JPH08500722A

JPH08500722A - ポリヌクレオチド固定化担体

Info

Publication number: JPH08500722A
Application number: JP5513529A
Authority: JP
Inventors: ケラー，シリア; 将人三橋; 龍男秋田谷
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1992-01-29
Filing date: 1993-01-29
Publication date: 1996-01-30
Also published as: KR100289793B1; MX9300492A; CA2128891A1; EP0675965A1; US5656462A; WO1993015228A1; KR950700425A; EP0675965A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、不溶性担体とその不溶性担体に固定化されたヌクレオチドを含むヌクレオチド固定化担体を提供する。このポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのポリアデニル酸テイルに相補的な配列を少なくとも一つ含む。このヌクレオチド固定化担体は、センス及びアンチセンスｃＤＮＡや一本鎖ｃＤＮＡの合成を含む種々の方法に有用である。このヌクレオチド固定化担体は、また、センスおよびアンチセンスｍＲＮＡの合成にも有用である。更に加えて、このヌクレオチド固定化担体は、ベクターにｃＤＮＡ配列を一定の方向で挿入する改良法も提供する。本発明は、また不溶性担体にポリヌクレオチドを結合する新しい方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチド固定化担体発明の背景大部分の生物は、遺伝情報がＤＮＡの形で保存されている。このＤＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、このｍＲＮＡはタンパク質に翻訳される。真核細胞においては、ゲノムＤＮＡが成熟ｍＲＮＡにプロセシングされるときに、通常、いくつかの遺伝情報の欠落が起こる。この欠落はイントロン／エキソン、すなわち、ＲＮＡスプライシングもしくはタンパク質のプロセシングによって起こる。したがって、タンパク質構造の遺伝的基礎はゲノムＤＮＡよりもむしろｍＲＮＡを使って研究するほうが有利である。しかし不幸なことに、ｍＲＮＡは非常に不安定で、種々のリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素、以下、ＲＮａｓｅという。）により、容易に分解を受け、実験が困難である。そこで、多くの研究者達は、ｍＲＮＡ分子のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を研究の材料に使ってきた。これらコピーは、ターゲットのｍＲＮＡを鋳型として、一本鎖ＤＮＡを生産できるレトロウィルスから分離された逆転写酵素を用いてつくる。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）は一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓ−ｃＤＮＡ）よりも一般的には安定である。ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ｓｓ−ｃＤＮＡをｄｓ− ｃＤＮＡへ変換する方法は、この技術分野でよく知られている。ｄｓ−ｃＤＮＡ上に貯えられた遺伝子情報は、種々のプロトコールで、例えば、ｄｓ−ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いでこの組換えベクターを種々の細胞に導入して、利用される。これらのベクターに存在するプロモーターや制限部位は、ｄｓ−ｃＤＮＡの転写及び翻訳の研究の道具として利用できる。ポリペプチドをコードする配列を含むｍＲＮＡ（すなわち、センスｍＲＮＡ）の転写に関与するベクターのプロモーターの利用に加えて、相補的ｃＤＮＡ鎖から転写されたアンチセンスｍＲＮＡをつくることもできる。アンチセンスｍＲＮＡは、タンパク質の生物学的機能や、その作用が未だ知られていないｍＲＮＡを理解する有用な道具である。アンチセンスＲＮＡ分子はターゲットｍＲＮＡと共にアニールさせ、翻訳を阻害することによって、特異的タンパク質の生産をブロックする。それゆえ、この型の翻訳阻害は種々の病状に関連するいろいろな遺伝子産物の研究に重要であろうと容易に想定される。ｓｓ−ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用によるｄｓ−ｃＤＮＡの合成の基礎として使用されるほか、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲという。）の鋳型として使用できる。この方法で、反対向きの複数のヌクレオチド・プライマーと熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、特異的な遺伝子配列を迅速に増幅できる。アニーリングとＤＮＡ合成のサイクルを繰り返すことにより、ターゲット遺伝子のコピーが速やかにつくられる。こうして、センスｓｓ−ｃＤＮＡは、それに対応するｄｓ−ｃＤＮＡのセグメントを特異的に増幅させるため使われる。現在知られている、ｄｓ−ｃＤＮＡ生産の一つのプロトコールは、Sambrookらの「モレキュラー・クローニング実験マニュアル、第２版」（Cold Spring Ha rbor, NY, 1989）（以下、「モレキュラー・クローニング」という。）に記載された液相法がある。このマニュアルを完全に開示するため、参考文献がここに取り込まれている。液相法では、アンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから逆転写酵素の作用、それに続くＲＮａｓｅによるｍＲＮＡ分解によってつくられる。ｄｓ−ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、残ったアンチセンスｓｓ −ｃＤＮＡからつくられる。逆転写酵素に続くＤＮＡポリメラーゼ反応は、逆転写酵素が自己プライミングするループ構造をその３’末端にもつｓｓ−ｃＤＮＡを残していくので、特異的プライマーを必要とはしない。液相法では、生じたｄｓ−ｃＤＮＡは分子の方向を決定するマーカーが含まれていない。したがって、新しくつくられたｄｓ−ｃＤＮＡクローンは、その５０％が転写方向が誤っているであろうから、容易にはクローニング・ベクターへ挿入できない。それゆえ、ベクターへ正しい方向で挿入し、ｍＲＮＡを迅速にクローニングする方法が、望まれている。ｓｓ−ｃＤＮＡあるいはｄｓ−ｃＤＮＡは、固相を用いることによってもつくられる（I．Raineri et al., Nucleic Acids Research, 19:4010, 1991）。固相法では、通常、多孔性ビーズに固定されたポリデオキシチミジル酸（ポリｄＴ）がｍＲＮＡのポリアデニル酸（ポリＡ）テイルと相補し結合する。次いで、アンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡが、結合されたｍＲＮＡから逆転写酵素によってつくられる。鋳型のＲＮＡが消化分解されたのち、第２のｃＤＮＡ鎖がＤＮＡポリメラーゼによって合成される。生じたｄｓ−ｃＤＮＡは、ビーズに固定化されたアンチセンス鎖をもっている。しかし固相法においては、ｄｓ−ｃＤＮＡ産物は不溶性担体から切り離すことができない。この問題を避けるためには、ｄｓ−ｃＤＮＡ産物を加熱し、担体に固定されたｄｓ−ｃＤＮＡからｓｓ−ｃＤＮＡを遊離させ、このｓｓ−ｃＤＮＡを用いて、ｄｓ−ｃＤＮＡがＰＣＲで合成される。しかし、これは反応にもう一つのステップが加わることを意味し、ＰＣＲ反応ごとに適当な一揃いのプライマーが必要となる。それゆえ、単離されたｍＲＮＡから、結合型ではないｄｓ−ｃＤＮＡクローンを創る単純な方法が要求されている。本発明の方法は、結合型ではなく、方向性が正しい、クローン創生可能な産物を有利に提供するであろう。また、ｃＤＮＡクローンからｍＲＮＡを合成できる種々の方法も知られており、その一つは液相法である（S. Shichijo ら：J. Neurosci. Res., 30:316-320, 1991）。この方法においては、ＲＮＡプロモーターをもつベクターにｄｓ−ｃＤＮＡが挿入される。ベクターは次いで、制限酵素で消化されて直鎖状となり、ＲＮＡポリメラーゼの作用でｍＲＮＡが合成される。合成されたｍＲＮＡは、鋳型ＤＮＡを除去するためＤＮａｓｅで処理される。必要ならばこのとき、新たに合成されたＲＮＡの末端に、ターミナル・トランスフェラーゼ及びｄＡＴＰを用いてポリアデニル酸テイルが付加される。ｍＲＮＡの固相合成法もまた、よく知られている。その一つは、Hironori Ter ada（寺田博之）らの「固定化ＤＮＡによる転写の動的解析」（Biophysics（生物物理）、31:49-52、1991）に書かれている。この方法では、ＤＮＡ配列が制限酵素によってバクテリオファージ・ラムダのゲノムから消化されて、粘着末端をもつランダムＤＮＡ断片が生じる。これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い、ビオチン化ｄＵＴＰによって粘着末端を満たし平滑化する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のあいだ、ビオチン化ｄＵＴＰがハイブリダイズするように、むき出しのｄＡヌクレオチドをもつ粘着末端が残るように、制限酵素が選ばれる。ランダム配列が次に、アビジンをもつアクリルアミド担体に固定化される。ｍＲＮＡが天然のラムダ・プロモーター配列をもつ配列から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて、合成される。この系は、バクテリオファージ・ラムダにおける転写の速度論的解析の研究のため設計されたものである。ｍＲＮＡの液相及び固相合成法はいずれも、欠点をもっている。液相合成法は、ＲＮＡプロモーター含有のベクターの使用が必要な上、挿入の後はベクターは、直鎖状の配列に変換されなければならない。固相合成法は、いつも完全な遺伝情報を提供するとは限らない。なぜなら、この情報は固定化されたゲノムＤＮＡの情報であってｍＲＮＡの情報ではないからである。それゆえ、改良されたｍＲＮＡの合成方法が望まれている。 Stammらは、固相担体にアミノ結合を介して共有結合されたオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの実験に便利に使用できると述べている（Nucleic Acids Res., 19 :1350, 1991）。しかし、Stammらが述べているテクニックは、ｃＤＮＡやＲＮＡの生産を特異的に提供するものではない。そのうえ、担体に共有結合されたオリゴヌクレオチドを除くメカニズムについては何ら提供されていない。発明の概要本発明は、遺伝子の保存や分析に有用なポリヌクレオチド固定化担体、そのポリヌクレオチド固定化担体を用いる遺伝子の保存方法、並びに、ｓｓ−ｃＤＮＡ、ｄｓ−ｃＤＮＡ、センスｍＲＮＡもしくはアンチセンスｍＲＮＡの製造方法に関する。本発明のひとつの局面は、不溶性担体とその担体に固定されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド固定化担体を提供することである。ここで固定されるポリヌクレオチドは、少なくとも、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的なひとつの配列を含む。このポリヌクレオチド固定化担体は、ｄｓ−ｃＤＮＡの製造や、またセンスもしくはアンチセンスｃＤＮＡの製造を含む、いろいろな方法に有用である。このポリヌクレオチド固定化担体は、また、センスもしくはアンチセンスｍＲＮＡの製造にも有用である。更に、このポリヌクレオチド固定化担体は、ｃＤＮＡ配列をベクターに方向性正しく挿入する改良法も提供する。本発明は、また、不溶性担体にポリヌクレオチドを結合する新しい方法も含んでいる。本発明は、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列、例えばオリゴｄＴ、を含むポリヌクレオチドに焦点を当てている。本発明のひとつの好ましい局面においては、このポリヌクレオチドは、更に制限酵素の認識サイト及びｍＲＮＡのプロモーター配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、通常、マイクロタイタープレートのような不溶性皿に固定される。本発明のひとつの好ましい形態におけるマイクロタイタープレートは、少なくとも、二つのウェルをもち、各々には異なるポリヌクレオチドが固定される。本発明のポリヌクレオチド固定化担体は、全体長さをもつｄｓ−ｃＤＮＡ、センスもしくはアンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡ、及びセンスもしくはアンチセンスｍＲＮＡの製造に使用できる。更に、ポリヌクレオチド固定化ｓｓ−ｃＤＮＡは長期に安定であって、ｄｓ−ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの製造に何度もこれを繰り返して使用できる。本発明のひとつの実施態様は、不溶性皿、好ましくはマイクロタイタープレートにポリヌクレオチドを固定化させた、ポリヌクレオチド固定化担体である。固定化されたポリヌクレオチドは、少なくとも、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的なひとつの配列、例えば、ポリｄＴを含む。あるひとつの好ましい実施態様においては、このポリヌクレオチドは、少なくともひとつの制限酵素サイトを含む。更に好ましい実施態様では、このポリヌクレオチドは、制限酵素サイトに加え、ＲＮＡプロモーターをもっている。本発明のもうひとつの実施態様は、少なくともひとつのＲＮＡプロモーターを含む不溶性担体に、好ましくはポリヌクレオチドを結合させた、ポリヌクレオチド固定化担体である。最も好ましい実施態様は、Ｔ７もしくはＳＰ６ＲＮＡプロモーターのいずれかを含むものである。本発明の別の実施態様は、不溶性担体と、少なくともひとつの制限酵素サイトを含む固定化されたポリヌクレオチドから成る、ヌクレオチド固定化担体である。好ましい制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ及びＳａｌＩ等である。好ましいポリヌクレオチドの配列はSEQ ID NO:（配列番号）４、１３又は１４である。好ましい実施態様では、固定化ポリヌクレオチドは３０〜１００ヌクレオチドの長さである。本発明の更に別の実施態様では、不溶性担体、好ましくは不溶性皿と、それに結合されたｄｓ−ｃＤＮＡから成るｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体の、そのｄｓ−ｃＤＮＡの少なくとも一方の鎖は、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補する配列を少なくとも含んでいる。本発明の好ましい実施態様においては、ｄｓ−ｃＤＮＡの少なくとも一方の鎖は、ＲＮＡプロモーターをもっており、更に好ましくは、ｄｓ −ｃＤＮＡは少なくとも二つの異なるＲＮＡプロモーターを含んでいる。もっと好ましくは、これらのプロモーターは、Ｔ７もしくはＳＰ６ＲＮＡプロモーターである。ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体の別の実施態様においては、少なくとも一つの制限酵素認識サイトは、その配列に組み込まれている。本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチド、好ましくは、少なくとも一つのＲＮＡプロモーターをもつポリヌクレオチドを不溶性担体に結合させて得られる、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体の製造方法である。このポリヌクレオチドは、好ましくはｍＲＮＡのポリＡテイルに相補する配列を少なくとも一つもっており、ヌクレオチド固定化担体を形成する。そこへ、細胞溶解液のようなポリＡテイルのｍＲＮＡ含有溶液を加え、ｍＲＮＡのポリアデニル酸テイル（ポリＡテイル）を固定化ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせ、更に好ましくは、担体と溶液をインキュベートすると、最初の液相及び固相が生じる。上記方法の更に好ましい実施態様においては、最初の液相はインキュベーションの後、除かれる。ハイブリダイゼーションののち、アニール処理されたｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡがつくられ、次いで、センスｃＤＮＡがつくられる。上記方法の更に好ましい実施態様は、最初の反応混合物に逆転写酵素、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを用い、固相と最初の反応混合物をインキュベートすることを必要とする。インキュベーションののち、ＲＮａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む第２の反応混合物が、液相に加えられる。そののち、固相をインキュベートし、第２の液相をつくり、そののち、この第２の液相を除去する。本発明の更に別の実施態様は、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体をつくったのち担体から液を除去し、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を保存する、ｄｓ−ｃＤＮＡの保存方法である。本発明の更に別の実施態様は、不溶性担体に固定化されたｄｓ−ｃＤＮＡが更にＲＮＡプロモーターをもつように、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を上記のようにしてつくることにより、担体上にアンチセンスｍＲＮＡを製造する方法である。プロモーターが転写を始めるような試薬を含むサンプル液を加えると、アンチセンスｍＲＮＡが生産される。アンチセンスｍＲＮＡの好ましい生産方法では、担体とサンプル液をインキュベートすることによって、最初の液相と固相をつくり、次いで以下のステップで反応を始める。１）固相に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰと共に、望ましくは、ラベルされたｄＮＴＰ類の一つを含む反応混合物を加える。２）液相と反応混合物をインキュベートし、次いで、固相と反応混合物を加熱し、アンチセンスｍＲＮＡを含む液相をつくる。そののち、液相を取得し、ＤＮａｓｅで処理することにより、反応をつづけることが望ましい。本発明の別の実施態様は、固相担体上にセンスｍＲＮＡを以下のステップによって生産する方法に向けられている。（ａ）ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補する配列を少なくとも一つもっており、ＲＮＡプロモーターを少なくとも一つもっており、更に制限酵素認識サイトを少なくとも一つもっているポリヌクレオチドを、不溶性担体に結合させ、ヌクレオチド固定化担体をつくる；（ｂ）ヌクレオチド固定化担体にポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有サンプル液を加える；（ｃ）ｍＲＮＡのポリＡテイルを相補塩基配列とハイブリダイズさせる；（ｄ）ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡをつくるため、鋳型としてｍＲＮＡを用いる；（ｅ）アンチセンスｃＤＮＡに相補的なセンスｃＤＮＡをつくる。この際、ｄｓ−ｃＤＮＡ分子は担体に固定されている；（ｆ）ｄｓ−ｃＤＮＡに、二本鎖のアダプターを加える。この二本鎖アダプターは、不溶性担体に固定化されたポリヌクレオチドとは異なる第２のＲＮＡプロモーター、及び不溶性担体に固定化されたポリヌクレオチド上の制限酵素認識サイトとは異なる第２の制限酵素認識サイトの、少なくとも一つを含んでいるものである。オプションとして、ＤＮＡリガーゼ及び二本鎖アダプター含有の反応混合物を加えてもよい；（ｇ）第２の制限酵素認識サイトを認識する制限酵素で、ｄｓ−ｃＤＮＡを消化する；（ｈ）第２のＲＮＡプロモーターを用いて、ＲＮＡを転写し、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをつくる。この反応は固相に、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、及び第２のＲＮＡプロモーターと反応するＲＮＡポリメラーゼを加え、そののち、固相と反応混合物をインキュベートし、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをつくる。オプションとして、前記のｄＮＴＰ類の一つがラベルされていてもよい。（ｉ）好ましくは加熱によって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを解離させ、センスｍＲＮＡを含有する液相をつくる。液相をＤＮａｓｅで処理してもよい。本発明の他の実施態様は、以下の方法によるｄｓ−ｃＤＮＡの製造方法に向けられている。１．ヌクレオチド固定化担体にポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有サンプル液を加える；２．サンプル液と担体をインキュベートし、第１の液相と固相をつくる；３．第１の液相を除く。４．逆転写酵素、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰと共に、前記のラベルされたヌクレオチドを含む第１の反応混合物を、固相に加える；５．第１の反応混合物と固相をインキュベートする；６．ＲＮａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ含有の第２の反応混合物を固相に加え；そして７．第２の反応混合物と固相をインキュベートする。本発明の他の実施態様は、上記したような方法でｄｓ−ｃＤＮＡをつくり、次いで第２の反応混合物と固相を加熱する、センスｓｓ−ｃＤＮＡの製造方法である。このとき、センスｓｓ−ｃＤＮＡを含む第２の液相が得られる。本発明の他の実施態様は、上記したような方法でｄｓ−ｃＤＮＡをつくり、次いで第２の反応混合物と固相を加熱する、アンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡの製造方法である。このとき、センスｓｓ−ｃＤＮＡを含む第２の液相と、固相を含むアンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡが得られる。本発明の他の同様な実施態様の一つは、上記したようなｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を用いる、センスｃＤＮＡの製造方法である。センスｃＤＮＡとアンチセンスｃＤＮＡが液相で二本鎖ｃＤＮＡを形成したのちに、そのｄｓ−ｃＤＮＡは変性され、液相が得られる。本発明の他の同様な実施態様の一つは、センスｓｓ−ｃＤＮＡの製造方法に向けられている。この方法は、液相でのｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体の生産を含むもので、そこでは、ｄｓ−ｃＤＮＡ鎖の一方の鎖が不溶性担体に固定され、ｄｓ− ｃＤＮＡ鎖の一方の鎖は、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含んでいる。その後、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を変性し、液相を得る。本発明の他の実施態様の一つは、上記したように、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を製造することによる、アンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡの製造方法であり、そこでは、センスｃＤＮＡとアンチセンスｃＤＮＡは液相で二本鎖を形成している。このｄｓ−ｃＤＮＡは、この方法で自由に選択して開裂できる制限酵素サイトを含むほうが好ましい。ｄｓ−ｃＤＮＡを変性させ、液相を除去し、得られる固相はアンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡを含むであろう。本発明の他の実施態様の一つは、ベクターに特定の方向性をもたせて、ｃＤＮＡを挿入するｃＤＮＡベクターの操作方法である。一つの手順を以下に示す。（ａ）上記したように、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体をつくる。そこでは、不溶性担体に固定されたポリヌクレオチドには、第１の制限酵素認識サイトが付加されて含まれている；（ｂ）そのｄｓ−ｃＤＮＡに二本鎖アダプターを加える。この二本鎖アダプターは、不溶性担体に固定化されたポリヌクレオチド上の制限酵素認識サイトとは異なる第２の制限酵素認識サイトを含んでいる；（ｃ）そのｄｓ−ｃＤＮＡを、第１の制限酵素認識サイトを認識する制限酵素、及び第２の制限酵素認識サイトを認識する制限酵素で消化して、第１の粘着末端をもち、好ましくは更に第２の粘着末端をもつ、遊離型のｄｓ−ｃＤＮＡを生じさせ；（ｄ）遊離型のｄｓ−ｃＤＮＡを、第１の粘着末端に対して相補的配列をもち、好ましくは更に第２の粘着末端に対しても相補的配列をもつベクターに挿入する。本発明のもうひとつの局面は、表面にＳＨ基をもつ不溶性担体に、少なくとも一つのプリン塩基をもつ第１の一本鎖ポリヌクレオチドを、その第１の一本鎖ポリヌクレオチドに第２の一本鎖ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖コンプレックスを形成させるたのちに、これを固定化する方法に向けられている。担体は第一級アミン化合物で任意に処理される。上記コンプレックスは、このとき、プリン塩基を副反応から保護する。その後、第１のポリヌクレオチドの５ ’を、好ましくは二本鎖コンプレックスを変性後に、マレイミド化合物と反応させると、５’末端にマレイミド基をもつポリヌクレオチドが生じる。一つの任意に選ばれるマレイミド化合物はスルフォ−ＳＭＣＣである。反応が進むと、不溶性担体に結合されたＳＨ基に、第１のポリヌクレオチドの５’末端と反応したマレイミド基が結合する。上記の不溶性担体へのポリヌクレオチドの固定化方法において、好ましい一つの実施態様では、不溶性担体上でアミン残基とスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオ酢酸（ＳＡＴＡ）を反応させ、反応コンプレックスを形成させることにより、ＳＨ残基がアミン残基からつくられる。反応コンプレックスの脱アセチル化はヒドロキシルアミンで行われる。図面の簡単な説明図１は、マレイミド法による不溶性担体上への第１のポリヌクレオチド・プローブの固定化手順を示す。図２は、カルボジイミド法による不溶性担体上への第１のポリヌクレオチド・プローブの固定化手順を示す。図３は、本発明における、ポリヌクレオチド固定化担体からのセンスｓｓ−ｃＤＮＡ、アンチセンスｍＲＮＡ及びセンスｍＲＮＡの合成手順の原理を示す。図４は、本発明による、合成されたＧｓ蛋白のアンチセンスｍＲＮＡ（Ａ）及びセンスｍＲＮＡ（Ｂ）のアガロースゲル電気泳動のポラロイド写真を示す。図５は、本発明における、ポリヌクレオチド固定化担体からのＧｓ蛋白のｓｓ −ｃＤＮＡからの、ＰＣＲで増幅されたｄｓ−ｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動のポラロイド写真を示す。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ同じプレートからの、第１、第２及び第３の合成を示す。図６は、本発明による、ヒトの末梢血白血球からのｊｕｎオンコジーンの、ＰＣＲで増幅されたｄｓ−ｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動のポラロイド写真を示す。図７は、本発明による、ヒトの末梢血白血球からの種々の遺伝子の、ＰＣＲで増幅されたｄｓ−ｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動のポラロイド写真を示す。（Ａ）及び（Ｂ）は、ＰＣＲのアニーリングの温度がそれぞれ、４５℃及び５５ ℃である。図８は、本発明による、ＰＣＲで増幅されたＧｓ蛋白のｄｓ−ｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動のポラロイド写真を示す。発明の詳細な説明定義よく知られた以下の略号を使用した。Ａ：アデニンＣ：シトシンＧ：グアニンＴ：チミンＵ：ウラシルｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸本発明において、「不溶性皿」とは、オリゴヌクレオチドの通常の生産に使用され、水性緩衝液もしくは溶液に不溶性の、窪みをもった、もしくは平らな担体を意味する。本願で使用される不溶性皿は、液体を保持できるものが好ましい。したがって、好ましい実施態様はマイクロタイター・ディシュ、プラスチック・プレート又はナイロン膜であって、例えば、プラスチック・ビーズや他の不溶性ビーズではない。制限エンドヌクレアーゼ酵素で特異的に消化されるヌクレオチド配列は、ここでは、「制限酵素認識サイト」として定義される。そのような認識サイトは数多く知られており、ある与えられた配列は１以上の認識サイトを持っていることもありうる。例えば、その配列がＮｏｔＩに対する認識サイトとＥｃｏＲＩに対する認識サイトの両方を含むような場合である。「ＲＮＡプロモーター」は、ここでは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、そこから下流にヌクレオチドの転写が始まるヌクレオチド配列を意味する。例えば、Ｔ７ＲＮＡプロモーター（SEQ ID NO:1）は下記に示される。５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’ 別のもう一つのＲＮＡプロモーターはＳＰ６プロモーター（SEQ ID NO:2）で、下記に示される。５’−ＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ−３’ 「不溶性担体」とはここでは、本願発明の範囲内において操作するとき、操作をしているあいだに使用溶液に実質的に溶解せず、また加熱過程で融解もしくは溶解しない物質を意味する。そのような不溶性担体の例として、不溶性皿（プラスチック製マイクロタイタープレート、ガラス製マイクロタイタープレート、又はナイロン膜を含む）があり、また、アガロースやプラスチック・ビーズも含む。本願発明において、センスｍＲＮＡとは遺伝情報と同等なｍＲＮＡを意味し、一方、アンチセンスｍＲＮＡとはセンスｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドを意味する。センスｓｓ−ｃＤＮＡは、センスｍＲＮＡの遺伝情報と同等な遺伝情報を含んでいる。ただし、そのｃＤＮＡにおいては、ｍＲＮＡのウラシルはチミンに置き代わり、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであってリボヌクレオチドではない。本発明で用いられる水は、その中のＲＮａｓｅ活性を実質的に減少させるために、好ましくは、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理される。水のＤＥＰＣ処理は、水に対してＤＥＰＣを０．１％加え、３７℃で一晩インキュベート後、オートクレーブすることにより行う。本発明の概観本願発明を使用して、ｄｓ−ｃＤＮＡ、ｓｓ−ｃＤＮＡ、センス−ｍＲＮＡ及びアンチセンスｍＲＮＡが迅速、かつ有利にマイクロタイター・プレートのような不溶性皿（ＩＤ）の中で、固定オリゴヌクレオチド配列から合成される。このシステムの利点は、ＲＮＡが不溶性皿に固定されているとき、液を容易に交換できる点である。以前には、エタノール沈殿やそれに類似の操作は、液交換のたびに可溶性ＲＮＡを回収する必要があった。本発明の好ましい実施態様では、制限酵素サイト、ＲＮＡプロモーター配列及びポリｄＴ配列は、共有結合でマイクロタイター・プレートのウェルに結合されている。細胞質のｍＲＮＡを含む細胞溶解液は、更に精製することなく、ウェルの中に注ぐことができる。好ましい実施態様においては、オリゴｄＴヌクレオチド鎖は、ｍＲＮＡのポリＡテイルと水素結合するであろう。ｍＲＮＡがアニールによって、ターゲットに固定化されると、ハイブリダイゼーションの条件を妨害しない液の交換をすることができる。一本鎖ｃＤＮＡは、デオキシヌクレオチドと逆転写酵素を加えることにより、固定化ｍＲＮＡから製造できる。二本鎖ｃＤＮＡは、その反応液をＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシオリゴヌクレオチドを含む反応液に交換すれば容易に製造できる。アンチセンスｍＲＮＡは、共有結合で付加されたオリゴヌクレオチド上のプロモーター結合サイトに向けられたＲＮＡポリメラーゼを加えることにより、転写できる。更に、好ましくは、別の異なる制限酵素認識サイト及び第２のＲＮＡプロモーター配列を含むアダプターを、そのｄｓ−ｃＤＮＡの固定されていない方の末端に、有利に結合させることができる。その後、センスｍＲＮＡは、結合されたアダプターに向けられたＲＮＡポリメラーゼを加えることにより、速やかに容易に、転写される。一本鎖センスｃＤＮＡは、固定された一本鎖アンチセンスｃＤＮＡから、繰り返し合成できる。本発明は、基礎分子生物学と分析のみに有用な道具を提供するものではなく、種々の疾患の分子診断及び治療にも有用である。我々は、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを不溶性担体に固定すると、理論及び応用分子生物学におけるヌクレオチド類合成や実験テクニックに意義のある有利性がもたらされることを見出した。これらの有利性の多くは、以下の発明の記述から明らかとなるであろう。本発明の固定化ポリヌクレオチド上で述べたように、固定化ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含んでいる。そのような相補的配列は、オリゴｄＴやポリＵである。その配列の長さは１５〜８０塩基、更に好ましくは、３０〜１００塩基である。３０〜１００ｍｅｒを含む種々の長さのポリヌクレオチドは、この分野で通常の知識をもつ技術者に知られたテクニックを用いて容易に合成できる。これらのテクニックは、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列、ＲＮＡプロモーター配列、及び／又はいろいろな制限酵素サイトをもった配列の合成方法を含む。ＤＮＡ合成装置は、そのような合成を促進する。ＤＮＡ合成装置の一つは、カリフォルニア州、ロサンジェルスのアプライド・バイオシステムズ社により生産されている。本発明の好ましい実施態様において、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドは、不溶性担体に結合されていて、ヌクレオチド固定化担体を構成する。これらの配列は、好ましくは３０〜１００ヌクレオチド長さである。より好ましい実施態様では、固定化ポリヌクレオチドは、更にＲＮＡプロモーター、及び／又は制限酵素認識サイトを含む。好ましくは、その５’末端は不溶性担体に固定され、その３’末端はｍＲＮＡのポリＡテイルに相補する。我々は、固定化のためのポリヌクレオチドを数多く使用してみた。一つの特に好ましい配列は、ポリｄＴ配列、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ認識サイト、及びＴ７プロモーター配列を含む配列である。この配列の使用は本明細書の実施例で多く記述されている。しかし、他の制限酵素認識サイト及びプロモーターを組合せても、我々は同様の結果を得ている。例えば、Ｔ７プロモーターと共にＳｍａＩ−ＳａｌＩを使用しても、ここに記載の方法に重要な影響を及ぼさないようである。我々はまた、ＳＰ６プロモーターと共にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩも使用した。固定化方法本発明の実行に当っては、ポリヌクレオチドは不溶性担体に固定される。不溶性担体へのポリヌクレオチドの固定化方法は種々用いることができ、その方法には共有結合法、イオン結合法、その他物理吸収法がある。しかし、共有結合法が好ましい。本発明のある実施態様においては、ポリヌクレオチドはその表面にカルボキシル基、アミノ基、又は水酸基のような官能基をもつマイクロタイター・プレートに固定される。その表面にカルボキシル基又は第一級アミノ基をもつプラスチック・プレート、あるいは、その表面にこれらの官能基をもたないが、後にこれらの官能基を付加したプラスチック・プレートも使用できる。好ましくは、その表面に既にカルボキシル基又は第一級アミノ基をもつプラスチック・プレートである。これらカルボキシル基又は第一級アミノ基をもつプラスチック・プレートの例は、「スミロン」マイクロプレートＭＳ−３７９６ＦやＭＳ−３６９６Ｆで、住友ベークライトから入手できる。官能基をもつ不溶性担体にポリヌクレオチドを固定する好ましい方法では、ポリヌクレオチドの５’末端を担体の官能基に共有結合で結合させる。官能基へのポリヌクレオチドの結合に用いられる種々の共有結合法の多くは、使用できる。よく知られた、好ましい方法の例は、マレイミド法とカルボジイミド法がある。マレイミド法は、図１に示したように、マレイミド基を含む物質と別のＳＨ基を含む物質との反応を伴う。マレイミド法を用いて、不溶性担体にポリヌクレオチドの５’末端を結合させるため、ポリヌクレオチドの５’末端はマレイミド化合物と反応させる。好適なマレイミド化合物はスルフォスクシンイミディル−４ −（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（以下、スルフォ−ＳＭＣＣ）である。ＳＨ基は、アミノ基をもつ担体とスクシンイミディル−Ｓ−アセチルチオアセテート（以下、ＳＡＴＡ）との反応に続く、ヒドロキシラミンを用いる脱アセチル化により、担体に付与される。なお、スルフォ−ＳＭＣＣやＳＡＴＡは、ピアース社等のいくつかの会社から、市販品を容易に入手できる。生じた担体上のＳＨ基は、ポリヌクレオチドの５’末端のマレイミド基と反応し、ポリヌクレオチド固定化担体を形成する。マレイミド法を用いて我々が経験した一つの問題は、プレート上のＳＨ基がポリヌクレオチドの５’末端のアミノ基と反応するばかりではなく、プリン塩基、すなわち、アデニン及びグアニンの第一級アミンとも反応することである。ポリヌクレオチドを５’末端でのみ固定化することを確かなものとするため、プリン塩基上のアミノ基は、固定化の前に相補的ポリヌクレオチドと対をつくらせて、保護しておく。固定化ののちに、相補的ポリヌクレオチドは加熱等の変性処理により除かれる。カルボジイミド法は、図２に示されている。この方法は、アミノ基をもつカルボジイミドとカルボキシル基をもつ材料との反応を伴う。カルボジイミド化合物の一つの例は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣ）である。カルボジイミド法でＥＤＣを用いるためには、ＥＤＣを先ずアミノ基をもつＥＤＣ化合物に活性化しておかなければならない。これは、Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイミド（以下、スルフォ−ＮＨＳ）と共に反応させて得られる。ＥＤＣもスルフォ−ＮＨＳも、ピアース社等のよく知られた会社から、市販品を容易に入手できる。カルボジイミド法で担体にポリヌクレオチドを結合させるには、好ましくは、予めカルボキシル基を結合させた担体を用いる。ＥＤＣは、スルフォ−ＮＨＳと反応させ活性化しておく。この活性化ＥＤＣは、その表面にカルボキシル基を含む担体と反応する。次いで、これをアミノ基をもつポリヌクレオチドの５’末端と反応させると、ポリヌクレオチド固定化担体が得られる。我々は、不溶性担体上の活性化アミノ基又は活性化カルボキシル基の非特異的結合が、そのプレートを第一級アミン化合物、好ましくは、グリシンで処理することにより、効果的に減少もしくは除去されうることを見つけている。他の多くの固定化方法、例えば、寺田らにより記述されているビオチン−アビジン系を用いる方法も使用できる（上掲書）。検体の供試本発明の好ましい方法においては、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列をもつ不溶性担体に、ｍＲＮＡを含む検体を供試する。検体のｍＲＮＡのポリＡテイルは、固定化ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように処置される。この処置は、この分野で通常の知識をもつ技術者によく知られたように、種々の因子に依存する温度によるインキュベーションにより達成される。これらの因子は、相補的ヌクレオチド配列の長さ、相補的ヌクレオチド配列の全塩基量のうちのグアニンもしくはシトシンの比（ＧＣ含量）、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度、相補鎖におけるミスマッチの塩基数、及びヌクレオチドの型、等である。本発明の好ましい形においては、次の式がインキュベーションの温度の計算に使用できる。Ｔ（inc）＝16.6×log（Ｍ）＋0.41（ＧＣ）＋81.5-67.5/n-15（℃）上式において、Ｍは溶液中の塩化ナトリウム濃度（Ｍ）、ＧＣはＧＣ含量、ｎはヌクレオチド配列の長さ（ヌクレオチドの数）を示す。インキュベーションの時間も、「モレキュラー・クローニング」のマニュアルに書かれている。インキュベーションの時間は、好ましくは、１時間から一晩で、検体は、インキュベーションの間ゆっくり振ったほうが好ましい。インキュベーションは、好ましくは好適な緩衝液中で行う。ノーザーンブロットやドットブロット法においてＲＮＡとＤＮＡをハイブリダイズさせるときに用いる緩衝液と同じ緩衝液が使える。この緩衝液は、好ましくは、ＲＮａｓｅで汚染されないようにして、調製する。もし、ＲＮａｓｅが存在するようなら、その活性をできるかぎり抑えるようにコントロールしなければならない。ＲＮａｓｅを含まない緩衝液は、例えば市販品の「ファスト・トラック」（インヴィトロゲン社、サンジエゴ、カルフォルニア州）の商標で売られているｍＲＮＡ精製用キットの中に、あるいは、後述の溶解用バッファーとして、入手できる。上記したように、本発明で使用する水からＲＮａｓｅ活性を除去するために、水は好ましくは、ジエチルピオカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理される。好ましいＤＥＰＣ処理は、水にＤＥＰＣを０．１％加え、３７℃で一晩放置したのち、オートクレーブで滅菌する。洗浄操作インキュベーション後、好ましくは、検体の非結合成分を不溶性担体から洗い去る。適当な洗浄液は、インキュベーション用バッファーであり、あるいはｍＲＮＡ精製用キットに含まれるバッファー等である。しかし、核酸の型に因っては、適当な溶液を使用することが好ましい。ｍＲＮＡを捕捉したまま保持するための洗浄液は、好ましくは、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．５Ｍ塩化ナトリウム含有の２０ｍＭトリスバッファー（ＤＥＰＣ処理水を使用）、ｐＨ７．５（以下、ＲＮＡ洗浄液という。）を用いる。ＤＮＡをそのまま保持するための洗浄液は、好ましくは、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．５Ｍ塩化ナトリウム含有の２０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ７．５をオートクレーブし、これ（以下、ＤＮＡ洗浄液という。）を用いる。二本鎖ｃＤＮＡ固定化担体本発明におけるｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体は、次のようにして得られる。ポリヌクレオチド固定化担体を、ｍＲＮＡ検体と混合し、固定化ポリヌクレオチドとｍＲＮＡのあいだでハイブリダイゼーションを起こさせる。次いで、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡが合成される。ｍＲＮＡは、好ましくは、ＲＮａｓｅＨを用いて消化され、次いで、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ、４つのｄＸＴＰ類及びリガーゼの作用により、ｄｓ−ｃＤＮＡが合成される。その結果、不溶性担体に固定化されたｄｓ−ｃＤＮＡの構築が成される。生じたｃＤＮＡの相補鎖は、その生産の間、標識ｄＸＴＰ類を取り込むことにより、標識させることができる。種々の標識方法のいくつか、例えば、放射性物質あるいはビオチンのような試薬−引き続き起こる比色的又は光発生反応で検出可能なのであるが−等が用いられる。固定化ｃＤＮＡは、更に種々のテクニックのため、利用できる。本発明の特に好ましい方法では、もし固定化ポリヌクレオチドがＲＮＡプロモーター配列をもっているならば、アンチセンスＲＮＡをつくることができる。そのとき、プロモーターに対する好適なＲＮＡポリメラーゼが、４つのリボヌクレオチド三リン酸と共に加えられる。この分野の通常の知識をもつ技術者にとって明らかなように、少なくともこれらヌクレオチド三リン酸の一つが標識をもっているならば、この際のアンチセンスＲＮＡが標識されることは明らかであろう。本発明の更に好ましい方法は、熱変性で生じた固定化アンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡに検体をハイブリダイズさせて、ＲＮＡブロット分析と同等の分析方法を提供できることである。熱変性後、センスｓｓ−ｃＤＮＡは液相に来るであろう。このセンスｓｓ−ｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ及び塩基配列決定のような種々の良く知られたテクニックに利用されるであろう。これらの実験で使用されるｍＲＮＡは、好ましくは、精製ｍＲＮＡ、生物試料からのｍＲＮＡ、又はＲＮａｓｅ活性を阻害した細胞溶解液である。ｍＲＮＡの精製は、ノーザーンブロット又はドットブロット法で使用されるｍＲＮＡ精製法が使える。市販のキットも入手できる。ＲＮａｓｅ活性を阻害した細胞溶解液を得る操作のためには、溶解用バッファーが好んで使われ、そこでは、生物試料は２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１０ｍＭバナジル・リボヌクレオシド・コンプレックス、５００単位／ｍｌＲＮａｓｅインヒビター、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）含有のｐＨ８．０溶液で処理される。インキュベーションの温度は、その実験が核酸のハイブリダイゼーションか、酵素反応かによって、それぞれのケースで変動する。ハイブリダイゼーションは、検体の供試と題したセクションで既に述べている。酵素反応においては、酵素が阻害されない温度ならばどんな温度でも構わないが、それぞれの酵素に最適な温度がよい。インキュベーションの時間は、３０分〜一晩で、振り混ぜの有無はいずれでもよい。酵素反応では、酵素活性を阻害しなければどんな緩衝液も使用できるが、それぞれの酵素活性に最適な緩衝液成分が好ましい。しかし、この緩衝液にＲＮａｓｅが混入していないことが重要である。もしＲＮａｓｅが存在するならば、その作用をＲＮＡｓｉｎ等のインヒビターを用いてできる限り最小に抑えておかねばならない。更に付言すれば、二本鎖ポリヌクレオチド・コンプレックスを変性させるような加熱反応は、好適な緩衝液中で行われる。固定化ｄｓ−ｃＤＮＡを含む不溶性担体は、ＤＮａｓｅが混入していない溶液、好ましくは、ＤＮａｓｅが混入しておらず、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．５Ｍ塩化ナトリウム含有の２０ｍＭ、ｐＨ７．６のトリス−塩酸緩衝液から成る溶液の条件下で、４℃で少なくとも１ヵ月保存することができる。固定化ポリヌクレオチドをもつ不溶性担体は、繰り返し何度も使用できる。事実、我々は、ヌクレオチド固定化担体を固定化ヌクレオチドの有意な損失なく、何度も使用した。固定化ポリヌクレオチドの再使用のために行う、ハイブリダイズされたｍＲＮＡの消化及び除去は、インキュベーションの後にＲＮａｓｅ含有液でリンスして行う。ＲＮａｓｅ含有液の代わりに希ＮａＯＨ溶液を用いて、固定化ｃＤＮＡからハイブリダイズされたｍＲＮＡを除去することもできる。第２のＲＮＡプロモーターおよびセンスＲＮＡの合成本発明方法の一つの実施態様では、第２のＲＮＡプロモーターがあることが望ましい。この第２のＲＮＡプロモーターは、センスＲＮＡの生産に向けられ使用される。標識されたヌクレオチド三リン酸が、標識されたセンスＲＮＡの生産に使用できる。第２のＲＮＡプロモーターのヌクレオチド配列は、その下流に続く遺伝情報を転写・開始させるため用いられるＲＮＡポリメラーゼで認識できる配列である。第２のＲＮＡプロモーターは、通常は、ｄｓ−ｃＤＮＡの第１のプロモーターの反対側に位置する。これらの配列は、ポリヌクレオチド固定化不溶性担体の第１のプロモーター配列とは異なるプロモーター結合サイトをコードする配列が好ましい。本発明では、第２のＲＮＡプロモーターと反応するＲＮＡポリメラーゼは、第１のＲＮＡプロモーターと交叉反応を起こしてはならない。仮に、第１のＲＮＡプロモーターがバクテリオファージＴ７からのものであるとき、第２のＲＮＡプロモーターは例えば、ＳＰ６プロモーターとすることができる。第２のプロモーターを提供するため、第２のＲＮＡプロモーター及び第２の制限酵素認識サイトを含むアダプターが使われる。このアダプターは、ｄｓ−ｃＤＮＡの末端に付加される。好適なアダプターの例は、下記のＳＡｌＩ−ＳＰ６アダプターである（SEQ ID NO:3）。５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ−３’ ３’− ＧＴＡＡＡＴＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＴ−５’ 第２の制限酵素認識サイトは、好ましくは、ポリヌクレオチド固定化不溶性担体中にある制限酵素認識サイトと同じであってはならない。同じならば、消化されるｍＲＮＡの方向性が失われるからである。第１の制限酵素が、例えば、ＥｃｏＲＩ及び／又はＮｏｔＩならば、第２の制限酵素がＳｍａＩ及び／又はＳａｌＩとする。方向性をもったクローニング一方の末端に第１の制限酵素サイト、及び他方の末端に第２の制限酵素サイトを含むｄｓ−ｃＤＮＡ分子は、平滑末端連結により調製できる。この方法では、制限酵素サイト及びＲＮＡプロモーター配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｔ４リガーゼのような酵素を用いて、固定化ｄｓ−ｃＤＮＡの固定されていない一方の末端に連結される。生じた修飾ｄｓ−ｃＤＮＡは、両制限酵素サイトを含む直鎖状ベクターに挿入される。第１の制限酵素サイトと第２の制限酵素サイトは類似していないので、ｄｓ−ｃＤＮＡの連結は一方向性をもって起こるであろう。この方法では、ベクターへのｃＤＮＡの挿入の方向はコントロールできる。発明の図示的、例示的使用本発明の好ましい実施態様を図示的に図３に示した。制限酵素認識サイト、ＲＮＡプロモーター、及びオリゴｄＴ配列をもつ、３０〜１００ｍｅｒのポリヌクレオチド配列を含む不溶性担体（ａ）は、ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有検体液と混合される。生じた固定化ポリヌクレオチド−ｍＲＮＡのコンプレックスは、固定化ヌクレオチドのオリゴｄＴテイルをプライマーとし、ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素と反応させる。その結果、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドが不溶性担体（ｃ）上で合成される。ＲＮａｓｅ及びＤＮＡポリメラーゼの添加は、ＲＮＡの消化を伴い、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドは、不溶性担体（ｄ）上に固定されたｄｓ−ｃＤＮＡへと変換される。次いで、この固定されたｄｓ−ｃＤＮＡは、低塩濃度で、例えば、水中でインキュベートされ、次いで加熱されてｄｓ−ｃＤＮＡを変性させる。センスｓｓ−ｃＤＮＡは、その相補ペアと水素結合を保つことができず、溶液（ｅ）中に遊離の形で浮遊する。浮遊するセンスｓｓ−ｃＤＮＡ（ｅ）は、その後ＰＣＲの鋳型として興味対象の特異的遺伝子の増幅のため使用される。上記ｄｓ−ｃＤＮＡ固定不溶性担体（ｄ）の他の使用は、アンチセンスｍＲＮＡ（ｆ）の生産のためである。ｄｓ−ｃＤＮＡのアンチセンス鎖に特異的なＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ分子の転写に使われる。次いで、マイクロタイター・プレートを加熱し、液を除去し、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（ｆ）で消化することによって、アンチセンスｍＲＮＡが得られる。本発明の更に別の実施態様は、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体（ｄ）を二本鎖オリゴヌクレオチドの連結ターゲットとして使うことである。これらのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、第２のＲＮＡプロモーター及び第２の制限酵素サイト（ｇ）に対応するヌクレオチド配列を含んでいる。そして、このコンプレックス（ｇ）は、第２のプロモーターから転写が始まるＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることによって、センスｍＲＮＡを合成できる。次いで、マイクロタイター・プレートを加熱し、液相を除去し、液相をＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（ｈ）で消化することによって、センスｍＲＮＡを合成できる。この発明の種々の面を、以下の実施例によって更に詳細に説明する。これらの実施例は、分かりやすく説明することを意図したもので、本発明を何ら制限するものではない。実施例１イン・ビトロで合成されたＧｓ蛋白特異的なｍＲＮＡからの、ｓｓ−ｃＤＮＡ、ｄｓ−ｃＤＮＡ、センスｍＲＮＡ及びアンチセンスｍＲＮＡの合成、並びにＰＣＲによるＧｓ蛋白特異的ｄｓ−ｃＤＮＡの増幅（１）ポリデオキシリボヌクレオチドの合成ＤＮＡシンセサイザー３８０Ｂ（Applied Biosystems社製）を用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩが認識する塩基配列、Ｔ７ＲＮＡプロモーターの塩基配列並びにチミンが１７個連続した塩基配列を含む下記の５３ｍｅｒのポリデオキシリボヌクレオチドを合成した。このポリデオキシリボヌクレオチドの塩基配列（SEQ ID NO:4）を、次に示す。５’−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’ 合成に当っては、Applied Biosystems社のプロトコールに従って、アミノリンク−２（Applied Biosystems社製）を用い、このポリデオキシリボヌクレオチドの５’末端にアミノ基を導入した。合成後、３０％水酸化アンモニウム中、５５ ℃で、一晩、放置した後、スピード・バック（Savant社製）で乾燥し、ＤＥＰＣ処理水で１mg/mlとなるように溶解し、−２０℃で保存した。（２）マイクロタイタープレートへのポリデオキシリボヌクレオチドの固定ＤＥＰＣ処理水に溶解した２０ｍＭＥＤＣ（Pierce社製）液とＤＥＰＣ処理水に溶解した１０ｍＭスルフォ−ＮＨＳ（Pierce社製）液を２４μｌずつ当量混合し、これに上記（１）のポリデオキシリボヌクレオチド２μｌ（２μｇ）を加え、この溶液をスミロンマイクロプレートＭＳ−３７９６Ｆ（住友ベークライト社製）のウェル中に注ぎ、３７℃で一晩、インキュベートした。その後、反応液を１ｍＭＥＤＴＡ及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０Ｍトリス塩酸緩衝液（Ｈ７．６）に置き換え、使用するまで、４℃に保管した。（３）ｍＲＮＡの合成ラットＧｓ蛋白特異的ｍＲＮＡを次のように合成した。ラットＧｓ蛋白のｃＤＮＡが挿入されたプラスミドベクターｐＧＥＭ２の１００μｇは米国ジョーンズ・ホプキンス大学、Ｒ．リード博士から供与を受けた。そのプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩ（Promega社製）１０００ユニットで、３７ ℃、２時間、消化し、直鎖状とした。ｐＨ７．４のトリス塩酸緩衝液で予め飽和させたフェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）混合液を等量加えてＤＮＡを抽出したのち、これに０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムとドライアイスで冷した２．５容のエタノールを加え、３０分間、ＤＮＡを沈殿させた。次に、そのＤＮＡを１５，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間、遠心分離した（ＭＴＸ−１５０、Ｔｏｍｙ）。沈殿を７０％エタノールに再懸濁し、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間、再び遠心分離した。上清を除き、沈殿をスピード・バック減圧遠心で乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。これに５×ＲＮＡ転写バッファー（Promega社製）２０μｌ，１００mM ＤＴＴ（Promega社製）１０μｌ，ＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ、Promega社製）１００ユニット、２．５mMリボヌクレオチド（Prome ga社製）２０μｌ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega社製）１００ユニットを加え、ＤＥＰＣ処理水で最終液量を１００μｌとし、３７℃で２時間反応させた。その後、これにＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（Promega社製）１００ユニット（１００μｌ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＤＮＡの消化ののち、予め水で飽和させたフェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）混合液を等量加え、ＲＮＡを抽出した。ドライアイス上、０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容の冷エタノールを加えて、３０分間放置し、ＲＮＡを沈殿させた。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間、遠心分離し（ＭＴＸ−１５０、Ｔｏｍｙ）、沈殿を７０％エタノール１ｍｌに再懸濁し、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間、再び遠心分離した。上清を除いた後、沈殿をスピード・バック減圧遠心で乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。このＲＮＡの２６０ｎｍの吸光度を測定した（Ｕ−２０００、日立製）。２６０ｎｍの吸光度が１．０のときＲＮＡ濃度は４０μｇ／ｍｌとして、液中のＲＮＡの濃度を１．０μｇ／ｍｌとなるように希釈した。これを５μｌずつに分け、使用まで−７０℃に保管した。（４）マイクロタイタープレート上でのｄｓ−ｃＤＮＡの合成合成されたヒトＧｓ蛋白特異的ｍＲＮＡをＤＥＰＣ処理水で希釈し、それぞれ、その５μｇ、１μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ及び０．１ｐｇを含むサンプル液５μｌをとり、溶解バッファー４５μ ｌを加え液量を５０μｌとし、４５℃で１時間インキュベートして内在のＲＮａｓｅを分解した。これに、最終濃度が０．５Ｍとなるように５Ｍ塩化ナトリウムを加えた。この液をポリデオキシリボヌクレオチド固定マイクロタイタープレートのウェルに注いだ。室温で３０分間インキュベートし、そのｍＲＮＡのポリＡテイルと固定化オリゴｄＴをハイブリダイズさせた。洗浄後、７５ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＤＴＴ及び０．５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）５０μｌ，並びに逆転写酵素（スーパースクリプト、Gibco-BR L社製）５００ユニットを、それぞれのウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートし、ｍＲＮＡを鋳型として第１のｃＤＮＡ鎖を合成させた。この「第１のｃＤＮＡ鎖」合成後、その緩衝液を１００ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１５ｍＭ酸化型β−ＮＡＤ、各０．２５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、１．２ｍＭＤＴＴ、６５ユニット／ｍｌＤＮＡリガーゼ、２５０ユニット／ｍｌＤＮＡポリメラーゼおよび１３ユニット／ｍｌＲＮａｓｅＨ（Gibc o-BRL社製）を含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ｄｓ−ｃＤＮＡ調製用バッファーという。）５０μｌに置き換え、１６℃で３時間インキュベートし、第１のｃＤＮＡ鎖からｄｓ−ｃＤＮＡを合成した。反応終了後、液を１ｍＭＥＤＴＡ及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に置き換え、４℃に保管した。（５）固定化ヌクレオチドからのｓｓ−ｃＤＮＡの合成上記パラグラフ（４）で述べた固定化ｄｓ−ｃＤＮＡをｃＤＮＡ洗浄液で５回洗い、ＤＥＰＣ処理水５０μｌを加え、８０℃、１０分間加熱し、相補的ｃＤＮＡ鎖を変性させた。遊離のｓｓ−ＤＮＡを含む溶液を直ちに新鮮な０．６５ｍｌ容チューブに移し、これを−２０℃に保管した。プレートは、上記パラグラフ（４）で述べたようにして、ｄｓ−ｃＤＮＡ調製用バッファーとともに再度、１６ ℃で３時間インキュベートし、ｄｓ−ｃＤＮＡ合成のため再使用した。この操作を３回繰り返し、ウェル一つからｓｓ−ｃＤＮＡ液を合計３回採取した。（６）アンチセンスｍＲＮＡの合成上記パラグラフ（４）で得た固定化されたｄｓ−ｃＤＮＡをＲＮＡ洗浄液で５回洗浄し、５×転写バッファー（Promega社製）１０μｌ、１００ｍＭＤＴＴ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ５０ユニット（１．２５μｌ）、１０ｍＭリボヌクレオチド混合物１０μｌ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ２０ユニット（１μｌ）を加え、ＤＥＰＣ処理水で液量を５０μｌとした。３７℃で一時間インキュベートしたのち、プレートを９０℃で８分間加熱し、遊離のアンチセンスｍＲＮＡ含有液を直ちに新鮮なチューブに移した。これに、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（Promega社製）１０ユニット（１０μｌ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートし、残っているＤＮＡを消化した。次いで、反応混合物に等量の水飽和フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合液を加え、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをエタノールで沈殿させ、１５，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した（ＭＴＸ−１５０、Ｔｏｍｙ）。沈殿を７０％エタノール１ｍｌに再懸濁し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間、再度遠心分離した。上清を除いたのち、沈殿をスピード・バック遠心（Savant社製）で乾燥し、ＤＥＰＣ処理水５μｌに再懸濁した。得られたアンチセンスｍＲＮＡ分子を下記のアガロースゲル電気泳動で分析した。ｍＲＮＡの５μｌに、４０ｍＭ酢酸ナトリウム及び５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）含有の０．１ＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）２μｌ、ホルムアミド１０μｌ及びホルムアルデヒド３．５μｌを加え、４５℃、１５分間加熱した。次いで、そのｍＲＮＡ液に、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２５％ブロモフェノールブルー及び０．２５％キシレンシアノールＦＦを含有する５０％グリセリン（ローディング・バッファー）２μｌ、及び１ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド１μｌを加え、１％アガロースゲルに供試した。電気泳動は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１００Ｖ／６．５ｃｍ幅の電圧で、約１時間かけて行なった。電気泳動後、ゲルをＵＶで照射し、生じたＲＮＡ蛍光バンドを、図４（Ａ）に示すように、ポラロイドフィルム上に記録した。図４の（Ａ）のレーン１は、上記（３）の対照Ｇｓ蛋白ｍＲＮＡを示し、レーン２及び３は、ここで合成されたＧｓ蛋白ｍＲＮＡの別々の二つの実験を示す。成されたｍＲＮＡの大きさは約２０００塩基で、対照ｍＲＮＡより少し大きかった。これは、多分３’末端に付加されたポリデオキシリボヌクレオチドに因るものと思われる。（７）センスｍＲＮＡの合成上記パラグラフ（４）で得たｄｓ−ｃＤＮＡ固定化マイクロタイターウェルをｃＤＮＡ洗浄液で３回洗い、５×Ｔ４リガーゼバッファー（Gibco-BRL社製）１０μｌ、ＤＥＰＣ処理水３１μｌ、SEQ ID NO:3の配列のSalI-SP6アダプター４ μｌ（４μｇ）及びＴ４リガーゼ（Gibco-BRL社製）５μｌ（５ユニット）を加え、１６℃で一晩インキュベートした。各ウェルをｃＤＮＡ洗浄液で３回洗ったのち、Ｈバッファー（ベーリンガー・マンハイム社製）５μｌ、ＤＥＰＣ処理水４４μｌ及びSalI（ベーリンガー・マンハイム社製）１μｌ（１０ユニット）を加えた。この液を３７℃で２時間インキュベートし、SalIサイトで切断した。各ウェルをＲＮＡ洗浄液で５回洗い、５ ×ＲＮＡ転写バッファー１０μｌ、０．１ＭＤＴＴ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ１２５μｌ（５０ユニット）、１０mMリボヌクレオチド１０μｌ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（Promega社製）１μｌ（２０ユニット）を加え、ＤＥＰＣ処理水で液量を５０μｌとした。３７℃で１時間インキュベートしたのち、プレートを９０℃で８分間加熱し、ウェル内の液体を直ちに新鮮なチューブに移した。ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅの１０μｌ（１０ユニット）を加え、３７℃で３０分間インキュベートし、残存のＤＮＡを消化した。次いで、反応混合物に等量の水飽和フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合液を加え、ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをエタノールで沈殿させ、１５，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した（ＭＴＸ−１５０、Ｔｏｍｙ）。沈殿を７０％エタノール１ｍｌに再懸濁し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間、再度遠心分離した。上清を除いたのち、沈殿を乾燥し、ＤＥＰＣ処理水５μｌに再懸濁した。得られたｍＲＮＡ分子を、パラグラフ（６）で述べたようにアガロース電気泳動で分析し、蛍光を発しているＲＮＡバンドを図４（Ｂ）に示すように、ポラロイドフィルムに記録した。図４（Ｂ）のレーン１、２及び３は、それぞれ、上記パラグラフ（３）に記載したＧｓ蛋白ｍＲＮＡ、上記パラグラフ（６）からの合成Ｇｓ蛋白ｍＲＮＡ、及びパラグラフ（７）の合成Ｇｓ蛋白ｍＲＮＡを示す。合成ｍＲＮＡの大きさは約２０００塩基で、対照ｍＲＮＡより少し大きかった。これは、多分３’末端に付加されたポリデオキシリボヌクレオチドに因るものと思われる。（８）Ｇ蛋白特異的なｄｓ−ｃＤＮＡの増幅用ＰＣＲプライマーの合成Ｇ蛋白のアルファ・サブユニットに特異的なセンス（Ｇ2-s）及びアンチセンス（Ｇ4-as）オリゴデオキシリボヌクレオチドを、パラグラフ（１）に記載したようにＤＮＡシンセサイザーで合成した。塩基配列を次に示す。Ｇ2-s ５’−ＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡ−３’ （ SEQID NO:5）Ｇ4-as ５’−ＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡ−３’ （ SEQID NO:6）（９）ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅パラグラフ（５）で取得したｓｓ−ｃＤＮＡの１μｌに、上記Ｇ2-s及びＧ4-a sの２種類のヌクレオチド各０．１μｇ（１μｌ）、１０×ＰＣＲバッファー（P romega社製）５μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ混合物（Promega社製）４μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（Promega社製）０．５μｌ、及びＤＥＰＣ処理水３６．５μｌを加えた。これに蒸発防止のためミネラルオイル２滴を加え重層した。初めに９５℃で１０分間加熱し、その後サーマルサイクラー４８０型（Perkin-Elmer Cetus社製）でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、５５℃／１．５分、７２℃／４分及び９５℃／１．５分の保温サイクルを３０回繰り返した。並行実験として、Ｇｓ蛋白のｃＤＮＡ１０ｎｇ（１μｌ）を用い、陽性対照とした。得られたＰＣＲ産物の１０μｌに、１０×ローディング・バッファー（０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールＦＦ及び１５％フィコール、タイプ４００）１μｌを加え、６５℃で１５分間加熱し、その後、５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド含有１．５％アガロースゲルに供試した。電気泳動は、１×ＴＢＥバッファー（０．００１ＭのＥＤＴＡを含む０．０４５Ｍのトリス−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０）中、１００Ｖ／６．５ｃｍ幅の電圧で、約１時間かけて行なった。電気泳動後、図５に示すように蛍光を発するヌクレオチドバンドは、ポラロイドフィルム上に記録された。図５において、ゲル（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ、連続的な実験結である。ゲルのレーン２−１０は、上記パラグラフ（５）で述べた初めのｍＲＮＡを、それぞれ、５μｇ、１μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ及び０．１ｐｇ含んでいる。レーン１１は陰性コントロールで、ｍＲＮＡを含んでいない。図５に示すように、Ｇｓ蛋白のＤＮＡは、初めの１０−１００ｐｇのｍＲＮＡから再現性よく増幅され、その大きさは約５００塩基対で、レーン１の陽性対照の大きさと同じ程度であった。実施例２ヒト白血球からの、ｊｕｎオンコジーン特異的なｄｓ−ｃＤＮＡ及びセンスｓｓ−ｃＤＮＡの合成、並びにそのｄｓ−ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（Ｉ）ポリデオキシリボヌクレオチド固定化マイクロタイタープレートポリデオキシヌクレオチド固定化マイクロタイタープレートを、実施例１のパラグラフ（２）で述べたようにして調製した。（II）ヒト白血球の細胞溶解液の調製ヘパリン処理血３ｍｌに３倍量のリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）を加え、これをイソリンフォ（Gallard-Schlesinger社製）３ｍｌ入りの１５ｍｌチューブに加えて重層した。４００×ｇで３０分間遠心分離後、イソリンフォと血漿のあいだの中間層の細胞を集め、これをＰＢＳで３回、洗浄した。ペレット（細胞）に細胞溶解用バッファー１５０μｌを加え懸濁し、太さ１８Ｇの注射針の中を繰返し通して、細胞を完全に溶解させた。次いで、細胞溶解液を、間歇的に攪拌しながら、４５℃で３０分間インキュベートし、ＲＮａｓｅを減らした。（III）マイクロタイタープレート上でのｄｓ−ｃＤＮＡの合成パラグラフ（II）で調製した細胞溶解液に、最終濃度が０．５Ｍとなるように５Ｍ塩化ナトリウムを加えた。これを、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有細胞溶解用バッファーで１０倍、１００倍及び１０００倍に希釈した。得られた希釈液各５０μｌをポリデオキシリボヌクレオチド固定化マイクロタイタープレートのウェルに加え、室温で３０分間インキュベートし、固定化ポリｄＴ配列と分離細胞ｍＲＮＡのポリＡテイルとのあいだで、ハイブリダイズさせた。反応終了後、そのバッファーを除去し、各ウェルをＲＮＡ洗浄液を用いて２回洗浄した。各ウェルに、逆転写酵素用バッファー５０μｌ及び逆転写酵素５００ユニットを加え、３７℃で１時間インキュベートし、第１のｃＤＮＡ鎖の合成を開始させた。その反応バッファーを、ｄｓ−ｃＤＮＡ調製用バッファー５０μｌと置き換え、１６℃ で３時間インキュベートして、ｄｓ−ｃＤＮＡを合成させた。（IV）プレートからのｓｓ−ｃＤＮＡの合成パラグラフ（III）で得た固定化ｄｓ−ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ洗浄液を用いて５回洗い、次いでＤＥＰＣ処理水５０μｌを加えて、８０℃で１０分間加熱して、相補ＤＮＡ鎖を変性させた。次いで、ウェルの液を新鮮な０．６５ｍｌチューブに直ちに移し、これを−２０℃で保存した。（V）ｊｕｎオンコジーン特異的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅用プライマーの合成ｊｕｎオンコジーンに特異的な、下記の配列を有するセンス（ｊｕｎ−ｓ）及びアンチセンス（ｊｕｎ−ａｓ）オリゴデオキシリボヌクレオチドを、実施例１パラグラフ（Ｉ）に記載したように、ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した。 jun-s ：5'-CCC TGA AGG AGG AGC CGC AGA C-3' （SEQ ID NO:7） jun-as ：5'-CGT GGG TCA AGA CTT TCT GCT TGA GCT G-3'（SEQ ID NO:8）（VI）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅上記パラグラフ（IV）で得たセンスｓｓ−ｃＤＮＡ１μｌに、上記パラグラフ（V）の２種のオリゴデオキシリボヌクレオチド各１μｌ（０．１μｇ）、１０ ×ＰＣＲバッファー（Promega社製）５μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム１μ ｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ混合物（Promega社製）４μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（P romega社製）０．５μｌ及びＤＥＰＣ処理水３６．５μｌを加えた。蒸発を防ぐために、２滴のミネラル油を反応物に加えて、重層した。反応混合物を、実施例１パラグラフ（９）に記載したように、はじめは９５℃で１０分間、次いで、５５℃／１．５分、７２℃／４分及び９５℃／１．５分の保温サイクルを３０回繰り返して、ＰＣＲ増幅反応に供した。得られたＰＣＲ産物の１０μｌに、１０×ローディング・バッファー１μｌを加え、これを５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド含有１．５％アガロースゲルに供試した。電気泳動は、１×ＴＢＥバッファー中、１００Ｖ／６．５ｃｍ幅の電圧で、約１時間かけて行なった。電気泳動後、蛍光を発するＤＮＡバンドを、図４に示されるようにポラロイドフィルム上に記録した。図６のレーン１−８は、それぞれ、白血球の１：１０００希釈、原液（血液１ｍｌに相当）、１：１０希釈、及び１：１００希釈についての、２回の実験結果を示している。図６に示したように、ｊｕｎオンコジーンは、細胞溶解液の原液のみではなく、１：１０希釈や１：１００希釈についても、ｃＤＮＡの増幅が確認され、その大きさは３７０塩基対と評価した。この大きさは、理論値３７２塩基対と近似している。実施例３ヒト白血球からのタキキニン受容体に特異的なｄｓ−ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（ｉ）タキキニン受容体に特異的なｍＲＮＡの増幅用ＰＣＲプライマーの合成下記の２種類の塩基配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチド（tac-s及びt ac-as）を、実施例１パラグラフ（１）に記載したように、ＤＮＡシンセサイザーで合成した。 tac-s ：5'-ＧＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＣ-3' （SEQ ID NO:9） tac-as ：5'-ＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＡＴＧＧ-3' （SEQ ID NO:10）（ii）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅実施例２のパラグラフ（IV）で調製した細胞溶解液原液からのｓｓ−ｃＤＮＡ１μｌに、上記tac-s及びtac-asオリゴデオキシリボヌクレオチド各０．１μｇ（１μｌ）、１０×ＰＣＲバッファー５μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム１μ ｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ混合物４μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ０．５μｌ及びＤＥＰＣ処理水３６．５μｌを加え、混合した。蒸発を防ぐために、２滴のミネラル油を反応物に加えて、重層した。反応は、最初に９５℃、１０分間、加熱処理し、その後、アニーリング温度を４５℃と５５℃の２通り／１．５分とし、次いで、実施例１パラグラフ（９）に記載したように、エキステンションを７２℃／４分、及び変性を９５℃／１．５分とする加熱サイクルでＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産物１０μｌを１０×ローディングバッファー１μｌと混ぜ、６５℃、５分間加熱し、５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド含有の１．５％アガロースゲルに供試した。電気泳動は、１×ＴＢＥバッファー中で、１００Ｖ／６．５ｃｍ幅の電圧で約１時間かけて行った。電気泳動後、ＤＮＡバンドをポラロイドフィルム上で記録した。結果は、次の実施例４でディスカスされている。実施例４ヒト白血球からのオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）に特異的なｄｓ−ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅ａ）ＯＤＣ特異的ｍＲＮＡのＰＣＲ用プライマーの合成ＯＤＣ特異的なセンス（ODC-s）及びアンチセンス（ODC-as）オリゴデオキシリボヌクレオチドを、実施例１パラグラフ（１）に記載したようにＤＮＡシンセサイザーで合成した。その塩基配列は下記に示した。 ODC-s ：5'-ＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＡ-3' （SEQ ID NO:1 1） ODC-as ：5'-ＡＴＣＣＡＡＴＣＡＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＴＴ-3' （SEQ ID NO:1 2）ｂ）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅細胞溶解液からのｓｓ−ｃＤＮＡ１μｌに、上記２種類のオリゴデオキシリボヌクレオチドODC-s及びODC-asを各０．１μｇ（１μｌ）、１０×ＰＣＲバッファー５μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ混合物４ μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ、及びＤＥＰＣ処理水３６．５μｌを加え、混合した。蒸発を防ぐために、２滴のミネラル油を反応物に加えて、重層した。実施例１のパラグラフ（９）に記載したようにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物１０μｌを１０×ローディングバッファー１μｌと混ぜ、６５℃、５分間加熱し、５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド含有の１．５％アガロースゲルに供試した。電気泳動は、１×ＴＢＥバッファー中で、１００Ｖ／６．５ｃｍ幅で約１時間かけて行った。電気泳動後、ゲルを紫外線に当て、蛍光を発しているＤＮＡバンドをポラロイドフィルム上に、図７に示すように記録した。図７において、レーン（Ａ）及び（Ｂ）は、アニーリング温度がそれぞれ、４５℃及び５５℃である。レーン１、２、及び３は、それぞれ、ＯＤＣ、タキキニン受容体及びｊｕｎオンコジーンである。図７に示されるように、ＯＤＣ遺伝子は、アニーリング温度が４５℃及び５５℃のいずれでも増幅されたのに対して、タキキニン受容体及びｊｕｎオンコジーン遺伝子は、４５℃においてのみ増幅された。実施例５ポリデオキシリボヌクレオチド固定化マイクロタイタープレート上で合成されたｄｓ−ｃＤＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築とバクテリアへのｃＤＮＡライブラリーの導入（１）マイクロタイタープレート上で合成されたｄｓ−ｃＤＮＡへのＳＰ６−ＳａｌＩアダプターの連結実施例２パラグラフ（III）で述べた、マイクロタイタープレート上で合成されたヒト白血球のｄｓ−ｃＤＮＡは、ＳＰ６−ＳａｌＩアダプターが連結され、その後、実施例パラグラフ（７）で述べたように、ＳａｌＩで消化された。（２）マイクロタイタープレートからのｄｓ−ｃＤＮＡの除去ＳａｌＩによる消化ののち、ウェルをｃＤＮＡ洗浄液で３回洗浄し、これに、Ｈバッファー５μｌ、ＤＥＰＣ処理水４４μｌ及びＮｏｔＩ（ベーリンガーマンハイム社製）１μｌ（１０ユニット）を加え、３７℃で一晩インキュベートし、固定化ポリデオキシリボヌクレオチド上のＮｏｔＩサイトで切断した。反応液は新鮮な０．６５ｍｌチューブに移し、６５℃、２０分間、加熱してＮｏｔＩを失活させた。（３）ベクターへのｄｓ−ｃＤＮＡの挿入（ｃＤＮＡライブラリーの構築）上記の加熱失活液のｄｓ−ｃＤＮＡを１０μｌとり、これに５×Ｔ４リガーゼバッファー４μｌ、ＤＥＰＣ処理水４μｌ、予めＳａｌＩ及びＮｏｔＩで処理したｐＳＰＯＲＴベクター（Gibco-BRL社製）１μｌ（５０ｎｇ）、及びＴ４リガーゼ（Gibco-BRL社製）１μｌを加え、室温で３時間インキュベートし、分離したｄｓ−ｃＤＮＡをベクターに連結した。ｃＤＮＡ−ベクター複合体を沈殿させるため、これに酵母ｔＲＮＡ（Gibco-BRL社製）５μｌ（５μｇ）、７．５Ｍ酢酸アンモニウム１２．５μｌ及びエタノール７０μｌを加え、−７０℃で一晩静置した。１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させ、沈殿を７０％エタノール０．５ｍｌに再懸濁し、１５，０００ｒｐｍで５分間、再遠心分離した。上清を除去後、沈殿をスピード・バック遠心で乾燥させ、これをＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。（４）トランスフォーメーション（形質転換）上記のｃＤＮＡが挿入されたプラスミドをＤＥＰＣ処理水５μｌに再懸濁した。この懸濁液１μｌをとり、これにコンピテント細胞（エレクトロマックスＤＨ１０α、Gibco-BRL社製）２５μｌを加え、氷上で混合し、０．１ｃｍの専用キュベット（バイオラッド社製）に注入し、ジーンパルサー（バイオラッド社製）を用いて、１６．６Ｖ／ｃｍの電気刺激を与え、細胞内にｃＤＮＡライブラリーを取り込ませた。その後、ＳＯＣバッファー（Gibco-BRL社製）１ｍｌを加え、細胞を新鮮な１０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。細胞混合物を３７℃で正確に１時間、２２５ｒｐｍで振り混ぜながら、インキュベートした。細胞をＳＯＣ培地で１０倍及び１００倍に希釈後、その５０μｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。こうして、培地上に出現したコロニー数をカウントした。表１は、その結果である。１ｍｌの血液の白血球当り、それぞれのウェルから約６０，０００〜９００，０００のコロニーが得られた。この実験は、ｄｓ−ｃＤＮＡは増幅され、続いてプラスミドベクターにクローン化されうることを示している。この方法は、効率性及び迅速性の点で有利である。実施例６種々のオリゴヌクレオチド固定化プレートから、イン・ビトロ合成されたＧｓ蛋白特異的ｍＲＮＡからの、Ｇｓ蛋白特異的ｓｓ−及びｄｓ−ｃＤＮＡの合成、並びにＧｓ蛋白特異的ｄｓ−ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（１）ポリデオキシリボヌクレオチドの合成ＳｍａＩとＳａｌＩのような二つの異なる制限酵素サイト、Ｔ７ＲＮＡプロモーター配列、及びそれに続く５’から３’への１７個のチミン残基を含む５０ｍｅｒのポリデオキシリボヌクレオチドを実施例１の記載と同様にして、合成した。このポリデオキシリボヌクレオチド配列を、以下に示した。５’−ＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（SEQ ID NO:13）ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩのような二つの異なる制限酵素サイト、ＳＰ６ＲＮＡプロモーター配列、及びそれに続く５’から３’への１７個のチミン残基を含む５６ｍｅｒのポリデオキシリボヌクレオチドを実施例１の記載と同様にして、合成した。このポリデオキシリボヌクレオチド配列を、以下に示した。５’−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’ （SEQ ID NO:14）実施例１に述べたようにアミノリンク２を用いて、これらのポリデオキシリボヌクレオチドの５’末端に、第一級アミン残基を導入した。（２）マイクロタイタープレートへのポリデオキシリボヌクレオチドの固定化２０ｍＭＥＤＣ（ピアース社製）及び１０ｍＭスルフォ−ＮＨＳ（ピアース社製）のＤＥＰＣ−水の溶液２４μｌと合成ポリデオキシリボヌクレオチド２ μｌ（２μｇ）を混ぜ、これをマイクロタイタープレート（ＭＳ−３７９６Ｆ、住友ベークライト社製）のウェルに加えた。プレートを３７℃で一晩、インキュベート後、各ウェルの反応液を１ｍＭＥＤＴＡ、及び０．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）で置き換えた。（３）マイクロタイタープレート上でのｄｓ−ｃＤＮＡ合成実施例１の記載と同様に合成して得られたＧｓ蛋白のｍＲＮＡの２μｇを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む溶解用バッファーに溶かして液量を５０μｌとしこれを、ポリデオキシリボヌクレオチド固定化マイクロタイタープレートのウェルに加えた。プレートを室温で３０分間、インキュベートしたのち、各ウェルをＲＮＡ洗浄用バッファーで２回洗い、次いで、スーパースクリプトの代わりにＭＭＬＶ−逆転写酵素を使ったほかは実施例１の記載と同様に合成して、ｃＤＮＡをプレート上で合成した。第１のｃＤＮＡ鎖の合成の後に実施例１の記載と同様にして、プレート上で第２のｃＤＮＡ鎖を合成した。ｄｓ−ｃＤＮＡ合成のウェルは、ｃＤＮＡ洗浄用バッファーで５回洗ったのち、ＤＥＰＣ処理水５０μｌを加え、８０℃で１０分間加熱し、ＤＮＡ二重コイルを変性させた。その液は、直ちに新鮮な０．６５ｍｌチューブに移し、使用するまで２０℃に保管した。（４）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅上記（３）のｓｓ−ｃＤＮＡ１μｌに、実施例１で記載したＧ２−ｓ及びＧ４ −ａｓの各０．１μｇ（１μｌ）、１０×ＰＣＲバッファー５μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ混合物４μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ、及びＤＥＰＣ処理水３６．５μｌを加え、混合し、次いで蒸発を防ぐため２滴のミネラル油を反応物に加え重層した。初めはチューブを９５℃、１０分間、加熱し、その後、サーマルサイクラー（480型、Perkin-Elmer-Cetus 社製）を用い、５５℃、１．５分のアニーリング処理を３０回行った。ＰＣＲ産物１０μｌを１０×ローディングバッファー１μｌと混ぜ、６５℃、５分間加熱後、５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド含有の１．５％アガロースゲルに供試した。電気泳動は、１×ＴＢＥバッファー中で、１００Ｖ／６．５ｃｍ幅で約１時間かけて行った。電気泳動後、ゲルに紫外線を当ててＤＮＡバンドを視覚化し、これをポラロイドフィルム上に、図６Ａに示すように記録した。図６Ａ中、レーン２及び３は、SEQ ID NO:13の配列をもつポリヌクレオチドが固定されたプレートからの二つの結果を示し、レーン５及び６は、SEQ ID NO:14の配列をもつポリヌクレオチドが固定されたプレートからの二つの結果を示す。レーン１及び４は、それぞれ、SEQ ID NO:13及び14の配列をもつポリヌクレオチドが固定されたプレートからの陰性対照（ｍＲＮＡ無添加）である。以上のように、これらの実施例は本発明の広範な利用性を示している。しかし、これらの実施例は、本発明を分かりやすく説明することを意図したものであって、本発明を制限するものではなく、本発明の範囲は、次のクレームで説明されるものである。配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：ケラー，シリア（Keller, Cylia）ミツハシ，マサト（Mitsuhashi ,Masato）アキタヤ，タツオ（Akitaya, Tatsuo）（ii）発明の名称：メッセンジャーＲＮＡを測定するための方法と試薬（iii）配列数：１２（vi）連絡先：（A）宛名：クノービ・マーテンズ・オルソンアンドベアー（B）番地：６２０ニューポートビーチセンタードライブ１６階（C）市：ニューポートビーチ（D）州：カリフォルニア（E）国：アメリカ合衆国（F）ZIP:92660 （v）コンピュータ読取り可能形式（A）媒体：フロッピーディスク（B）コンピュータ：IBM PC 互換（C）操作システム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：PatentIn Release ♯1.0, Version ♯1.25 （vi）現行出願データ（A）出願番号（B）出願日（C）分類（viii）代理人／事務所情報（A）名前：アルトマン，ダニエルイー（B）登録番号：34,115 （C）整理番号：HITACHI.002A （ix）通信情報（A）電話番号：714-760-0404 （B）ファクシミリ番号：714-760-9502 （２）SEQ ID NO:1に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：17 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：Ｔ７プロモーター配列（xi）配列の説明：SEQ ID NO:1 （2）SEQ ID NO:2に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：21 （Ｂ）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：ＳＰ６プロモーター配列（xi）配列の説明：SEQ ID NO:2 （2）SEQ ID NO:3に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：25 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：SALI SP6アダプター配列（xi）配列の説明：SEQ ID NO:3 （2）SEQ ID NO:4に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：53 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：EcoRI, NotI及びT7プロモーターを含む53merオリゴ（xi）配列の説明：SEQ ID NO:4 （2）SEQ ID NO:5に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：22 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A)組織：G2-Sオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:5 （2）SEQ ID NO:6に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：22 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A)組織：G2-ASオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:6 （2）SEQ ID NO:7に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：22 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：JUN-Sオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:7 （2）SEQ ID NO:8に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：28 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：JUN-ASオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:8 （2）SEQ ID NO:9に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：20 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：TAC-Sオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:9 （2）SEQ ID NO:10に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：17 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：TAC-ASオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:10 （2）SEQ ID NO:11に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：21 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：ODC-Sオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:11 （2）SEQ ID NO:12に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：21 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：ODC-ASオリゴヌクレオチドプライマー（xi）配列の説明：SEQ ID NO:12 （2）SEQ ID NO:13に関する情報（i）配列の特徴（A）長さ：50 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセテイカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：SmaI及びSalI部位及びT7 RNAプロモーターを含む50 merオリゴ（xi）配列の説明：SEQ ID NO:13 （2）SEQ ID NO:14に関する情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：56 （B）種類：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：NO （iv）アンチ・センス：NO （vi）オリジナル出所（A）組織：EcoRI及びNotI及びSP6 RNAプロモーターを含む56 merオリゴ（xi）配列の説明：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４

Claims

【特許請求の範囲】１．次の工程：（ａ）少なくとも一つの、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含むポリヌクレオチドを、不溶性担体に結合させて、ヌクレオチド固定化担体をつくる工程；（ｂ）上記ヌクレオチド固定化担体に、ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有サンプル液を加える工程；（ｃ）上記ｍＲＮＡのポリＡテイルと、ポリＡテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程；（ｄ）上記ｍＲＮＡを鋳型として、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡを製造する工程；及び（ｅ）そのアンチセンスｃＤＮＡに相補的なセンスｃＤＮＡを製造する工程；を含むｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を製造する方法。２．ポリヌクレオチドが、少なくとも一つのＲＮＡプロモーターを更に含む請求項１の方法。３．サンプル液が細胞溶解液を含む請求項１の方法。４．工程（ｃ）が、上記担体とサンプル液のインキュベートを含んでなり、第１の液相と固相を生成させるものである、請求項１の方法。５．更に第１の液相を除去する工程を含む請求項４の方法。６．工程（ｄ）が次の工程：逆転写酵素、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む第１の反応混合物を上記固相に加える工程；及び上記固相と第１の反応混合物をインキュベートする工程；を含む請求項４の方法。７．工程（ｅ）が次の工程：ＲＮａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む第２の反応混合物を、インキュベートされた固相に加える工程；その固相をインキュベートし、第２の液相を生成させる工程；及びその第２の液相を除去する工程；を含む請求項６の方法。８．次の工程：（ｉ）請求項１の方法によりｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を製造する工程；（ii）上記担体から液体を除去する工程；及び（iii）そのｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を貯蔵する工程；を含むｄｓ−ｃＤＮＡの貯蔵方法。９．次の工程：（ｉ）担体に固定されるｄｓ−ｃＤＮＡは、更にＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいるｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を、請求項１の方法により製造する工程；及び（ii）そのプロモーターからアンチセンスｍＲＮＡを製造する工程；を含む固相担体上でアンチセンスｍＲＮＡを製造する方法。１０．工程（ｃ）は、上記担体とサンプル液をインキュベートして、第１の液相と固相を生成させる工程を含み、そして、工程（ii）は次の工程：上記固相に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰを含む反応混合物を添加する工程；上記固相と反応混合物をインキュベートする工程；及び上記固相と反応混合物を加熱し、アンチセンスｍＲＮＡを含む液相を生成させる工程；を含む請求項９の方法。１１．添加されるＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ又はＵＴＰのうちの、少なくとも一が標識されたものである、請求項１０の方法。１２．更に次の工程：アンチセンスｍＲＮＡを含む液相を得る工程；及びアンチセンスｍＲＮＡを含む液相をＤＮａｓｅで処理する工程；を付加的に含む請求項１０の方法。１３．次の工程：（ａ）少なくとも一つの、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列、少なくとも一つのＲＮＡプロモーター、及び少なくとも一つの制限酵素認識サイトを含むポリヌクレオチドを、不溶性担体に結合させて、ヌクレオチド固定化担体をつくる工程；（ｂ）上記ヌクレオチド固定化担体に、ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有サンプル液を加える工程；（ｃ）上記ｍＲＮＡのポリＡテイルと、ポリＡテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程；（ｄ）上記ｍＲＮＡを鋳型として、上記ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡを製造する工程；及び（ｅ）上記アンチセンスｃＤＮＡに相補的なセンスｃＤＮＡを製造しつつ、上記担体に固定されたｄｓ−ｃＤＮＡを製造する工程；（ｆ）不溶性担体に固定化されたＲＮＡプロモーターとは異なる第２のＲＮＡプロモーター、あるいは、上記担体に固定化された制限酵素認識サイトとは異なる第２の制限酵素認識サイトの、少なくともいずれかを含む二本鎖アダプターを、上記ｄｓ−ｃＤＮＡに加える工程；（ｇ）上記ｄｓ−ｃＤＮＡを、上記第２の制限酵素認識サイトを認識する制限酵素で消化する工程；（ｈ）上記第２のＲＮＡプロモーターを用いて、ＲＮＡを製造することにより、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を製造する工程；及び（ｉ）ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を変性して、センスｍＲＮＡを含む液相を生成する工程；を含む固相担体上でセンスｍＲＮＡを製造する方法。１４．工程（ｆ）が次の工程：上記固相に、ＤＮＡリガーゼ、上記二本鎖アダプターを含む反応混合物を加える工程；及び上記固相と反応混合物をインキュベートする工程；を含む請求項１３の方法。１５．工程（ｈ）が次の工程：上記固相に、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ及び第２のＲＮＡプロモーターと反応するＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物を添加する工程；及び上記固相と反応混合物をインキュベートし、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖をつくる工程；を含む請求項１３の方法。１６．添加されるＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰのうちの、少なくとも一が標識されてなる、請求項１５の方法。１７．工程（ｉ）が、上記ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を加熱することを含む請求項１３の方法。１８．更に次の工程：工程（ｉ）の液相を採取する工程；及びその液相をＤＮａｓｅで処理する工程；を付加的に含む請求項１３の方法。１９．次の工程：（ａ）上記ヌクレオチド固定化担体に、ｍＲＮＡ含有サンプル液を加える工程；（ｂ）上記サンプル液と担体をインキュベートし、第１の液相と固相を生成させる工程；（ｃ）液相を除去する工程；（ｄ）上記固相に、逆転写酵素、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む第１の反応混合物を加える工程；（ｅ）上記第１の反応混合物と固相をインキュベートする工程；（ｆ）上記固相に、ＲＮａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む第２の反応混合物を添加する工程；及び（ｇ）上記第２の反応混合物と固相をインキュベートする工程；を含み、不溶性皿に、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドが固定された、ヌクレオチド固定化担体を用いる、ｄｓ−ｃＤＮＡを製造する方法。２０．工程（ｄ）において添加されるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰのうちの、少なくとも一が標識されたものである、請求項１９の方法。２１．請求項１９の方法により、ｄｓ−ｃＤＮＡを製造する工程；第２の反応混合物と固相を加熱して、センスｓｓ−ｃＤＮＡを含む第２の液相をつくる工程；及びその第２の液相を採取する工程；を含むセンスｓｓ−ｃＤＮＡを製造する方法。２２．請求項１９の方法により、ｄｓ−ｃＤＮＡを製造する工程；第２の反応混合物と固相を加熱して、センスｓｓ−ｃＤＮＡを含む第２の液相をつくる工程；及びその固相を採取する工程；を含むアンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡを製造する方法。２３．次の工程：（ａ）請求項１の方法により、センスｃＤＮＡとアンチセンスｃＤＮＡが液相でｄｓ−ｃＤＮＡ二本鎖を形成する、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を製造する工程；（ｂ）上記ｄｓ−ｃＤＮＡを変性させる工程；及び（ｃ）上記液相を採取する工程；を含むセンスｓｓ−ｃＤＮＡを製造する方法。２４．次の工程：（ａ）ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を、少なくとも一つ含むｄｓ−ｃＤＮＡの一方の鎖を、不溶性担体に固定して、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を液相中に製造する工程；（ｂ）上記ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を変性させる工程；及び（ｃ）その液相を採取する工程；を含むセンスｓｓ−ｃＤＮＡを製造する方法。２５．次の工程：（ａ）請求項１の方法により、センスｃＤＮＡとアンチセンスｃＤＮＡが液相でｄｓ−ｃＤＮＡ二本鎖を形成する、ｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を製造する工程；（ｂ）上記ｄｓ−ｃＤＮＡを変性させる工程；及び（ｃ）上記液相を除去し、上記アンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡを含む固相とする工程；を含むアンチセンスｓｓ−ｃＤＮＡを製造する方法。２６．ｄｓ−ｃＤＮＡが制限酵素認識サイトを含み、かつ、その制限酵素認識サイトを認識する制限酵素で、そのアンチセンスｄｓ−ｃＤＮＡを消化することを含む請求項２５の方法。２７．次の工程：（ａ）請求項１の方法により、不溶性担体に固定されたポリヌクレオチドが更に第１の制限酵素認識サイトを含むｄｓ−ｃＤＮＡ固定化担体を製造し；（ｂ）そのｄｓ−ｃＤＮＡに、上記不溶性担体に固定されたポリヌクレオチドの制限酵素認識サイトとは異なる、第２の制限酵素認識サイトを含む二本鎖アダプターを加える工程；（ｃ）上記ｄｓ−ｃＤＮＡを、上記第１の制限酵素認識サイトを認識する制限酵素、及び上記第２の制限酵素認識サイトを認識する制限酵素で消化し、第１の末端に第１の粘着末端をもつ非固定ｄｓ−ｃＤＮＡを生成させる工程；（ｄ）非固定ｄｓ−ｃＤＮＡを、その第１の末端で、上記第１の粘着末端に相補的な配列をもっているベクターに連結する工程、を含むｃＤＮＡ配列を特定の方向でベクターに挿入する方法。２８．工程（ｃ）の非固定ｄｓ−ｃＤＮＡが、更に第２の末端で粘着末端を生じ、かつ、工程（ｄ）のベクターが更に、第２の末端で上記第２の粘着末端に相補的な配列をもっている、請求項２７の方法。２９．次の工程：第１の一本鎖ポリヌクレオチドに、その第１のポリヌクレオチドに相補的な第２の一本鎖ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ二本鎖を形成させて、ポリヌクレオチドのプリン塩基を更なる反応から保護する工程；その第１のポリヌクレオチドの５’末端をマレイミド化合物と反応させて、５ ’末端にマレイミド基をもつポリヌクレオチドをつくる工程；第１のポリヌクレオチドの５’末端でマレイミド基にスルフヒドリル基を反応する工程；を含んでなり、少なくとも一つのプリン塩基をもつ第１の一本鎖ポリヌクレオチドを、表面にスルフヒドリル基をもつ不溶性担体に固定化する方法。３０．更に、上記二本鎖コンプレックスを変性させることを含む請求項２９の方法。３１．上記マレイミド化合物がスルフォーＳＭＣＣを含む請求項２９の方法。３２．上記スルフヒドリル基が、不溶性担体上で、上記アミノ基をＳＡＴＡと反応させ、反応コンプレックスを生成させる反応；及び、その反応コンプレックスをヒドロキシルアミンで脱アセチル化する反応；を含む方法により、担体表面アミノ基から製造されるものである、請求項２９の方法。３３．更に、上記担体を第一級アミン化合物で処理することを含む請求項２９の方法。３４．（ａ）不溶性皿；及び（ｂ）ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ、ＲＮＡプロモーターを少なくとも一つ、及び制限酵素認識サイトを少なくとも一つ含むポリヌクレオチドを、上記不溶性皿に固定されたポリヌクレオチド；を含むヌクレオチド固定化担体。３５．上記ポリヌクレオチドが、３０〜１００ヌクレオチドを含む請求項３４のヌクレオチド固定化担体。３６．不溶性皿がマイクロタイタープレートを含む請求項３４のヌクレオチド固定化担体。３７．マイクロタイタープレートが少なくとも二つのウェルを含み、そのウエル各々は相異なる固定化ポリヌクレオチドを含む請求項３６のヌクレオチド固定化担体。３８．ヌクレオチドが、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ及びＳａｌＩから成る群から選ばれる制限酵素の認識サイトを含む請求項３４のヌクレオチド固定化担体。３９．ポリヌクレオチドが、Ｔ７ＲＮＡプロモーター又はＳＰ６ＲＮＡプロモーターを含む請求項３４のヌクレオチド固定化担体。４０．ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列としてポリｄＴを含む請求項３４のヌクレオチド固定化担体。４１．ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:13及びSEQ ID NO:14から成る群から選ばれる配列を含む請求項３４のヌクレオチド固定化担体。４２．ポリヌクレオチドが、少なくとも二つのＲＮＡプロモーターを含む請求項３４のヌクレオチド固定化担体。４３．ポリヌクレオチドが、少なくとも二つの相異なるＲＮＡプロモーターを含む請求項４２のヌクレオチド固定化担体。４４．ポリヌクレオチドが、Ｔ７ＲＮＡプロモーター及びＳＰ６ＲＮＡプロモーターを含む請求項４２のヌクレオチド固定化担体。