JPH08325160A - 塩基性繊維芽細胞増殖因子含有ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、架橋ゼラチンゲルにポリアニオンを
少量付加することにより、塩基性繊維芽細胞増殖因子の
放出を抑制し、より長期にわたる塩基性繊維芽細胞増殖
因子の徐放化を達成することができるポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲル製剤を提供する。 【構成】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルに、塩基性
繊維芽細胞増殖因子を含ませてなることを特徴とするポ
リアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖
因子（Basic Fibroblast Growth Factor、以下ｂＦＧＦ
と略称する）を含有することを特徴とする、ポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲル製剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ｂＦＧＦは１９７４年にGospodarowics
によって、ウシ脳下垂体から繊維芽細胞の増殖を強く刺
激するタンパク質として見いだされた（Nature; ２４
巻、１２４頁、１９７４年）。その後ｂＦＧＦをコード
する遺伝子がクローニングされ、遺伝子組み替え技術を
用いた大量生産が可能になり、ｂＦＧＦの研究は精力的
に行われるようになった。その結果、繊維芽細胞ばかり
でなく、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、角膜内皮細
胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの他種類の細胞に対する細
胞増殖を刺激することが明らかになってきた。

【０００３】しかし、ｂＦＧＦは、他のポリペプチドお
よびタンパク質と同様に生体内半減期が短く、水溶液と
して投与したのでは期待する効果が得られない。そのた
め、ｂＦＧＦを安定に保ち、ある一定の期間徐々に放出
することのできる徐放化製剤とすることが望ましい。そ
こで本発明者らは、ｂＦＧＦの徐放製剤化を目的とし
て、ｂＦＧＦの徐放化担体について鋭意検討を重ねた結
果、架橋ゼラチンゲルにｂＦＧＦを含浸させることによ
りなる製剤を発明した。このｂＦＧＦ架橋ゼラチンゲル
製剤は、マウス皮下血管新生やラット腓骨骨折治癒に対
して有効であった（国際公開番号ＷＯ９４／２７６３
０）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ｂＦＧＦは、中性水溶
液中では正に帯電している。この場合、同じ正電荷をも
つ等電点９付近のゼラチンとは電気的に相互作用をしな
い。また、等電点５付近のゼラチンとは電気的に相互作
用をするものの強いものとはいえない。本発明では、ｂ
ＦＧＦとマトリックスとの電気的な相互作用を強化する
ことにより、ｂＦＧＦのゲルマトリックスからの放出を
さらに長期化するために、架橋ゼラチンゲル調製時に少
量のポリアニオンを添加した。このようにして得られた
ゲルマトリックスが、ｂＦＧＦの徐放化に適しているこ
とを見いだし、本発明を完成させた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、塩
基性繊維芽細胞増殖因子を含浸させることを特徴とする
ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤を要旨とする。
本発明は、生体適合性が良く、刺激性の少ない架橋ゼラ
チンゲルにポリアニオンを付加することにより、より長
期の徐放作用をもつｂＦＧＦの徐放性製剤を提供するこ
とに特徴を有する。徐放速度は、ポリアニオンの種類、
ポリアニオンの添加濃度、ゲルの架橋度、架橋ゲルの含
水率、用いるゼラチンの性質（等電点、分子量等）によ
り変化させることが可能である。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤は、徐放性担体
であるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルに有効成分ｂ
ＦＧＦを含有してなるものである。本発明で用いる架橋
ゼラチンゲルの原料となるゼラチンには、特に制限はな
く、通常入手できるものでよい。このようなゼラチンと
しては、例えば、等電点４．９アルカリ処理ゼラチン
（新田ゼラチン社製）、等電点９．０酸処理ゼラチン
（新田ゼラチン社製）等が挙げられる。また、ゼラチン
は一種類のみでなく、溶解性、分子量、等電点および原
料等の物性の異なるものを混合して用いてもよい。

【０００７】本発明で用いることのできるポリアニオン
としては、生体高分子、合成高分子のいずれでもよく、
例えばポリカルボン酸としては、カルボキシメチルセル
ロース、ポリグルタミン酸などのアニオン性ポリアミノ
酸、カルボキシメチルスターチ、ヒアルロン酸、ポリア
クリル酸、ポリメタクリル酸等が、ポリ硫酸としては、
デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロ
イチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ポリビニ
ル硫酸カリウム等が、ポリリン酸としてＤＮＡ、ＲＮＡ
などの核酸、フォスマー等が好ましく、カルボキシメチ
ルセルロース、ポリグルタミン酸およびデキストラン硫
酸が特に好ましい。また、これらのポリアニオンは必要
に応じて種類の異なるものを混合して用いることもでき
る。

【０００８】本発明で用いることのできるゼラチンを架
橋するための架橋剤としては、生体に対して毒性のない
ものであればよいが、例えばグルタルアルデヒド、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モリホ
リノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスル
ホナート等の水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合
物、ホルマリン等が好ましく、グルタルアルデヒドおよ
び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩が特に好ましい。

【０００９】また、ゼラチンは、熱処理または紫外線照
射によっても架橋化できる。本発明で用いる徐放性担体
であるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルの形状は特に
制限はないが、例えば円柱状、角柱状、シート状、ディ
スク状、球状、粒子状、不定形などがある。円柱状、角
柱状、シート状、ディスク状のものについては、通常イ
ンプラントとして用いられることが多く、また、球状、
粒子状、不定形のものは注射投与も可能である。円柱
状、角柱状、シート状、ディスク状のポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲルは、ゼラチンとポリアニオンを混合し
た水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、架橋剤水溶液に
ゼラチンとポリアニオンを添加し、所望の形状の鋳型に
流し込み、架橋反応させて調整することができる。ま
た、成形したゼラチンゲルとポリアニオンをそのまま、
あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋
反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等
のアミノ基を持つ低分子物質に接触させるか、またはｐ
Ｈ２．５以下の水溶液を添加する。得られたポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲルは、水溶液、エタノール、２−
プロパノール（以下ＩＰＡという）、アセトン等により
洗浄し、製剤調製に供される。

【００１０】得られるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲ
ルの含水率は５０〜９９ｗ／ｗ％（以下、単に％で表示
する）である。ここでゲルの含水率とは、湿潤時のゲル
全重量に対するゲル中の水分重量の割合を示す。球状、
粒子状のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルは、例え
ば、三つ口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例
えば新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ
ｍｉｎｉ Ｄ．Ｃ．Ｓｔｉｒｒｅｒ等）とテフロン製攪
拌用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装
置に、オリブ油等の油を入れ、ここにゼラチンとポリア
ニオンの混合水溶液を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度
の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架
橋剤水溶液を添加するか、ゼラチンとポリアニオンの混
合水溶液をあらかじめオリブ油中にて前乳化（例えばｖ
ｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ Ａｄｖａｎｔｅｃ ＴＭＥ−
２１、ホモジナイザーｐｏｒｙｔｒｏｎ ＰＴ１０−３
５等）しておいたものをオリブ油中に滴下し、微粒子化
したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶
液を添加し、架橋反応させ、遠心分離によりポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲルを回収し、アセトン、酢酸エチ
ル等で洗浄し、さらにＩＰＡ、エタノール等に浸漬して
架橋反応を停止させることにより調製することができ
る。得られたポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子
は、ＩＰＡ、Ｔｗｅｅｎ ８０を含む蒸留水、蒸留水等
で順次洗浄し、製剤調製に供される。

【００１１】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子が
凝集する場合には、例えば、超音波照射（冷却下、１分
以内程度が好ましい）等を行ってもよい。なお、前乳化
することによって、粒子サイズ２０μｍ以下の微粒子状
のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルが得られる。得ら
れる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒径は、１〜１０００
μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふ
るい分けして使用する。また、得られるポリアニオン付
加架橋ゼラチンゲル粒子の含水率は５０〜９３％程度で
あり、適宜好ましい含水率のものを調製できる。球状、
粒子状のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルを調製する
別法として次のような方法もある。上記の方法と同様の
装置にオリブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速
度で攪拌し、ここにゼラチンとポリアニオンを混合した
水溶液を滴下し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これ
を冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠
心分離によりポリアニオンを付加したゼラチン粒子を回
収する。回収したポリアニオンを付加したゼラチン粒子
をさらにアセトン、酢酸エチル等、次いでＩＰＡ、エタ
ノール等で洗浄後乾燥させる。乾燥したポリアニオンを
付加したゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含
む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋
反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ
８０を含む１００ｍＭ グリシン水溶液または０．１
％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ ＨＣｌなどにて
洗浄して架橋反応を停止することによりポリアニオン付
加架橋ゼラチンゲル粒子を得ることができる。本別法で
得られるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子の平均
粒径および含水率は、上記の方法で得られるものと同様
である。架橋反応条件は適宜選択すべきであるが、反応
温度は０〜４０℃、反応時間は１〜４８時間が好まし
い。

【００１２】上記のようにして得られたポリアニオン付
加架橋ゼラチンゲルは、減圧乾燥または凍結乾燥させる
こともできる。凍結乾燥は、例えばポリアニオン付加架
橋ゼラチンゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以
上、または−８０℃で１時間以上凍結させた後に凍結乾
燥機で１〜３日間乾燥させることにより行う。ポリアニ
オン付加架橋ゼラチンゲルを調製する際のゼラチン、ポ
リアニオン、および架橋剤の濃度は所望の含水率により
適宜選択すべきであるが、ゼラチン濃度１〜１００ｗ／
ｖ％（以下、単に％で示す）、ポリアニオン濃度０．０
１〜２０ｗ／ｖ％（以下、単に％で示す）、架橋剤濃度
０．０１〜１００ｗ／ｖ％（以下、単に％で示す）（１
〜５４００ｍＭに相当）が好ましい。ポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲルは、原料であるゼラチンおよび架橋剤
の濃度を変化させることにより所望の含水率とすること
ができる。含水率を高くするには、ゼラチン濃度、架橋
剤濃度共に低くし、逆に含水率を低くするには、ゼラチ
ン濃度、架橋剤濃度共に高くすればよい。上記のように
して調製したポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルにｂＦ
ＧＦを含有させるためには、ｂＦＧＦ水溶液をポリアニ
オン付加架橋ゼラチンゲルに滴下して含浸させるか、ポ
リアニオン付加架橋ゼラチンゲルをｂＦＧＦ水溶液中に
懸濁して再膨潤させる。

【００１３】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルに含有
させることができるｂＦＧＦの量は、ポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲルの含水率等により異なるが、ポリアニ
オン付加架橋ゼラチンゲル１ｍｇ当たり０．０１〜２０
００μｇが可能である。なお、徐放期間、ｂＦＧＦの放
出量等は、製剤に含有されるｂＦＧＦの量、ポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲルの含水率、用いたゼラチンの等
電点等の物性、用いたポリアニオンの分子量およびアニ
オンの置換度、投与される部位などの種々の条件により
異なる。上記のようにして得られたｂＦＧＦ含有するポ
リアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤（以下、架橋ゼラ
チンゲル製剤という）は、凍結乾燥することもできる。
凍結乾燥する場合には、例えば、液体窒素中で３０分以
上以上または−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍
結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行う。

【００１４】本発明の架橋ゼラチンゲル製剤の有効成分
であるｂＦＧＦは、脳下垂体、脳、網膜、黄体、副腎、
腎、胎盤、前立腺、胸腺などの臓器より抽出されるも
の、組み換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学的手法で製造
されるもの、さらにこれらの修飾体であって繊維芽細胞
増殖因子として作用し得るものを含む。ｂＦＧＦの修飾
体としては、例えば上記の抽出により得られたまたは遺
伝子工学的手法で得られたｂＦＧＦのアミノ酸配列にお
いてアミノ酸が付加されたもの、アミノ酸の一部が他の
アミノ酸で置換されたもの、またはアミノ酸の一部が欠
損したものなどが挙げられる。本発明においては、これ
らのｂＦＧＦまたはその修飾体は単独で用いてもよい
し、これらの混合物として用いてもよい。

【００１５】上記ｂＦＧＦとしては、好ましくは、例え
ばをＷＯ８７／０１７２８（特表昭６３−５００８４３
号公報）、ＷＯ８９／０４８３２（特表平２−５０４４
６８号公報）、ＷＯ８６／０７５９５（特表昭６３−５
０００３６号公報）、ＷＯ８７／０３８８５（特表昭６
３−５０１９５３号公報）、欧州特許出願公開第２３７
９６６号明細書（特表昭６３−２２６２８７号公報）、
欧州特許出願公開第２８１８２２号明細書（特表平２−
１９３号公報）、欧州特許出願公開第３２６９０７号明
細書（特表平２−２０９８９４号公報）、欧州特許出願
公開第３９４９５１号明細書（特表平３−６１４９４号
公報）、欧州特許出願公開第４９３７３７号明細書（特
表平５−１２４９７５号公報）などに記載のものが挙げ
られる。これらのｂＦＧＦのうち、ＷＯ８７／０１７２
８に記載の遺伝子工学的手法製造した下記の配列番号１
の１５４個のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび
配列番号２の１５３個のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドが、安定性および材料として必要な量を常時供給す
ることが容易であるという点から特に好ましい。配列番
号１のアミノ酸配列を有するｂＦＧＦは、具体的には特
表昭６３−５００８４３号公報の実施例に記載されてい
るように、ヒトの腎臓のｍＲＮＡから調製されたλ_gt１
０ｃＤＮＡライブラリーからウシの１．４ｋｂ塩基性副
断片を用いてヒトのｂＦＧＦのｃＤＮＡクローンを調製
し、発現ベクターを構築して前記クローンを発現するこ
とによって得られる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例および試験例を挙げて本発明に
ついて詳細に説明するが、本発明は以下の実施例および
試験例に限定されるものではない。 （実施例１）１０００ｍｌ容丸底フラスコにオリブ油３
７５ｍｌを加え、固定した攪拌用モーター（新東科学社
製、スリーワンモーター）にテフロン製攪拌用プロペラ
を取り付け、フラスコと一緒に固定した。オリブ油を３
０℃、４２０ｒｐｍにて攪拌しながら等電点４．９アル
カリ処理ゼラチンとポリアニオンとしてカルボキシメチ
ルセルロース（以下ＣＭＣと略称する、分子量２４，０
００、カルボキシル基の置換度２．７４）の混合水溶液
（ゼラチン１０％、ＣＭＣ０、０．１、０．２５、およ
び０．５％）１０ｍｌを滴下し、Ｗ／Ｏ型エマルジョン
を調製した。１０分間攪拌後、フラスコを１０〜２０℃
に冷却し、３０分攪拌した。冷却後、ここに１００ｍｌ
のアセトンを加え１時間攪拌した後、遠心分離によりＣ
ＭＣを包含したゼラチン粒子を回収した。回収した粒子
をアセトンにて洗浄し、さらに２−プロパノール（以下
ＩＰＡと略称する）にて洗浄することにより未架橋のＣ
ＭＣを包含したゼラチン粒子を得た。この粒子を乾燥さ
せ、４℃で保存した。乾燥した未架橋ゼラチン粒子５０
０ｍｇを０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含むグルタルアル
デヒド（以下ＧＡという）水溶液（ＣＭＣ０および０．
１％はＧＡ０．０５％、５．０ｍＭに相当、ＣＭＣ０．
２５および０．５％はＧＡ０．１％、１０ｍＭに相当）
１００ｍｌに懸濁させ、４℃、１５時間ゆるやかに攪拌
することにより架橋反応を行った。反応終了後、架橋粒
子を遠心分離により回収し、０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０
を含む１００ｍＭグリシン水溶液にて３７℃、１時間洗
浄することにより架橋反応を停止した。反応停止後、架
橋粒子を順に０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０水溶液、ＩＰ
Ａ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０水溶液で洗浄し、蒸留水
で２回洗浄した後に凍結乾燥を行い、乾燥ＣＭＣ付加架
橋ゼラチンゲル粒子（平均粒径４０μｍ、含水率：ＣＭ
Ｃ０、０．１、０．２５、０．５％添加で、それぞれ９
０、８７、８７、９０％）を得た。得られたＣＭＣを付
加した架橋ゼラチンゲル粒子１０ｍｇに３．３ｍｇ ｂ
ＦＧＦ／１ｍｌ １／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）の
３０μｌを滴下し、４℃、一昼夜放置することによりｂ
ＦＧＦ水溶液を粒子内に含浸させ、ｂＦＧＦ含有ＣＭＣ
付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製した。得られたｂＦＧ
Ｆ含有ＣＭＣ付加架橋ゼラチンゲル製剤を凍結乾燥させ
ることにより、ｂＦＧＦ含有乾燥ＣＭＣ付加架橋ゼラチ
ンゲル製剤を調製した。

【００１７】（実施例２）ＣＭＣ添加濃度を０．５％に
固定し、架橋剤として１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＷＳＣ
と略す）水溶液（０．１％、５ｍＭに相当）を使用した
以外は、実施例１と同様の方法でＣＭＣ付加架橋ゼラチ
ンゲル粒子（平均粒径４０μｍ、含水率８１％）、ｂＦ
ＧＦ含有ＣＭＣ付加架橋ゼラチンゲル製剤、およびｂＦ
ＧＦ含有乾燥ＣＭＣ付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製し
た。

【００１８】（実施例３）ポリアニオンとしてポリグル
タミン酸（以下ＰＧＡという）０．５％を使用し、ＧＡ
濃度を０．０５％（５ｍＭに相当）に固定した以外は、
実施例１と同様の方法でＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル粒
子（平均粒径４０μｍ、含水率８７％）、ｂＦＧＦ含有
ＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル製剤、およびｂＦＧＦ含有
乾燥ＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製した。

【００１９】（実施例４）ポリアニオンとしてデキスト
ラン硫酸（以下ＤＳという）０．５％を使用し、ＧＡ濃
度を０．０５％（５ｍＭに相当）に固定した以外は、実
施例１と同様の方法でＤＳ付加架橋ゼラチンゲル粒子
（平均粒径４０μｍ、含水率８７％）、ｂＦＧＦ含有Ｄ
Ｓ付加架橋ゼラチンゲル製剤、およびｂＦＧＦ含有乾燥
ＤＳ付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製した。

【００２０】上記実施例１〜４で調製したｂＦＧＦ含有
ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤の処方および得
られた架橋ゼラチンゲルの含水率を表１として示す。表
１中、架橋剤ＧＡおよびＷＳＣはそれぞれグルタルアル
デヒドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩を表す。また、表中のゼ
ラチンおよび架橋剤の濃度％は、それぞれ「ｗ／ｖ％」
を表し、含水率の％は「ｗ／ｗ％」を表す。 表１

【表１】

【００２１】（試験例１）実施例１および実施例３にて
調製したｂＦＧＦ含有ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲ
ル製剤をマウス背部皮下に注射により投与した。投与か
ら３、７、および１４日目における投与部位周辺での血
管新生の程度をヘモグロビン量の変化を指標に評価し
た。なお、血管新生の評価は以下の様に行った。製剤投
与部位の皮膚の裏側ならびに背部筋側組織を、製剤投与
部位を中心に２ｃｍ四方をメスにて削り取った。これら
の組織を０．７５％の塩化アンモニウムを含有した１７
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に浸漬しヘモグ
ロビンを抽出した。ヘモグロビンはシアンメトヘモグロ
ビン法（和光純薬社製、ヘモグロビンテストワコー）に
て定量した。なお、マウスの匹数は１群５匹である。各
群のヘモグロビン量の経時変化を図１に示す。１００μ
ｇのｂＦＧＦを溶液状態で投与したり、ｂＦＧＦを含ま
ないポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子を投与して
も、ヘモグロビン量は変化しない。ポリアニオンを含ま
ないｂＦＧＦ含有ゼラチンゲル製剤を投与した場合に
は、ヘモグロビン量は、３日目をピークに上昇し、以降
減少していった。ＣＭＣを付加したｂＦＧＦ含有架橋ゼ
ラチンゲル製剤を投与した場合には、ヘモグロビン量
は、７日目をピークに上昇した。ＣＭＣの添加量の増加
に伴い、７日目のヘモグロビン量も増加した。ＣＭＣ含
有量の最も多いＣＭＣ０．５％付加粒子においては１４
日目においてもヘモグロビンの残存が認められた。ｂＦ
ＧＦ含有ＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル製剤の場合にも、
同夜のヘモグロビン量のパターンの変化が認められた。
これは、添加したポリアニオンとｂＦＧＦが静電的相互
作用をし、製剤からのｂＦＧＦの放出を抑制するため
に、組織での血管新生が遅延し、組織中のヘモグロビン
量のパターンの変化となって現れたものと考えられる。

【００２２】（試験例２）実施例４にて調製したｂＦＧ
Ｆ含有ＤＳ付加架橋ゼラチンゲル粒子製剤をマウス背部
皮下に注射により投与した。投与から３、７、および１
４日目における投与部位周辺での血管新生の程度をヘモ
グロビン量の変化を指標に評価した。血管新生の評価
は、試験例１と同様の方法にて行った。ヘモグロビンの
経時変化を図２に示す。ＤＳ付加粒子の場合にはヘモグ
ロビン量のピークは３日目であり、ポリアニオンを添加
しない粒子の場合と同様であった。しかしながら、ヘモ
グロビン量はその後もあまり減少せず、１４日目におい
ても相当量のヘモグロビンが認められた。これは、ＤＳ
を添加することによって、試験例１に示した場合と同様
のｂＦＧＦの放出抑制が起こり、血管新生パターンが遅
延したものと考えられる。

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、架橋ゼラチンゲルにポ
リアニオンを少量付加することにより、ｂＦＧＦの放出
を抑制し、より長期にわたるｂＦＧＦの徐放化を達成す
ることができた。本発明の製剤から徐放されたｂＦＧＦ
は生理活性を保持していた。さらに、添加するポリアニ
オンの種類や添加濃度を変えることにより、ｂＦＧＦの
活性発現の持続性を制御できた。

【００２４】

【配列表】

【００２５】配列番号：1 配列の長さ：154 配列の型：アミノ酸 起源 生物名：ホモ サピエンス（Homo sapiens） 配列 Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 20 25 30 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val 35 40 45 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val 85 90 95 Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150

【００２６】配列番号：2 配列の長さ：153 配列の型：アミノ酸 起源 生物名：ホモ サピエンス（Homo sapiens） 配列 Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys 20 25 30 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 35 40 45 Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala 50 55 60 Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr 65 70 75 80 Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 85 90 95 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr 100 105 110 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr 115 120 125 Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile 130 135 140 Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ポリアニオン（カルボキシメチルセル
ロース、ポリグルタミン酸）付加架橋ゼラチンゲル製剤
（ｂＦＧＦ１００μｇ）マウス皮下投与における周辺組
織のヘモグロビン量の経時的変化を示す図である。

【図２】図２は、デキストラン硫酸付加架橋ゼラチンゲ
ル製剤（ｂＦＧＦ１００μｇ）マウス皮下投与における
周辺組織のヘモグロビン量の経時的変化を示す図であ
る。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルに、
   塩基性繊維芽細胞増殖因子を含ませてなることを特徴と
   するポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤。
2. 【請求項２】塩基性繊維芽細胞増殖因子が、下記の配列
   番号１および／または２で示されるアミノ酸配列を有す
   るものである請求項１に記載のポリアニオン付加架橋ゼ
   ラチンゲル製剤。
3. 【請求項３】ポリアニオン付加架橋ゼラチンの架橋剤
   が、グルタルアルデヒドまたは水溶性カルボジイミドで
   ある請求項１に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲ
   ル製剤。
4. 【請求項４】水溶性カルボジイミドが、１−エチル−３
   −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
   塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
   ル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホナート
   からなる群より選ばれる請求項３に記載のポリアニオン
   付加架橋ゼラチンゲル製剤。
5. 【請求項５】ポリアニオン付加架橋ゼラチンの架橋剤が
   グルタルアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメ
   チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である請求
   項３に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤。
6. 【請求項６】付加するポリアニオンが、ポリカルボン
   酸、ポリ硫酸、ポリリン酸からなる群より選ばれる１つ
   または複数のポリアニオンである請求項１に記載のポリ
   アニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤。
7. 【請求項７】付加するポリアニオンが、カルボキシメチ
   ルセルロース、ポリグルタミン酸またはデキストラン硫
   酸である請求項６に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチ
   ンゲル製剤。
8. 【請求項８】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルが、ゼ
   ラチンの濃度１〜１００ｗ／ｖ％、架橋剤濃度０．０１
   〜１００ｗ／ｖ％およびポリアニオン濃度０．０１〜２
   ０ｗ／ｖ％からなる請求項１に記載のポリアニオン付加
   架橋ゼラチンゲル製剤。
9. 【請求項９】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルの含水
   率が５０〜９９％である請求項１に記載のポリアニオン
   付加架橋ゼラチンゲル製剤。
10. 【請求項１０】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルの形
    状が、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、
    粒子状、または不定形である請求項１に記載のポリアニ
    オン付加架橋ゼラチンゲル製剤。
11. 【請求項１１】塩基性繊維芽細胞増殖因子の水溶液をゲ
    ルに接触させ含浸させるか、または塩基性繊維芽細胞増
    殖因子の水溶液中にゲルを懸濁させることにより塩基性
    繊維芽細胞増殖因子をゲルに含有させることを特徴とす
    る請求項１に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル
    製剤。
12. 【請求項１２】請求項１に記載の塩基性繊維芽細胞増殖
    因子含有ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤を乾燥
    させたことを特徴とする乾燥ポリアニオン付加架橋ゼラ
    チンゲル製剤。