SU1730151A1 - Recombinant plasmid dna p9fmd, encoding hybridous polypeptide p199- asp-pro-cys-cys-vp1(200-213)-pro-pro-ser-pro-vp1(131-152)-pro-cys-- gly and a strain of bacteria escherichia coli - a producer of hybridous polypeptide p199-asp-pro-cys-gly-vp1(200-213)-pro-pro-ser -pro-vp1(131-152)-pro-cys-gly - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехноло гии, в частности к генетической инженерии, и представл ет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плэзмидную ДНК. содержащую искусственный ген. кодирующий гибридный белок, в состав которого вход т антигенные детерминанты вируса  щура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансл ции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при. иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. соП-продуцент этого полипептида . Рекомбинантна  плаэмидна  ДНК p9FMD кодирует иммуногенный полипептид Р199, в котором аминокислотна  последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с последовательностью AspProCysCys- VP1()-ProProSerPro(131-152}-Pro CysGiy. Она состоит из Sau3Al/HInd III - фрагмента ДНК-плазмиды pINF 314. содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7. полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансл ции, терминатор транскрипции фага л мбда и ген /J-лактамазы и Sau3AI/Hlnd Ill-фрагмента, содержащего синтетический ген. кодирующий пептидные антигенные детерминанты вируса  щура (штамм А22). При трансформации плазмидной p9FMD компе тентных клеток Е.срН SG20050 получают штамм - продуцент иммуногенного полипептида Р199 вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус  щура подтипа А22. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.. 1 ил. xi СО 01 The invention relates to biotechnology, in particular, genetic engineering, and is a recombinant plasmid DNA constructed in vitro. containing an artificial gene. encoding a hybrid protein, which includes antigenic determinants of the schur virus, promoters of the early region of bacteriophage T7, and the synthetic region of translation initiation, which causes the biosynthesis of the polypeptide that causes when. immunization of experimental animals; the formation of neutralizing antibodies that protect against viral infection, as well as the strain E. coP-producer of this polypeptide. The recombinant plasmid DNA p9FMD encodes the immunogenic polypeptide P199, in which the amino acid sequence of the human tumor necrosis factor is linked to the AspProCysCys-VP1 () - ProProSerPro (131-152} -Pro CysGiy) sequence by its C-terminus. plasmids pINF 314. containing the tandem of the A2 and A3 promoters in the early region of bacteriophage T7, a semisynthetic gene for human tumor necrosis factor with an artificial site for translation initiation, phage lambda transcription terminator and gene / J-lactamase and Sau3AI / Hlnd Ill fragment, sod A synthetic synthetic gene that encodes peptide antigenic determinants of the schur virus (strain A22) .Transforming the plasmid p9FMD of E.CPH competent cells of SG20050, the strain is produced by producing an immunogenic polypeptide P199 which causes the formation of antibodies of the scion virus of the A22 subtype A.22. ly, 2 tabl .. 1 il. xi CO 01

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к генетической инженерии, и представл ет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК.содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный бепок, в состав которого вход тThe invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and is a recombinant plasmid DNA constructed in vitro. It contains a synthetic gene that encodes a hybrid bepoque, which includes

.антигенные детерминанты вируса  щура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансл ции, обусловливающий биосинтез поТипептидов. вызывающих при иммунизации экспериментальных животных обраэование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. cod - продуцент этого полипептида ..antigenic determinants of the schur virus, promoters of the early region of bacteriophage T7, and the synthetic site of translation initiation, which causes biosynthesis by peptides. experimental animals that cause immunization with virus neutralizing antibodies that protect against a viral infection, as well as the E. cod strain, which produces this polypeptide.

Вирус  щура вызывает высококонтагиозное заболевание парнокопытных сельскохоз йственных животных, нанос щее значительный ущерб странам с высокоразвитым животноводством. В насто щее врем  в качестве вакцины против  щура используют инактивированный вирус. Технологи  приготовлени  такой вакцины требует небезопасного крупномасштабного культивировани  вирулентного вируса. Главным недостатком ее применени   вл ютс  вспышки заболевани , вызванные неполностью инактивированным вирусом.The schur virus causes a highly contagious disease of pedigree agricultural animals, causing significant damage to countries with highly developed animal husbandry. Currently, an inactivated virus is used as a shchur vaccine. The technology of preparing such a vaccine requires the unsafe large-scale cultivation of a virulent virus. The main disadvantage of its use is disease outbreaks caused by an incompletely inactivated virus.

Вирус  щура представл ет собой нукле- опротеид, состо щий из одной молекулы од- ноцепочечной значащей РНК и 60 копий каждого из капсидных белков VP1, VP2, VP3 -и VP4. Установлено, что поверхностный белок VP1  вл етс  главным антигеном и способен инициировать при вакцинации образование вируснейтрализующих антител . Однако полученный в чистом виде из вирусной частицы или технологией реком- бинантных ДНК белок VP1 вызывает слабый иммунный ответ,The sciatic virus is a nucleoprotein consisting of one molecule of single-stranded RNA and 60 copies of each of the capsid proteins VP1, VP2, VP3 and VP4. It has been established that the VP1 surface protein is the main antigen and is able to initiate the formation of virus-neutralizing antibodies during vaccination. However, VP1 protein produced in its pure form from a viral particle or by recombinant DNA technology causes a weak immune response,

Альтернативный подход к созданию субъединичных вакцин против вируса  щера вытекает из наблюдени , что синтетические пептиды, включающие амино-. кислотные последовательности 141-160 и 200-213 белка VP1 вызывают образование значительного уровн  вируснейтрализующих антител при иммунизации этими пептидами в виде коньюгатов с белком-носителем . Однако и в этом случае иммуноген- ность наиболее активного из этих пептидов остаетс  в 100-1000 раз ниже, чем иммуно- генность целого вируса, Отмеченные трудности в создании субъединичной вакцины можно преодолеть, использу  дл  синтеза иммуногенного пептида технологию реком- бинантных ДНК.An alternative approach to the creation of subunit vaccines against scherus virus follows from the observation that synthetic peptides, including amino. acid sequences 141-160 and 200-213 of the VP1 protein cause the formation of a significant level of neutralizing antibodies upon immunization with these peptides in the form of conjugates with the carrier protein. However, even in this case, the immunogenicity of the most active of these peptides remains 100–1000 times lower than the immunogenicity of the whole virus. The noted difficulties in creating a subunit vaccine can be overcome by using recombinant DNA technology to synthesize the immunogenic peptide.

Известна рекомбинантна  плазмида pFMD65, кодирующа  гибридный белок, в котором аминокислотна  последовательность /J-галактозмдазы Е. coll соединена с повтор ющейс  последовательностью 141- 160 белка VP1 вируса  щура (штамм OiK). Методами ммунодиффузии и иммунофер- ментного анализа показано, что гибридный белок, продуцируемый бактери ми, содержащими рекомбинантную п азмиду рРМОбб. специфически св зываетс  с антителами к целому вирусу  щура OiK и к фрагменту 136-148 капсидного белка VP1.The recombinant plasmid pFMD65, encoding a fusion protein, is known in which the E. coli amino acid / J-galactosmdase sequence is linked to the repetition sequence 141-160 of the VP1 protein of the schur virus (strain OiK). Using the methods of munodiffusion and immunofermental analysis, it was shown that the hybrid protein produced by bacteria containing the recombinant rRMobb unit. specifically binds to antibodies to whole shich OiK virus and to fragment 136-148 of the VP1 capsid protein.

Известны рекомбинантные плазмиды рМ01-71, рМ01-72, рМ01-74 и рМ01-78, кодирующие гибридный белок, ч котором единична  или повтор ющеес  послёдовательности 137-162 поверхностного белка VP1 вируса  щура (штамм 01, BSF) слиты с последовательностью /8-галактозидазы Е. coli. Кодируемые этими плазмидами гибридные белки способны при иммунизации морRecombinant plasmids pM01-71, pM01-72, pM01-74, and pM01-78 are known that encode a hybrid protein whose single or repeated sequences 137-162 of the surface protein VP1 of the schur virus (strain 01, BSF) are fused with the sequence / 8- galactosidase E. coli. The hybrid proteins encoded by these plasmids are capable of immunizing morphine

ских евино/ вызывать по вление вирусспецифических антител, взаимодействующих в иммуноферментном тесте и имму- ноблоттинге с рекомбинантным антигеном. Однако данные о способности получаемыхevinos / cause the appearance of virus-specific antibodies that interact in the ELISA test and immunoblotting with a recombinant antigen. However, data on the ability to receive

антител нейтрализовать вирус и предотвращать инфекцию отсутствуют.antibodies neutralize the virus and prevent infection are absent.

По принципу конструировани  рекомбинантна  плазмида pFMD65, кодирующа  гибрид /З-галактозидазэ -энтигенна  детерминанта вируса  щура OiK -  вл етс  наиболее близкой к предлагаемой.According to the principle of construction, the recombinant plasmid pFMD65, encoding a hybrid / 3-galactosidase -entigenic determinant of the Schiu virus, OiK, is closest to the one proposed.

Основным недостаткам перечисленных выше плазмидных конструкций  вл етс  то, что все они кодируют гибридные белки, вThe main disadvantages of the above plasmid constructs are that they all encode fusion proteins, in

которых антигенные детерминанты соединены с / -галактозидазой Е. coll. Применение таких гибридов в качестве вакцин вр д ли возможно, поскольку сама бактериальна  / -галактозидаза  вл етс  достаточноwhich antigenic determinants are connected with / -galactosidase E. coll. The use of such hybrids as vaccines is hardly possible, since the bacterial / -galactosidase itself is sufficiently

сильным иммуногеном; кроме того, дол  пептидного фрагмента в таком сплавленном белке слишком мала, чтобы вносить существенный вклад в иммунный ответ.strong immunogen; in addition, the proportion of the peptide fragment in such a fused protein is too small to make a significant contribution to the immune response.

Сконструирована рекомбинантна Constructed recombinantly

плазмидна  ДНК p9FMD, кодирующа  биосинтез иммуногенного полипептида Р199, который индуцирует образование нейтрализующих антител против подтипа Ааа вируса  щура, и бактериальный штамм Е. colip9FMD plasmid DNA encoding the biosynthesis of the immunogenic polypeptide P199, which induces the formation of neutralizing antibodies against the Aaa subtype of the schur virus, and the bacterial strain E. coli

ВКПМ В-5296 - продуцент этого полипептида , обеспечивающий высокий уровень его биосинтеза.VKPM B-5296 is a producer of this polypeptide, providing a high level of its biosynthesis.

Кодируемый плазмидой p9FMD имму- ногенный полипептид состоит из аминокислотной последовательности фактора некроза опухолей человека, соединенной своим С-концом с последовательностью универсальной антигенной детерминанты вируса  щура (последовательность 200-213The plasmid-encoded p9FMD immunogenic polypeptide consists of the amino acid sequence of human tumor necrosis factor, its C-terminus is linked to the sequence of the universal antigenic determinant of the schur virus (sequence 200-213

аминокислот белка VP1). котора , в свою очередь, посредством последовательности ProProSerPro, обеспечивающей изгиб полипептидной цепи, соединена с последовательностью главной вариабельной антигенной детерминанты вируса  щура (последовательность 131-152 белка VP1). Выбор последовательности антигенного полипептида обусловлен имеющимис  в литературе данными по локализации главногоamino acids of the protein VP1). which, in turn, is connected to the sequence of the main variable antigenic determinant of the schur virus (sequence 131-152 of the VP1 protein) by means of the ProProSerPro sequence, which bends the polypeptide chain. The choice of the sequence of the antigenic polypeptide is determined by the data available in the literature on the localization of the main

иммуногенного эпитопа вируса  щура и обеспечивает моделирование пространственной сближенности двух а-спиралей анти- генных детерминант, которое, по-видимому, имеет место в вирусной частице.: immunogenic epitope of the schur virus and provides a simulation of the spatial convergence of two a-helices of antigenic determinants, which, apparently, takes place in a virus particle:

Рекомбинантна  плазмидна  ДНК p9FMD, кодирующа  иммуногенный полипептид Р199, характеризуетс  следующими признаками:-ГRecombinant p9FMD plasmid DNA encoding the immunogenic P199 polypeptide is characterized by the following features:

кодирует аминокислотную после довательность гибридного белка: фактор некроза опухолей человека - AspProCysCys-VP 1 (200-21 ShProProSerPfo- VP1 (131-152)-ProCysGly;encodes the amino acid sequence of the hybrid protein: human tumor necrosis factor - AspProCysCys-VP 1 (200-21 ShProProSerPfo-VP1 (131-152) -ProCysGly;

имеет мол:м. 2,49 Мд (3,81 т.п.о.),has a mole: m 2.49 MD (3.81 kb),

состоит из consists of

5аиЗА1/Н1пс1111-фрагмента ДНК плазмиды pTNF314 Д. содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансл ции/терминатор транскрипции.фага л мбда и ген /5-лактама- зы (3,66 т.п.о.).5aIAZ1 / H1ps1111 DNA fragment of the plasmid pTNF314 D. containing the tandem of the A2 and A3 promoters of the early T7 bacteriophage region, the semisynthetic gene for human tumor necrosis factor with an artificial translation initiation site / transcription terminator. , 66 kb).

SauSAI/HindII 1-фрагмента. содержаще- го синтетический ген, кодирующий пептиды антигенных детерминант вируса  щура (подтип А22):SauSAI / HindII 1-fragment. containing a synthetic gene that encodes peptides of antigenic determinants of the schur virus (subtype A22):

содержитcontains

в качестве генетического маркера ген / -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой p9FMD клеток Е. coli к пенициллиновымантибиотикам ,as a genetic marker for the gene / -lactamase, determining the resistance of E. coli cells transformed with the p9FMD plasmid to penicillin antibiotics,

уникальные сайты узнавани  рестрик- ционными эндонуклеазами. расположенными на следующих рассто ни х вправо от сайта BstEH: BamHI - 73 нуклеотида, Bglll- 154 нуклеотида, Hlndfll - 229 нуклеотИдов, Ncol - 562 нуклеотида, Pstl - 2406 нуклеоти- дов.;unique restriction endonuclease recognition sites. located to the right from the BstEH site: BamHI, 73 nucleotides, Bglll, 154 nucleotides, Hlndfll, 229 nucleotides, Ncol, 562 nucleotides, Pstl, 2406 nucleotides;

На чертеже изображены схемы лигаз- ных сшивок синтетических олигонуклерти- дов в двухцепочечные ДНК (сегменты А и В), кодирующие пептиды - антигенные детер- минанты белка оболочки VP1 вируса  щура (штамм Аа2). Дл  получени  этих двухцепо- чечных ДНК амидофосфитным способом синтезируют одиннадцать олигонуклеоти- дов величиной от 13 до 43 нуклеотидных звеньев, которые затем соедин ют при помощи ДНК-лигазы как указано на чертеже.The drawing shows schemes of ligase cross-links of synthetic oligonucle- ritides in double-stranded DNA (segments A and B) encoding peptides — antigenic determinants of the protein of the VP1 coat of the schur virus (strain Aa2). To obtain these double-stranded DNAs, eleven oligonucleotides ranging from 13 to 43 nucleotide units are synthesized by an amidophosphite method, which are then joined using DNA ligase as indicated in the drawing.

Дл  дальнейшего конструировани  используют рекомбинантную плазмиду pTNF314 Л котора   вл етс  производной плазмиды pTNF311 Л с измененной с помощью слигонуклеотид-направленного мутагенеза С-концевой частью искусственного гена фактора некроза опухолей человека . В результате в самый С-конец гена был введен уникальный дл  этой плазмиды ре- стриктный сайт Bglll. ДН-плазмиды pTNF314 Д расщепл ют эндонуклеазами Bglll и Hlndlll, больший фрагмент выдел ют и лигируют с избытком нефос- форилированного сегмента А. Аликвоту реакционной смеси используют дл  трансформации компетентных клеток Е. coll НВ101. Трансформанты высевают на LB- агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. и скрининг колоний провод т гибридизацией „с 5 - 32Р -меченным олигонуклеотидом VII. Из гибридизующихс  клонов выдел ют плазмидную ДНК p7FMD, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз Haelll и Mspl. а также определением нуклеотидной последовательности части плазмидной ДНК между сайтами рестриктаз Hind III и BamHI.For further construction, a recombinant plasmid pTNF314L which is a derivative of the plasmid pTNF311L with the C-terminal part of the artificial human tumor necrosis factor gene modified by sligonucleotide-directed mutagenesis is used. As a result, the Bglll restriction site, unique to this plasmid, was introduced at the very C-terminus of the gene. The DN plasmids pTNF314 D are digested with endonucleases Bglll and Hlndlll, the larger fragment is isolated and ligated with an excess of a non-phosphorylated segment A. An aliquot of the reaction mixture is used to transform E. coli HB101 competent cells. Transformants are plated on LB-agar containing 50 μg / ml ampicillin. and colony screening is carried out by hybridization with 5 to 32P-labeled oligonucleotide VII. P7FMD plasmid DNA was isolated from hybridizing clones, the structure of which was confirmed by restriction analysis using Haelll and Mspl endonucleases. as well as determining the nucleotide sequence of the part of the plasmid DNA between the Hind III and BamHI restriction sites.

Дл  конструировани  новой рекомби- нантной плазмиды p9FMD плазмидную ДНК p7FMD сначала линеаризуют гидролизом зндонуклеазы Pstl, а затем полученную таким образом линейную форму ДНК подвергают действию рестриктазы Kpnl. Из образовавшейс  смеси фрагмент величиной около 2,2 т.п.о. выдел ют электрофорезом в 1 %-ном геле легкоплавой агарозы. С другой стороны ДНК-плазмиды pTNF314 Дгидро- лизуют смесью рестриктаз Bglll n Pstl. Выделенный электрофорезом как описано выше Pstl/Bglll-фрагмент величиной около 1,6 т.п.о. лигируют в присутствии большого избытка синтетического сегмента В с Pstl/Kpnl-фрагментом ДНК плаэмиды p7FMD величиной около 2.2 т.п.о. Частью лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е. соН НВ101; трзсформанты высевают на 1,7% LB-arap, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг провод т путем in situ гибридизации колоний с 51- Р -меченным олигонуклеотидом XII. Выделенную из гибридизирующихс  колоний ДНК плазмиды p9FMO анализировали при помощи рестриктаз Mspl и Haelll и ее структуру подтверждали определением нуклеотидной последовательности в районе .клонировани  сегмента В.To construct a novel recombinant plasmid p9FMD, the plasmid p7FMD DNA is first linearized by the hydrolysis of the Pstl nucleotide, and then the linear DNA thus obtained is subjected to the restriction enzyme Kpnl. From the resulting mixture, a fragment of about 2.2 kbp. are isolated by electrophoresis in 1% light melting agarose gel. On the other hand, the DNA plasmid pTNF314 is hydrolyzed with a mixture of restriction enzymes Bglll n Pstl. Selected by electrophoresis as described above, the Pstl / Bglll fragment of about 1.6 kbp. are ligated in the presence of a large excess of the synthetic B segment with the Pstl / Kpnl fragment of the p7FMD plamid DNA of about 2.2 kb. Part of the ligase mixture transform the competent cells of E. coH HB101; Trsformants are plated on 1.7% LB-arap containing 50 μg / ml ampicillin. Screening was performed by in situ hybridization of colonies with 51-P-tagged oligonucleotide XII. Plasmid p9FMO isolated from hybridizing colonies of DNA was analyzed using Mspl and Haelll restriction enzymes and its structure was confirmed by determining the nucleotide sequence in the region of B cloning of the segment B.

Рекомбинантна  плазмида p9FMD кодирует иммуногенный пептид Р199, который представл ет собой белок фактора некроза опухолей человека, слитый через дипептид AspPro с последовательност ми антигенных детерминант подтипа А22 вируса  щура.The recombinant plasmid p9FMD encodes the immunogenic peptide P199, which is a human tumor necrosis factor protein, fused through an AspPro dipeptide with sequences of the antigenic determinants of the A5 virus subtype.

Дл  получени  бактериального штамма - продуцентов иммуногенного полипептидаTo obtain a bacterial strain producing immunogenic polypeptide

Р199 плззмидой pQFMD трансформируют компетентные клетки Е. coll SG20050.P199 plzmid pQFMD transform competent cells of E. coll. SG20050.

Полученный таким образом штамм Е. coll ВКПМ В-5296 характеризуетс  следующими признаками..The strain E. coll. Obtained by VKPM B-5296 thus obtained is characterized by the following features.

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.Morphological signs. Cells small thickened rod-shaped, gram-negative, risperadone.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые , гладкие, прижаты, мутные, блест щие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной.среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.Cultural features. Cells grow well on simple nutrient media. With growth on Difco agar, the colonies are round, smooth, pressed, dull, shiny gray, the edge is even. With growth in liquid media (on minimal medium with glucose or LB-broth) they form an intense even dregs.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме рН 6,8-7,0. В качестве источника азота испоЛьзуют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединени  в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.Physical and biological signs. Cells grow at a temperature of from 4 to 40 ° C at an optimum pH of 6.8-7.0. As a nitrogen source, both ammonium mineral salts and organic compounds in the form of peptone, tryptone, yeast extract, amino acids, etc. are used as the nitrogen source. Amino acids, glycerin, carbohydrates are used as a carbon source.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки про вл ют устойчивость к ампициллину (до 300 мк/мл), обусловленную наличием плаз- миды, а также к тетрациклину (до 30 мкг/мл), благодар  наличию транспозона.Antibiotic resistance. Cells exhibit ampicillin resistance (up to 300 micron / ml), due to the presence of a plasmid, as well as tetracycline (up to 30 µg / ml), due to the presence of a transposon.

Штамм Е. coll ВКПМ В-5296 обусловливает конститутивный синтез больших количеств (свыше 25% тотального клеточного, белка бактерий) иммуногенного по ипепти- да Р199, способного при иммунизации жи- вотных вызывать образование антител, нейтрализующих вирус  щура подтипа А22П р и м е р 1. Химический синтез и лигирование олигонуклеотидов.The strain E. coll. VKPM B-5296 determines the constitutive synthesis of large quantities (over 25% of the total cellular, bacterial protein) immunogenic by ipeptide P199, which, when immunized, causes the formation of antibodies that neutralize the sch30 virus of the subtype A22P 1. Chemical synthesis and ligation of oligonucleotides.

Синтез олигонуклеотидов выполн ют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System 1 (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3-конца к 5-концу с помощью защищенных фосфамидитов - метокситрил-М-ацил-2 -дезоксинуклеозид- 3-0-(метоксидиизопропиламино)-фосфи- тов, активированных тетраэолом. Синтез провод т в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, использу  в качестве носител  пористое стек- ло (размер пор 500 A,f размер пор 40-80 мкм), к которому через З -сукцинатную св зь присоедин ют первое нуклеозидное звено (нагрузка J20-30 мкмоль/r). После проведени  конденсации промывают смолу смесью тетрагидрофуран-пиридин-вода (5:3:2). По окончании синтеза защитные группы удал ли последовательной обработкой тиофеиол том триэтиламмони  и концентрированным аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотида от носител . 5 -Диметокси-тритильную группу удал ют кислотной обработкой, и олигонуклеотид очищают электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Выход- 1-5 о.е.The synthesis of oligonucleotides is performed by a solid phase phosphoramidite method on a System 1 (Beckman) DNA synthesizer, with the oligonucleotide chain growing from 3-to-5-end using protected phosphamidites, methoxytrile-M-acyl-2 -doxox-3-0- ( methoxy diisopropylamino) phosphites activated by tetraol. The synthesis is carried out on a scale of 0.5-0.7 µmol, using porous glass as a carrier (pore size 500 A, f pore size 40-80 µm), to which the first nucleoside link is attached via a 3 -succinate bond (load J20-30 µmol / r). After condensation, the resin is washed with tetrahydrofuran-pyridine-water (5: 3: 2). At the end of the synthesis, the protecting groups were removed by sequential treatment with triethylammonium thiophoilate and concentrated ammonia. When this occurs, the separation of the oligonucleotide from the carrier. The 5-dimethoxy-trityl group is removed by acid treatment, and the oligonucleotide is purified by electrophoresis in 20% PAAG containing 7 M urea. Output - 1-5 pu

Лигазна  сшивка. Смесь 250 пмоль каждого из нефосфорилированных олигонуклеотидов (I) и (VII) и 200 пмоль каждого из фосфорилированных олигонуклеотидов (II)- (VI) нагреваю ; 10 мин при 90°С в 100 мкл буфера содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, и 10 мМ MgClg, затем медленно охлаждают до 15°С. прибавл ют гАТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 5 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем депротеинизиру- ют двукратной фенольной экстракцией фенолом; ДНК высаживают этанолом и продукты сшивки выдел ют при помощи электрофореза в 15% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Нужный полинуклеотид выдел ют из гел  электроэлюцией на DEAE-бумагу DE-81, которую промывают несколько раз ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют при помощи 1,5 М раствора NaCI в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с сефадексом G-50. Выход сегмента А - 160 пмоль. Аналогичным образом получают сегмент В. Выход- 150 пмоль.Ligase stitching. A mixture of 250 pmol of each of the unphosphorylated oligonucleotides (I) and (VII) and 200 pmol of each of the phosphorylated oligonucleotides (II) - (VI) is heated; 10 min at 90 ° C in 100 μl of buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, and 10 mM MgClg, then slowly cooled to 15 ° C. gATP is added to a concentration of 0.2 mM, dithiotreite to a concentration of 5 mM and 100 units. T4 DNA ligase. The mixture is incubated for 6 hours at 15 ° C, then deproteinized by phenol twice with phenol extraction; DNA is planted with ethanol and the crosslinked products are isolated by electrophoresis in 15% PAAG containing 7 M urea. The desired polynucleotide is separated from the gel by electroelution onto DEAE DE-81 paper, which is washed several times with TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA) and ethanol. The nucleotide material is eluted with a 1.5 M solution of NaCI in TE-buffer and desalted on a Sephadex G-50 column. Segment A exit - 160 pmol. Similarly, a segment B is obtained. The yield is 150 pmol.

Л р и м е р 2. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК p7FMD.Lecturer 2. Construction of recombinant plasmid DNA p7FMD.

Клетки бактерий Е. coll HB101, содержащие плазмидную ДНК pTNF314 Д, выращивают при 37°С в LB-бульоне. содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выдел ют в соответствии с процедурой щелочной денатурации с модификаци ми, заключающимис  в том, что к супернатанту, полученному после подкислени  ацетатом натри , прибавл ют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37°С, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1) и ДНК высаживают этанолом. Осадок раствор ют в ТЕ-буфере, содержащем 1 М NaCI, прибавл ют полиэтиленгли- коль PEG-6000 до концентрации 1,5%, выдерживают 1 ч при 0°С, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин; осадок промывают 70% этанолом, высушивают и раствор ют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной°ДНК определ ют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 о.е./мг.Bacteria E. coli cells HB101 containing plasmid DNA pTNF314 D are grown at 37 ° C in LB broth. containing 100 µg / ml ampicillin, to the stationary phase. The plasmid DNA was then isolated according to the alkaline denaturation procedure, with the modifications that RNase A was added to the supernatant obtained after acidification with sodium acetate to a concentration of 10 µg / ml, the mixture was incubated for 20 minutes at 37 ° C, extracted twice with a mixture of phenol-chloroform (1: 1) and DNA are planted with ethanol. The precipitate is dissolved in TE-buffer containing 1 M NaCl, polyethylene glycol PEG-6000 is added to a concentration of 1.5%, kept for 1 hour at 0 ° C, centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm; the precipitate is washed with 70% ethanol, dried and dissolved in TE buffer. The yield of plasmid ' DNA was determined spectrophotometrically at 260 nm using an extinction coefficient of 20 pu / mg.

К раствору 2 мкгплазмиды pTNF314 А в 30 мкл буфера R, содержащего 20 мм трис- HCI, рН 7,5. 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCfc, 7 мМ меркаптоэтанол, инкубируют со смесью рестриктаз Hlndlll и Bglll (no 10 ед. каждой) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1) и векторный фрагмент очищают электрофоре- зом в 1 % геле легкоплавкой агарозы, ДНК выдел ют методом замораживани  - оттаивани  и высаживают 70% этанолом. К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCl2. 0,2 мМ гАТР и 5 мМ дитиотреит, прибавл ют 0.1 Мкг сегмента: А и 20 ед. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6ч при 15°С, затем ал и квоту (1/4) реакционной смеси используют Дл  трансформации компетентных Е.poll. Трансформацию провод т следующим образом . Предварительно клетки Е. colt НВт01 высевают на агар, содержащий среду Ш, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единич- ную колонию внос т в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37°С до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 Мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCla. центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl2 и выдерживают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугировани  клетки ресуспендируют в 3 мл 0.1 М СаОа и через 3 ч используют дл  трансфер- мациит С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М CaCIa, затем прибавл ют 150 мкл суспензии компетент- ных клеток, выдерживают при 0°С. затем 2 мин при42°Си снова 10 мин при 0°С, после чего прибавл ют 2 мл LB-бульона. инкубируют 1 ч при 37°С и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целевую плазмиду p7FMD, идентифицируют гибридизацией с одним из олигонуклеотидов 32P-VII, вход щих в состав клонируемого сегмента А. Из гибриди- зующихс  с этой пробой клонов выдел ют плазмидную ДНК, строение которой под- тверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз Haelll и Mspl. Окончательно структуру рекомбинантной плазмиды p7FMD подтверждают определением нуклеотидной последовательности плазмиды в области вставки синтетической ДНК.To a solution of 2 μgplasmid pTNF314 A in 30 μl of buffer R containing 20 mm Tris-HCl, pH 7.5. 50 mM NaCI, 10 mM MgCfc, 7 mM mercaptoethanol, are incubated with a mixture of restriction enzymes Hlndlll and Bglll (no 10 units each) for 1 hour at 37 ° C. After incubation, the reaction is stopped by double extraction with phenol-chloroform (1: 1) and the vector fragment is purified by electrophoresis in 1% low-melting agarose gel, DNA is isolated by freeze-thawing and planted with 70% ethanol. To a solution of 0.2 μg of the vector thus obtained in 20 μl of buffer L containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2. 0.2 mM gATP and 5 mM dithiothreitol, add 0.1 µg of the segment: A and 20 units. T4 DNA ligase. The mixture is incubated for 6 hours at 15 ° C, then the al and quota (1/4) of the reaction mixture are used to transform competent E.poll. The transformation is carried out as follows. Previously, E. colt NW01 cells are plated on agar containing medium W, 0.2% glucose and 2 μg / ml thiamine. A single colony is added to 50 ml of nutrient broth LB and grown at 37 ° C to a turbidity of 0.3-0.5. Then the cells are cooled, precipitated by centrifugation (10 min, 5000 rpm), washed with a solution of 10 mm MgCla. centrifuged, suspended in 20 ml of a 0.1 M solution of CaCl2 and kept at 0 ° C for 30 minutes. After centrifugation, the cells are resuspended in 3 ml of 0.1 M CaOa and after 3 hours they are used for transfer maciit. To this end, 5 µl of the ligase mixture is mixed with 50 µl of 0.05 M CaCIa, then 150 µl of the suspension of the competent cells is added, kept at 0 ° s then 2 minutes at 42 ° C again for 10 minutes at 0 ° C, after which 2 ml of LB-broth are added. incubated for 1 h at 37 ° C and aliquots plated on plates with LB-agar containing ampicillin (50 μg / ml). Bacterial clones containing the target plasmid p7FMD are identified by hybridization with one of the oligonucleotides 32P-VII included in the cloned segment A. Plasmid DNA isolated from restriction analysis using restrictase analysis is isolated from the hybrid clones with this sample. and Mspl. Finally, the structure of the recombinant plasmid p7FMD was confirmed by determining the plasmid nucleotide sequence in the synthetic DNA insertion region.

ПримерЗ. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pQFMD.Example Construction of recombinant plasmid DNA pQFMD.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды p7FMD в 80 мкл буфера R прибавл ют20ед. каждой из рестрикционных нуклеаз Pstl и Kpnl и инкубируют 90 мин при 37°С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного KpnI/Pstl-фрагмента (2,2 т.п.о.) провод тTo a solution of 10 µg of the plasmid p7FMD DNA in 80 µl of buffer R is added 20 units. each of the restriction nucleases Pstl and Kpnl and incubated for 90 min at 37 ° C. Analysis of the completeness of hydrolysis and isolation of the vector KpnI / Pstl fragment (2.2 kb) is carried out.

при помощи электрофореза в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК плазмиды pTNF314 Д в 100 мкл буфера R обрабатывают 1,5 ч при 37°С 20 ед. каждой из рестриктаз Bglll и Kpnl, после чего фрагмент величиной около 1,6 т.п.о., содержащий синтетический ген антигенной детерминанты, выдел ют при помощи электрофореза в 1% геле легкоплавкой агарозы как описано в примере 1. Далее этот фрагмент (0.2 мкг) соедин ют в присутствии 0,3 мкг сегмента В с векторной ДНК (1,5 мкг) при помощи 30 ед. Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15°С. Дес тую часть( реакционной смеси используют дл  трансформации компетентных клеток Е. coll НВ101. Трансформанты высевают на агари- зованную среду, содержащую ампициллин (50 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов , содержащих рекомбинантную плазмиду p9FMD, провод т гибридизацией колоний in situ с Р-меченным олигонукле- отидом (XIV). Из клонов, гибридизирующих- с  с радиоактивной пробой, выдел ют плазмидную ДНК pQFMD, строение которой подтверждают гидролизом рестриктазами Mspl и Haelll, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса.by electrophoresis in 1% low melting point agarose gel. At the same time, 10 μg of plasmid pTNF314 D DNA in 100 μl of buffer R is treated for 1.5 hours at 37 ° C with 20 units. each of the Bglll and Kpnl restriction enzymes, after which a fragment of about 1.6 kbp, containing a synthetic antigenic determinant gene, is isolated by electrophoresis on a 1% low-melting agarose gel as described in Example 1. Next, this fragment (0.2 µg) is combined in the presence of 0.3 µg of segment B with vector DNA (1.5 µg) with 30 units. T4 DNA ligase in 50 μl of buffer L for 6 h at 15 ° C. A tenth part (the reaction mixture was used to transform E. coli HB101 competent cells. Transformants were plated on agar medium containing ampicillin (50 µg / ml). Screening of bacterial clones containing recombinant plasmid p9FMD was performed by in situ hybridization of P with P -labeled oligonucleotide (XIV). From clones hybridizing with the radioactive sample, plasmid DNA pQFMD was isolated, the structure of which was confirmed by hydrolysis with restrictase Mspl and Haelll, as well as the determination of the nucleotide sequence in the region of the insert syn Tetical duplex.

П р им е р 4. Получение штамма-продуцента иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус  щура подтипа А22.Example 4: Production of a producer strain of an immunogenic polypeptide that causes the formation of antibodies that neutralize the scholar virus subtype A22.

Плазмидой p9FMD трансформируют компетентные клетки Е. coll SG20050 по методу , описанному в примере 1, и получают штамм Е. соН ВКПМ В-5296 - продуцент иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус  щура подтипа А22. Иммунные свойства полипептида из штамма-продуцента подтверждены иммуноблоттингом.Plasmid p9FMD transform competent E. coli SG20050 cells according to the method described in Example 1, and the E. coli VKPM B-5296 strain is produced to produce an immunogenic polypeptide that causes the formation of antibodies that neutralize the A22 subtype sch30 virus. The immune properties of the polypeptide from the producer strain are confirmed by immunoblotting.

П р и м е р 5. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного полипептида Р199 (биологические испытани ).Example 5. Study of the immunogenic properties of the recombinant polypeptide P199 (biological testing).

Дл  иммунизации лабораторных животных выделенный из биомассы штамма-продуцента рекомбинатный белок Р199 при определенной концентрации смешивают в равном объемном соотношении с неполным адьювантом Фрейнда.To immunize laboratory animals, the recombinant protein P199 isolated from the biomass of the producer strain, at a certain concentration, is mixed in an equal volume ratio with the incomplete Freund's adjuvant.

Группе морских свинок или кроликов массой соответственно 0,5 или 2,0 кг ввод т вакцинирующий раствор однократно или двукратно в объеме 1,0 мл в дозе 150-200 мкг.A group of guinea pigs or rabbits weighing 0.5 or 2.0 kg, respectively, was injected with the vaccine solution once or twice in a volume of 1.0 ml in a dose of 150-200 µg.

Вторую иммунизацию провод т через 38-42 дн  после первой. Вируснейтрализу- ющие антитела определ ют на 47-60 день после первой иммунизации на культуре клеток свиной почки против 100 ТЦД50 вируса  щура подтипа А22.A second immunization is given 38-42 days after the first one. Neutralizing antibodies are detected on day 47-60 after the first immunization in a pig kidney cell culture against 100 TCD50 of the A22 subtype schip virus.

На 47-55 день после первой иммунизации морских свинок заражают введением 500 ИДбО вируса  щура А22, адаптированного к организму морских свинок, и определ ют протективный эффект.At 47-55 days after the first immunization, the guinea pigs are infected by administering 500 IDBOs of the A22 shura virus adapted to the body of the guinea pigs, and the protective effect is determined.

Данные титровани  вируснейтрализую- щих антител и протективный эффект приведены в таб. 1 и 2.These titers of virus neutralizing antibodies and the protective effect are given in tab. 1 and 2.

Таким образом, рекомбинантный белок Р199, выделенный из биомассы штамма- продуцента ВКПМ В-5296, обладает защитным действием против вируса  щура подтипа А22 и индуцирует высокий уровень вируснейтрализующих антител у кроликов и морских свинок.Thus, the recombinant protein P199, isolated from the biomass of the producer strain VKPM B-5296, has a protective effect against the A22 subtype schur virus and induces a high level of virus-neutralizing antibodies in rabbits and guinea pigs.

Claims (2)

1. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК p9FMD, кодирующа  гибридный полипептид P199-AspProCysCys - VP1 (200-213) - ProProSerPro-VP1(131-152)-ProCysGly. мол.м. 2,49 Мд и размером 3,81 т.п.о., содержаща  SauSAI - Hfnd III - фрагмент ДНКплазмиды pTNF314 Дс тандемом промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и с искусственным1. Recombinant plasmid p9FMD DNA encoding the hybrid polypeptide P199-AspProCysCys-VP1 (200-213) -ProProSerPro-VP1 (131-152) -ProCysGly. mol.m. 2.49 Md and 3.81 kb in size, containing SauSAI - Hfnd III - a fragment of DNA plasmid pTNF314 with the A2 and A3 promoters of the early T7 bacteriophage region, a semisynthetic gene of human tumor necrosis factor and with artificial участком иницииации трансл ции, термина- Top транскрипции фага л мбда и геном /J- лактамазы размером 3,66 т.п.;the site of translation initiation, term-Top transcription of phage lambda and the genome of / J-lactamase with a size of 3.66, etc .; Hind III - SauSAI - фрагмент с синтетическим геном, кодирующим пептиды -антигенные детерминанты вируса  щура подтип А22. генетические маркеры; ген Длактама- зы. обеспечивающий устойчивость пени- циллиновым антибиотиком; уникальные сайты узнавани  рестрикционными эндонуклеазами , а расположенные на следующих рассто ни х вправо от сайта BstEII: BamHI - 73 нуклеотида, Bgl II - 154 нуклео- тида; Hind lit - 229 нуклеотидов; Ncol - 562 нуклеотида, Pstl - 2406 нуклеотидов.Hind III - SauSAI - a fragment with a synthetic gene that encodes peptides - antigenic determinants of the schur virus, subtype A22. genetic markers; Daklamazy gene. providing stability with a penicillin antibiotic; unique recognition sites for restriction endonucleases, and located at the following distances to the right of the BstEII site: BamHI, 73 nucleotides, Bgl II, 154 nucleotides; Hind lit - 229 nucleotides; Ncol 562 nucleotides, Pstl 2406 nucleotides. 2. Штамм бактерий Esherichia coll ВКПМ В-5296 - продуцент гибридного полипептида Р199 - AspProCysCys VP1(200-213) - Pro ProSerPro-VP1(131-152)ProCysGly.2. The strain of bacteria Esherichia coll VKPM B-5296 - producer of hybrid polypeptide P199 - AspProCysCys VP1 (200-213) - Pro ProSerPro-VP1 (131-152) ProCysGly. Результаты биологических испытаний рекомбинантного белкаThe results of biological tests of recombinant protein Р199 на кроликахP199 on rabbits Результаты биологических испытаний рекомбинантного белка Р199 на морских свинкахThe results of biological tests of recombinant protein P199 on guinea pigs Таблица 1Table 1 Таблица 2table 2 ABpProTyrGlyHtsGlyLysIleSerAlaGlyGlyMetGlyArgArgGlyAspABpProTyrGlyHtsGlyLysIleSerAlaGlyGlyMetGlyArgArgGlyAsp 1д IIX   IV1d IIX IV GATCCTAACGGTACCGGTAMTAGTCTGCTGGTGGTATGGGCGGTAGAGGAGAT- GATTGCCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTCTAIIUVGATCCTAACGGTACCGGTAMTAGTCTGCTGGTGGTATGGGCGGTAGAGGAGAT- GATTGCCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTATAUV LeuGluProLeuAlaAlaProCysGly PerTerLeuGluProLeuAlaAlaProCysGly PerTer ... t   ... t CTAGAlcCTCTGGCTGCTCCTTGTGGTTAATA GATCTTGGAGACCGACGAGGAACACCAATTATTCGA U - . vii СЕГМЕНТ АCTAGAlcCTCTGGCTGCTCCTTGTGGTTAATA GATCTTGGAGACCGACGAGGAACACCAATTATTCGA U -. vii SEGMENT A ABpfroCyaCystArgH iatyaGInLyal I el IeAloProA lаABpfroCyaCystArgH iatyaGInLyal I el IeAloProA la GATCCTTGTTGTAGACACAAACAGAAAATCATTGCACCTGCA- GAACAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACGTmи GATCCTTGGTTGTAGACACAAACAGAAAATCATTGCACCTGCA- GAACAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACACTTi LysGlnLeuLeuProProSerProAsnGlyHlaLysGlnLeuLeuProProSerProAsnGlyHla XIIIXIII AAACAACTTTTGCCTCCTTCTCpTAACGGTAC TTTGTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGCAAACAACTTTTGCCTCCTTCTCpTAACGGTAC TTTGTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGC YIX СЕГМЕНТ ВYIX SEGMENT B