JPH08325160A - Polyanion-addition crosslinked gelatin preparation containing basophilic fibroblast growth factor - Google Patents
Polyanion-addition crosslinked gelatin preparation containing basophilic fibroblast growth factorInfo
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- JPH08325160A JPH08325160A JP7152671A JP15267195A JPH08325160A JP H08325160 A JPH08325160 A JP H08325160A JP 7152671 A JP7152671 A JP 7152671A JP 15267195 A JP15267195 A JP 15267195A JP H08325160 A JPH08325160 A JP H08325160A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖
因子（Basic Fibroblast Growth Factor、以下ｂＦＧＦ
と略称する）を含有することを特徴とする、ポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲル製剤に関するものである。The present invention relates to a basic fibroblast growth factor (hereinafter referred to as bFGF).
Abbreviated as "). Polyanion addition cross-linked gelatin gel preparation.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ｂＦＧＦは１９７４年にGospodarowics
によって、ウシ脳下垂体から繊維芽細胞の増殖を強く刺
激するタンパク質として見いだされた（Nature; ２４
巻、１２４頁、１９７４年）。その後ｂＦＧＦをコード
する遺伝子がクローニングされ、遺伝子組み替え技術を
用いた大量生産が可能になり、ｂＦＧＦの研究は精力的
に行われるようになった。その結果、繊維芽細胞ばかり
でなく、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、角膜内皮細
胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの他種類の細胞に対する細
胞増殖を刺激することが明らかになってきた。2. Description of the Related Art bFGF was introduced by Gospodarowics in 1974.
Was found as a protein that strongly stimulates the proliferation of fibroblasts from the bovine pituitary (Nature; 24).
Vol. 124, 1974). After that, the gene encoding bFGF was cloned, mass production using genetic recombination technology became possible, and the study of bFGF became vigorous. As a result, it has been revealed that it stimulates not only fibroblasts but also other types of cells such as vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, corneal endothelial cells, osteoblasts, and chondrocytes.
【０００３】しかし、ｂＦＧＦは、他のポリペプチドお
よびタンパク質と同様に生体内半減期が短く、水溶液と
して投与したのでは期待する効果が得られない。そのた
め、ｂＦＧＦを安定に保ち、ある一定の期間徐々に放出
することのできる徐放化製剤とすることが望ましい。そ
こで本発明者らは、ｂＦＧＦの徐放製剤化を目的とし
て、ｂＦＧＦの徐放化担体について鋭意検討を重ねた結
果、架橋ゼラチンゲルにｂＦＧＦを含浸させることによ
りなる製剤を発明した。このｂＦＧＦ架橋ゼラチンゲル
製剤は、マウス皮下血管新生やラット腓骨骨折治癒に対
して有効であった（国際公開番号ＷＯ９４／２７６３
０）。However, bFGF, like other polypeptides and proteins, has a short in vivo half-life, and the expected effect cannot be obtained when administered as an aqueous solution. Therefore, it is desirable to prepare a sustained-release preparation capable of keeping bFGF stable and gradually releasing it for a certain period of time. Therefore, the inventors of the present invention have made extensive studies on a sustained release carrier of bFGF for the purpose of preparing a sustained release formulation of bFGF, and as a result, invented a formulation obtained by impregnating a crosslinked gelatin gel with bFGF. This bFGF cross-linked gelatin gel preparation was effective for mouse subcutaneous angiogenesis and rat fibula fracture healing (International Publication No. WO94 / 2763).
0).
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】ｂＦＧＦは、中性水溶
液中では正に帯電している。この場合、同じ正電荷をも
つ等電点９付近のゼラチンとは電気的に相互作用をしな
い。また、等電点５付近のゼラチンとは電気的に相互作
用をするものの強いものとはいえない。本発明では、ｂ
ＦＧＦとマトリックスとの電気的な相互作用を強化する
ことにより、ｂＦＧＦのゲルマトリックスからの放出を
さらに長期化するために、架橋ゼラチンゲル調製時に少
量のポリアニオンを添加した。このようにして得られた
ゲルマトリックスが、ｂＦＧＦの徐放化に適しているこ
とを見いだし、本発明を完成させた。SUMMARY OF THE INVENTION bFGF is positively charged in a neutral aqueous solution. In this case, it does not electrically interact with gelatin near the isoelectric point 9 having the same positive charge. Moreover, although it interacts electrically with gelatin near the isoelectric point 5, it cannot be said to be strong. In the present invention, b
To further prolong the release of bFGF from the gel matrix by enhancing the electrical interaction between FGF and the matrix, a small amount of polyanion was added during the preparation of the crosslinked gelatin gel. The gel matrix thus obtained was found to be suitable for sustained release of bFGF, and the present invention was completed.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、塩
基性繊維芽細胞増殖因子を含浸させることを特徴とする
ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤を要旨とする。
本発明は、生体適合性が良く、刺激性の少ない架橋ゼラ
チンゲルにポリアニオンを付加することにより、より長
期の徐放作用をもつｂＦＧＦの徐放性製剤を提供するこ
とに特徴を有する。徐放速度は、ポリアニオンの種類、
ポリアニオンの添加濃度、ゲルの架橋度、架橋ゲルの含
水率、用いるゼラチンの性質（等電点、分子量等）によ
り変化させることが可能である。That is, the gist of the present invention is a polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation characterized by being impregnated with a basic fibroblast growth factor.
The present invention is characterized by providing a sustained-release preparation of bFGF having a longer-term sustained-release action by adding a polyanion to a crosslinked gelatin gel having good biocompatibility and low irritation. The sustained release rate depends on the type of polyanion,
It can be changed depending on the addition concentration of the polyanion, the degree of crosslinking of the gel, the water content of the crosslinked gel, the properties of the gelatin used (isoelectric point, molecular weight, etc.).
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤は、徐放性担体
であるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルに有効成分ｂ
ＦＧＦを含有してなるものである。本発明で用いる架橋
ゼラチンゲルの原料となるゼラチンには、特に制限はな
く、通常入手できるものでよい。このようなゼラチンと
しては、例えば、等電点４．９アルカリ処理ゼラチン
（新田ゼラチン社製）、等電点９．０酸処理ゼラチン
（新田ゼラチン社製）等が挙げられる。また、ゼラチン
は一種類のみでなく、溶解性、分子量、等電点および原
料等の物性の異なるものを混合して用いてもよい。The present invention will be described in detail below. The polyanion-added cross-linked gelatin gel preparation of the present invention is effective ingredient b in the poly-anion-added cross-linked gelatin gel which is a sustained release carrier.
It contains FGF. The gelatin used as a raw material for the crosslinked gelatin gel used in the present invention is not particularly limited and may be one that is usually available. Examples of such gelatin include isoelectric point 4.9 alkali-treated gelatin (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) and isoelectric point 9.0 acid-treated gelatin (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.). Further, the gelatin is not limited to one kind, and those having different physical properties such as solubility, molecular weight, isoelectric point and raw materials may be mixed and used.
【０００７】本発明で用いることのできるポリアニオン
としては、生体高分子、合成高分子のいずれでもよく、
例えばポリカルボン酸としては、カルボキシメチルセル
ロース、ポリグルタミン酸などのアニオン性ポリアミノ
酸、カルボキシメチルスターチ、ヒアルロン酸、ポリア
クリル酸、ポリメタクリル酸等が、ポリ硫酸としては、
デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロ
イチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ポリビニ
ル硫酸カリウム等が、ポリリン酸としてＤＮＡ、ＲＮＡ
などの核酸、フォスマー等が好ましく、カルボキシメチ
ルセルロース、ポリグルタミン酸およびデキストラン硫
酸が特に好ましい。また、これらのポリアニオンは必要
に応じて種類の異なるものを混合して用いることもでき
る。The polyanion that can be used in the present invention may be either a biopolymer or a synthetic polymer,
For example, as the polycarboxylic acid, carboxymethyl cellulose, anionic polyamino acids such as polyglutamic acid, carboxymethyl starch, hyaluronic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and the like, polysulfuric acid,
Dextran sulphate, heparin, heparan sulphate, chondroitin sulphate, keratan sulphate, dermatan sulphate, potassium polyvinyl sulphate, etc.
Nucleic acids such as, fosmers and the like are preferable, and carboxymethyl cellulose, polyglutamic acid and dextran sulfate are particularly preferable. Further, these polyanions may be used in a mixture of different kinds as necessary.
【０００８】本発明で用いることのできるゼラチンを架
橋するための架橋剤としては、生体に対して毒性のない
ものであればよいが、例えばグルタルアルデヒド、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モリホ
リノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスル
ホナート等の水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合
物、ホルマリン等が好ましく、グルタルアルデヒドおよ
び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩が特に好ましい。The cross-linking agent for cross-linking gelatin which can be used in the present invention may be any one which is not toxic to the living body, for example, glutaraldehyde, 1-
Water-soluble carbodiimides such as ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide-meth-p-toluenesulfonate, bisepoxy compounds, formalin and the like are preferable, Glutaraldehyde and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride are particularly preferred.
【０００９】また、ゼラチンは、熱処理または紫外線照
射によっても架橋化できる。本発明で用いる徐放性担体
であるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルの形状は特に
制限はないが、例えば円柱状、角柱状、シート状、ディ
スク状、球状、粒子状、不定形などがある。円柱状、角
柱状、シート状、ディスク状のものについては、通常イ
ンプラントとして用いられることが多く、また、球状、
粒子状、不定形のものは注射投与も可能である。円柱
状、角柱状、シート状、ディスク状のポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲルは、ゼラチンとポリアニオンを混合し
た水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、架橋剤水溶液に
ゼラチンとポリアニオンを添加し、所望の形状の鋳型に
流し込み、架橋反応させて調整することができる。ま
た、成形したゼラチンゲルとポリアニオンをそのまま、
あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋
反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等
のアミノ基を持つ低分子物質に接触させるか、またはｐ
Ｈ２．５以下の水溶液を添加する。得られたポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲルは、水溶液、エタノール、２−
プロパノール（以下ＩＰＡという）、アセトン等により
洗浄し、製剤調製に供される。Gelatin can also be crosslinked by heat treatment or UV irradiation. The shape of the polyanion-added cross-linked gelatin gel, which is the sustained-release carrier used in the present invention, is not particularly limited, and examples thereof include a cylindrical shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, a spherical shape, a particle shape, and an amorphous shape. Regarding cylindrical, prismatic, sheet-shaped, and disc-shaped ones, it is often used as an implant in general, and spherical,
Injectable administration is also possible for particulate and amorphous particles. Cylindrical, prismatic, sheet-shaped, and disk-shaped polyanion-added cross-linked gelatin gels can be prepared by adding an aqueous solution of a cross-linking agent to an aqueous solution of a mixture of gelatin and polyanion, or by adding gelatin and a polyanion to an aqueous solution of the cross-linking agent. It can be adjusted by pouring into a mold and crosslinking reaction. In addition, the molded gelatin gel and polyanion as they are,
Alternatively, the crosslinking agent aqueous solution may be added after drying. To stop the cross-linking reaction, contact with a low molecular weight substance having an amino group such as ethanolamine or glycine, or p
An aqueous solution of H2.5 or less is added. The obtained polyanion addition-crosslinked gelatin gel is an aqueous solution, ethanol, 2-
The product is washed with propanol (hereinafter referred to as IPA), acetone, etc., and then used for preparation of the preparation.
【００１０】得られるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲ
ルの含水率は５０〜９９ｗ／ｗ％（以下、単に％で表示
する）である。ここでゲルの含水率とは、湿潤時のゲル
全重量に対するゲル中の水分重量の割合を示す。球状、
粒子状のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルは、例え
ば、三つ口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例
えば新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ
ｍｉｎｉ Ｄ．Ｃ．Ｓｔｉｒｒｅｒ等）とテフロン製攪
拌用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装
置に、オリブ油等の油を入れ、ここにゼラチンとポリア
ニオンの混合水溶液を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度
の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架
橋剤水溶液を添加するか、ゼラチンとポリアニオンの混
合水溶液をあらかじめオリブ油中にて前乳化（例えばｖ
ｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ Ａｄｖａｎｔｅｃ ＴＭＥ−
２１、ホモジナイザーｐｏｒｙｔｒｏｎ ＰＴ１０−３
５等）しておいたものをオリブ油中に滴下し、微粒子化
したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶
液を添加し、架橋反応させ、遠心分離によりポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲルを回収し、アセトン、酢酸エチ
ル等で洗浄し、さらにＩＰＡ、エタノール等に浸漬して
架橋反応を停止させることにより調製することができ
る。得られたポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子
は、ＩＰＡ、Ｔｗｅｅｎ ８０を含む蒸留水、蒸留水等
で順次洗浄し、製剤調製に供される。The water content of the obtained polyanion addition-crosslinked gelatin gel is 50 to 99 w / w% (hereinafter, simply expressed as%). Here, the water content of the gel refers to the ratio of the weight of water in the gel to the total weight of the gel when wet. spherical,
The particulate polyanion addition cross-linked gelatin gel is, for example, a stirring motor fixed to a three-necked round bottom flask (eg, Shinto Kagaku KK, Three One Motor, EYELA).
mini D. C. (Stirrer, etc.) and a Teflon stirring propeller are attached, oil such as olive oil is put in an apparatus fixed together with the flask, and a mixed aqueous solution of gelatin and polyanion is added thereto and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm, A W / O type emulsion is prepared, and an aqueous solution of a crosslinking agent is added thereto, or a mixed aqueous solution of gelatin and polyanion is pre-emulsified in olive oil (for example, v
ortex mixer Advanced TME-
21, homogenizer polytron PT10-3
5 etc.) was added dropwise to olive oil to prepare a finely divided W / O type emulsion, to which an aqueous solution of a crosslinking agent was added, a crosslinking reaction was carried out, and a polyanion-added crosslinked gelatin gel was centrifuged. It can be prepared by recovering, washing with acetone, ethyl acetate or the like, and further immersing it in IPA, ethanol or the like to stop the crosslinking reaction. The obtained polyanion-added crosslinked gelatin gel particles are sequentially washed with distilled water containing IPA, Tween 80, distilled water and the like, and then used for preparation of a preparation.
【００１１】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子が
凝集する場合には、例えば、超音波照射（冷却下、１分
以内程度が好ましい）等を行ってもよい。なお、前乳化
することによって、粒子サイズ２０μｍ以下の微粒子状
のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルが得られる。得ら
れる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒径は、１〜１０００
μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふ
るい分けして使用する。また、得られるポリアニオン付
加架橋ゼラチンゲル粒子の含水率は５０〜９３％程度で
あり、適宜好ましい含水率のものを調製できる。球状、
粒子状のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルを調製する
別法として次のような方法もある。上記の方法と同様の
装置にオリブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速
度で攪拌し、ここにゼラチンとポリアニオンを混合した
水溶液を滴下し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これ
を冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠
心分離によりポリアニオンを付加したゼラチン粒子を回
収する。回収したポリアニオンを付加したゼラチン粒子
をさらにアセトン、酢酸エチル等、次いでＩＰＡ、エタ
ノール等で洗浄後乾燥させる。乾燥したポリアニオンを
付加したゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含
む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋
反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ
８０を含む１００ｍＭ グリシン水溶液または０．１
％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ ＨＣｌなどにて
洗浄して架橋反応を停止することによりポリアニオン付
加架橋ゼラチンゲル粒子を得ることができる。本別法で
得られるポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子の平均
粒径および含水率は、上記の方法で得られるものと同様
である。架橋反応条件は適宜選択すべきであるが、反応
温度は０〜４０℃、反応時間は１〜４８時間が好まし
い。When the polyanion-added crosslinked gelatin gel particles aggregate, for example, ultrasonic irradiation (under cooling, preferably within about 1 minute) may be carried out. By pre-emulsifying, a fine polyanion-added crosslinked gelatin gel having a particle size of 20 μm or less can be obtained. The average particle size of the obtained crosslinked gelatin gel particles is 1 to 1000.
The particles having a size of μm are appropriately sieved according to the purpose and used. The water content of the obtained polyanion-added cross-linked gelatin gel particles is about 50 to 93%, and a water content having a preferable water content can be appropriately prepared. spherical,
There is also the following method as another method for preparing a particulate polyanion-added crosslinked gelatin gel. Put olive oil in the same device as in the above method, stir at a speed of about 200 to 600 rpm, add an aqueous solution of a mixture of gelatin and polyanion thereto to prepare a W / O type emulsion, and after cooling this, Acetone, ethyl acetate, etc. are added and stirred, and the gelatin particles to which the polyanion has been added are recovered by centrifugation. The collected polyanion-added gelatin particles are further washed with acetone, ethyl acetate, etc., then IPA, ethanol, etc., and dried. The dried polyanion-added gelatin particles were suspended in an aqueous solution of a crosslinking agent containing 0.1% Tween 80, and allowed to undergo a crosslinking reaction while gently stirring.
100 mM glycine aqueous solution containing 80 or 0.1
Polyanion addition cross-linked gelatin gel particles can be obtained by stopping the cross-linking reaction by washing with 0.004 N HCl containing% Tween80. The average particle size and water content of the polyanion-added crosslinked gelatin gel particles obtained by this alternative method are the same as those obtained by the above method. The crosslinking reaction conditions should be appropriately selected, but the reaction temperature is preferably 0 to 40 ° C., and the reaction time is preferably 1 to 48 hours.
【００１２】上記のようにして得られたポリアニオン付
加架橋ゼラチンゲルは、減圧乾燥または凍結乾燥させる
こともできる。凍結乾燥は、例えばポリアニオン付加架
橋ゼラチンゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以
上、または−８０℃で１時間以上凍結させた後に凍結乾
燥機で１〜３日間乾燥させることにより行う。ポリアニ
オン付加架橋ゼラチンゲルを調製する際のゼラチン、ポ
リアニオン、および架橋剤の濃度は所望の含水率により
適宜選択すべきであるが、ゼラチン濃度１〜１００ｗ／
ｖ％（以下、単に％で示す）、ポリアニオン濃度０．０
１〜２０ｗ／ｖ％（以下、単に％で示す）、架橋剤濃度
０．０１〜１００ｗ／ｖ％（以下、単に％で示す）（１
〜５４００ｍＭに相当）が好ましい。ポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲルは、原料であるゼラチンおよび架橋剤
の濃度を変化させることにより所望の含水率とすること
ができる。含水率を高くするには、ゼラチン濃度、架橋
剤濃度共に低くし、逆に含水率を低くするには、ゼラチ
ン濃度、架橋剤濃度共に高くすればよい。上記のように
して調製したポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルにｂＦ
ＧＦを含有させるためには、ｂＦＧＦ水溶液をポリアニ
オン付加架橋ゼラチンゲルに滴下して含浸させるか、ポ
リアニオン付加架橋ゼラチンゲルをｂＦＧＦ水溶液中に
懸濁して再膨潤させる。The polyanion-added cross-linked gelatin gel obtained as described above can be dried under reduced pressure or freeze-dried. Freeze-drying is performed, for example, by placing a polyanion-added cross-linked gelatin gel in distilled water, freezing it in liquid nitrogen for 30 minutes or more, or freezing it at -80 ° C for 1 hour or more, and then drying it in a freeze dryer for 1 to 3 days. The concentrations of gelatin, polyanion, and crosslinking agent in preparing the polyanion-added crosslinked gelatin gel should be appropriately selected depending on the desired water content, but the gelatin concentration is 1 to 100 w /
v% (hereinafter referred to simply as%), polyanion concentration 0.0
1 to 20 w / v% (hereinafter, simply indicated by%), the concentration of the cross-linking agent is 0.01 to 100 w / v% (hereinafter, simply indicated by%) (1
(Corresponding to ~ 5400 mM) is preferred. The polyanion addition cross-linked gelatin gel can be made to have a desired water content by changing the concentrations of the raw material gelatin and the cross-linking agent. To increase the water content, both the gelatin concentration and the cross-linking agent concentration should be lowered, and conversely, to decrease the water content, both the gelatin concentration and the cross-linking agent concentration should be increased. BF was added to the polyanion addition cross-linked gelatin gel prepared as described above.
To contain GF, an aqueous bFGF solution is dropped into a polyanion-added crosslinked gelatin gel to impregnate it, or the polyanion addition crosslinked-gelatin gel is suspended in a bFGF aqueous solution and re-swelled.
【００１３】ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲルに含有
させることができるｂＦＧＦの量は、ポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲルの含水率等により異なるが、ポリアニ
オン付加架橋ゼラチンゲル１ｍｇ当たり０．０１〜２０
００μｇが可能である。なお、徐放期間、ｂＦＧＦの放
出量等は、製剤に含有されるｂＦＧＦの量、ポリアニオ
ン付加架橋ゼラチンゲルの含水率、用いたゼラチンの等
電点等の物性、用いたポリアニオンの分子量およびアニ
オンの置換度、投与される部位などの種々の条件により
異なる。上記のようにして得られたｂＦＧＦ含有するポ
リアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤（以下、架橋ゼラ
チンゲル製剤という）は、凍結乾燥することもできる。
凍結乾燥する場合には、例えば、液体窒素中で３０分以
上以上または−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍
結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行う。The amount of bFGF that can be contained in the polyanion-addition-crosslinked gelatin gel varies depending on the water content of the polyanion-addition-crosslinked gelatin gel and the like, but is 0.01 to 20 per 1 mg of the polyanion-addition-crosslinked gelatin gel.
00 μg is possible. The sustained-release period, the amount of bFGF released, and the like include the amount of bFGF contained in the preparation, the water content of the polyanion-added crosslinked gelatin gel, the physical properties such as the isoelectric point of gelatin used, the molecular weight of the polyanion used, and the anion content. It depends on various conditions such as degree of substitution and site of administration. The polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation containing bFGF obtained as described above (hereinafter referred to as crosslinked gelatin gel preparation) can also be freeze-dried.
In the case of freeze-drying, for example, after freeze-drying in liquid nitrogen for 30 minutes or more or at −80 ° C. for 1 hour or more, it is dried by a freeze dryer for 1 to 3 days.
【００１４】本発明の架橋ゼラチンゲル製剤の有効成分
であるｂＦＧＦは、脳下垂体、脳、網膜、黄体、副腎、
腎、胎盤、前立腺、胸腺などの臓器より抽出されるも
の、組み換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学的手法で製造
されるもの、さらにこれらの修飾体であって繊維芽細胞
増殖因子として作用し得るものを含む。ｂＦＧＦの修飾
体としては、例えば上記の抽出により得られたまたは遺
伝子工学的手法で得られたｂＦＧＦのアミノ酸配列にお
いてアミノ酸が付加されたもの、アミノ酸の一部が他の
アミノ酸で置換されたもの、またはアミノ酸の一部が欠
損したものなどが挙げられる。本発明においては、これ
らのｂＦＧＦまたはその修飾体は単独で用いてもよい
し、これらの混合物として用いてもよい。BFGF, which is the active ingredient of the cross-linked gelatin gel preparation of the present invention, comprises pituitary, brain, retina, luteum, adrenal gland,
Those extracted from organs such as kidney, placenta, prostate, and thymus, those produced by genetic engineering techniques such as recombinant DNA technology, and the modified forms thereof that can act as fibroblast growth factors Including. Examples of modified bFGF include, for example, amino acids added to the amino acid sequence of bFGF obtained by the above extraction or obtained by a genetic engineering method, those in which a part of amino acids are replaced with other amino acids, Alternatively, a part of amino acids may be deleted. In the present invention, these bFGF or modified forms thereof may be used alone or as a mixture thereof.
【００１５】上記ｂＦＧＦとしては、好ましくは、例え
ばをＷＯ８７／０１７２８（特表昭６３−５００８４３
号公報）、ＷＯ８９／０４８３２（特表平２−５０４４
６８号公報）、ＷＯ８６／０７５９５（特表昭６３−５
０００３６号公報）、ＷＯ８７／０３８８５（特表昭６
３−５０１９５３号公報）、欧州特許出願公開第２３７
９６６号明細書（特表昭６３−２２６２８７号公報）、
欧州特許出願公開第２８１８２２号明細書（特表平２−
１９３号公報）、欧州特許出願公開第３２６９０７号明
細書（特表平２−２０９８９４号公報）、欧州特許出願
公開第３９４９５１号明細書（特表平３−６１４９４号
公報）、欧州特許出願公開第４９３７３７号明細書（特
表平５−１２４９７５号公報）などに記載のものが挙げ
られる。これらのｂＦＧＦのうち、ＷＯ８７／０１７２
８に記載の遺伝子工学的手法製造した下記の配列番号１
の１５４個のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび
配列番号２の１５３個のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドが、安定性および材料として必要な量を常時供給す
ることが容易であるという点から特に好ましい。配列番
号１のアミノ酸配列を有するｂＦＧＦは、具体的には特
表昭６３−５００８４３号公報の実施例に記載されてい
るように、ヒトの腎臓のｍＲＮＡから調製されたλgt１
０ｃＤＮＡライブラリーからウシの１．４ｋｂ塩基性副
断片を用いてヒトのｂＦＧＦのｃＤＮＡクローンを調製
し、発現ベクターを構築して前記クローンを発現するこ
とによって得られる。As the above-mentioned bFGF, preferably, for example, WO87 / 01728 (Table 63-500843)
No.), WO 89/04832 (Tokuhoku Hyo 2-5044)
No. 68), WO86 / 07595 (Special Table Sho 63-5)
No. 00006), WO87 / 03885 (Special table Sho6)
3-501953), European Patent Application Publication No. 237.
No. 966 (Japanese Patent Publication No. 63-226287),
European Patent Application Publication No. 2818222 (Patent Document 2)
193), European Patent Application Publication No. 326907 (Japanese Patent Publication No. 2-209894), European Patent Application Publication No. 3949951 (Japanese Patent Publication No. 3-61494), European Patent Application Publication No. Those described in Japanese Patent No. 4937737 (Japanese Patent Publication No. 5-124975) can be mentioned. Among these bFGF, WO87 / 0172
The following SEQ ID NO: 1 produced by the genetic engineering method described in 8
The polypeptide having the 154 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the polypeptide having the 153 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are particularly preferable in terms of stability and easy supply of the amount required as a material at all times. BFGF having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is λ gt 1 prepared from human kidney mRNA, as specifically described in the examples of JP-A-63-500843.
It is obtained by preparing a human bFGF cDNA clone from a 0 cDNA library using a bovine 1.4 kb basic subfragment, constructing an expression vector, and expressing the clone.
【００１６】[0016]
【実施例】以下、実施例および試験例を挙げて本発明に
ついて詳細に説明するが、本発明は以下の実施例および
試験例に限定されるものではない。 （実施例１）１０００ｍｌ容丸底フラスコにオリブ油３
７５ｍｌを加え、固定した攪拌用モーター（新東科学社
製、スリーワンモーター）にテフロン製攪拌用プロペラ
を取り付け、フラスコと一緒に固定した。オリブ油を３
０℃、４２０ｒｐｍにて攪拌しながら等電点４．９アル
カリ処理ゼラチンとポリアニオンとしてカルボキシメチ
ルセルロース（以下ＣＭＣと略称する、分子量２４，０
００、カルボキシル基の置換度２．７４）の混合水溶液
（ゼラチン１０％、ＣＭＣ０、０．１、０．２５、およ
び０．５％）１０ｍｌを滴下し、Ｗ／Ｏ型エマルジョン
を調製した。１０分間攪拌後、フラスコを１０〜２０℃
に冷却し、３０分攪拌した。冷却後、ここに１００ｍｌ
のアセトンを加え１時間攪拌した後、遠心分離によりＣ
ＭＣを包含したゼラチン粒子を回収した。回収した粒子
をアセトンにて洗浄し、さらに２−プロパノール（以下
ＩＰＡと略称する）にて洗浄することにより未架橋のＣ
ＭＣを包含したゼラチン粒子を得た。この粒子を乾燥さ
せ、４℃で保存した。乾燥した未架橋ゼラチン粒子５０
０ｍｇを０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含むグルタルアル
デヒド（以下ＧＡという）水溶液（ＣＭＣ０および０．
１％はＧＡ０．０５％、５．０ｍＭに相当、ＣＭＣ０．
２５および０．５％はＧＡ０．１％、１０ｍＭに相当）
１００ｍｌに懸濁させ、４℃、１５時間ゆるやかに攪拌
することにより架橋反応を行った。反応終了後、架橋粒
子を遠心分離により回収し、０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０
を含む１００ｍＭグリシン水溶液にて３７℃、１時間洗
浄することにより架橋反応を停止した。反応停止後、架
橋粒子を順に０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０水溶液、ＩＰ
Ａ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０水溶液で洗浄し、蒸留水
で２回洗浄した後に凍結乾燥を行い、乾燥ＣＭＣ付加架
橋ゼラチンゲル粒子（平均粒径４０μｍ、含水率：ＣＭ
Ｃ０、０．１、０．２５、０．５％添加で、それぞれ９
０、８７、８７、９０％）を得た。得られたＣＭＣを付
加した架橋ゼラチンゲル粒子１０ｍｇに３．３ｍｇ ｂ
ＦＧＦ／１ｍｌ １／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）の
３０μｌを滴下し、４℃、一昼夜放置することによりｂ
ＦＧＦ水溶液を粒子内に含浸させ、ｂＦＧＦ含有ＣＭＣ
付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製した。得られたｂＦＧ
Ｆ含有ＣＭＣ付加架橋ゼラチンゲル製剤を凍結乾燥させ
ることにより、ｂＦＧＦ含有乾燥ＣＭＣ付加架橋ゼラチ
ンゲル製剤を調製した。The present invention will be described in detail below with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to the following examples and test examples. (Example 1) Olive oil 3 was added to a 1000 ml round bottom flask.
75 ml was added, and a fixed stirring motor (manufactured by Shinto Kagaku Co., Three One Motor) was fitted with a Teflon stirring propeller and fixed together with the flask. Olive oil 3
With stirring at 0 ° C. and 420 rpm, isoelectric point 4.9 alkali-treated gelatin and carboxymethyl cellulose as polyanion (hereinafter, abbreviated as CMC, molecular weight 24.0)
00, and 10 ml of a mixed aqueous solution (gelatin 10%, CMC0, 0.1, 0.25, and 0.5%) having a carboxyl group substitution degree of 2.74) was added dropwise to prepare a W / O type emulsion. After stirring for 10 minutes, the flask is heated to 10 to 20 ° C.
It was cooled to room temperature and stirred for 30 minutes. After cooling, 100 ml here
Of acetone is added and the mixture is stirred for 1 hour, then centrifuged to separate C
The gelatin particles containing MC were recovered. The recovered particles are washed with acetone and further washed with 2-propanol (hereinafter abbreviated as IPA) to obtain uncrosslinked C.
Gelatin particles containing MC were obtained. The particles were dried and stored at 4 ° C. Dry uncrosslinked gelatin particles 50
An aqueous solution of glutaraldehyde (hereinafter referred to as GA) containing 0 mg of 0.1% Tween 80 (CMC0 and 0.
1% corresponds to GA 0.05%, 5.0 mM, CMC0.
25 and 0.5% correspond to GA 0.1% and 10 mM)
The suspension was suspended in 100 ml and gently stirred at 4 ° C. for 15 hours to carry out a crosslinking reaction. After the reaction was completed, the crosslinked particles were recovered by centrifugation, and 0.1% Tween 80
The cross-linking reaction was stopped by washing with a 100 mM glycine aqueous solution containing at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction was stopped, crosslinked particles were sequentially added with 0.1% Tween 80 aqueous solution, IP.
A, washed with 0.1% Tween 80 aqueous solution, washed twice with distilled water and then lyophilized, and dried CMC-added cross-linked gelatin gel particles (average particle size 40 μm, water content: CM
C0, 0.1, 0.25, 0.5% addition, 9 each
0, 87, 87, 90%). 3.3 mg b to 10 mg of the obtained CMC-added crosslinked gelatin gel particles
30 μl of FGF / 1 ml 1/15 M phosphate buffer (pH 6) was added dropwise, and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. b
BFGF-containing CMC by impregnating particles with an FGF aqueous solution
An addition cross-linked gelatin gel formulation was prepared. The obtained bFG
A bFGF-containing dry CMC-added cross-linked gelatin gel preparation was prepared by freeze-drying the F-containing CMC-added cross-linked gelatin gel preparation.
【００１７】（実施例２）ＣＭＣ添加濃度を０．５％に
固定し、架橋剤として１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＷＳＣ
と略す）水溶液（０．１％、５ｍＭに相当）を使用した
以外は、実施例１と同様の方法でＣＭＣ付加架橋ゼラチ
ンゲル粒子（平均粒径４０μｍ、含水率８１％）、ｂＦ
ＧＦ含有ＣＭＣ付加架橋ゼラチンゲル製剤、およびｂＦ
ＧＦ含有乾燥ＣＭＣ付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製し
た。Example 2 The concentration of CMC added was fixed at 0.5%, and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (hereinafter referred to as WSC) was used as a crosslinking agent.
CMC-added crosslinked gelatin gel particles (average particle size 40 μm, water content 81%), bF, were prepared in the same manner as in Example 1 except that an aqueous solution (equivalent to 0.1%, 5 mM) was used.
GF-containing CMC addition cross-linked gelatin gel preparation and bF
A dry CMC addition cross-linked gelatin gel preparation containing GF was prepared.
【００１８】（実施例３）ポリアニオンとしてポリグル
タミン酸（以下ＰＧＡという）０．５％を使用し、ＧＡ
濃度を０．０５％（５ｍＭに相当）に固定した以外は、
実施例１と同様の方法でＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル粒
子（平均粒径４０μｍ、含水率８７％）、ｂＦＧＦ含有
ＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル製剤、およびｂＦＧＦ含有
乾燥ＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製した。Example 3 Polyglutamic acid (hereinafter referred to as PGA) 0.5% was used as a polyanion, and GA was used.
Other than fixing the concentration to 0.05% (corresponding to 5 mM),
In the same manner as in Example 1, PGA-added cross-linked gelatin gel particles (average particle size 40 μm, water content 87%), bFGF-containing PGA addition cross-linked gelatin gel preparation, and bFGF-containing dry PGA addition cross-linked gelatin gel preparation were prepared.
【００１９】（実施例４）ポリアニオンとしてデキスト
ラン硫酸（以下ＤＳという）０．５％を使用し、ＧＡ濃
度を０．０５％（５ｍＭに相当）に固定した以外は、実
施例１と同様の方法でＤＳ付加架橋ゼラチンゲル粒子
（平均粒径４０μｍ、含水率８７％）、ｂＦＧＦ含有Ｄ
Ｓ付加架橋ゼラチンゲル製剤、およびｂＦＧＦ含有乾燥
ＤＳ付加架橋ゼラチンゲル製剤を調製した。(Example 4) The same method as in Example 1 except that 0.5% dextran sulfate (hereinafter referred to as DS) was used as the polyanion and the GA concentration was fixed at 0.05% (corresponding to 5 mM). DS addition cross-linked gelatin gel particles (average particle size 40 μm, water content 87%), bFGF-containing D
An S addition cross-linked gelatin gel preparation and a dry DS addition cross-linked gelatin gel preparation containing bFGF were prepared.
【００２０】上記実施例１〜４で調製したｂＦＧＦ含有
ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤の処方および得
られた架橋ゼラチンゲルの含水率を表１として示す。表
１中、架橋剤ＧＡおよびＷＳＣはそれぞれグルタルアル
デヒドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩を表す。また、表中のゼ
ラチンおよび架橋剤の濃度％は、それぞれ「ｗ／ｖ％」
を表し、含水率の％は「ｗ／ｗ％」を表す。 表１Table 1 shows the formulations of the bFGF-containing polyanion-added crosslinked gelatin gel preparations prepared in Examples 1 to 4 and the water contents of the obtained crosslinked gelatin gels. In Table 1, the cross-linking agents GA and WSC represent glutaraldehyde and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, respectively. The concentration% of gelatin and the cross-linking agent in the table are each "w / v%"
And% of water content represents “w / w%”. Table 1
【表１】 [Table 1]
【００２１】（試験例１）実施例１および実施例３にて
調製したｂＦＧＦ含有ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲ
ル製剤をマウス背部皮下に注射により投与した。投与か
ら３、７、および１４日目における投与部位周辺での血
管新生の程度をヘモグロビン量の変化を指標に評価し
た。なお、血管新生の評価は以下の様に行った。製剤投
与部位の皮膚の裏側ならびに背部筋側組織を、製剤投与
部位を中心に２ｃｍ四方をメスにて削り取った。これら
の組織を０．７５％の塩化アンモニウムを含有した１７
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に浸漬しヘモグ
ロビンを抽出した。ヘモグロビンはシアンメトヘモグロ
ビン法（和光純薬社製、ヘモグロビンテストワコー）に
て定量した。なお、マウスの匹数は１群５匹である。各
群のヘモグロビン量の経時変化を図１に示す。１００μ
ｇのｂＦＧＦを溶液状態で投与したり、ｂＦＧＦを含ま
ないポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル粒子を投与して
も、ヘモグロビン量は変化しない。ポリアニオンを含ま
ないｂＦＧＦ含有ゼラチンゲル製剤を投与した場合に
は、ヘモグロビン量は、３日目をピークに上昇し、以降
減少していった。ＣＭＣを付加したｂＦＧＦ含有架橋ゼ
ラチンゲル製剤を投与した場合には、ヘモグロビン量
は、７日目をピークに上昇した。ＣＭＣの添加量の増加
に伴い、７日目のヘモグロビン量も増加した。ＣＭＣ含
有量の最も多いＣＭＣ０．５％付加粒子においては１４
日目においてもヘモグロビンの残存が認められた。ｂＦ
ＧＦ含有ＰＧＡ付加架橋ゼラチンゲル製剤の場合にも、
同夜のヘモグロビン量のパターンの変化が認められた。
これは、添加したポリアニオンとｂＦＧＦが静電的相互
作用をし、製剤からのｂＦＧＦの放出を抑制するため
に、組織での血管新生が遅延し、組織中のヘモグロビン
量のパターンの変化となって現れたものと考えられる。(Test Example 1) The bFGF-containing polyanion-added crosslinked gelatin gel preparations prepared in Examples 1 and 3 were subcutaneously administered to the back of mice by injection. The degree of angiogenesis around the administration site on the 3rd, 7th, and 14th days after administration was evaluated using the change in hemoglobin amount as an index. The evaluation of angiogenesis was performed as follows. The tissue on the back side of the skin at the site of administration of the preparation and the muscle on the back muscle side were scraped off with a scalpel in a 2 cm square centering on the site of administration of the preparation. These tissues contained 0.75% ammonium chloride 17
Hemoglobin was extracted by immersing it in mM Tris-HCl buffer (pH 7.6). Hemoglobin was quantified by the cyanmethemoglobin method (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Hemoglobin Test Wako). The number of mice is 5 per group. The time-dependent change in the amount of hemoglobin in each group is shown in FIG. 100μ
The amount of hemoglobin does not change even when g of bFGF is administered in solution or polyanion-added crosslinked gelatin gel particles containing no bFGF are administered. When the bFGF-containing gelatin gel preparation containing no polyanion was administered, the amount of hemoglobin peaked on the third day and then decreased. When the bFGF-containing crosslinked gelatin gel preparation to which CMC was added was administered, the amount of hemoglobin peaked on the 7th day. As the amount of CMC added increased, the amount of hemoglobin on day 7 also increased. 14 in the CMC 0.5% addition particles with the highest CMC content
Residual hemoglobin was also observed on day one. bF
Also in the case of GF-containing PGA addition cross-linked gelatin gel preparation,
On the same night, a change in the hemoglobin amount pattern was observed.
This is because the added polyanion interacts with bFGF electrostatically and suppresses the release of bFGF from the preparation, which delays angiogenesis in the tissue and changes the pattern of hemoglobin content in the tissue. It is thought that it has appeared.
【００２２】（試験例２）実施例４にて調製したｂＦＧ
Ｆ含有ＤＳ付加架橋ゼラチンゲル粒子製剤をマウス背部
皮下に注射により投与した。投与から３、７、および１
４日目における投与部位周辺での血管新生の程度をヘモ
グロビン量の変化を指標に評価した。血管新生の評価
は、試験例１と同様の方法にて行った。ヘモグロビンの
経時変化を図２に示す。ＤＳ付加粒子の場合にはヘモグ
ロビン量のピークは３日目であり、ポリアニオンを添加
しない粒子の場合と同様であった。しかしながら、ヘモ
グロビン量はその後もあまり減少せず、１４日目におい
ても相当量のヘモグロビンが認められた。これは、ＤＳ
を添加することによって、試験例１に示した場合と同様
のｂＦＧＦの放出抑制が起こり、血管新生パターンが遅
延したものと考えられる。(Test Example 2) bFG prepared in Example 4
The F-containing DS addition cross-linked gelatin gel particle preparation was administered by subcutaneous injection to the back of the mouse. 3, 7, and 1 from administration
The degree of angiogenesis around the administration site on the 4th day was evaluated using the change in hemoglobin amount as an index. Evaluation of angiogenesis was performed by the same method as in Test Example 1. The time course of hemoglobin is shown in FIG. In the case of the DS-added particles, the peak of the amount of hemoglobin was on the 3rd day, which was similar to the case of the particles to which the polyanion was not added. However, the amount of hemoglobin did not decrease much thereafter, and a considerable amount of hemoglobin was recognized even on the 14th day. This is DS
It is considered that the addition of B.sup.2 caused the suppression of bFGF release similar to that shown in Test Example 1 and delayed the angiogenesis pattern.
【００２３】[0023]
【発明の効果】本発明によれば、架橋ゼラチンゲルにポ
リアニオンを少量付加することにより、ｂＦＧＦの放出
を抑制し、より長期にわたるｂＦＧＦの徐放化を達成す
ることができた。本発明の製剤から徐放されたｂＦＧＦ
は生理活性を保持していた。さらに、添加するポリアニ
オンの種類や添加濃度を変えることにより、ｂＦＧＦの
活性発現の持続性を制御できた。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, by adding a small amount of polyanion to a crosslinked gelatin gel, it was possible to suppress the release of bFGF and achieve a sustained release of bFGF for a longer period of time. BFGF sustained-released from the formulation of the present invention
Retained bioactivity. Furthermore, the sustainability of bFGF activity expression could be controlled by changing the type and concentration of the added polyanion.
【００２４】[0024]
【００２５】配列番号：1 配列の長さ：154 配列の型：アミノ酸 起源 生物名：ホモ サピエンス（Homo sapiens） 配列 Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 20 25 30 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val 35 40 45 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val 85 90 95 Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150SEQ ID NO: 1 Sequence length: 154 Sequence type: Amino acid Origin Organism name: Homo sapiens Sequence Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 20 25 30 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val 35 40 45 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val 85 90 95 Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150
【００２６】配列番号：2 配列の長さ：153 配列の型：アミノ酸 起源 生物名：ホモ サピエンス（Homo sapiens） 配列 Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys 20 25 30 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 35 40 45 Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala 50 55 60 Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr 65 70 75 80 Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 85 90 95 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr 100 105 110 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr 115 120 125 Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile 130 135 140 Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150SEQ ID NO: 2 Sequence length: 153 Sequence type: Amino acid Origin organism name: Homo sapiens sequence Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys 20 25 30 Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp 35 40 45 Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala 50 55 60 Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr 65 70 75 80 Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 85 90 95 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr 100 105 110 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr 115 120 125 Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile 130 135 140 Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150
【図１】図１は、ポリアニオン（カルボキシメチルセル
ロース、ポリグルタミン酸）付加架橋ゼラチンゲル製剤
（ｂＦＧＦ１００μｇ）マウス皮下投与における周辺組
織のヘモグロビン量の経時的変化を示す図である。FIG. 1 is a graph showing changes over time in the amount of hemoglobin in surrounding tissues after subcutaneous administration of polyanion (carboxymethyl cellulose, polyglutamic acid) addition cross-linked gelatin gel preparation (bFGF 100 μg) to mice.
【図２】図２は、デキストラン硫酸付加架橋ゼラチンゲ
ル製剤（ｂＦＧＦ１００μｇ）マウス皮下投与における
周辺組織のヘモグロビン量の経時的変化を示す図であ
る。[Fig. 2] Fig. 2 is a graph showing the time-dependent change in the amount of hemoglobin in the surrounding tissues after subcutaneous administration of a dextran sulfate-added cross-linked gelatin gel preparation (bFGF 100 µg) to mice.
Claims (12)
塩基性繊維芽細胞増殖因子を含ませてなることを特徴と
するポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤。1. A polyanion addition cross-linked gelatin gel,
A polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation, which comprises a basic fibroblast growth factor.
番号１および／または２で示されるアミノ酸配列を有す
るものである請求項１に記載のポリアニオン付加架橋ゼ
ラチンゲル製剤。2. The polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation according to claim 1, wherein the basic fibroblast growth factor has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or 2 below.
が、グルタルアルデヒドまたは水溶性カルボジイミドで
ある請求項１に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲ
ル製剤。3. The polyanion addition-crosslinked gelatin gel preparation according to claim 1, wherein the crosslinking agent of the polyanion addition-crosslinked gelatin is glutaraldehyde or water-soluble carbodiimide.
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホナート
からなる群より選ばれる請求項３に記載のポリアニオン
付加架橋ゼラチンゲル製剤。4. The water-soluble carbodiimide is 1-ethyl-3.
The polyanion-added crosslinked gelatin gel according to claim 3, which is selected from the group consisting of-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide-meth-p-toluenesulfonate. Formulation.
グルタルアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である請求
項３に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤。5. The polyanion addition-crosslinked gelatin gel preparation according to claim 3, wherein the crosslinking agent for the polyanion addition-crosslinked gelatin is glutaraldehyde or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride.
酸、ポリ硫酸、ポリリン酸からなる群より選ばれる１つ
または複数のポリアニオンである請求項１に記載のポリ
アニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤。6. The polyanion addition-crosslinked gelatin gel preparation according to claim 1, wherein the polyanion to be added is one or more polyanions selected from the group consisting of polycarboxylic acid, polysulfuric acid and polyphosphoric acid.
ルセルロース、ポリグルタミン酸またはデキストラン硫
酸である請求項６に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチ
ンゲル製剤。7. The polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation according to claim 6, wherein the polyanion to be added is carboxymethyl cellulose, polyglutamic acid or dextran sulfate.
ラチンの濃度１〜１００ｗ／ｖ％、架橋剤濃度０．０１
〜１００ｗ／ｖ％およびポリアニオン濃度０．０１〜２
０ｗ／ｖ％からなる請求項１に記載のポリアニオン付加
架橋ゼラチンゲル製剤。8. A polyanion-added cross-linked gelatin gel having a gelatin concentration of 1 to 100 w / v% and a cross-linking agent concentration of 0.01.
-100 w / v% and polyanion concentration 0.01-2
The polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation according to claim 1, which comprises 0 w / v%.
率が５０〜９９％である請求項１に記載のポリアニオン
付加架橋ゼラチンゲル製剤。9. The polyanion addition-crosslinked gelatin gel preparation according to claim 1, wherein the polyanion addition-crosslinked gelatin gel has a water content of 50 to 99%.
状が、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、
粒子状、または不定形である請求項１に記載のポリアニ
オン付加架橋ゼラチンゲル製剤。10. A polyanion-addition-crosslinked gelatin gel having a cylindrical shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, a spherical shape,
The polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation according to claim 1, which is in the form of particles or amorphous.
ルに接触させ含浸させるか、または塩基性繊維芽細胞増
殖因子の水溶液中にゲルを懸濁させることにより塩基性
繊維芽細胞増殖因子をゲルに含有させることを特徴とす
る請求項１に記載のポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル
製剤。11. A basic fibroblast growth factor is obtained by contacting and impregnating an aqueous solution of basic fibroblast growth factor with the gel, or suspending the gel in an aqueous solution of basic fibroblast growth factor. The polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation according to claim 1, which is contained in a gel.
因子含有ポリアニオン付加架橋ゼラチンゲル製剤を乾燥
させたことを特徴とする乾燥ポリアニオン付加架橋ゼラ
チンゲル製剤。12. A dry polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation, which is obtained by drying the basic fibroblast growth factor-containing polyanion-added crosslinked gelatin gel preparation.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7152671A JPH08325160A (en) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | Polyanion-addition crosslinked gelatin preparation containing basophilic fibroblast growth factor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7152671A JPH08325160A (en) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | Polyanion-addition crosslinked gelatin preparation containing basophilic fibroblast growth factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH08325160A true JPH08325160A (en) | 1996-12-10 |
Family
ID=15545563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7152671A Pending JPH08325160A (en) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | Polyanion-addition crosslinked gelatin preparation containing basophilic fibroblast growth factor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08325160A (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003091283A1 (en) * | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Nof Corporation | Gelatin derivatives and high-molecular micelles comprising the same |
| WO2004082657A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-30 | Medgel Corporation | Sustained-release hydrogel preparation |
| JP2007509643A (en) * | 2003-10-10 | 2007-04-19 | ゲ・ミン・ルイ | Methods and compositions for growth of corneal endothelium and related cells on biopolymers and creation of artificial corneal grafts |
| US7605231B2 (en) | 2002-04-26 | 2009-10-20 | Yasuhiko Tabata | Gelatin derivatives and high-molecular micelle comprising the derivatives |
| US20190060465A1 (en) * | 2011-06-23 | 2019-02-28 | National Cheng Kung University | Adhesive cell tissue gels |
| CN111936157A (en) * | 2018-02-13 | 2020-11-13 | 佛罗里达大学研究基金会 | Fibroblast growth factor analogs and uses thereof |
-
1995
- 1995-05-26 JP JP7152671A patent/JPH08325160A/en active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003091283A1 (en) * | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Nof Corporation | Gelatin derivatives and high-molecular micelles comprising the same |
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| US8771734B2 (en) | 2003-03-17 | 2014-07-08 | Medgel Corporation | Sustained-release hydrogel preparation |
| JP2007509643A (en) * | 2003-10-10 | 2007-04-19 | ゲ・ミン・ルイ | Methods and compositions for growth of corneal endothelium and related cells on biopolymers and creation of artificial corneal grafts |
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