JPH084498B2 - Modified RNA replication enzyme protein and method for preventing virus infection - Google Patents
Modified RNA replication enzyme protein and method for preventing virus infectionInfo
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- JPH084498B2 JPH084498B2 JP62123355A JP12335587A JPH084498B2 JP H084498 B2 JPH084498 B2 JP H084498B2 JP 62123355 A JP62123355 A JP 62123355A JP 12335587 A JP12335587 A JP 12335587A JP H084498 B2 JPH084498 B2 JP H084498B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、遺伝子工学の手法によってRNAウイルスの
天然型RNA複製酵素蛋白質の特定のアミノ酸残基を人為
的に他のアミノ酸残基で置換した改変RNA複製酵素蛋白
質を利用した新規なウイルス感染防禦方法に関するもの
であり、更に詳細には、RNAウイルスの天然型RNA複製酵
素蛋白質に存在する共通アミノ酸配列−Tyr−Ｘ−Asp−
Asp−のＸ残基を人為的に操作して他の特定のアミノ酸
残基で置換した改変RNA複製酵素蛋白質をコードする遺
伝子を含む変異クローンを利用した新規ウイルス感染防
禦方法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION <Industrial field of application> The present invention artificially replaces a specific amino acid residue of a natural RNA replication enzyme protein of an RNA virus with another amino acid residue by a genetic engineering technique. The present invention relates to a novel method for preventing viral infection using a modified RNA replication enzyme protein, and more specifically, a common amino acid sequence-Tyr-X-Asp- present in a natural RNA replication enzyme protein of RNA virus.
The present invention relates to a novel method for preventing viral infection using a mutant clone containing a gene encoding a modified RNA replication enzyme protein in which the X residue of Asp- is artificially manipulated and replaced with another specific amino acid residue.
〈従来の技術〉 RNAを遺伝子とするウイルスは、真核生物に感染する
ウイルスにも多く認められており、従来、ウイルス感染
防禦の観点からRNAウイルスの自己複製機構に関する研
究報告が数多く提示されている。<Prior art> Many viruses that use RNA as a gene are also found in viruses that infect eukaryotes.Therefore, many research reports on the self-replication mechanism of RNA viruses have been presented from the viewpoint of preventing viral infection. There is.
RNAウイルスの中でもとりわけ大腸菌RNAファージにつ
いては、HarunaとSpiegelmanによりRNAファージＱβの
感染菌からＱβRNAを複製するRNA複製酵素が単離され
て、Ｑβレプリカーゼと命名されたことに端を発して
（Proc.Natl.Acad.Su.,USA,54,579（1965））、RNAウイ
ルスの自己複製機構の解明は急速に進展し、細菌とバク
テリオファージの分子遺伝子学の段階から、真核細胞と
ウイルスの細胞生物学の段階に移行するに至った現在に
おいても、RNAウイルスは、遺伝現象の分子レベルでの
解明に多くの実証的成果を提供するものとして貴重な研
究対象とされている。Among the RNA viruses, especially for E. coli RNA phages, Haruna and Spiegelman originated in the fact that an RNA replication enzyme that replicates Qβ RNA was isolated from an infecting bacterium of RNA phage Qβ and named Qβ replicase (Proc. Natl.Acad.Su., USA, 54,579 (1965)), The elucidation of the self-renewal mechanism of RNA viruses has progressed rapidly, and from the stage of molecular genetics of bacteria and bacteriophages, cell biology of eukaryotic cells and viruses. Even now, at the time of the transition to the stage of, RNA viruses have been regarded as valuable research targets as they provide many empirical results for the elucidation of genetic phenomena at the molecular level.
ところで、大腸菌RNAファージは、血清学的性質、紫
外線に対する感受性、浮遊密度などの観点から、４つの
グループ（Ｉ〜IV）に大別されており、これら４つのグ
ループの各々代表的なファージを用いて、各々のRNA複
製酵素（レプリカーゼ）すなわち、f2（グループＩ）レ
プリカーゼ、GA（グループII）レプリカーゼ、Ｑβ（グ
ループIII）レプリカーゼ、及びSP（（グループIV）レ
プリカーゼなどが単離され、更に、それらの構造と機能
に関する基礎研究成果として、RNAレプリカーゼ蛋白質
が、α、β、γ、δの４つのサブユニットから成ってい
ることや、サブユニットα、γ、δが宿主由来の蛋白質
であり、サブユニットβだけがRNAファージによってコ
ードされる蛋白質であること、などがすでに解明されて
いる。By the way, Escherichia coli RNA phages are roughly classified into four groups (I to IV) from the viewpoints of serological properties, sensitivity to ultraviolet rays, buoyant density, etc., and representative phages of each of these four groups are used. The respective RNA replication enzymes (replicases), that is, f2 (group I) replicase, GA (group II) replicase, Qβ (group III) replicase, SP ((group IV) replicase, etc., have been isolated. As a result of basic research on the structure and function of RNA, the RNA replicase protein is composed of four subunits of α, β, γ, and δ, and the subunits α, γ, and δ are host-derived proteins. It has already been clarified that only unit β is a protein encoded by RNA phage.
これらのRNAレプリカーゼに代表されるRNA依存RNA複
製酵素は、感染宿主中において、RNAから相補的RNAを経
由して直接的にRNAを複製する機能を有することから、R
NAウイルスの自己複製機構を制御するための重要な役割
を持つものとして注目される中で、最近、多くのウイル
ス由来のRNA依存RNA又はDNA合成酵素（ポリメラーゼ）
蛋白質の一次構造の相同性が調査され、これらの酵素蛋
白質の間に、−Tyr−Ｘ−Asp−Asp−のアミノ酸配列か
ら成る共通の領域が存在することが明らかとなり、RNA
複製酵素の構造と機能の解明が分子レベルで展開される
ようになった。RNA-dependent RNA replication enzymes represented by these RNA replicases have the function of directly replicating RNA from RNA via complementary RNA in an infected host.
Recently, many virus-derived RNA-dependent RNA or DNA synthases (polymerases) have been attracting attention as having important roles in controlling the self-renewal mechanism of NA virus.
The homology of the primary structure of the protein was investigated, and it was revealed that a common region consisting of the amino acid sequence of -Tyr-X-Asp-Asp- exists between these enzyme proteins,
Elucidation of the structure and function of replication enzymes has been developed at the molecular level.
（Nature,305,827−829（1983）、Nucleic Acids Rse
arch,12,7296−7282（1984）、Natnre,317,366−368（1
985）） このように、RNAウイルスの自己複製機構の解明は、
分子生物学、疫学などの方向から分子レベルにおいて多
角的に推進されつつあるが、現在のところ、一部のワク
チンなどの開発を除いて、RNAウイルスの感染を防禦す
る有効な方法はいまだ開発されるに至っておらず、新し
いウイルス感染防禦方法の開発が強く要請されているの
が実情である。(Nature, 305 , 827-829 (1983), Nucleic Acids Rse
arch, 12 , 7296−7282 (1984), Natnre, 317 , 366−368 (1
985)) Thus, the elucidation of the self-renewal mechanism of RNA virus is
Although it is being diversified at the molecular level from the directions of molecular biology and epidemiology, at present, except for the development of some vaccines, effective methods to prevent RNA virus infection are still being developed. However, the fact is that there is a strong demand for the development of new methods for preventing virus infection.
〈発明が解決しようとする問題点〉 このような状況を踏え、本発明者らは、RNA依存RNAポ
リメラーゼの中でも最も基礎研究が先行している大腸菌
RNAファージを中心としてその構造と機能に関して分子
レベルでの研究を積重ねた結果、前記のRNA依存RNA又は
DNA合成酵素の一次構造に共通に保有されているアミノ
酸配列が、４つのグループの大腸菌RNAファージ、すな
わち、MS2、GA、Ｑβ及びSPのRNA複製酵素蛋白質中にも
存在することを見出すと共に、これらの特定のアミノ酸
配列が、RNAファージの複製に重要な役割を演じている
ことを見出すに至った。<Problems to be Solved by the Invention> In light of this situation, the present inventors have established that E. coli, which is the most basic research among RNA-dependent RNA polymerases
As a result of accumulated research at the molecular level regarding the structure and function centering on RNA phage, the above RNA-dependent RNA or
It was found that an amino acid sequence commonly possessed by the primary structure of DNA synthase is also present in four groups of Escherichia coli RNA phages, namely, MS2, GA, Qβ, and SP RNA-replicating proteins. It has been found that a specific amino acid sequence of Escherichia coli plays an important role in RNA phage replication.
さらに具体的に説明すると、ＱβファージのRNA複製
酵素β−サブユニット蛋白質の一次構造には、他のRNA
ファージの場合と同様に、−Tyr−Gly−Asp−Asp−の共
通のアミノ酸配列が存在していること、そして、357番
目のGly残基を、Ala、Ser、Pro、Met又はValから選択さ
れるアミノ酸残基で置換したクローンを作製し、レプリ
カーゼ活性を調べたところ、これらの変異クローンはレ
プリカーゼ活性を示さないこと、更に、これらの変異ク
ローンでクローニングした大腸菌は、Ｑβ及びSPファー
ジの増殖を阻害することなどを見出すと共に、前記変異
クローンがウイルス感染の防禦に有効であるとの知見を
得て本発明を完成するに至った。More specifically, the primary structure of the RNA replication enzyme β-subunit protein of Qβ phage contains other RNAs.
As in the case of the phage, the existence of a common amino acid sequence of -Tyr-Gly-Asp-Asp-, and the Gly residue at position 357 was selected from Ala, Ser, Pro, Met or Val. When clones substituted with amino acid residues were prepared and replicase activity was examined, these mutant clones did not show replicase activity. Furthermore, Escherichia coli cloned with these mutant clones showed growth of Qβ and SP phages. In addition to finding inhibition, etc., the inventors have found that the mutant clone is effective in preventing viral infection, and completed the present invention.
本発明は、RNAウイルスの改変RNA複製酵素蛋白質を利
用したウイルス感染防禦方法を提供せんとすることを第
一目的とするものであり、同時に、当該改変RNA複製酵
素蛋白質とその製造方法、当該改変RNA複製酵素蛋白質
をコードする遺伝子自体、及び当該遺伝子を含む変異ク
ローンを提供することをも目的とするものである。The first object of the present invention is to provide a method for preventing virus infection using a modified RNA replication enzyme protein of RNA virus, and at the same time, the modified RNA replication enzyme protein and a method for producing the modified RNA replication enzyme protein, and the modification It is also intended to provide a gene itself encoding an RNA replication enzyme protein and a mutant clone containing the gene.
〈問題点を解決するための手段〉 このような本発明の目的を達成するための構成は、RN
Aウイルスの天然型RNA複製酵素蛋白質に存在する共通の
アミノ酸配列−Tyr−Ｘ−Asp−Asp−のＸ残基を当該RNA
ウイルスにおけるＸ残基部分に対応するアミノ酸以外の
他のアミノ酸残基で置換した改変RNA複製酵素蛋白質を
コードする遺伝子を含む変異クローンにより宿主細胞を
クローニングして改変RNA複製酵素蛋白質を産生させる
ことを基本的要旨とするものであり、その具体的技術的
手段について、ファージＱβのRNA複製酵素を例とに挙
げて以下に説明する。<Means for Solving Problems> The configuration for achieving the object of the present invention as described above is
The X residue of the common amino acid sequence -Tyr-X-Asp-Asp- present in the native RNA replication enzyme protein of virus A is the RNA of interest.
To produce a modified RNA replication enzyme protein by cloning a host cell with a mutant clone containing a gene encoding a modified RNA replication enzyme protein substituted with an amino acid residue other than the amino acid corresponding to the X residue portion of the virus This is a basic gist, and its specific technical means will be described below by taking the RNA replication enzyme of phage Qβ as an example.
（１）ファージＱβのRNA複製酵素β−サブユニット蛋
白質遺伝子を含むクローンpRQ1の作成 遺伝子供与体は、感染性を有するZpQβ−32DNAを用い
た。このZpQβ−32DNAは、Taniguchi及びWeissmannによ
って作成されたＱβファージのcDNAであり（Nature,27
4,223（1978））、Weissmannから入手した。また、ベク
ターは、プラスミドpBR322由来のpUC8（P.L.Biochemica
l社（現Pharmacia社）製）を用いた。このpUC8は、1acZ
領域にマルチクローニングサイトを有しており、IPTGと
Ｘ−galを含むプレートで外来遺伝子挿入の有無を判別
できる特徴をもっている。（Gene,19,259−268（198
2）、PRODUCT REFERENCE GUIDE （1984）） これらのZpQβ−32DNAとpUC8から、第１図に示す工程
に従ってRNA複製酵素蛋白質遺伝子を含むクローンを作
成し、pRQ1と命名した。(1) Preparation of clone pRQ1 containing RNA replication enzyme β-subunit protein gene of phage Qβ As a gene donor, infectious ZpQβ-32 DNA was used. This ZpQβ-32 DNA is a cDNA of the Qβ phage prepared by Taniguchi and Weissmann (Nature, 27.
4 , 223 (1978), obtained from Weissmann. In addition, the vector is pUC8 (PLBiochemica
Company (currently Pharmacia) was used. This pUC8 is 1acZ
It has a multi-cloning site in the region and has the characteristic of being able to determine the presence or absence of foreign gene insertion on a plate containing IPTG and X-gal. (Gene, 19 , 259-268 (198
2), PRODUCT REFERENCE GUIDE (1984)) From these ZpQβ-32 DNA and pUC8, a clone containing an RNA replication enzyme gene was prepared according to the process shown in FIG. 1 and named pRQ1.
なお、E．Coli JA221（pRQ1）は、微工研菌寄第9372
号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託済であ
る。Note that E. Coli JA221 (pRQ1) is Microorganisms Research Institute
It has been deposited with the Institute of Microbial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
（２）部位指定的変異作製方法によるアミノ酸置換の作
製 RNA複製酵素蛋白質の特定のアミノ酸を他のアミノ酸
で置換した変異クローンプラスミドは、RNA複製酵素β
−サブユニット蛋白質遺伝子の塩基配列の一部を部位指
定的変異作製法により改変することによって作製され
る。改変する部位として、ＱβファージのRNA複製酵素
β−サブユニット蛋白質の356番目から359番目にある配
列−Tyr−Gly−Asp−Asp−のGly残基を選定したのは、
この配列が、ほとんど全てのRNAウイルスのRNA複製酵
素蛋白質に見出される共通領域であること、しかも、
逆転写酵素蛋白質にも保存されている（但し、Glyでは
なくMet、Val又はLeu）こと故、RNA依存型ポリメラーゼ
がRNAを転写する際に重要な機能を有すると推察される
に至ったからである。(2) Preparation of amino acid substitution by site-directed mutagenesis method A mutant clone plasmid in which a specific amino acid of RNA replication enzyme protein is replaced with another amino acid is RNA replication enzyme β.
-It is prepared by modifying a part of the nucleotide sequence of the subunit protein gene by a site-directed mutagenesis method. The Gly residue of the sequence -Tyr-Gly-Asp-Asp- located at positions 356 to 359 of the RNA replication enzyme β-subunit protein of Qβ phage was selected as the site to be modified.
This sequence is a common region found in the RNA replication enzyme proteins of almost all RNA viruses, and
Because it is also conserved in the reverse transcriptase protein (however, Met, Val, or Leu, not Gly), it has been speculated that RNA-dependent polymerase has an important function in transcribing RNA. .
改変RNA複製酵素β−サブユニット蛋白質遺伝子を含
むヘテロデュプレックス（ヘテロ二本鎖DNA）に関して
は、前記pRQ1 DNAと17個の塩基配列から成る特定のオリ
ゴデオキシヌクレオチドを用いて、Inouye ＆ Inouyeの
方法（1986）により、357番目のGly残基をAla、Ser、Pr
o、Mat又はVal残基で置換した変異クローンプラスミド
を作製し、各々、pVAR−A357、pVAR−S357、pVAR−P35
7、pVAR−M357及びpVAR−V357と命名した。Regarding the heteroduplex (heteroduplex DNA) containing the modified RNA replication enzyme β-subunit protein gene, the method of Inouye & Inouye using the pRQ1 DNA and a specific oligodeoxynucleotide consisting of 17 nucleotide sequences ( 1986), the Gly residue at position 357 was changed to Ala, Ser, Pr.
Mutant clone plasmids were prepared by substituting o, Mat or Val residues into pVAR-A357, pVAR-S357 and pVAR-P35, respectively.
7, pVAR-M357 and pVAR-V357.
（３）改変RNA複製酵素β−サブユニット蛋白質遺伝子
を含む変異クローンプラスミドによる大腸菌の形質転換 前記（２）で作製した各種変異クローンプラスミドを
用いて、常法により（Maniatis T., Fritsh E.E. and S
ambrook J.編“Molecular Cloning "249−255, Cold Sp
ring Harbor Labaratory（1982）大腸菌をクローニング
して改変RNA複製酵素蛋白質を産生させた。(3) Transformation of Escherichia coli with Mutant Clone Plasmid Containing Modified RNA Replication Enzyme β-Subunit Protein Gene Using the various mutant clone plasmids prepared in (2) above, according to a conventional method (Maniatis T., Fritsh EE and S
ambrook J. ed. “Molecular Cloning” 249−255, Cold Sp
ring Harbor Labaratory (1982) E. coli was cloned to produce a modified RNA replication enzyme protein.
宿主菌としては、E. coli JA 221/F′LacIg （hsd
R, Ieu B6, Iac Y, thi, recA, Δ trp E5/F′ Iac , p
ro AB）（Robert Wood Johnson Medical School at Rutgers,New Jersey、井上より入手した）、
E. coli 594/F′LacIg （su-，gal-，strR,recA44/
F′lacIg , lac+ , proAB）を用いた。なお、594株（su
-，gal-，strR,recA44）は、東京大学医科学研究所、池
田より入手し、また、594/F′LacIg 株は、JA 221/F′
LacIg株から接合によりＦ′因子594株に導入して作製し
た。 E. coli JA 221 / F'Lac Ig (hsd
R, Ieu B6, Iac Y, thi, recA, Δ trp E5 / F ′ Iac, p
ro AB) (Robert Wood Johnson Medical School at Rutgers, New Jersey, obtained from Inoue),
E. coli 594 / F'Lac Ig (su -, gal -, str R, recA44 /
F'lac Ig , lac + , proAB) were used. In addition, 594 shares (su
-, gal -, str R, recA44) , the Institute of Medical Science, University of Tokyo, was obtained from Ikeda, also, 594 / F'Lac Ig strain, JA 221 / F '
It was prepared by introducing the Lac Ig strain into the F'factor 594 strain by conjugation.
以上、本発明の構成について、ファージＱβのRNA複
製酵素を例として説明したが、ファージＱβのRNA複製
酵素β−サブユニット蛋白質に存在する−Tyr−Gly−As
p−Asp−のアミノ酸配列は、RNAファージばかりでなく
他のウイルスのRNA依存RNAポリメラーゼにも見出される
普遍的な領域であることから、各種RNAウイルスについ
て、ファージＱβの場合と同様にして変異クローンを作
製することが可能である。Although the constitution of the present invention has been described above by taking the RNA replication enzyme of phage Qβ as an example, it is present in the RNA replication enzyme β-subunit protein of phage Qβ-Tyr-Gly-As.
Since the amino acid sequence of p-Asp- is a universal region found not only in RNA phages but also in RNA-dependent RNA polymerases of other viruses, various RNA viruses are mutated in the same manner as phage Qβ. Can be produced.
なお、アミノ酸残基として示したTyrは、チロシン、G
lyはグリシン、Aspアスパラギン酸、Arはアラニン、Ser
はセリン、Proはプロリン、Metはメチオニン、Valはバ
リン、Leuはロイシンを表わす。In addition, Tyr shown as an amino acid residue is tyrosine, G
ly is glycine, Asp aspartic acid, Ar is alanine, Ser
Represents serine, Pro represents proline, Met represents methionine, Val represents valine, and Leu represents leucine.
〈発明の効果〉 ＱβファージのRNA複製酵素β−サブユニット蛋白質
の357番目のアミノ酸置換体クローンは、宿主細胞にお
いて不活性なRNA複製酵素を産生して、Ｑβ−及びSP−R
NAファージの増殖を阻害する機能を有しており、このア
ミノ酸置換クローンを利用することにより、宿主細胞へ
のウイルス感染を高率で抑制することができる。<Effects of the Invention> A clone of the RNA replication enzyme β-subunit protein of Qβ phage having the amino acid substitution at the 357th position produces an RNA replication enzyme inactive in host cells to produce Qβ- and SP-R.
It has a function of inhibiting the proliferation of NA phages, and by utilizing this amino acid substitution clone, viral infection to host cells can be suppressed at a high rate.
本発明のウイルス感染防禦方法はＱβファージに限ら
ず、他の同様の構造、機能をもったRNAウイルスの場合
にも適用することが可能であり、特に植物RNAウイル
ス、動物RNAウイルスなどの感染防禦方法、すなわち、
植物、動物を対象とした新しい免疫法としても適宜に応
用できることから産業上の利用価値の高いものである。The method for preventing viral infection of the present invention is not limited to Qβ phage, but can be applied to other RNA viruses having the same structure and function, and particularly to prevent infection of plant RNA virus, animal RNA virus and the like. Method, ie
Since it can be appropriately applied as a new immunization method for plants and animals, it has a high industrial utility value.
次いで、本発明を実施例により更に詳細に説明する
が、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。Next, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the scope of the present invention is not limited to the examples.
〈実施例〉 （１）ファージＱβのRNA複製酵素β−サブユニット蛋
白質遺伝子を含むクローンpQR1の作製 １）外来遺伝子の調整 Taniguchi Weissmannによって作製されたZpQβ−32DN
A 4.7μｇを制限酵素BglIで切断した後、BglI切断部位
を平滑未端化にするために４種類のデオキシトリヌクレ
オチド（4dNTP）とT4DNAポリメラーゼで37℃、20分間反
応処理した。次いで、この反応液を70℃、10分間加熱処
理することによって酵素を失活させ、更に、BglIIで切
断して得られるRNA複製酵素β−サブユニット蛋白質遺
伝子（Ｒ）を含む2,178bpのDNA断片を低融点寒天ゲル電
気泳動で分離した。<Examples> (1) Preparation of clone pQR1 containing RNA replication enzyme β-subunit protein gene of phage Qβ 1) Preparation of foreign gene ZpQβ-32DN prepared by Taniguchi Weissmann
After 4.7 μg of A was cleaved with the restriction enzyme BglI, four types of deoxytrinucleotides (4dNTPs) and T4 DNA polymerase were subjected to a reaction treatment at 37 ° C. for 20 minutes to blunt the BglI cleavage site. Then, this reaction solution is heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme, and is further cleaved with BglII to obtain a 2,178 bp DNA fragment containing the RNA replication enzyme β-subunit protein gene (R). Were separated by low melting point agar gel electrophoresis.
２）クローニングベクターの調整 プラスミドpBR322由来のpUC8 DNA 500ngを制御酵素Ba
mHIとHincII（各々１ユニット）で、37℃、60分間反応
処理して、2,662bpのpUC8 DNA断片を調整した。2) Preparation of cloning vector 500 ng of pUC8 DNA derived from plasmid pBR322 was added to the control enzyme Ba.
A 2,662 bp pUC8 DNA fragment was prepared by reaction with mHI and HincII (1 unit each) at 37 ° C. for 60 minutes.
３）組換え体の作製と大腸菌の形質転換 前記１）と２）で調整した外来遺伝子50ng/10μ１と
ベクターDNA 10ng/μ１を、50mM Tris−HC1（pH7.4）、
10mM MgC12、10mM DTT（ジチオスレイトール）、1mM ス
ペルミジン、1mM ATP、T4 DNA リカーゼ1unit/10μ１中
で12.5℃、一液反応させて環化することによりクローン
（組換え体）を作製した。次いで、このDNAを用いて常
法によりE. coli K12株由来のE. coli JM 105（Neucl
eic Auids Researcch,9, 309−321（1981））を形質転
換し、0.8％バクトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％
食塩、1.5％寒天、50Mg/mlアンピシリン（Ampicillin）
から成る平板寒天培地を用いて、Ampγ、Lacγを示す大
腸菌を選択した。この中からRNA複製酵素蛋白質遺伝子
を含むプラスミドを常法により抽出し、得られた4,840b
pのクローンをpRQ1と命名した。3) Preparation of recombinant and transformation of Escherichia coli 50 ng / 10 μ1 of the foreign gene and 10 ng / μ1 of vector DNA prepared in 1) and 2) above were added to 50 mM Tris-HC1 (pH7.4),
A clone (recombinant) was prepared by cyclization by 1-solution reaction at 12.5 ° C. in 1 unit / 10 μ1 of 10 mM MgC12, 10 mM DTT (dithiothreitol), 1 mM spermidine, 1 mM ATP, T4 DNA ligase. Then, E. coli JM 105 derived from E. coli K12 strain by a conventional method using the DNA (Neucl
eic Auids Researcch, 9, 309-321 (1981)) and transformed with 0.8% bactryptone, 0.5% yeast extract, 0.5%
Salt, 1.5% agar, 50Mg / ml Ampicillin
E. coli showing Amp γ and Lac γ were selected using a plate agar medium consisting of A plasmid containing the RNA replication enzyme protein gene was extracted from this by a conventional method to obtain 4,840b
The clone of p was named pRQ1.
（２）改変RNA複製酵素蛋白質遺伝子を含む変異クロー
ンの作製 前記（１）により作製したpRQ1 DNAを用いて、Inouye
＆Inouyeの部位指定的変異作製法に従って、目的とする
RNA複製酵素β−サブユニット蛋白質の357番目のGly残
基をAla、Ser、Pro、Met又はVal残基で置換した改変RNA
複製酵素蛋白質遺伝子を含む変異クローン（組換え体）
を作製した。(2) Preparation of mutant clone containing modified RNA-replicating enzyme protein gene Using the pRQ1 DNA prepared in (1) above, Inouye
In accordance with &Inouye's site-directed mutagenesis method
Modified RNA in which the 357th Gly residue of the RNA replication enzyme β-subunit protein is replaced with an Ala, Ser, Pro, Met, or Val residue
Mutant clone (recombinant) containing the replication enzyme protein gene
Was produced.
１）pRQ1 DNA由来のDNA断片Ｉ pRQ1 DNA 50ng/μ１を、20mM KCl、10mM Tris−HC1
（pH8.0）、10mM MgC12、1mMジチオスレイトールを含緩
衝液中で制限酵素SmaI0.5units/μ１と37℃、２時間反
応させて得られる4,840bpのDNA断片Ｉを希釈してDNA濃
度150ng/μ１とした。1) pRQ1 DNA-derived DNA fragment I pRQ1 DNA 50 ng / μ1 was added to 20 mM KCl, 10 mM Tris-HC1
(PH8.0), 10mM MgC12, 1mM dithiothreitol are reacted with restriction enzyme SmaI 0.5units / μ1 in a buffered solution at 37 ℃ for 2 hours to dilute the 4,840bp DNA fragment I and obtain a DNA concentration of 150ng. / μ1
２）pRQ1 DNA由来のDNA断片II pRQ1 DNA 50ng/μ１を、50mMKCl、10mM Tris−HC1（p
H7.5）、10mM MgC12、1mMジチオスレイトールを含む緩
衝液中で制限酵素XhoI 0.5units/μ１、PstI 0.5units/
μ１と37℃、２時間反応させた後、改変しようとする領
域を含まない大きいDNA断片を５％アクリルアミドゲル
電気泳動で分離して、4,046bpのDNA断片IIを得た。2) pRQ1 DNA-derived DNA fragment II pRQ1 DNA 50 ng / μ1 was added to 50 mM KCl, 10 mM Tris-HC1 (p
H7.5), 10 mM MgC12, 1 mM dithiothreitol in a buffer containing restriction enzyme XhoI 0.5 units / μ1, PstI 0.5 units /
After reacting with μ1 at 37 ° C. for 2 hours, a large DNA fragment containing no region to be modified was separated by 5% acrylamide gel electrophoresis to obtain a DNA fragment II of 4,046 bp.
３）オリゴデオキシヌクレオチドの合成 改変しようとするアミノ酸残基を中心にした17個の塩
基配列から成るオリゴデオキシヌクレオチドをDNA合成
機380B型（Applied Bio Systems社製）で合成し、その
５′−端をリン酸化して成る下記のオリゴデオキシヌク
レオチドを作製した。3) Synthesis of oligodeoxynucleotides Oligodeoxynucleotides consisting of 17 nucleotide sequences centering on the amino acid residue to be modified were synthesized with a DNA synthesizer 380B type (manufactured by Applied Bio Systems) and their 5'-ends were synthesized. The following oligodeoxynucleotide was prepared by phosphorylating
CT−GTT−TAC−GGA−GAC−GAT CT−GTT−TAC−GCG−GAC−GAT CT−GTT−TAC−TCT−GAC−GAT CT−GTT−TAC−CCT−GAC−GAT CT−GTT−TAC−ATG−GAC−GAT CT−GTT−TAC−GTT−GAC−GAT は天然型、はpVAR−A357、はpVAR−S337、はpV
AR−P357、はpVAR−M357、はpNAR−A357に各々対応
する。CT-GTT-TAC-GGA-GAC-GAT CT-GTT-TAC-GCG-GAC-GAT CT-GTT-TAC-TCT-GAC-GAT CT-GTT-TAC-CCT-GAC-GAT CT-GTT-TAC- ATG-GAC-GAT CT-GTT-TAC-GTT-GAC-GAT is natural type, is pVAR-A357, is pVAR-S337, is pV
AR-P357 corresponds to pVAR-M357, and corresponds to pNAR-A357.
４）ヘテロデュプレックス（ヘテロ二本鎖DNA）の作製 前記１）〜３）で作製した各DNA断片を混合し、３分
間沸湯水に浸漬した後、30℃に30分間、４℃に30分間、
氷水中に10分間保持して段階的に冷却処理することによ
り、沸湯水に浸漬して一本鎖になったDNA断片に再生化
を施した。続いて、DNAポリメラーゼ（Klenow Enzyme）
で修飾し、T4DNAリガーゼで処理してDNAの環化を行っ
た。4) Preparation of heteroduplex (heteroduplex DNA) After mixing the DNA fragments prepared in 1) to 3) above and immersing in boiling water for 3 minutes, 30 ° C for 30 minutes, 4 ° C for 30 minutes,
By holding in ice water for 10 minutes and gradually cooling, the single-stranded DNA fragment was regenerated by immersion in boiling water. Next, DNA polymerase (Klenow Enzyme)
The DNA was circularized by modification with and treated with T4 DNA ligase.
５）変異クローンによる大腸菌の形質転換 このようにして作製した変異クローン（組換え体）を
用いてE. coli JA 221 /F′ LacIgを形質転換し、変
異クローンの作製に際して用いたオリゴデオキシヌクレ
オチドをプローブとして変異クローンの選択を行った。
ここで得られた変異クローンを各々、pVAR−A357、pVAR
−S357、pVAR−P357、pVAR−M357、pVAR−A357と命名し
た。これらは、ＱβファージRNA複製酵素β−サブユニ
ット蛋白質遺伝子の357番目のGly残基を、各々、Ala、S
er、Pro、Mrt、Val残基で置換した改変蛋白質遺伝子を
含んでいる。5) Transformation of Escherichia coli with mutant clone E. coli JA 221 / F 'Lac Ig was transformed with the mutant clone (recombinant) thus prepared, and the oligodeoxynucleotide used for preparation of the mutant clone Mutant clones were selected using as a probe.
Mutant clones obtained here were designated pVAR-A357 and pVAR, respectively.
-S357, pVAR-P357, pVAR-M357, and pVAR-A357 were named. In these, the Gly residue at position 357 of the Qβ phage RNA replication enzyme β-subunit protein gene was replaced with Ala and S, respectively.
It contains a modified protein gene substituted with er, Pro, Mrt, and Val residues.
（３）ファージＱβのRNA複製酵素の構造と機能の検討 １）遺伝子機能の発現 宿主細胞内での遺伝子機能の発現を検討すべく、大腸
菌RNAファージの各種突然変異株を大腸菌に感染させ、
そこで産生される子ファージの数を調べた結果を末尾第
１表に示す。(3) Examination of structure and function of RNA replication enzyme of phage Qβ 1) Expression of gene function In order to examine expression of gene function in host cells, various mutant strains of E. coli RNA phage were infected into E. coli,
The results of the examination of the number of offspring phages produced there are shown in Table 1 at the end.
プラスミドpRQ1を保有する大腸菌細胞では、Ｑβファ
ージの成熟蛋白質遺伝子（Ｍ）、外被蛋白質遺伝子
（Ｃ）の変異株は増殖できず、RNA複製酵素蛋白質遺伝
子（Ｒ）の変異株だけが増殖できた。従って、このクロ
ーンでは、活性あるRNA複製酵素蛋白質が産生されてい
ることが証明された。In Escherichia coli cells harboring the plasmid pRQ1, mutants of the mature protein gene (M) and coat protein gene (C) of Qβ phage could not grow, but only mutants of RNA replication enzyme gene (R) could grow. . Therefore, it was proved that an active RNA replication enzyme protein was produced in this clone.
２）変異クローン（改変プラスミド）を保持している大
腸菌を指示菌としてRNAファージを感染させた場合の感
染効率 前記（２）で作製した各種の変異クローンを保持して
いる大腸菌（E. coli JA 221 /F′ LacIg）を、酵母
エキス5g/1、バクトトリプトン8g/1NaCl 5g/1から成るY
T培地中で37℃に保温しながら振盪培養し、対数増殖期
中期の菌を一定量の大腸菌RNAファージf2、GA、Ｑβ又
はSPと混合し、更に、2.5mlの0.6％の寒天を含むYT培地
（軟寒天培地）を加えて、ペトリ皿（直径90mm×深さ15
mm）内に予め作製しておいた1.5％の寒天を含むYT培地
から成る寒天平板培地上に重層した。寒天が固まったの
を確めた上で37℃。一夜培養し、そこに現われた溶菌斑
の数を数えた。感染効率は、対象としたプラスミドpUC8
を保有している大腸菌に感染したファージ数を１とした
場合の各大腸菌に感染したファージの数として表わし
た。末尾表２に示す結果から明らかなように、Ｑβ及び
SPのプラーク形性能が、357番目のアミノ酸置換体クロ
ーンで、著しく低下していることから、Ｑβ及びSPファ
ージの増殖が抑制されること、抑制の程度は置換される
アミノ酸の種類にも依存することが判明した。なお、f2
及びGAのプラーク形性能は、いずれのクローンでも等し
く、増殖抑制の程度も余り高くないが、これは、RNAフ
ァージのRNA複製酵素の鋳型特異性によるものと推察さ
れる。また、末尾表２に示したpVAR−A390は、390番目
のGly残基をAla残基で置換した変異クローンを意味す
る。2) Infection efficiency when RNA phages are infected with Escherichia coli harboring a mutant clone (modified plasmid) as an indicator bacterium Escherichia coli ( E. coli JA) harboring various mutant clones prepared in (2) above 221 / F ′ Lac Ig ) is composed of yeast extract 5g / 1, bactotryptone 8g / 1NaCl 5g / 1
Shake culture in T medium while keeping it at 37 ℃, mix the bacteria in the mid-logarithmic growth phase with a fixed amount of E. coli RNA phage f2, GA, Qβ or SP, and further add 2.5 ml of YT containing 0.6% agar. Add medium (soft agar medium) and add petri dish (diameter 90 mm x depth 15
mm) was pre-prepared in 1.5% agar and overlaid on an agar plate medium consisting of YT medium. Make sure that the agar has solidified, and then at 37 ℃. The cells were cultured overnight, and the number of lytic spots that appeared there was counted. Infection efficiency depends on the targeted plasmid pUC8
Was expressed as the number of phages infected with each E. coli when the number of phages infected with E. coli harboring E. coli was 1. As is clear from the results shown in Table 2 at the end, Qβ and
Since the plaque-shaped performance of SP is significantly reduced in the clone with the 357th amino acid substitution, the growth of Qβ and SP phage is suppressed, and the degree of suppression depends on the type of amino acid replaced. It has been found. Note that f2
The plaque-shaped performances of GA and GA were the same in all clones, and the degree of growth inhibition was not so high, but it is speculated that this is due to the template specificity of the RNA replication enzyme of RNA phage. Further, pVAR-A390 shown in Table 2 at the end means a mutant clone in which the 390th Gly residue is replaced with an Ala residue.
３）変異クローン（改変プラスミド）を保持している大
腸菌内でのＱβファージの一段階増殖実験 各種変異クローンを保持している大腸菌（E. coli 5
94 /F′ LacIg）を10mMの塩化カルシウムを含む酵母エ
キス5g/lバクトトリプトン8g/l、NaCl5g/lから成るYT培
地中で、37℃に保温しながら振盪培養し、菌数が108個/
mlにまで増殖した時点で、Ｑβファージを107PFU/ml
（感染多重度0.1）で感染させた。菌に感染しないファ
ージを除くために、感染後10分目に遠心分離してファー
ジ感染大腸菌を沈澱させた。次いで、この大腸菌を当量
の新しいYT培地に菌懸濁し、更に、1mMのイソプロピル
−β−Ｄ−チオグラクトシド（IPTG）を含む培地で稀釈
した後、30℃で振盪培養を続けた。感染後、第２図に示
した時点で一定量を採取し、これを十分量の指示菌（E.
coli A/λ及び2.5mlの0.6％の寒天を含むYT培地と混
合し、ペトリ皿（直径90mm×深さ15mm）内に予め作製し
ておいた1.5％の寒天を含むYT培地から成る寒天平板培
地上に重層した。寒天が固まったことを確認した後、こ
のペトリ皿を37℃で一夜保温した。この平板培地上に現
われた溶菌斑の数から大腸菌内で増殖したファージの数
を算出した。第２図にその結果を示す。3) mutant clones (holding the single-step growth experiments various mutations clones Qβ phage in E. coli that holds the modified plasmid) are coli (E. coli 5
94 / F ′ Lac Ig ) was cultivated with shaking in a YT medium consisting of yeast extract 5 g / l bactotryptone 8 g / l and NaCl 5 g / l containing 10 mM calcium chloride while keeping the temperature at 37 ° C. with shaking. 8 /
At the time of growth to 10 ml, Qβ phage was added to 10 7 PFU / ml.
Infection was performed at a multiplicity of infection of 0.1. In order to remove the phages that did not infect the bacteria, centrifugation was performed 10 minutes after the infection to precipitate phage-infected E. coli. Then, this Escherichia coli was suspended in an equivalent amount of fresh YT medium, further diluted with a medium containing 1 mM isopropyl-β-D-thioglactoside (IPTG), and shake culture was continued at 30 ° C. After infection, a fixed amount was collected at the time shown in Fig. 2 and a sufficient amount of the indicator strain ( E.
Agar plate consisting of YT medium containing 1.5% agar prepared in advance in a Petri dish (90 mm diameter x 15 mm depth) after mixing with YT medium containing coli A / λ and 2.5 ml of 0.6% agar. Overlaid on the medium. After confirming that the agar had solidified, the Petri dish was incubated at 37 ° C overnight. The number of phages grown in E. coli was calculated from the number of lytic plaques appearing on this plate medium. The results are shown in FIG.
なお、採取した試料を直ちに指示菌と供に接種した場
合は、○、△、□で示し、また、採取した試料をクロロ
ホルム処理して菌体を破壊した後、指示菌と共に接種し
た場合は、●、▲、■で示した。In addition, when the collected sample is immediately inoculated with the indicator bacterium, it is indicated by ○, △, □, and when the collected sample is treated with chloroform to destroy the bacterial cells, it is inoculated together with the indicator bacterium. ●, ▲, ■ are shown.
更に、○は、pRQ1、△は、pVAR−P357、□はpVAR−P3
57をそれぞれ保持している大腸菌中でのＱβファージの
増殖を意味する。Furthermore, ○ means pRQ1, △ means pVAR-P357, and □ means pVAR-P3.
It refers to the growth of Qβ phage in E. coli carrying 57 respectively.
第２図のＱβ野生株の一段増殖実験結果の比較から、
不活性なRNA複製酵素蛋白質を産生している細胞でのフ
ァージ感染中心数（白抜き）及び産生される全子孫ファ
ージ（黒塗り）は、いずれも活性なRNA複製酵素産生細
胞に比べて著しく減少していることが判明した。From the comparison of the single-stage growth experiment results of the Qβ wild strain shown in FIG.
The number of phage infectious centers (white) and the total progeny phage (black) produced in cells producing inactive RNA replication enzyme proteins are both significantly reduced compared to active RNA replication enzyme producing cells. It turned out that
ファージＱβのRNA複製酵素の構造と機能に関する以
上の知見から、357番目のアミノ酸置換による不活性な
ＱβRNA複製酵素蛋白質により、Ｑβ RNA及びSP DNAの
合成が著しく抑制されることが確認されたが、RNAウイ
ルスのRNA依存RNA複製酵素蛋白質に存在する共通のアミ
ノ酸配列−Tyr−Ｘ−Asp−Asp−のＸ残基を他のアミノ
酸残基で置換した改変RNA依存RNA複製酵素蛋白質をコー
ドする遺伝子を含む変異クローンを利用した本発明のRN
Aウイルスの感染防禦方法は、RNAファージのみならず、
同様の植物ウイルス、動物ウイルスの新しい感染防禦方
法、すなわち従来の免疫法とは異る新しい免疫手法とし
て多角的に利用し得る普遍的な技術として位置づけられ
るものであり、その産業上の利用価値は極めて高い。From the above findings on the structure and function of the RNA replication enzyme of phage Qβ, it was confirmed that the synthesis of Qβ RNA and SP DNA is remarkably suppressed by the inactive Qβ RNA replication enzyme protein by the amino acid substitution at position 357. A gene encoding a modified RNA-dependent RNA replication enzyme protein in which the X residue of the common amino acid sequence -Tyr-X-Asp-Asp- existing in the RNA-dependent RNA replication enzyme protein of RNA virus is replaced with another amino acid residue RN of the present invention utilizing a mutant clone containing
A virus infection prevention method is not limited to RNA phage,
It is positioned as a universal technology that can be used in various ways as a new immunity protection method against similar plant viruses and animal viruses, that is, a new immunization method different from the conventional immunization method, and its industrial utility value is Extremely high.
第１図は、ＱβファージのRNA複製酵素蛋白質遺伝子の
クローンの作製工程を示し、第２図は、Ｑβファージ野
生株による一段増殖実験の結果を示す。FIG. 1 shows the steps for preparing a clone of the RNA replication enzyme protein gene of Qβ phage, and FIG. 2 shows the results of a one-stage growth experiment using a Qβ phage wild strain.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI technical display location C12N 1/21 8828-4B 15/09 // (C12N 1/21 C12R 1:19)
Claims (2)
ット蛋白質の356番目から359番目のアミノ酸配列−Tyr
−Gly−Asp−Asp−のGly残基をAla、Ser、Pro、Met又は
Valから選択されるアミノ酸残基で置換した改変RNA複製
酵素蛋白質をコードする遺伝子又は当該遺伝子を含む変
異クローンプラスミド。1. An amino acid sequence from the 356th position to the 359th position of the RNA replication enzyme β-subunit protein of Qβ phage-Tyr
-Gly-Asp-Asp- Gly residue Ala, Ser, Pro, Met or
A gene encoding a modified RNA replication enzyme protein substituted with an amino acid residue selected from Val or a mutant clone plasmid containing the gene.
特許請求の範囲第１項記載の変異クローンプラスミド2. A mutant clone plasmid according to claim 1, which is selected from pVAR-A357 or pVAR-S357.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62123355A JPH084498B2 (en) | 1987-05-20 | 1987-05-20 | Modified RNA replication enzyme protein and method for preventing virus infection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62123355A JPH084498B2 (en) | 1987-05-20 | 1987-05-20 | Modified RNA replication enzyme protein and method for preventing virus infection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63287483A JPS63287483A (en) | 1988-11-24 |
| JPH084498B2 true JPH084498B2 (en) | 1996-01-24 |
Family
ID=14858526
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|---|---|---|---|
| JP62123355A Expired - Lifetime JPH084498B2 (en) | 1987-05-20 | 1987-05-20 | Modified RNA replication enzyme protein and method for preventing virus infection |
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| JP (1) | JPH084498B2 (en) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19508290A1 (en) * | 1995-03-09 | 1996-09-12 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Process for controlling unwanted virus replication and for producing virus-resistant organisms |
-
1987
- 1987-05-20 JP JP62123355A patent/JPH084498B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63287483A (en) | 1988-11-24 |
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