JPH0850133A - Immunochemical measuring method - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To quantitatively determine antigens existing inside of a microorganism from a specimen wherein a large quantity of antibodies against the antigens exist by inactivating the antibodies against the interior antigens of the microorganism existing in the specimen, and then destroying a surface structure of the microorganism. CONSTITUTION:For example, after antibodies (HBcAb) against hepatitis B virus core antigens existing in a specimen are inactivated, hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) pellicle is destroyed to discharge the hepatitis B virus core antigens (HBcAg). Obtained solution is incubated with immune globulin against the HBcAg and a quantity of the immune globulin bonded with the HBcAg is measured so as to quantitavely determine the HBcAg in the specimen. At the time of inactivation of the antibodies (HBcAb) against the hepatitis B virus core antigens existing in a specimen, in consideration of stability of a natural type HBcAg, conditions such as temperature, pH, surfactant are changed to select conditions for destroying the HBcAb without destruction of the HBcAg so as to realize the inactivation of the HBcAb.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、微生物内部に存在する
抗原の定量的測定方法に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for quantitatively measuring an antigen present inside a microorganism.

【０００２】[0002]

【従来の技術】通常、細菌、ウイルス、酵母、黴などの
微生物はヒト体内では生体内防御機構いわゆる免疫によ
って駆逐され成育できない。その免疫力を発揮する主な
因子の一つが抗体であり、一度感染罹病した病原微生物
や、通常環境中に常在する微生物に対しては、ヒトは血
中にその抗体を有するか、迅速に血中抗体量を上昇させ
ることができる。2. Description of the Related Art Usually, microorganisms such as bacteria, viruses, yeasts and fungi cannot be grown in the human body because they are exterminated by an in vivo defense mechanism called immunity. One of the main factors that exerts its immunity is an antibody, and humans have the antibody in the blood or rapidly if it is against a pathogenic microorganism once infected and infected, or a microorganism normally existing in the environment. The amount of antibody in the blood can be increased.

【０００３】しかしながら、昨今諸事情により免疫力の
低下した患者が増えており、いわゆる日和見感染が大き
な問題となりつつある。このような病態時には、常在す
る日和見感染病因菌に対する抗体を含む健常者血清から
免疫グロブリンを取得し、抗菌剤の補助療法として、免
疫力の低下した患者に投与されだした。すなわち、人為
的に、自然には生じないような量比の抗原と抗体が一時
的に血中に共存する時期が生み出されている。However, due to various circumstances, the number of patients whose immune system has been lowered is increasing, and so-called opportunistic infections are becoming a serious problem. Under such pathological conditions, immunoglobulin was obtained from the serum of healthy individuals containing antibodies against the resident pathogens of opportunistic infections, and it was administered to patients with weakened immunity as adjuvant therapy of antibacterial agents. That is, a period is artificially created in which the antigen and antibody in a quantitative ratio that does not naturally occur coexist in blood.

【０００４】また、宿主の免疫力の低下を待って盛んに
増殖するウイルスの存在様式は潜伏感染と呼ばれ体内で
抗体反応の及ばない神経系などに巣くっている。この場
合にも、一般に血中抗体量は増えている。ヘルペスウイ
ルスやサイトメガロウイルスがこの感染様式をとる。さ
らに体内で増殖しながら免疫を掻い潜る微生物も存在す
る。持続感染と呼ばれるこの様式は、Ｂ型肝炎ウイル
ス、Ｃ型肝炎ウイルス、歯周病起因細菌などにみられ、
宿主が抗体量を上昇させているその環境下で、それぞれ
異なるメカニズムにより成育を続けて宿主を蝕んでい
く。Further, the mode of existence of the virus, which proliferates awaiting the reduction of the immune system of the host, is called latent infection, and it nests in the nervous system and the like which the antibody reaction does not reach in the body. Also in this case, the amount of antibody in the blood is generally increasing. Herpes virus and cytomegalovirus take this mode of infection. In addition, there are also microorganisms that grow in the body and ditch the immune system. This mode called persistent infection is found in hepatitis B virus, hepatitis C virus, periodontal disease-causing bacteria, etc.
Under the environment where the host is raising the amount of antibody, the host continues to grow by different mechanisms and eats away the host.

【０００５】いずれにしても、抗体が存在すれば異種抗
原である微生物は駆逐されるといった従来のような単純
な機構では説明できない微生物感染が問題視されてお
り、そのような状況下での微生物の定量法が望まれてい
る。In any case, microbial infection, which cannot be explained by a conventional simple mechanism in which a microorganism that is a heterologous antigen is exterminated by the presence of an antibody, is regarded as a problem. Is desired.

【０００６】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染性粒子
は、直径４２ｎｍの二重構造粒子、Ｄａｎｅ粒子であ
る。その外皮のリポ蛋白質の示す抗原性がＨＢｓ抗原
（ＨＢｓＡｇ）であり、内部の直径２７ｎｍのヌクレオ
カプシドを形成する粒子（コア粒子）の示す抗原性がＨ
Ｂｃ抗原（ＨＢｃＡｇ）である。肝細胞にＨＢＶが感染
すると、細胞質内で外皮が外され、コア粒子中の部分二
本鎖ウイルスＤＮＡの情報が読まれて、ウイルス関連の
蛋白質が合成されたり、ウイルスＤＮＡの複製が行なわ
れ、細胞質内でコア粒子が増幅される。増幅したコア粒
子は、細胞質内で外皮を被ってＤａｎｅ粒子となり、コ
ア粒子を持たない多数の管状粒子、球型粒子（ＨＢｓＡ
ｇ）とともに血液中に放出される。Infectious particles of hepatitis B virus (HBV) are Dane particles, which are double-structured particles having a diameter of 42 nm. The antigenicity of the outer lipoprotein is HBs antigen (HBsAg), and the antigenicity of the internal nucleocapsid-forming particles of 27 nm in diameter (core particle) is H
Bc antigen (HBcAg). When HBV infects hepatocytes, the outer coat is removed in the cytoplasm, the information of the partially double-stranded viral DNA in the core particle is read, virus-related proteins are synthesized, and viral DNA is replicated. Core particles are amplified in the cytoplasm. The amplified core particles cover the outer coat in the cytoplasm to become Dane particles, and a large number of tubular particles without core particles, spherical particles (HBsA
g) is released into the blood.

【０００７】Ｂ型肝炎の診断は、通常、血液中にＢ型肝
炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出することによ
って行なわれる。しかしながら、ＨＢｓＡｇの抗原の存
在または血液中の濃度に関する情報は、Ｂ型肝炎におい
て感染時期や感染性粒子の量を正確に示すものではな
く、慢性の同疾患においてむしろ肝障害の進行によって
血中ＨＢｓＡｇ濃度が下がるなど、ウイルス増殖の判定
に用いることができない。Diagnosis of hepatitis B is usually carried out by detecting hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) in blood. However, the information on the presence or concentration of HBsAg antigen in blood does not accurately indicate the time of infection or the amount of infectious particles in hepatitis B, and rather, in the same chronic disease, HBsAg in blood is more likely due to progression of liver damage. It cannot be used for the determination of virus growth, such as a decrease in concentration.

【０００８】また、ウイルス増殖の判定に用いることが
できる代表的ＨＢＶマーカーがＨＢｅ抗原（ＨＢｅＡ
ｇ）であって、未症候性のキャリアや慢性肝炎の経過を
観察する上でも、治療をモニタリングする上でも最も有
効な指標となってきた。ＨＢｅＡｇはＨＢＶに感染した
肝細胞から持続的に血中に放出され、ＨＢｅＡｇ陽性血
液中には、Ｄａｎｅ粒子が多くウイルスに関連したＤＮ
Ａポリメラーゼの活性も高いことが知られており、ウイ
ルス活動性の間接的定性的指標になってきた。しかしな
がら、ＨＢｅＡｇ陽性からＨＢｅＡｇ陰性・ＨＢｅ抗体
（ＨＢｅＡｂ）陽性へのセロコンバージョンが、常にＨ
ＢｅＡｇの質的変化（変異）に基づく現象である事が明
らかになり、多くの場合ウイルス活動性の減少を反映す
るものの、ウイルスの量的変化を完全に反映できない例
がある事が示唆され問題となっている。またＢ型肝炎治
療法の進歩に伴い、ウイルス活動性の直接的定量的判定
法が望まれるようにもなってきた。[0008] A typical HBV marker that can be used for determining virus growth is HBe antigen (HBeA).
g), which has been the most effective index for observing the course of asymptomatic carriers and chronic hepatitis and for monitoring treatment. HBeAg is continuously released into the blood from HBV-infected hepatocytes, and in the HBeAg-positive blood, Dane particles are abundant and virus-related DN is involved.
It is known that the activity of A polymerase is also high, and has become an indirect qualitative indicator of viral activity. However, seroconversion from HBeAg positive to HBeAg negative / HBe antibody (HBeAb) positive is always H
It became clear that it is a phenomenon based on qualitative change (mutation) of BeAg, and although it often reflects a decrease in viral activity, it is suggested that there are cases in which it cannot completely reflect the quantitative change of virus. Has become. Further, with the progress of hepatitis B treatment methods, a direct quantitative determination method of virus activity has been desired.

【０００９】感染性を有するウイルス量の血中内変化を
直接的定量的に把握するために、Ｄａｎｅ粒子の構成成
分であるＨＢＶ−ＤＮＡやＤＮＡポリメラーゼを検査す
ることは既に日常的である。しかしながら、これらの方
法は、時間や手間、費用のかかる方法であり、さらに放
射性同位元素を使用する場合もあって、限られた施設で
しか普及していなかった。It is already routine to test HBV-DNA and DNA polymerase, which are components of Dane particles, in order to directly and quantitatively grasp changes in the infectious viral amount in blood. However, these methods are time-consuming, labor-intensive, and costly, and sometimes radioisotopes are used. Therefore, these methods have been used only in limited facilities.

【００１０】ウイルス量の血中内変化を直接的定量的に
把握するもう一つの手段は、やはりＤａｎｅ粒子の構成
成分であるＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）を
測定することであり、免疫化学的手法を適用することに
より、時間や手間、費用を減ずる事ができると考えられ
るが、現実的に普及していないのは、以下のような理由
があった。Another means for directly quantitatively grasping the change in the viral load in the blood is to measure the hepatitis B virus core antigen (HBcAg), which is also a component of Dane particles, and immunochemistry. It is thought that the time, labor, and cost can be reduced by applying the statistical method, but the reason why it has not spread in reality is as follows.

【００１１】前述のように、ＨＢｃＡｇは血液中におい
てはＨＢｓＡｇの外皮を被って存在するために、そのま
まではＨＢｃＡｇとして測定することはできない。Ｄａ
ｎｅ粒子を界面活性剤などで処理し、外皮を取り除くこ
とができることは判明していたが、一般にＢ型肝炎患者
の血液中にはＨＢｃＡｇに対する抗体（ＨＢｃＡｂ）が
高力価に存在し、血液中でＨＢｃＡｇを放出させると大
過剰のＨＢｃＡｂと抗原抗体反応物を形成して、以後免
疫化学的手法を適用できなくなる。As described above, since HBcAg exists in blood by covering the outer coat of HBsAg, it cannot be measured as it is as HBcAg. Da
It has been known that the ne particles can be treated with a surfactant or the like to remove the outer skin, but in general, the blood of patients with hepatitis B has a high titer of an antibody against HBcAg (HBcAb). When HBcAg is released in the above step, an antigen-antibody reaction product is formed with a large excess of HBcAb, and the immunochemical technique cannot be applied thereafter.

【００１２】そこでＤａｎｅ粒子と血液中のＨＢｃＡｂ
とを分離するために、Ｄａｎｅ粒子にＨＢｓＡｂとの免
疫凝集物を形成させ、その後に遠心分離洗浄を繰り返す
方法（J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、197
6）、超遠心を利用する方法（Gastroenterology、第80
巻、1420−1427頁、1981）、ＨＢｓＡｇに対する免疫グ
ロブリンを結合させた不溶性担体で一旦Ｄａｎｅ粒子を
分離する方法（特公平５−７６５８２）などが開示され
てきたが、いずれも時間や手間あるいは特別な器具が必
要であり、また試料中のＨＢｃＡｂの除去も不十分であ
った。Therefore, Dane particles and HBcAb in blood
To separate Dane particles with HBsAb and then repeat centrifugation and washing (J. Immunology, 117, 102-105, 197).
6), Method using ultracentrifugation (Gastroenterology, No. 80)
Vol. 1420-1427, 1981), a method of once separating Dane particles with an insoluble carrier to which an immunoglobulin against HBsAg is bound (Japanese Patent Publication No. 5-76582) has been disclosed. Equipment was required and the removal of HBcAb in the sample was insufficient.

【００１３】[0013]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物内部中に存在する抗原をそれに対する抗体が大量に存
在する試料中から定量する簡便な方法を提供するもので
あり、たとえば、大量にＨＢｃＡｂを含む試料中に存在
するＨＢｃＡｇを定量的に検出し得る簡便な方法を提供
することにある。The object of the present invention is to provide a simple method for quantifying an antigen present in the inside of a microorganism from a sample in which a large amount of an antibody against the antigen is present. It is to provide a simple method capable of quantitatively detecting HBcAg present in a sample containing HBcAb.

【００１４】[0014]

【課題を解決するための手段】これを達成するために本
発明による方法は、試料中に存在する微生物の内部抗原
に対する抗体を不活化した後、微生物の表面構造物を破
壊することにより微生物内部抗原を放出させ、微生物の
内部抗原量を定量することを特徴とする免疫化学的測定
方法に関するものである。In order to achieve this, the method according to the present invention comprises the steps of inactivating an antibody against an internal antigen of a microorganism present in a sample and then destroying the surface structure of the microorganism to destroy the internal structure of the microorganism. The present invention relates to an immunochemical assay method, which comprises releasing an antigen and quantifying the amount of internal antigen of a microorganism.

【００１５】本発明における微生物とは細菌，ウイル
ス，酵母が好ましく用いられ、例えば日和見感染により
敗血症を起こさせる主原因となる黄色ブドウ球菌、表皮
ブドウ球菌、E.faecalis, 緑膿菌や大腸菌群、歯周病起
因細菌であるP.gingivalisやA.actinomycetemcomitans
，持続感染ウイルスであるＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝
炎ウイルスが挙げられる。The microorganisms used in the present invention are preferably bacteria, viruses and yeasts. For example, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, E.faecalis, Pseudomonas aeruginosa and coliform bacteria, which are the main causes of sepsis due to opportunistic infections, Periodontal disease-causing bacteria P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans
, Hepatitis B virus and hepatitis C virus, which are persistently transmitted viruses.

【００１６】本発明は宿主によって以前に免疫反応を受
けたことにより、その抗体価が上昇しているものの試料
中の抗体とは直接的には反応しない微生物の内部に存在
する抗原を定量するために、試料中に存在するその抗体
を不活化した後、微生物表面構造物を破壊し内部抗原を
放出させ、定量するものであるが、この不活化手段とし
ては酵素処理、熱処理、酸・アルカリ処理、変性剤処
理、有機溶剤処理のいずれかあるいはそれらを組み合わ
せ行なうことができる。The present invention is for quantifying an antigen present inside a microorganism which has an increased antibody titer due to previous immune reaction by a host but does not react directly with the antibody in a sample. In addition, after inactivating the antibody present in the sample, the surface structure of the microorganism is destroyed and the internal antigen is released, and quantification is performed.The inactivation means include enzyme treatment, heat treatment, acid / alkali treatment. , Treatment with a modifier, treatment with an organic solvent, or a combination thereof.

【００１７】中でも、本発明の好ましい１例としてＢ型
肝炎ウイルスの内部に存在する抗原であるＢ型肝炎ウイ
ルスコア抗原量を定量する場合を例にあげて本願発明を
説明する。Of these, the present invention will be described by way of a preferred example of the present invention, in which the amount of hepatitis B virus core antigen, which is the antigen present inside the hepatitis B virus, is quantified.

【００１８】すなわち、試料中に存在するＢ型肝炎ウイ
ルスコア抗原に対する抗体（ＨＢｃＡｂ）を不活化して
から、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）外皮を
破壊することによりＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ
Ａｇ）を放出させ、得られた溶液をＨＢｃＡｇに対する
免疫グロブリンとインキュベーションし、ＨＢｃＡｇに
結合した免疫グロブリン量を測定して、試料中のＨＢｃ
Ａｇ量を定量するものである。That is, by inactivating the antibody (HBcAb) to the hepatitis B virus core antigen present in the sample, the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) is destroyed to destroy the hepatitis B virus core antigen ( HBc
AgB is released, the resulting solution is incubated with an immunoglobulin against HBcAg, and the amount of immunoglobulin bound to HBcAg is measured to obtain HBc in the sample.
The amount of Ag is quantified.

【００１９】試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコア抗
原に対する抗体（ＨＢｃＡｂ）の不活化に際しては、既
に知られている天然型のＨＢｃＡｇの安定性（J. gen.
Virol.，第65巻、 405-414頁、1984）あるいは組換え型
のＨＢｃＡｇの安定性（J. Cliｎ． Microbiol.、第30
巻、1617−1619頁、1992）を考慮して、温度、ｐＨ、界
面活性剤、還元剤、有機溶剤、カオトロピックイオン、
蛋白分解酵素などの条件を変化させることにより、ＨＢ
ｃＡｇを破壊せずにＨＢｃＡｂを破壊する条件を選択し
て、ＨＢｃＡｂの不活化が実施できる事を見出だした。
例えば、J. gen.Virol.，第65巻、 405-414頁、1984
を参考にするならば、３７℃下１０時間処理や５６℃下
４時間などの熱処理、ｐＨ１１．５による処理、還元剤
である０．５Ｍ２−メルカプトエタノール処理、カオト
ロピックイオンである３Ｍチオシアン酸アンモニウムや
６Ｍ尿素処理などによって、天然型のＨＢｃＡｇの抗原
性は保たれる事が示されている。J. Cliｎ． Microbio
l.、第30巻、1617−1619頁、1992 を参考にするなら
ば、７０℃下１時間処理や８０℃下３０分などの熱処
理、ｐＨ１０．５やｐＨ５．０による処理、界面活性剤
である４％ＳＤＳによる２４時間処理、還元剤である４
０ｍＭ２−メルカプトエタノールによる４８時間処理、
有機溶剤である５０％メタノールや５０％エタノール処
理、蛋白分解酵素であるトリプシンやキモトリプシン処
理などによって、組換え型のＨＢｃＡｇの抗原性は保た
れる事が示されている。これらの知見により、一般の蛋
白質にとっては過酷ともいえる条件下でＨＢｃＡｇが安
定であることを利用し、ＨＢｃＡｇを破壊せずにＨＢｃ
Ａｂを破壊する最適の下記条件を見出だした。When inactivating the antibody (HBcAb) to the hepatitis B virus core antigen present in the sample, the stability of the already known natural HBcAg (J. gen.
Virol., 65, 405-414, 1984) or the stability of recombinant HBcAg (J. Clin. Microbiol., 30).
Vol., 1617-1619, 1992), temperature, pH, surfactant, reducing agent, organic solvent, chaotropic ion,
By changing conditions such as protease, HB
It has been found that the inactivation of HBcAb can be carried out by selecting the condition that destroys HBcAb without destroying cAg.
For example, J. gen. Virol., 65, 405-414, 1984.
For reference, heat treatment at 37 ° C. for 10 hours or 56 ° C. for 4 hours, pH 11.5 treatment, 0.5M 2-mercaptoethanol treatment as a reducing agent, 3M ammonium thiocyanate as a chaotropic ion, It has been shown that the natural antigenicity of HBcAg is maintained by treatment with 6M urea. J. Clin. Microbio
l., Vol. 30, pp. 1617-1619, 1992, heat treatment at 70 ° C for 1 hour or heat treatment at 80 ° C for 30 minutes, treatment with pH 10.5 or pH 5.0, and surfactant. 24 hours treatment with a certain 4% SDS, a reducing agent 4
Treatment with 0 mM 2-mercaptoethanol for 48 hours,
It has been shown that the antigenicity of the recombinant HBcAg is maintained by treatment with 50% methanol or 50% ethanol as an organic solvent and treatment with trypsin or chymotrypsin as proteolytic enzymes. Based on these findings, the fact that HBcAg is stable under conditions that can be said to be severe for general proteins is utilized, and HBcAg is not destroyed and HBcAg is not destroyed.
The following optimum conditions for destroying Ab have been found.

【００２０】すなわち、本発明において試料中に存在す
るＨＢｃＡｂを不活化する手段としては、蛋白質分解酵
素処理、熱処理、アルカリ処理のいずれかあるいはそれ
を組合わせることが好ましく行なわれる。例えば蛋白質
分解酵素処理としてはプロナーゼ、プロテアーゼＫ、ト
リプシン、キモトリプシンなどであり、熱処理温度とし
ては好ましくは３７ー８０℃であり、アルカリ処理とし
てはｐＨ９以上が好ましく行なわれる。これらの不活化
手段は各々単独で行なってもよいし、２種以上組み合わ
せても構わない。さらに好ましくは３種の組み合わせで
ある熱処理、蛋白質分解処理およびアルカリ処理を使用
するのが好ましい。That is, in the present invention, the means for inactivating the HBcAb present in the sample is preferably any of proteolytic enzyme treatment, heat treatment, alkali treatment, or a combination thereof. For example, the proteolytic enzyme treatment is pronase, protease K, trypsin, chymotrypsin, etc., the heat treatment temperature is preferably 37-80 ° C., and the alkali treatment is preferably pH 9 or more. These inactivating means may be used alone or in combination of two or more kinds. It is more preferable to use a combination of three kinds of heat treatment, proteolytic treatment and alkali treatment.

【００２１】本発明で測定する試料は、一般的な生体試
料や人為的に調製された溶液などなんでも良いが、好ま
しくは、人血液あるいはそれに由来する血清や血漿が用
いられる。さらに好適には、Ｂ型肝炎ウイルスのＤａｎ
ｅ粒子を一旦血液由来の他の成分と分離する操作によ
り、ＨＢｃＡｇに対する人由来抗体の濃度を一部減少さ
せた試料が用いられる。Ｄａｎｅ粒子を他の成分と分離
して一部減少させる操作については、前述のように、Ｄ
ａｎｅ粒子にＨＢｓＡｂとの免疫凝集物を形成させ、そ
の後に遠心分離する方法（J. Immunology、第 117巻、 1
02−105 頁、1976）、超遠心を利用する方法（Gastroen
terology、第80巻、1420−1427頁、1981）、ＨＢｓＡｇ
に対する免疫グロブリンを結合させた不溶性担体で一旦
Ｄａｎｅ粒子を分離する方法（特公平５−７６５８２）
などが利用できるが、特殊な装置や器具を使用せずにＤ
ａｎｅ粒子の濃縮効果が期待できる事から、Ｄａｎｅ粒
子にＨＢｓＡｂとの免疫凝集物を形成させ、その後に遠
心分離する方法が好適に利用できる。The sample to be measured in the present invention may be a general biological sample or an artificially prepared solution, but human blood or serum or plasma derived therefrom is preferably used. Even more preferably, Dan of hepatitis B virus
A sample in which the concentration of human-derived antibody against HBcAg is partially decreased by once separating the e particles from other components derived from blood is used. As for the operation of separating the Dane particles from other components to partially reduce them, as described above,
Method of forming immuno-aggregates with HBsAb on ane particles and then centrifugation (J. Immunology, Vol. 117, 1
02-105, 1976), a method using ultracentrifugation (Gastroen
terology, 80, 1420-1427, 1981), HBsAg.
Method for temporarily separating Dane particles with an insoluble carrier bound to immunoglobulin (Japanese Patent Publication No. 5-76582)
Etc. can be used, but without using special equipment or equipment D
Since a concentration effect of ane particles can be expected, a method of forming an immune aggregate with HBsAb on Dane particles and then centrifuging can be suitably used.

【００２２】ＨＢｃＡｂ破壊後にＨＢｓＡｇ外皮を破壊
するのに適する薬剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、ドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウム、臭化セチル
トリメチルアンモニウム、塩化ドデシルピリミジニウ
ム、パルミトイルリソレシチン、ドデシル−Ｎ−ベタイ
ン、ポリオキシエチレン−アルコール、ポリオキシエチ
レン−イソアルコール、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−
オクチルフェノール、ポリオキシエチレン−ノニルフェ
ノール、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオ
キシエチレンソルビトールエステル、ドデシルスルホン
酸ナトリウム、臭化テトラデシルアンモニウムおよびサ
ポニンのような界面活性剤である。これらのうち特に好
適な界面活性剤は、非イオン系の界面活性剤であり、特
にポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Brij）、
トリトン（Triton）、ノニデット（Nonidet ）Ｐ40およ
びツイーン（Ｔｗｅｅｎ）などがあげられる。Suitable agents for destroying the HBsAg crust after HBcAb destruction are, for example, sodium dodecylsulfate, sodium dodecyl N-sarcosinate, cetyltrimethylammonium bromide, dodecylpyrimidinium chloride, palmitoyllysolecithin, dodecyl-N-. Betaine, polyoxyethylene-alcohol, polyoxyethylene-isoalcohol, polyoxyethylene-pt-
Surfactants such as octylphenol, polyoxyethylene-nonylphenol, polyoxyethylene esters of fatty acids, polyoxyethylene sorbitol esters, sodium dodecyl sulfonate, tetradecyl ammonium bromide and saponins. Among these, particularly preferable surfactants are nonionic surfactants, particularly bridges (Brij), which are polyoxyethylene derivatives,
Examples include Triton, Nonidet P40 and Tween.

【００２３】中でもノニデット（Nonidet ）Ｐ40が好ま
しく用いられる。Of these, Nonidet P40 is preferably used.

【００２４】上述のように、本発明は試料中に存在する
微生物の内部抗原を放出させ、微生物の内部抗原量を定
量するものであるが、その定量方法は内部抗原に対する
免疫グロブリンとインキュベーションさせ、結合した内
部抗原量を免疫化学分析の分野で知られている、例えば
凝集法やサンドイッチ法などの任意の方法である。As described above, the present invention is to release the internal antigen of the microorganism present in the sample and quantify the amount of the internal antigen of the microorganism. The quantitative method is to incubate with the immunoglobulin against the internal antigen, The amount of bound internal antigen can be determined by any method known in the field of immunochemical analysis, such as agglutination or sandwich method.

【００２５】内部抗原としてＢ型肝炎ウイルスコア抗原
を測定する場合を例にあげ詳細を説明すると、凝集法を
用いる場合、ＨＢｃＡｇに対する免疫グロブリンは一般
に、赤血球やラテックスなどの粒子に結合して使用され
る。ＨＢｃＡｇが存在すれば、これらの粒子の凝集をも
たらし、ＨＢｃＡｇ量を測定することができる。In the case of measuring the hepatitis B virus core antigen as an internal antigen, the details will be described. When the agglutination method is used, the immunoglobulin for HBcAg is generally used by being bound to particles such as red blood cells and latex. It The presence of HBcAg causes agglomeration of these particles and the HBcAg amount can be measured.

【００２６】サンドイッチ法を用いる場合、試料中のＨ
ＢｃＡｇは、放射性同位元素あるいは酵素などにより標
識化された抗ＨＢｃＡｇ免疫グロブリンと、不溶性担体
に結合した同一かあるいは別の抗ＨＢｃＡｇ免疫グロブ
リンとに、同時にかあるいは段階的にインキュベート
し、いわゆるサンドイッチ構造物を形成させる。その後
に通常、不溶性担体と結合した標識体の量を測定するこ
とによりＨＢｃＡｇ量が測定できる。When the sandwich method is used, H in the sample
BcAg is a so-called sandwich structure in which anti-HBcAg immunoglobulin labeled with a radioisotope or enzyme and the same or another anti-HBcAg immunoglobulin bound to an insoluble carrier are simultaneously or stepwise incubated. To form. After that, usually, the amount of HBcAg can be measured by measuring the amount of the label bound to the insoluble carrier.

【００２７】[0027]

【実施例】【Example】

参考例 １．血清中のＨＢｃＡｂの減少 Ａ．検体と試薬 血清中のＨＢＶ−ＤＮＡ量は、小西ら
（医学と薬学、第２８巻、 813-823頁、1992）に開示さ
れた化学発光法によるＨＢＶ−ＤＮＡ定量法で測定し
た。４８８０ｐｇ／ｍｌのＨＢＶ−ＤＮＡを含む慢性Ｂ
型肝炎患者の血清をＨＢＶ−ＤＮＡを含まない正常ヒト
血清で１０倍ずつ２段階に希釈した。それぞれの希釈血
清には、３１１ｐｇ／ｍｌ、４９ｐｇ／ｍｌのＨＢＶ−
ＤＮＡが含まれていた。以下、未希釈の高力価血清を
Ｈ、希釈の順番にＭ、Ｌ血清と記す。ＨＢｃＡｂ量は、
凝集法である三光純薬社製セロクリット−抗ＨＢｃある
いは競合法ＥＩＡである日本ロシュ社製コバスコアAnti
-HBc EIAを用いて測定した。Reference example 1. Reduction of HBcAb in serum A. Specimens and Reagents The amount of HBV-DNA in serum was measured by the chemiluminescence-based HBV-DNA quantification method disclosed in Konishi et al. (Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 28, 813-823, 1992). Chronic B containing 4880 pg / ml HBV-DNA
The sera of patients with hepatitis C were diluted with normal human serum containing no HBV-DNA in 10-fold dilutions in two steps. Each diluted serum contained 311 pg / ml and 49 pg / ml HBV-.
It contained DNA. Hereinafter, undiluted high-titer serum is referred to as H, and diluted in order of M and L serum. The amount of HBcAb is
Agglomeration method Sanko Junyaku Co., Ltd. cellocrit-anti-HBc or competitive EIA Nippon Roche Cobascore Anti
-Measured using HBc EIA.

【００２８】Ｂ．血清中のＨＢｃＡｂの減少 プロナーゼ処理・熱処理 ５０μｌのＨ、Ｍ、Ｌ血
清にＰＢＳに溶解した１２．５μｌの５ｍｇ／ｍｌプロ
ナーゼ（科研製薬社製、商品名アクチナーゼＥ）を加え
て、３７℃で一夜、７０あるいは８０℃で30分間処理し
た。プロナーゼの活性を停止するために１２．５μｌの
５００ｍＭＥＤＴＡを添加後、コバスコアAnti-HBc EIA
でＨＢｃＡｂを測定した。結果を表１に示す。B. Reduction of HBcAb in serum Pronase treatment / heat treatment 50 μl of H, M, L serum was added with 12.5 μl of 5 mg / ml pronase (trade name Actinase E manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) dissolved in PBS, and overnight at 37 ° C. Treatment at 70 or 80 ° C for 30 minutes. Cobascore Anti-HBc EIA after addition of 12.5 μl of 500 mM EDTA to stop pronase activity
HBcAb was measured at. The results are shown in Table 1.

【００２９】[0029]

【表１】 [Table 1]

【００３０】８０℃の処理により、ＨＢｃＡｂ力価に応
じて、血清中のＨＢｃＡｂ力価が減少した。また通常、
血清に６０℃以上の熱処理を施すと、凝固反応が進行し
てその後の処理が困難になるが、プロナーゼを添加する
ことにより、この現象が回避できた。プロナーゼ添加に
より、ＨＢｃＡｂの分解が促進するとともに、血清中の
各種蛋白質が小分子量化して凝固しにくくなったと考え
られる。The treatment at 80 ° C. reduced the HBcAb titer in serum depending on the HBcAb titer. Also usually
When serum is heat-treated at 60 ° C. or higher, the coagulation reaction proceeds and the subsequent treatment becomes difficult, but by adding pronase, this phenomenon could be avoided. It is considered that the addition of pronase promoted the decomposition of HBcAb and reduced the molecular weight of various proteins in serum to make it difficult to coagulate.

【００３１】熱アルカリ処理５０μｌのＨ、Ｍ、Ｌ血
清に、１２．５μｌの０．１規定水酸化ナトリウムを加
えて、７０あるいは８０℃で３０分間処理した。溶液の
ｐＨを中性に戻すために１２．５μｌの０．１規定塩酸
を添加後、セロクリット−抗ＨＢｃでＨＢｃＡｂを測定
した。結果を表２に示す。Heat alkaline treatment To 50 μl of H, M and L serum, 12.5 μl of 0.1N sodium hydroxide was added and treated at 70 or 80 ° C. for 30 minutes. After adding 12.5 μl of 0.1 N hydrochloric acid to return the pH of the solution to neutral, HBcAb was measured with serocrit-anti-HBc. Table 2 shows the results.

【００３２】[0032]

【表２】 [Table 2]

【００３３】温度上昇に伴い、血清中のＨＢｃＡｂ力価
が減少した。また、プロナーゼ添加の場合に見られたの
と同様に、血清をアルカリ条件下にすることによっても
凝固現象を避ける事ができた。The HBcAb titer in serum decreased with increasing temperature. Further, as in the case of adding pronase, the coagulation phenomenon could be avoided by subjecting the serum to alkaline conditions.

【００３４】Ｄａｎｅ粒子の濃縮 Ｄａｎｅ粒子
は、外皮にＨＢｓＡｇを有し、これに対する免疫グロブ
リンと反応して凝集物を形成する（Lancet、第１巻、 6
95−698頁、1970）。また、この凝集物を低速遠心分離
で濃縮洗浄を繰り返して、血清中の他の成分を除く試み
もあった（J. Immunology、第 117巻、 102−105 頁、19
76）が、超遠心を繰り返しても血清中に存在していたＨ
ＢｓＡｂを完全に除く事は大変な手間である事も明らか
であった（Gastroenterology、第80巻、1420−1427頁、
1981）。Concentration of Dane Particles Dane particles have HBsAg in their outer coat and react with immunoglobulins against them to form aggregates (Lancet, Vol. 1, 6).
95-698, 1970). There has also been an attempt to remove other components in serum by repeating concentrated washing of this aggregate by low-speed centrifugation (J. Immunology, 117, 102-105, 19).
76) was still present in serum after repeated ultracentrifugation.
It was also clear that removing BsAb completely was a troublesome task (Gastroenterology, Volume 80, 1420-1427,
1981).

【００３５】１ｍｌのＨ、Ｍ、Ｌ血清に１μｇの抗ＨＢ
ｓＡｇモノクローナル抗体（日本バイオテスト社製ＨＢ
−０２１）を添加して、３７℃で３０分間インキュベー
トした後に、 12000ｒｐｍ、３０分間の遠心分離操作を
行なった。沈殿を１ｍｌのＰＢＳに懸濁して、そのＨＢ
ｃＡｂ価をセロクリット−抗ＨＢｃとコバスコアAnti-H
Bcで測定した。結果を表３に示した。1 μg of anti-HB in 1 ml of H, M, L serum
sAg monoclonal antibody (Nippon Biotest HB
-021) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes. Suspend the pellet in 1 ml of PBS and
cAb value serocrit-anti-HBc and cobascore Anti-H
It was measured by Bc. The results are shown in Table 3.

【００３６】[0036]

【表３】 [Table 3]

【００３７】過去の研究例が示すように、Ｄａｎｅ粒子
の濃縮操作だけでは、完全にＨＢｃＡｂを除去できなか
った。As shown in past research examples, HBcAb could not be completely removed only by concentrating Dane particles.

【００３８】Ｄａｎｅ粒子濃縮後の熱処理あるいは熱
アルカリ処理 上記のように調製したDane粒子沈殿
物を、上記あるいはのようにプロナーゼ熱処理ある
いは熱アルカリ処理してＨＢｃＡｂ価を測定した。結果
を表４と表５に示す。Heat treatment after Dane particle concentration or hot alkali treatment Dane particle precipitate prepared as described above was subjected to heat treatment with pronase or heat alkali as described above to measure HBcAb value. The results are shown in Tables 4 and 5.

【００３９】[0039]

【表４】 [Table 4]

【００４０】[0040]

【表５】 [Table 5]

【００４１】、、それぞれ単独の処理では十分に
ＨＢｃＡｂ価は減少しなかったが、表５に示すように、
Ｄａｎｅ粒子濃縮後に５６〜６５℃の熱アルカリ処理を
組合わせることにより、血清由来のＨＢｃＡｂ価をほぼ
消滅させることが可能になった。The HBcAb titers were not sufficiently reduced by the treatments alone, but as shown in Table 5,
By combining the Dane particle concentration with a hot alkali treatment at 56 to 65 ° C., it was possible to almost eliminate the serum-derived HBcAb value.

【００４２】参考例 ２．血清中のＤａｎｅ粒子の濃縮 ヒト正常血清で適当に希釈した５００μｌあるいは１ｍ
ｌのＨＢＶ−ＤＮＡ陽性血清に１μｇの抗ＨＢｓＡｇ抗
体（日本バイオテスト社製ＨＢ−０２１）を添加して、
３７℃で３０分間インキュベートした後に、 12000ｒｐ
ｍ、３０分間の遠心分離操作を行なった。沈殿を５０μ
ｌのＰＢＳに懸濁して、その全量を化学発光法によるＨ
ＢＶ−ＤＮＡ定量法で測定した。結果を表６に示す。表
６に示すように、１〜1000倍に希釈したＤａｎｅ粒子含
有血清から、定量的にＤａｎｅ粒子が濃縮されているこ
とが、ＨＢＶ−ＤＮＡを定量することにより判明した。Reference Example 2. Concentration of Dane particles in serum 500 μl or 1 m appropriately diluted with normal human serum
1 μg of anti-HBsAg antibody (HB-021 manufactured by Japan Biotest) was added to 1 HBV-DNA positive serum,
After incubating at 37 ° C for 30 minutes, 12000 rp
Centrifugation operation was performed for 30 minutes. 50μ precipitate
l suspended in PBS and the whole amount of H by chemiluminescence method
It was measured by the BV-DNA quantitative method. The results are shown in Table 6. As shown in Table 6, it was revealed by quantitatively quantifying HBV-DNA that the Dane particles were quantitatively concentrated from the serum containing the Dane particles diluted 1 to 1000 times.

【００４３】[0043]

【表６】 [Table 6]

【００４４】実施例１ Ａ．検体と試薬 特開昭６０−１４３７７２号公報に
開示された方法を用いてＤａｎｅ粒子を調製して用い
た。対照として、正常ヒト血清に精製したＤａｎｅ粒子
を添加して用いた。検体中のＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ力
価は、それぞれダイナボット社製オースザイムIIあるい
はダイナボット社製ＨＢｅ・ＥＩＡ「アボット」で測定
した。ＨＢｃＡｂは、セロクリット−抗ＨＢｃを用いて
測定した。またナカネらの方法（J. Histochem. Cytoch
em.、第２２巻、1084−1091頁、1974）にしたがって、Ｈ
ＢｃＡｇに対する免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキ
シダーゼとの結合体を調製して使用した。ｐＨ９．０の
重炭酸塩緩衝液中に溶解したＨＢｃＡｇに対するモノク
ローナル抗体（ＷＢＡＧ社製Ｃ４Ａ７）をポリスチレン
製マイクロタイタープレートで、４℃一夜、さらに０．
５％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳで４℃一夜インキ
ュベートすることにより、固相を調製し、使用直前に
０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄して
使用した。Example 1 A. Specimen and Reagent Dane particles were prepared and used by the method disclosed in JP-A-60-143772. As a control, purified Dane particles were added to normal human serum and used. The HBsAg and HBeAg titers in the sample were respectively measured by Auszyme II manufactured by Dynabot and HBe EIA "Abbott" manufactured by Dynabot. HBcAb was measured using serocrit-anti-HBc. The method of Nakane et al. (J. Histochem. Cytoch
em., Vol. 22, 1084-1091, 1974).
A conjugate of immunoglobulin to BcAg and horseradish peroxidase was prepared and used. A monoclonal antibody against HBcAg (C4A7 manufactured by WBAG) dissolved in a bicarbonate buffer solution having a pH of 9.0 was added to a polystyrene microtiter plate at 4 ° C. overnight, and further added to 0.2%.
The solid phase was prepared by incubating with PBS containing 5% bovine serum albumin overnight at 4 ° C., and washed with PBS containing 0.02% Tween-20 immediately before use.

【００４５】Ｂ．手順 ウイルス濃縮 １ｍｌの血清に１μｇの抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体（日本バイオテスト社製ＨＢ−０２１）を添加し
て、３７℃で３０分間インキュベートした後に、12000
ｒｐｍ、３０分間の遠心分離操作を行なった。B. Procedure Virus concentration 1 μg anti-HBsA in 1 ml serum
g antibody (HB-021 manufactured by Japan Biotest) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, then 12000
Centrifugation operation was performed at rpm for 30 minutes.

【００４６】ＨＢｃＡｂ破壊 上記沈殿をＰＢＳに
溶解した２５μｌの５ｍｇ／ｍｌプロナーゼに懸濁し
て、５６℃で１５分インキュベートした。２５μｌの
０．０８規定水酸化ナトリウムを加えて、さらに５６℃
で１５分インキュベートした後、１００ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ７．０に溶解した２５μｌの０．０４規定
塩酸と２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添
加した。HBcAb disruption The above precipitate was suspended in 25 μl of 5 mg / ml pronase dissolved in PBS and incubated at 56 ° C. for 15 minutes. Add 25 μl of 0.08N sodium hydroxide, and add 56 ° C.
After incubating for 15 minutes at 25 μl, 25 μl of 0.04 N hydrochloric acid dissolved in 100 mM sodium phosphate, pH 7.0 and 25 μl of 500 mM EDTA, pH 8.0 were added.

【００４７】ウイルス破壊および固相による捕捉
上記抗体破壊液に対して、ＰＢＳに溶解した25μｌの５
％ノニデットＰ４０、０．５％２−メルカプトエタノー
ルを添加して、前記抗体固相化マイクロプレートに移し
て、３７℃で２時間インキュベートした。Virus disruption and capture by solid phase
For the above antibody disruption solution, 25 μl of 5 dissolved in PBS was used.
% Nonidet P40, 0.5% 2-mercaptoethanol was added, transferred to the antibody-immobilized microplate, and incubated at 37 ° C. for 2 hours.

【００４８】サンドイッチ検出 上記のマイクロプ
レートを、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ
で２回洗浄してから、０．２５％の牛血清アルブミンを
含むＰＢＳに溶解した１００μｌの１μｇ／ｍｌ西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識抗体を添加して、３７℃で２
時間インキュベートした。０．０２％のＴｗｅｅｎ−２
０を含むＰＢＳで２回洗浄してから、１５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、ｐＨ５．０に溶解した１００μｌの０．２ｍ
ｇ／ｍｌｏ−フェニレンジアミン、０．２ｍｇ／ｍｌ過
酸化水素を添加し、３７℃で３０分インキュベートした
後、１００μｌの０．２規定硫酸を加えて反応を停止し
た。このようにして得られた溶液の４９２ｎｍの吸光度
を光度計で測定した。Sandwich Detection The above microplate was added to PBS containing 0.02% Tween-20.
After washing twice with 100 μl of 1 μg / ml horseradish peroxidase-labeled antibody dissolved in PBS containing 0.25% bovine serum albumin, the mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours.
Incubated for hours. 0.02% Tween-2
Was washed twice with PBS containing 0 and then 100 μl of 0.2 m dissolved in 150 mM sodium acetate, pH 5.0.
After adding g / ml o-phenylenediamine and 0.2 mg / ml hydrogen peroxide and incubating at 37 ° C for 30 minutes, 100 µl of 0.2 N sulfuric acid was added to stop the reaction. The absorbance at 492 nm of the solution thus obtained was measured with a photometer.

【００４９】Ｃ．結果 結果を表７に示した。表７上
段に示したように、Ｄａｎｅ粒子を含む血清中にＨＢｃ
Ａｂが存在しなければ、Ｄａｎｅ粒子を濃縮後に、ウイ
ルス破壊を行なうだけで、ＨＢｃＡｇが検出できた（表
７上段第２列）。さらに抗体破壊の操作を加えることに
より信号量が増大したのは、精製されたＤａｎｅ粒子に
検出限界以下のＨＢｃＡｂがまだ混入しているからかも
しれない。そして表７下段に示したように、実際の臨床
検体には多量のＨＢｃＡｂが含まれており、ウイルス濃
縮後にウイルス破壊を行なっただけでは、全くＨＢｃＡ
ｇは検出されなかった（表７下段第２列）。しかしなが
ら、抗体破壊を行なってからサンドイッチ検出を行なう
ことにより、臨床検体中のＨＢｃＡｇ量が測定できるよ
うになったと結論する事ができる（表７下段第３列）。C. Results The results are shown in Table 7. As shown in the upper part of Table 7, HBc was increased in serum containing Dane particles.
If Ab was not present, HBcAg could be detected only by concentrating Dane particles and then carrying out virus destruction (Table 7, upper row, second column). The reason why the signal amount was increased by further adding the antibody destruction operation may be that HBcAbs below the detection limit were still mixed in the purified Dane particles. As shown in the lower part of Table 7, actual clinical specimens contained a large amount of HBcAb, and HBcA was completely destroyed by virus destruction after virus concentration.
g was not detected (Table 7, lower row, second column). However, it can be concluded that the amount of HBcAg in the clinical sample can be measured by performing the sandwich detection after the antibody destruction (Table 7, lower row, third column).

【００５０】[0050]

【表７】 [Table 7]

【００５１】[0051]

【発明の効果】本発明において、微生物内部中に存在す
る抗原をそれに対する抗体が大量に存在する試料中から
定量する簡便な方法、特に大量にＨＢｃＡｂを含む試料
中に存在するＨＢｃＡｇを定量的に検出する簡便な方法
を見出だした。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, a simple method for quantifying an antigen present in the inside of a microorganism from a sample in which a large amount of an antibody against it is present, and particularly HBcAg present in a sample containing a large amount of HBcAb is quantitatively determined. We have found a simple way to detect.

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】試料中に存在する微生物の内部抗原に対す
る抗体を不活化した後、微生物の表面構造物を破壊する
ことにより微生物内部抗原を放出させ、微生物の内部抗
原量を定量することを特徴とする免疫化学的測定方法。1. A method for inactivating an antibody against an internal antigen of a microorganism present in a sample, and then destroying the surface structure of the microorganism to release the internal antigen of the microorganism to quantify the amount of the internal antigen of the microorganism. Immunochemical assay method. 【請求項２】微生物の内部抗原に対する抗体を不活化す
る手段として、酵素処理、熱処理、酸・アルカリ処理、
変性剤処理、有機溶剤処理のいずれかあるいはそれを組
合わせ不活化することを特徴とする請求項１記載の免疫
化学的測定方法。2. As a means for inactivating an antibody against an internal antigen of a microorganism, enzyme treatment, heat treatment, acid / alkali treatment,
2. The immunochemical assay method according to claim 1, wherein either treatment with a denaturant or treatment with an organic solvent or a combination thereof is performed to inactivate. 【請求項３】微生物が細菌、ウイルス、酵母、または黴
であることを特徴とする請求項１記載の免疫化学的測定
方法。3. The immunochemical assay method according to claim 1, wherein the microorganism is bacteria, virus, yeast, or mold. 【請求項４】試料中に存在するＢ型肝炎ウイルスコア抗
原に対する抗体を不活化してから、Ｂ型肝炎ウイルス表
面抗原外皮を破壊することによりＢ型肝炎ウイルスコア
抗原を放出させ、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原量を定量す
ることを特徴とする請求項１〜３記載の免疫化学的測定
方法。4. A hepatitis B virus core antigen is released by inactivating an antibody against the hepatitis B virus core antigen present in a sample, and then destroying the hepatitis B virus surface antigen coat to release the hepatitis B virus core antigen, thereby producing hepatitis B virus. The immunochemical assay method according to claim 1, wherein the amount of viral core antigen is quantified. 【請求項５】Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体を
不活化するに際し、あらかじめＢ型肝炎ウイルス表面抗
原に対する免疫グロブリンによって処理した対象試料を
用いることを特徴とする請求項４記載の免疫化学的測定
方法。5. The immunochemical assay according to claim 4, wherein a target sample that has been previously treated with an immunoglobulin against a hepatitis B virus surface antigen is used for inactivating the antibody against the hepatitis B virus core antigen. Method. 【請求項６】Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体を
不活化する手段として、蛋白質分解酵素処理、熱処理、
アルカリ処理のいずれかあるいはそれを組合わせ不活化
することを特徴とする請求項４記載の免疫化学的測定方
法。6. A method for inactivating an antibody against hepatitis B virus core antigen, which comprises treatment with a proteolytic enzyme, heat treatment,
The immunochemical assay method according to claim 4, wherein any one of the alkali treatments or a combination thereof is inactivated. 【請求項７】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原外皮を破壊して
Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原を放出させる薬剤として、界
面活性剤を用いることを特徴とする請求項４記載の免疫
化学的測定方法。7. The immunochemical assay method according to claim 4, wherein a surfactant is used as the agent for destroying the hepatitis B virus surface antigen coat and releasing the hepatitis B virus core antigen. 【請求項８】Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原量を測定するに
際し、酵素を標識試薬として用いることを特徴とする請
求項４記載の免疫化学的測定方法。8. The immunochemical assay method according to claim 4, wherein an enzyme is used as a labeling reagent when the amount of hepatitis B virus core antigen is assayed.