DE19508290A1 - Process for controlling unwanted virus replication and for producing virus-resistant organisms - Google Patents

Abstract

The invention concerns a method of inhibiting virus multiplication by deliberate interference with the interactions necessary for virus replication by the expression of chromosomally coded dominantly negative mutations.

Description

1. Einleitung1 Introduction

Die Replikation der Erbinformation der Zellen eines beliebigen Organismus ist fundamentale Voraussetzung für dessen Vermehrung. Die durchführenden funktionellen Faktoren bestehen aus einem Komplex von Proteinen, die in spezifischer Weise interagieren müssen, um das Genomsubstrat identisch zu replizieren zu können. Die Komponenten des Replikationskomplexes werden von der Zelle selbst kodiert und unterliegen einer genauen Regulationskontrolle. Bei der Vermehrung viraler Genome wechselwirken Proteine, die durch das Virus kodiert werden, mit wirtszelleigenen Faktoren, wodurch die notwendigen Replikationskomplexe entstehen. Die beteiligten jeweiligen Wirtsfaktoren sind in der Mehrzahl noch nicht identifiziert.The replication of the genetic information of the cells of any organism is fundamental requirement for its multiplication. The performing functional factors consist of a complex of proteins that are in specifically need to interact to make the genome substrate identical to be able to replicate. The components of the replication complex are from the cell itself and are subject to precise regulatory control. At The proliferation of viral genomes interact with proteins caused by the virus be encoded with host cell factors, thereby eliminating the necessary Replication complexes arise. The respective host factors involved are in the majority have not yet been identified.

An komplexen Funktionen in einem biologischen Organismus sind immer mehrere Proteine beteiligt, die in spezifischer Weise untereinander zusammenwirken müssen. Für die Interaktion der Proteine eines Enzymkomplexes ist die räumliche Nähe der beteiligten Faktoren und die Aufrechterhaltung der Struktur unabdingbar. Die Organisation der räumlichen Struktur bedingt spezialisierte Bereiche der beteiligten Faktoren, die Kontaktaufnahme und Zusammenhalt der beteiligten Faktoren bewirken müssen. Eine korrekte und effiziente Durchführung eines Prozesses wie Replikation oder Transkription kommt erst zustande, wenn die Proteine in der richtigen räumlichen Ausrichtung zueinander stehen. There are always complex functions in a biological organism several proteins are involved, which are specific to each other have to work together. For the interaction of the proteins one Enzyme complex is the spatial proximity of the factors involved and the Maintaining the structure is essential. The organization of the spatial Structure requires specialized areas of the factors involved Establishing contact and cohesion of the factors involved. A correct and efficient implementation of a process like replication or Transcription only occurs when the proteins are in the correct spatial orientation to each other.  

So konnte durch Untersuchungen an E. coli festgestellt werden, daß es drei verschiedene DNA-Polymerasen gibt, die in unterschiedlichen Phasen der Replikation aktiv sind. Diese müssen mit anderen Proteinen räumlich und funktionell zusammenwirken, um die DNA replizieren zu können. Bevor die eigentliche Replikation startet, wird der DNA-Strang in den jeweils einzelsträngigen "leading" and "lagging"-Strang entwunden. DNA-bindende Proteine stabilisieren diese Einzelstränge. Primasen erzeugen im "lagging"-Strang kurze RNA-Primer. Die eigentliche Replikation wird von der Polymerase III durchgeführt. Diese ist auch an der Fehlerkorrektur beteiligt. Die Polymerase I füllt die Lücken zwischen den Okazakifragmenten, die während der "lagging"-Strangsynthese entstehen.Studies on E. coli showed that there were three Different DNA polymerases exist in different phases of the Replication are active. These need to be spatial and functional with other proteins work together to replicate the DNA. Before the real one Replication starts, the DNA strand is in the respective single-stranded "leading" and "lagging" strand. DNA-binding proteins stabilize them Single strands. Primases generate short RNA primers in the "lagging" strand. The actual replication is carried out by polymerase III. This is also on involved in error correction. Polymerase I fills the gaps between the Okazaki fragments formed during "lagging" strand synthesis.

Die Polymerase III besteht aus einem Komplex von mindestens sieben verschiedenen Polypeptiden, die zusammen das Holoenzym bilden. Das Polypeptid α enthält die 5′ → 3′-Exonukleaseaktivität und die eigentliche Polymerasefunktion.Polymerase III consists of a complex of at least seven different polypeptides that together form the holoenzyme. The polypeptide α contains the 5 ′ → 3′-exonuclease activity and the actual polymerase function.

Das Polypeptid ε wirkt als 3′ → 5′ Exonuklease. Eines der Polypeptide bindet ATP. Andere Polypeptide binden Nukleotide, lagern eine korrespondierende Base an und knüpfen die Nukleotide zusammen. Der Gesamtkomplex erfordert ein präzises Zusammenwirken der verschiedenen Teile. Die intakten Kontaktstellen bilden eine notwendige Voraussetzung zur ausgerichteten Anordnung der funktionellen Domänen. Die gezielte Modifizierung der Kontaktdomänen wird zu einer Veränderung im Wirken der funktionellen Teile führen. Im extremen Fall kann die Replikation verhindert werden, wenn die räumliche Ausbildung des Polymerasekomplexes blockiert ist.The polypeptide ε acts as a 3 ′ → 5 ′ exonuclease. One of the polypeptides binds ATP. Other polypeptides bind nucleotides, attach a corresponding base and tie the nucleotides together. The overall complex requires a precise one Interaction of the different parts. The intact contact points form one necessary prerequisite for the aligned arrangement of the functional Domains. The targeted modification of the contact domains becomes one Change the way functional parts work. In extreme cases, the Replication can be prevented if the spatial training of the Polymerase complex is blocked.

Eine einfache Klassifizierung von RNA-Viren ergibt sich aus der Genomorganisation und Replikationsstrategie. (+)-Strang-RNA und (-)-Strang-RNA bilden zwei unterscheidbare Klassen, die sich von Doppelstrang-RNA-Viren und Retroviren als vierter Gruppe absetzen lassen. Die virale Taxonomie gliedert die Gruppen weiter nach Genomstruktur, Morphologie, Wirtsbereich und Infektionsmodus. A simple classification of RNA viruses results from the genome organization and replication strategy. (+) - strand RNA and (-) - strand RNA form two distinguishable classes that differ from double-stranded RNA viruses and retroviruses fourth group drop off. The viral taxonomy further divided the groups by genome structure, morphology, host range and mode of infection.  

Retroviren findet man fast ausschließlich in tierischen Systemen. Eine Besonderheit zeigt die Organisation des pflanzenpathogenen CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) als sogenanntes Pararetrovirus. In diesem Virus kann eine reverse Transkriptase nachgewiesen werden, wobei CaMV ein DNA-Genom besitzt. Die reverse Transkriptase ist ein typisches Enzym der Retroviren. Im CaMV-Replikationszyklus wandelt das Enzym ein RNA-Transkript wieder in DNA um. Möglicherweise besteht eine verwandtschaftliche Beziehung von CaMV zu den Retroviren.Retroviruses are found almost exclusively in animal systems. A special feature shows the organization of the plant pathogenic CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) as a so-called pararetrovirus. A reverse transcriptase can be found in this virus are detected, with CaMV having a DNA genome. The reverse Transcriptase is a typical enzyme of the retroviruses. In the CaMV replication cycle the enzyme converts an RNA transcript back into DNA. Possibly exists a relationship between CaMV and the retroviruses.

Sequenzvergleiche der RNA-abhängigen RNA-Polymerase ergeben eine große Ähnlichkeit zwischen (+)-Strang und Doppelstrangviren, wohingegen (-)-Strangviren geringere Homologie zu diesen Gruppen zeigen. Die Replikation des Genoms wird in allen Fällen von einem Enzym komplex durchgeführt, der viruskodierte und wirtskodierte Faktoren enthält. Die richtige Interaktion der Komponenten untereinander und mit dem Genomsubstrat ist ausschlaggebend für eine korrekte Durchführung des Prozesses. Retroviren starten die Replikation mit dem Umschreiben der RNA-Sequenz in eine komplementäre DNA-Sequenz durch die reverse Transkriptase. Das DNA-Molekül wird in der Regel nach dem rolling-circle-Mo­ dell vervielfältigt.Sequence comparisons of the RNA-dependent RNA polymerase reveal a large one Similarity between (+) - strand and double-stranded viruses, whereas (-) - stranded viruses show less homology to these groups. Replication of the genome will in all cases carried out by an enzyme complex, the virus-encoded and contains host-encoded factors. The correct interaction of the components with each other and with the genome substrate is crucial for a correct Execution of the process. Retroviruses start replication with the Rewrite the RNA sequence into a complementary DNA sequence reverse transcriptase. The DNA molecule is usually after the rolling circle Mo. duplicated by dell.

Im Falle der (+)-Strangviren wird zuerst aus einem (+)-Strang der komplementäre (-)-Strang gebildet, wobei der entstehende RNA-Doppelstrang das replikative Intermediat darstellt. Der (-)-Strang des replikativen Intermediats dient als Template zur Produktion des (+)-Stranges. Dieser wird in der späten Phase der Infektion zum fertigen Viruspartikel verpackt.In the case of (+) strand viruses, a (+) strand first becomes the complementary one (-) - strand formed, the resulting RNA double strand the replicative Intermediate represents. The (-) strand of the replicative intermediate serves as a template for the production of the (+) strand. This becomes late in the infection packed into the finished virus particle.

Bei (-)-Strang-RNA-Viren verläuft der Vorgang analog. Doppelsträngige RNA-Viren sollten beide Stränge in annähernd gleichen Mengen produzieren. Die Replikation der Stränge erfolgt auch bei dieser Klasse durch Umschreiben eines RNA-Stranges in das komplementäre RNA-Molekül. Die Replikation der pflanzlichen RNA-Viren wird von sogenannten RNA-abhängigen RNA-Polymerasen durchgeführt. Diese Enzymkomplexe sind membrangebunden und lassen sich durch Zentrifugation mit 10000 xg bis 100000 xg anreichern. The process is analogous for (-) - strand RNA viruses. Double-stranded RNA viruses should produce both strands in approximately equal quantities. The replication in this class, the strands are also made by rewriting an RNA strand into the complementary RNA molecule. Replication of plant RNA viruses is carried out by so-called RNA-dependent RNA polymerases. These Enzyme complexes are membrane-bound and can be centrifuged Enrich 10,000 xg to 100,000 xg.  

An den Komplexen sind viruskodierte Faktoren beteiligt, die eine Kernpolymerase bilden. Diese arbeiten mit Wirtsfaktoren zusammen und wird vermutlich durch diese je nach Anforderung verschieden modifiziert. Die Blockierung der Interaktion der beteiligten Faktoren sollte zu einem Replikationsstop des Virus und als Resultat für die Pflanze zur Resistenz führen. Die RNA-Replikationskomplexe verschiedener Virusspezies wurden isoliert und charakterisiert.Virus-encoded factors, a core polymerase, are involved in the complexes form. These work together with host factors and will probably be through them modified differently depending on requirements. Blocking the interaction of the Factors involved should stop replication of the virus and as a result for lead the plant to resistance. The RNA replication complexes of various Virus species have been isolated and characterized.

So gibt es Präparationen von Brome Mosaic virus (Hardy et al., 1979; Quadt et al., 1988), Cowpea Mosaic virus (Dorssers et al., 1982), Tobacco Mosaic Virus (White et al., 1977), Alfalfa Mosaic Virus (De Graff et al., 1993), Turnip Yellow Mosaic Virus (Garnier et al., 1980), Enation Mosaic Virus (Powell et al., 1977) und Cucumber Mosaic Virus (Hayes et al., 1990), die näher charakterisiert wurden.There are preparations of Brome Mosaic virus (Hardy et al., 1979; Quadt et al., 1988), Cowpea Mosaic virus (Dorssers et al., 1982), Tobacco Mosaic Virus (White et al., 1977), Alfalfa Mosaic Virus (De Graff et al., 1993), Turnip Yellow Mosaic Virus (Garnier et al., 1980), Enation Mosaic Virus (Powell et al., 1977) and Cucumber Mosaic Virus (Hayes et al., 1990), which were characterized in more detail.

Für den viruskodierten Teil des Replikasekomplexes von Brome Mosaic Virus konnten bestimmte Domänen den kodierenden Sequenzen zugeordnet werden. Das Virus benötigt zur Replikation zwei viruskodierte Proteine. Das Protein 1a mit einer putativen Helicase mit capping-Funktion kodiert, einen Komplex. Die Bindedomäne des Proteins 1a konnte dem Carboxy-Ende zugeordnet werden. Das Protein 2a bindet das Protein 1a innerhalb eines 115 Aminosäuren langen Abschnitts vor der Polymerase-Domäne (9). Somit kann das Protein 2a deutlich in zwei funktionell unterschiedliche Bereiche gegliedert werden.For the virus-encoded portion of the Brome Mosaic Virus replica complex certain domains could be assigned to the coding sequences. The virus requires two virus-encoded proteins for replication. The protein 1a with a putative helicase with capping function encodes a complex. The Binding domain of protein 1a could be assigned to the carboxy end. The Protein 2a binds protein 1a within a 115 amino acid long Section before the polymerase domain (9). Protein 2a can thus clearly in two functionally different areas can be divided.

In einigen Fällen wurde beschrieben, daß die Expression einer modifizierten RNA, die als RNA oder Protein an der Replikation teilnimmt, zur Virusresistenz in transgenen Pflanzen führt. Die Expression einer RNA2 mit einer genau beschriebenen Deletion führte zu einer Hemmung der Vermehrung von CMV (Anderson et al., 1992; Carr et al., 1993). Ebenso konnten TMV-resistente Pflanzen erzeugt werden, indem eine Transformation mit einem 50 kDa Gen, das im Leseraster des Replikaseproteins liegt, durchgeführt wurde (Golemboshi et al., 1990). Eine analoge Konstruktion wurde auch für das Pea Early Browning Virus beschrieben (MacFarlane and Davies, 1992). In some cases it has been described that the expression of a modified RNA, which participates in replication as RNA or protein, for virus resistance in transgenic plants. The expression of an RNA2 with an exact Deletion described led to an inhibition of the multiplication of CMV (Anderson et al., 1992; Carr et al., 1993). Likewise, TMV-resistant plants generated by a transformation with a 50 kDa gene, which is in the Reading frame of the replicase protein is carried out (Golemboshi et al., 1990). An analogous construction was also used for the Pea Early Browning Virus (MacFarlane and Davies, 1992).  

Tabakpflanzen, transformiert mit dem vollständig oder teilweise vorhandenen Gen des 165 Kda Protein von PVX, zeigten in einigen Fällen Resistenz gegen PVX und PVY (Brann and Hemenway, 1992). Der Mechanismus dieser Resistenzen ist noch unverstanden. Möglicherweise spielen unterschiedliche Mechanismen hierbei eine Rolle. Nachteilig an dieser Form der Resistenz ist deren Abhängigkeit von der Stabilität der modifizierten RNA innerhalb der Zelle.Tobacco plants transformed with the fully or partially present gene of the 165 Kda protein from PVX, showed resistance to PVX and in some cases PVY (Brann and Hemenway, 1992). The mechanism of this resistance is still misunderstood. Different mechanisms may play a role here Role. A disadvantage of this form of resistance is its dependence on the Stability of the modified RNA within the cell.

2. Gegenstand der Erfindung2. Subject of the invention

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung der Virusvermehrung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß gezielt die für die Virusreplikation notwendigen Interaktionen durch die Expression von chromosomal kodierten dominant negativen Mutationen gestört wird.The invention relates to a method for inhibiting virus multiplication, which is characterized in that targeted for virus replication necessary interactions through the expression of chromosomally encoded dominant negative mutations.

Unter dem Begriff dominant negativen Mutationen sind solche Gene zu verstehen, die für ein Protein, ein Peptid, eine Nukleinsäure, ein Oligonukleotid oder ein Kohlenhydrat kodieren, das dem funktionellen Molekül so stark ähnelt, daß es dessen Rolle im Stoffwechsel, insbesondere der Replikation, zwar wahrnehmen kann, aber dessen Funktion nicht ausführen kann. Es bindet im Komplex, kann aber seine Aufgabe nicht erfüllen und führt somit zur Blockade der Reaktion. In diesem Zusammenhang können auch die Begriffe Inhibitor oder Platzhalter verwendet werden.The term dominant negative mutations means such genes those for a protein, a peptide, a nucleic acid, an oligonucleotide or a Coding carbohydrates that resemble the functional molecule so strongly that it perform its role in metabolism, especially replication can, but cannot perform its function. It binds in the complex, can but does not fulfill its task and thus leads to a blockage of the reaction. In the terms inhibitor or placeholder can also be used in this context be used.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung von virusresistenten Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß in diese Organismen eine für dominant negative Mutationen kodierende DNA stabil integriert wird. Die Expression dieser Gene verursacht, daß die für die Virusreplikation notwendigen Interaktionen gezielt gestört werden. Gegenstand der Erfindung sind auch die nach diesem Verfahren hergestellten Organismen. Das Verfahren wird vorzugsweise zur Herstellung von resistenten Pflanzen eingesetzt. The invention also relates to processes for the production of virus-resistant Organisms, characterized in that in these organisms one is dominant DNA encoding negative mutations is stably integrated. The expression of this Genes causes the interactions necessary for virus replication to be targeted be disturbed. The invention also relates to those using this method manufactured organisms. The method is preferably used to manufacture resistant plants.  

Für die Einführung der DNA in pflanzliche Wirtszellen stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wie z. B. die Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder rhizogenes als Transformationsmittel, die Protoplastentransformation, die Injektion oder biolistische Verfahren.A large number of are available for the introduction of DNA into plant host cells Techniques available, such as B. using T-DNA transformation of Agrobacterium tumefaciens or rhizogenes as transformation agents which Protoplast transformation, injection or biolistic procedures.

Je nach Verfahren müssen DNA-Stränge verwendet werden, die zusätzliche für die Integration notwendige Sequenzen enthalten, wie z. B. die rechte Begrenzung der Ti- oder Ri-Plasmid-DNA.Depending on the method, DNA strands must be used, which are additional for the Integration necessary sequences contain such. B. the right limit of Ti or Ri plasmid DNA.

Zur Selektion der Transformanten sollte das zur Transformation eingesetzte Konstrukt außerdem ein Markergen enthalten.To select the transformants, the one used for the transformation should be used Construct also contain a marker gene.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Pflanzenzellen können prinzipiell aus jeder beliebigen Pflanzenspezies stammen. Prinzipiell können sowohl Angio- als auch Gymnospermae in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Vorteilhaft werden Nutzpflanzen, wie z. B. Tabak, Zuckerrübe, Mais, Soja und Raps, behandelt.The plant cells used in the process according to the invention can principally come from any plant species. In principle, both Angio as well as Gymnospermae used in the inventive method will. Crops such as B. tobacco, sugar beet, corn, soy and rapeseed.

Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren, die durch Unterbrechung des funktionellen Zusammenhangs der Replikationskomplexe zur Virusresistenz führt.The invention particularly relates to methods which are carried out by interrupting the functional relationship of the replication complexes leads to virus resistance.

Dazu muß z. B. eine Bindedomäne eines Komplexproteins mit Faktoren des Gesamtkomplexes in eine Wechselwirkung treten, so daß ein nicht funktioneller Replikasekomplex gebildet wird. Die Überexpression dieses Systems in Zellen führt in der Folge zum Erliegen der Replikation, da die Konzentration nicht funktionierender Komplexe überwiegt. Wird dafür Sorge getragen, daß diese fehlerhaften Replikationsstrukturen nur in Zellen auftreten können, die ausgeschaltet werden sollen, dann verhalten sich gewöhnliche Zellen völlig unbeeinträchtigt.For this, z. B. a binding domain of a complex protein with factors of Entire complex interact so that a non-functional Replica complex is formed. The overexpression of this system results in cells consequently, replication ceases because the concentration does not functioning complexes predominate. Care is taken that this faulty replication structures can only occur in cells that are turned off ordinary cells behave completely unaffected.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Verfahren zur Hemmung der Vermehrung von mindestens einem Virus, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:The invention particularly relates to methods for inhibiting the Multiplication of at least one virus selected from the following group:

(+) RNA-Viren (wie z. B. CMV, TMV, PVX, PVY)
(-)RNA-Viren
antisense RNA-Viren (wie z. B. TSWV)
DNA-Viren (wie z. B. CaMV) und
Retroviren.(+) RNA viruses (such as CMV, TMV, PVX, PVY)
(-) RNA viruses
antisense RNA viruses (such as TSWV)
DNA viruses (such as CaMV) and
Retroviruses.

Von Interesse sind generell Verfahren, in denen die zur Identische Vermehrung von Nukleinsäuren benötigten Protein/Protein- oder Protein/Nukleinsäure- oder Protein/Cofaktor-Komplexe durch Peptide, Proteine, Nukleotide, Oligonukleotide (DNA, RNA), Zucker blockiert oder behindert werden.Of general interest are methods in which the identical propagation of Nucleic acids require protein / protein or protein / nucleic acid or Protein / cofactor complexes by peptides, proteins, nucleotides, oligonucleotides (DNA, RNA), sugar blocked or hindered.

Von besonderem Interesse sind Verfahren, in denen die Komplexe durch Proteine, Peptide oder Zucker blockiert oder behindert werden.Of particular interest are processes in which the complexes are formed by proteins, Peptides or sugar can be blocked or hindered.

Gegenstand der Erfindung sind auch Testsysteme zur Auffindung, Charakterisierung oder Untersuchung von Verbindungen, die mit der beschriebenen Komplexen direkt interagieren oder an den beschriebenen Interaktionen teilnehmen, wie z. B. Testsysteme, Assays und Kits für Diagnostik und Screening.The invention also relates to test systems for detection, Characterization or investigation of connections with the described complexes interact directly or at the described Participate in interactions such as B. Test systems, assays and kits for diagnostics and Screening.

Die Absättigung einer Bindedomäne eines beteiligten Faktors durch ein Molekül, welches die für die Gesamtfunktion nötige Kette von weiteren Binde- bzw. Funktionsdomänen unterbricht, sollte einen starken Einfluß auf die Replikation haben. Es werden dadurch vor allem unvollständige Proteinkomplexe gebildet. Vorzugsweise wird ein Peptid verwendet, das lediglich aus einer isolierten Bindedomäne besteht und so einen fehlerhaften Gesamtkomplex produziert. Das Peptid muß in geeigneter Weise in der Zelle exprimiert werden, um den gewünschten Effekt zu erreichen, d. h. in ausreichenden Mengen exprimiert werden.The saturation of a binding domain of a factor involved by a molecule, which the chain of further binding or Interrupting functional domains should have a strong impact on replication to have. In particular, incomplete protein complexes are formed as a result. Preferably, a peptide is used that consists only of an isolated Binding domain exists and thus produces a faulty overall complex. The Peptide must be appropriately expressed in the cell in order for the achieve the desired effect, d. H. be expressed in sufficient quantities.

Im Falle einer transgenen Pflanze könnte das ein konstitutiver Promotor sein. Eine induzierte Induktion würde den Effekt erst dann entstehen lassen, wenn definierte Induktionssignale vorhanden wären. In the case of a transgenic plant, this could be a constitutive promoter. A induced induction would only let the effect arise if defined Induction signals would be present.  

Außer einem Peptid könnten auch andere Moleküle verwendet werden. Bedingung ist jedesmal, daß eine Affinität zu einer Bindedomäne eines Proteins besteht, die Wechselwirkungen zu Proteinen oder DNA bzw. RNA herstellt.In addition to a peptide, other molecules could be used. condition is each time that there is an affinity for a binding domain of a protein, the Interactions with proteins or DNA or RNA.

Die erzeugten Effekte würden unterschiedlich ausfallen, je nach Charakter des beteiligten Faktors. Die Blockierung der Replikationsstruktur durch Inhibierung der Kontaktstellen eines core-Enzyms des Replikationskomplexes würde die Replikation der Zelle ausschalten und die Zelle abtöten. Dies wäre denkbar zur Bekämpfung von Virusinfektionen. Die Abtötung virusinfizierter Zellen würde die systematische Ausbreitung unterbinden.The effects produced would vary depending on the character of the factor involved. Blocking the replication structure by inhibiting the Replication complex would contact a core enzyme of the replication complex turn off the cell and kill the cell. This would be conceivable to combat of viral infections. Killing virus-infected cells would be the most systematic Stop spreading.

Die Vermehrung des Virusgenoms ist abhängig von einer intakten Replikation und Transkription. Die beteiligten Faktoren werden teilweise vom Virus selbst bereitgestellt. Der Organismus selbst beteiligt sich zu einem maßgeblichen Teil an den Prozessen, die zur Virusvermehrung führen. Transkription- und Replikationskomplexe bestehen sehr häufig aus Wirts- und Virusfaktoren gleichzeitig. Eine Störung dieser Interaktion der Proteine für die grundlegenden Überlebensprozesse des Virus sollte die Virusvermehrung stark herabsetzen. Diese Interaktion kann z. B. durch gezielte Expression einer Bindedomäne für ein funktionelles Enzym des Virus gestört werden. Eine solche Domäne kann bei Proteinen, die eine starke Funktionsseparierung aufweisen, wie dies bei dem Protein 2a der Fall ist, zur Inaktivierung des gesamten Replikationskomplexes führen. Dieses Proteinfragment, das die proteinbindende Domäne repräsentiert, kann in Pflanzen konstitutiv exprimiert werden, wenn sichergestellt ist, daß keine Wechselwirkung mit Pflanzenproteinen erfolgt. Ein in der frühen Infektionsphase vom Virus mit niedriger Konzentration synthetisierter Faktor kann dadurch effektiv abgefangen werden.The propagation of the virus genome depends on intact replication and Transcription. The factors involved are partly caused by the virus itself provided. The organism itself participates to a significant extent the processes that lead to virus replication. Transcription and Replication complexes very often consist of host and virus factors at the same time. Interfering with this interaction of proteins for basic Virus survival processes should greatly reduce virus replication. These Interaction can e.g. B. by targeted expression of a binding domain for a functional enzyme of the virus can be disrupted. Such a domain can Proteins that have a strong functional separation, as is the case with the Protein 2a is the case for inactivating the entire replication complex to lead. This protein fragment that represents the protein binding domain can be constitutively expressed in plants if it is ensured that none Interaction with plant proteins takes place. One in the early infection phase Factor synthesized by the low concentration virus can thereby be effective be intercepted.

Die Virusvermehrung wird so zu einem Zeitpunkt angehalten, zu dem noch keine Schädigung der Pflanze erfolgt ist. The virus replication is stopped at a time when none Damage to the plant has occurred.  

Das Genom von CMV besteht aus drei RNA-Molekülen (Rizzo and Palukaitis, 1992; Rizzo and Palukaitis, 1992; Owen et al., 1990). Die RNA1 im Falle des Stammes Fny mit einer Länge von 3357 Nukleotiden kodiert für ein putatives Protein (1a) von 993 Aminosäuren. Die RNA2 besteht aus 3050 Basen und enthält den open reading frame für ein Protein (2a) von 857 Aminosäuren. Die RNA3 besteht aus 2216 Nukleodiden. Diese RNA hat zwei open reading frames. Das Protein 3a wird vom ersten Leserahmen kodiert. Es spielt für den Transport der Viruspartikel in der Pflanze eine Rolle. Das Protein 4a bildet die Hülle der Viruspartikel.The CMV genome consists of three RNA molecules (Rizzo and Palukaitis, 1992; Rizzo and Palukaitis, 1992; Owen et al., 1990). The RNA1 in the case of the strain Fny with a length of 3357 nucleotides encodes a putative protein (1a) from 993 amino acids. The RNA2 consists of 3050 bases and contains the open reading frame for a protein (2a) of 857 amino acids. The RNA3 consists of 2216 Nucleodides. This RNA has two open reading frames. Protein 3a is from encoded the first reading frame. It plays for the transport of the virus particles in the Plant a roll. The protein 4a forms the envelope of the virus particles.

Die Proteine 1a und 2a spielen in CMV eine vergleichbare Rolle wie die analogen Proteine in BMV. Sie bilden zusammen mit vermutlich noch weiteren Faktoren den Replikasenkomplex. Eine wirksame Hemmung der Replikation ist möglich, wenn die Bildung des Replikasekomplexes gestört wird oder sich ein unvollständiger nicht funktionsfähiger Komplex ausbildet. Mit einem Teil des Replikationsproteins 2a, der nur die Bindedomäne, aber nicht mehr die Polymerasedomäne enthält, kann das Protein 1a gebunden werden, ohne daß die Replikation ausgeführt werden kann. Eine Überexpression dieses Peptids sollte zur Bildung nicht funktionierender Replikasekomplexe führen, so daß die Replikation zum Erliegen kommt. Derselbe Zweck kann durch ein Molekül erreicht werden, das eine so hohe Affinität zur Bindestelle hat, daß eine bevorzugte Bindung gegenüber dem natürlichen Substrat erreicht wird.Proteins 1a and 2a play a comparable role in CMV as the analog ones Proteins in BMV. Together with presumably other factors, they form the Replica complex. An effective inhibition of replication is possible if the Formation of the replica complex is disturbed or an incomplete one does not training functional complex. With part of the replication protein 2a, the only the binding domain, but no longer contains the polymerase domain, can do this Protein 1a are bound without replication can be carried out. Overexpression of this peptide should not work to form Replica complexes lead, so that the replication comes to a standstill. The same Purpose can be achieved by a molecule that has such a high affinity for Binding site has a preferred bond over the natural substrate is achieved.

Eine Anwendung ist für alle Fälle denkbar, in der die Replikation eines Systems dadurch gestört wird, daß keine funktionellen Replikationskomplexe gebildet werden können, oder die Interaktion modifizierter Faktoren (Stimulierung, Inhibierung, Spezifität) behindert oder verhindert wird.An application is conceivable for all cases in which the replication of a system is disturbed by the fact that no functional replication complexes are formed can, or the interaction of modified factors (stimulation, inhibition, Specificity) is hindered or prevented.

Die Replikation der Retroviren könnte unterbunden werden, wenn die Strukturbildung für die reverse Transkriptase verhindert würde. Prinzipiell ist auf diese Weise jede Virusvermehrung zu blockieren.Replication of the retroviruses could be prevented if the Structure formation for the reverse transcriptase would be prevented. In principle is on this way to block any virus replication.

3. Beispiele: Virusresistenz gegen CMV in Tabak durch Überexpression einer Proteinbindedomäne von Protein 2a3. Examples: Virus resistance to CMV in tobacco through overexpression of a Protein binding domain of protein 2a

Im beschriebenen Beispiel wird ein Teil des Proteins 2a von CMV in Pflanzenzellen exprimiert, die durch Elektroporation mit CMV-RNA infiziert werden. Das Proteinfragment enthält eine potentielle Kontaktdomäne, die mit dem gleichfalls viruskodierten Protein 1a wechselwirkt. Dem Proteinfragment fehlt die funktionelle Replikasedomäne.In the example described, part of the protein 2a from CMV is in plant cells which are infected by electroporation with CMV-RNA. The Protein fragment contains a potential contact domain that also matches that virus-encoded protein 1a interacts. The protein fragment lacks the functional one Replica domain.

3.1 Klonierung der Bindedomäne3.1 Cloning of the binding domain

Ein Fragment aus der RNA2 des CMV-Stammes Fny wurde mit Hilfe der PCR-Tech­ nik amplifiziert. Das Fragment umfaßte die Basen 87 bis 1631 (14). Das ausgewählte Fragment in Analogie zur Organisation von BMV eine Kontaktstelle des Proteins 2a zum Protein 1a, während der Polymerase stellt nicht mehr vorhanden ist. Als PCR-Primer für das 5′-Ende des Gens wurde die SequenzA fragment from the RNA2 of the CMV strain Fny was cut using PCR-Tech amplified. The fragment spanned bases 87 to 1631 (14). The selected fragment in analogy to the organization of BMV a contact point of protein 2a to protein 1a, while the polymerase no longer provides is available. The sequence was used as a PCR primer for the 5 'end of the gene

5′-GGATCCMGGCTTCCCTGCCCCCGCATTCTCAC-3′5′-GGATCCMGGCTTCCCTGCCCCCGCATTCTCAC-3 ′

und für das 3′-Ende des Gens die Sequenzand for the 3'-end of the gene the sequence

5′-CTGCAGCTCGAGGCAGTGCTTGTTCTTGACATC-3′5′-CTGCAGCTCGAGGCAGTGCTTGTTCTTGACATC-3 ′

verwendet. Der erste Primer enthielt vor dem Gen homologen Sequenz sechs Basen für eine BamHl-Stelle und der zweite Primer an analoger Stelle eine Pstl-Stel­ le.used. The first primer contained sequence six homologous to the gene Bases for a BamHl site and the second primer at a similar site a Pstl site le.

10 ng Plamid-DNA wurden in einer Standardreaktion mit 4 Mm MgCl₂, je 50 pmol der Primer-Molek Ie und 2,5 u Taq Polymerase 50 Mm KCl/10 Mm Tris/Hcl, Ph 8,4/0,1 mg/ml Gelatine amplifiziert. Die Reaktion wurde der 30 Zyklein amplifiziert. Jeder Zyklus bestand aus 2 Minuten Reaktionen bei 94°C, 15 Minuten bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C. Die amplifizierten Produkte wurden nach der Reaktion gefällt und drei Stunden bei 37°C ligiert. Anschließend wurde BamHl und Pstl geschnitten. Der Ansatz wurde auf ein 1% Low Melt Agarose Gel aufgetragen. Ein 1550 Basenpaare langes Fragment wurde eluiert und in die BamHl/Pstl geschnittenen Vektoren PSK (-) (Stratagene) und pDH51 (Pietrzak et al., 1986) kloniert. 10 ng of plamide DNA were in a standard reaction with 4 mm MgCl₂, 50 pmol the primer molecule Ie and 2.5 u Taq polymerase 50 mm KCl / 10 mm Tris / Hcl, Ph 8.4 / 0.1 mg / ml gelatin amplified. The reaction was amplified by 30 cycles. Each cycle consisted of 2 minutes of reactions at 94 ° C, 15 minutes at 55 ° C and 2 minutes at 72 ° C. The amplified products were precipitated after the reaction and ligated for three hours at 37 ° C. BamHl and Pstl were then cut. The mixture was applied to a 1% low melt agarose gel. A 1550 Base pair long fragment was eluted and cut into the BamHl / Pstl Vectors PSK (-) (Stratagene) and pDH51 (Pietrzak et al., 1986) were cloned.  

Die Identität des Fragmentes konnte durch Mapping und Sequenzierung bestätigt werden. Der Vektro PSK (-) enthält je einen T3- und T7-Polymerasepromotor, die den Polyliner, in den das Fragment kloniert wurde, flankieren. Mit Hilfe dieser Promotoren und der käuflich zu erwerbenden T3- und T7-Polymerasen konnte das Insert in vitro transkribiert werden.The identity of the fragment was confirmed by mapping and sequencing will. The vector PSK (-) contains a T3 and T7 polymerase promoter, which flank the polyliner into which the fragment was cloned. With the help of this Promoters and the commercially available T3 and T7 polymerases could do that Insert can be transcribed in vitro.

Im Vektor PDH51 liegt vor dem einklonierten Fragment der sehr starke, in Pflanzen konstitutiv aktive 35-Promotor des CaMV. Mit Hilfe dieses Promotors konnte das Insert in Pflanzenzellen exprimiert werden. Dieser Promotor ist in allen Pflanzengeweben und in isolierten Protoplasten aktiv.In vector PDH51 the very strong one is in plants in front of the cloned-in fragment constitutively active 35 promoter of the CaMV. With the help of this promoter Insert can be expressed in plant cells. This promoter is in all Plant tissues and active in isolated protoplasts.

3.2 Test der Virusreplikation3.2 Virus replication test

In Protoplasten wurde getestet, ob das klonierte Fragment Virusresistenz erzeugt. In der Kontrolle wurden jeweils 10⁵ Protoplasten mit 2,5 µg gereinigter CMV Fny RNA elektroporiert. Proben wurden jeweils zum Zeitpunkt 0 und längstens nach 24 Stunden genommen. Nach Extraktion der RNA wurde ein Northern Blot durchgeführt.It was tested in protoplasts whether the cloned fragment produced virus resistance. In the control, 10⁵ protoplasts with 2.5 µg purified CMV Fny RNA electroporated. Samples were taken at time 0 and at the latest after 24 Taken hours. After extracting the RNA, a Northern blot carried out.

Virus-RNA wurde durch Hybridisierung mit einem Oligonukleotid nachgewiesen, das komplementär zum 3′-Ende der RNA war. In der Kontrolle konnte nach 24 Stunden Virusvermehrung nachgewiesen werden.Virus RNA was detected by hybridization with an oligonucleotide that was complementary to the 3'-end of the RNA. In control, after 24 hours Virus propagation can be detected.

Für den Test des klonierten Fragments wurden die Protoplasten zuerst mit dem BamHl/Pstl-Fragment der RNA2 in PDH51 elektroporiert und 15 Stunden inkubiert. Danach wurde eine Elektroporation mit 2,5 µg Virus-RNA durchgeführt. Nach weiteren 24 Stunden wurde RNA aufgearbeitet. Es zeigt sich, daß keine Virusvermehrung stattgefunden hatte.For the test of the cloned fragment, the protoplasts were first with the BamHl / Pstl fragment of RNA2 electroporated in PDH51 and incubated for 15 hours. Electroporation was then carried out using 2.5 μg virus RNA. To RNA was worked up for a further 24 hours. It turns out that none Virus propagation had taken place.

In der Kontrolle für diesen Versuch wurden die Protoplasten zuerst mit dem Vektor PDH51 elektroporiert, nach 15 Stunden mit 2,5 µg Virus-RNA. Die Aufarbeitung nach 24 Stunden ergab eine normale Virenvermehrung.In the control for this experiment, the protoplasts were first made with the vector PDH51 electroporated after 15 hours with 2.5 µg virus RNA. The workup after 24 hours there was normal virus replication.

4. Literatur4. Literature

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Claims (6)

1. Verfahren zur Inhibierung der Virusvermehrung, dadurch gekennzeichnet, daß gezielt die für die Virusreplikation notwendigen Interaktionen durch die Expression von chromosomal kodierten dominant negativen Mutationen gestört wird.1. A method for inhibiting virus replication, characterized in that the interactions necessary for virus replication are deliberately disrupted by the expression of chromosomally coded dominant negative mutations. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem die zur identische Vermehrung von Nukleinsäuren benötigten Komplexe durch mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, Nukleotiden, Oligonukleotiden und Kohlenhydraten blockiert oder behindert werden.2. The method according to claim 1, in which for the identical propagation of Nucleic acids require complexes through at least one compound selected from the group consisting of peptides, proteins, Nucleotides, oligonucleotides and carbohydrates blocked or hindered will. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Hemmung der Vermehrung von mindestens einem Virus ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (+) RNA-Viren,
(-) RNA-Viren,
antisense RNA-Viren,
DNA-Viren und
Retroviren.3. The method according to claim 1 for inhibiting the multiplication of at least one virus selected from the following group: (+) RNA viruses,
(-) RNA viruses,
antisense RNA viruses,
DNA viruses and
Retroviruses. 4. Verfahren zur Herstellung von virusresistenten Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß in diese Organismen eine DNA stabil integriert wird, deren Expression zu einem Produkt führt, das gezielt die für die Virusreplikation notwendigen Interaktionen stört4. Process for the production of virus-resistant organisms, thereby characterized in that a DNA is stably integrated into these organisms, whose expression leads to a product that is targeted for the Virus replication interferes with necessary interactions 5. Verfahren gemäß Anspruch 2 zur Herstellung von resistenten Pflanzen.5. The method according to claim 2 for the production of resistant plants. 6. Verfahren gemäß Anspruch 2 zur Herstellung von resistenten Nutzpflanzen.6. The method according to claim 2 for the production of resistant crop plants.