存在するHBcAgを定量的に検出する簡便な方法
を見出だした。
Claims (8)
- 【請求項1】試料中に存在する微生物の内部抗原に対す
る抗体を不活化した後、微生物の表面構造物を破壊する
ことにより微生物内部抗原を放出させ、微生物の内部抗
原量を定量することを特徴とする免疫化学的測定方法。 - 【請求項2】微生物の内部抗原に対する抗体を不活化す
る手段として、酵素処理、熱処理、酸・アルカリ処理、
変性剤処理、有機溶剤処理のいずれかあるいはそれを組
合わせ不活化することを特徴とする請求項1記載の免疫
化学的測定方法。 - 【請求項3】微生物が細菌、ウイルス、酵母、または黴
であることを特徴とする請求項1記載の免疫化学的測定
方法。 - 【請求項4】試料中に存在するB型肝炎ウイルスコア抗
原に対する抗体を不活化してから、B型肝炎ウイルス表
面抗原外皮を破壊することによりB型肝炎ウイルスコア
抗原を放出させ、B型肝炎ウイルスコア抗原量を定量す
ることを特徴とする請求項1〜3記載の免疫化学的測定
方法。 - 【請求項5】B型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体を
不活化するに際し、あらかじめB型肝炎ウイルス表面抗
原に対する免疫グロブリンによって処理した対象試料を
用いることを特徴とする請求項4記載の免疫化学的測定
方法。 - 【請求項6】B型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体を
不活化する手段として、蛋白質分解酵素処理、熱処理、
アルカリ処理のいずれかあるいはそれを組合わせ不活化
することを特徴とする請求項4記載の免疫化学的測定方
法。 - 【請求項7】B型肝炎ウイルス表面抗原外皮を破壊して
B型肝炎ウイルスコア抗原を放出させる薬剤として、界
面活性剤を用いることを特徴とする請求項4記載の免疫
化学的測定方法。 - 【請求項8】B型肝炎ウイルスコア抗原量を測定するに
際し、酵素を標識試薬として用いることを特徴とする請
求項4記載の免疫化学的測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18447494A JPH0850133A (ja) | 1994-08-05 | 1994-08-05 | 免疫化学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18447494A JPH0850133A (ja) | 1994-08-05 | 1994-08-05 | 免疫化学的測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0850133A true JPH0850133A (ja) | 1996-02-20 |
Family
ID=16153804
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18447494A Pending JPH0850133A (ja) | 1994-08-05 | 1994-08-05 | 免疫化学的測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0850133A (ja) |
Cited By (9)
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---|---|---|---|---|
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WO2005111620A1 (ja) | 2004-05-19 | 2005-11-24 | Advanced Life Science Institute, Inc. | B型肝炎ウィルスの検出方法 |
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-
1994
- 1994-08-05 JP JP18447494A patent/JPH0850133A/ja active Pending
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