JPH0789992A - 免疫原性人工ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのワクチン
として使用できる抗原部位ポリペプチド、及びそれをコ
ードする遺伝子を提供する。 【構成】 ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのヘマグル
チニン分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を有し、ヘ
マグルチニン分子中の球状部領域が欠失した免疫原性人
工ポリペプチド。該免疫原性人工ポリペプチドをコード
する遺伝子。前記ウイルスの例には、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ
２、及びＨ３Ｎ２サブタイプがあり、それぞれの幹領域
と実質上同一の抗原性を有するポリペプチドが提供され
る。また、これら免疫原性人工ポリペプチドは、前記ヘ
マグルチニン分子のプロテアーゼ処理物から分離するこ
ともできる。 【効果】 球状部領域の変化に起因する抗原性変化の影
響を受けない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトインフルエンザＡ型
ウイルスのヘマグルチニン分子中の幹領域に対する抗体
が認識する抗原部位を含有するポリペプチド及び該ポリ
ペプチドをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】インフルエンザウイルスには３つの型
（Ａ、Ｂ及びＣ）があり、インフルエンザの世界的な流
行を起こし、多くの死者がでるのはＡ型のヒトインフル
エンザウイルスによるものである。インフルエンザＡ型
ウイルスは更にウイルス表面タンパク質であるヘマグル
チニン( haemagglutinin：以下、ＨＡと略す）及びノイ
ラミニダーゼ（以下、ＮＡと略す）の抗原性により多く
のサブタイプに分類され、ヒトインフルエンザＡ型ウイ
ルスとしてはＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラ
ス、Ｈ３Ｎ２サブクラスの３種が現在知られている。こ
のインフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは、球状部領域(
head region ) と幹領域( stem region ) という二つの
構造の異なった領域で構成され、球状部領域は、ウイル
スが標的細胞に結合するための受容体結合部位を含みＨ
Ａの血球凝集活性に関与し、一方、幹領域は、ウイルス
のエンベロープと細胞のエンドソーム膜間の膜融合に必
要な融合ペプチドを含み、融合活性に関与している〔ウ
イリー( Wiley ) ら、アニュアル レビュー オブ バ
イオケミストリー( Ann. Rev.Biochem. )、第５６巻、
第３６５〜３９４頁（１９８７）〕。Ｈ１Ｎ１サブタイ
プ、Ｈ２Ｎ２サブタイプを認識する抗ＨＡ抗体として従
来取得された抗ＨＡ抗体は、そのすべてがＨＡの球状部
領域を認識するものである。しかし、この領域は最も抗
原変異が起こり易い部位であり、それ故、これらの抗体
はヒトインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプに共通
に反応するものでなく、また、ウイルスのＨＡの抗原変
化に伴い、認識性を消失するものである。一方、グリー
ン( Green ) らは、Ｈ３Ｎ２サブタイプの１種のＨＡの
幹領域のアミノ酸配列より、ポリペプチドを合成し、こ
のポリペプチドに対する抗体を取得しているが、これら
の抗体はウイルスの中和活性が弱く（特表昭５９−５０
１７１４号公報）、また抗原として使用したポリペプチ
ド自体も、Ｈ３Ｎ２サブタイプで免疫して得たウサギ抗
ウイルス血清に反応を示さず、抗原性の点でも問題があ
った〔セル( Cell )、第２８巻、第４７７〜４８７頁
（１９８２）〕。インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは
プロテアーゼによって１ヵ所切断されることによって、
ウイルスの感染性が活性化されるが、該プロテアーゼ切
断後の大きい方のポリペプチドをＨＡ１、小さい方がＨ
Ａ２と呼ばれている。このうちＨＡ２はインフルエンザ
Ａ型ウイルスのサブタイプによる抗原変異が少ないとい
われている。グラーテ Ｈ．(Glathe Ｈ.)らは、東独国
特許出願公開第２２８７３７号公報において、ウイルス
粒子を酸処理後にトリプシン処理するか、又は還元剤処
理のみを行ってＨＡ２を取出したと記載している。しか
しながら、これらの操作でＨＡ分子は立体構造が破壊さ
れて不可逆的な変性状態となり、得られるＨＡ２は本来
の立体構造を持たないものとなっている。しかも、前記
公報には、得られたものについてワクチンとしての有効
性を具体的に確認した点について開示がない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ヒトインフルエンザＡ
型ウイルスは周期的にＨＡとＮＡの型を変えて大流行を
引起こし、インフルエンザの流行期である冬期前にワク
チン接種を受けても、別の型のウイルスによるインフル
エンザが流行するためワクチンの効果が期待できないこ
とが多い。しかし、ＨＡ分子やＮＡ分子中の、ウイルス
のサブタイプに共通で、抗原変異の生じ難い抗原部位を
得ることができれば、この抗原部位はワクチンとして有
用となる。本発明の目的は、インフルエンザＡ型ウイル
スのサブタイプに認識性を有する抗体が認識し、ワクチ
ンとしても使用できる抗原部位ポリペプチド、及び該ポ
リペプチドをコードする遺伝子を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はヒトインフルエンザＡ型ウイルスの
ＨＡ分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を有し、ＨＡ
分子中の球状部領域が欠失した免疫原性人工ポリペプチ
ドに関する。また本発明の第２の発明は、上記本発明の
第１の発明の免疫原性人工ポリペプチドをコードする遺
伝子に関する。

【０００５】本発明者らは鋭意研究の結果、ヒトインフ
ルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ
２サブタイプのＨＡ分子中のそれぞれの幹領域に、共通
に保存された抗原部位を含有するポリペプチド、及びＨ
３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に、共通に保存
された抗原部位を含有するポリペプチドがワクチンとし
て極めて有用であることを見出し、該ポリペプチドの遺
伝子工学的製造に有用な、該ポリペプチドをコードする
遺伝子を創製し、本発明を完成した。

【０００６】なお本発明のヒトインフルエンザＡ型ウイ
ルスのＨＡ分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を有
し、ＨＡ分子中の球状部領域が欠失した免疫原性ポリペ
プチドとしては、タンパク質工学的にＨＡ分子の球状部
領域を欠失させたポリペプチドが代表的なものである
が、ＨＡ分子をコードする遺伝子より、球状部領域を特
異的に削除して得られる本発明の遺伝子を用いて発現さ
れるポリペプチドでも良い。更に、これらのポリペプチ
ドは、ＨＡ分子中の幹領域を特異的に認識する抗体が認
識する立体構造を有していれば良く、その一部が削除さ
れていても、また、他のアミノ酸配列が付加されていて
も良い。また、タンパク質工学的製造や、遺伝子工学的
製造時において、部分的にプロテアーゼ消化されていて
も良い。すなわち、本発明において、ＨＡ分子中の幹領
域と実質上同一の抗原性を有するとは、ＨＡ分子の幹領
域においてワクチンとして有効に使用可能なＨＡ１部分
及びＨＡ２部分の両方の抗原性を有していればよいこと
を意味する。それ故、既述のグラーテ Ｈ．らの得たも
ののように、変性して本来の立体構造の破壊されたＨＡ
２のみからなるポリペプチドは含まない。本発明におい
て、ワクチン用に最も有効な免疫原性人工ポリペプチド
の例としては下記のものが挙げられる。 （１）分子内に少なくとも配列表の配列番号１で表され
るＴＧＬＲＮポリペプチド配列と、配列表の配列番号２
で表されるGITNKVNSVIEKポリペプチド配列を有し、該両
配列の立体配置がＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブ
タイプのヘマグルチニン分子中の幹領域と実質上同一の
抗原性を有することを特徴とする免疫原性人工ポリペプ
チド。 （２）分子内に少なくとも配列表の配列番号３で表され
るＴＧＭＲＮポリペプチド配列と、配列表の配列番号４
で表されるQINGKLNR（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列
を有し、該両配列の立体配置がＨ３Ｎ２サブタイプのヘ
マグルチニン分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を有
することを特徴とする免疫原性人工ポリペプチド。 （３）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのヘマグルチニ
ン分子のプロテアーゼ処理物より分離してなることを特
徴とする本発明の第１の発明の免疫原性人工ポリペプチ
ド。

【０００７】ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ
１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子幹領域
中の共通部位を認識し、該ウイルスを中和する抗体は、
モノクローナル抗体として、次の様に調製することがで
きる。例えばマウス、モルモット、ウサギのような、ほ
乳動物を下記抗原で免疫する。抗原としては次のような
物質を使用することができる。

【０００８】Ｈ１Ｎ１サブタイプ又はＨ２Ｎ２サブタイ
プより選択されるウイルス粒子を使用することができ
る。Ｈ１Ｎ１サブタイプとしては例えばＡ／Bangkok ／
１０／８３、Ａ／Yamagata／１２０／８６、Ａ／Osaka
／９３０／８８、Ａ／Suita ／１／８９（以上、大阪大
学微生物病研究所保存株）、Ａ／ＰＲ／８／３４〔イン
フルエンザ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−９５〕、Ａ
１／ＦＭ／１／４７〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、
ＡＴＣＣ ＶＲ−９７〕、Ａ／New Jersey／８／７６
〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣＶＲ−８９
７〕、Ａ／ＮＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ
１）、ＡＴＣＣＶＲ−２１９〕、Ａ／Weiss ／４３〔イ
ンフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣＶＲ−９６〕、
Ａ／ＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ
ＣＣ ＶＲ−８２５〕がある。Ｈ２Ｎ２サブタイプとし
ては例えばＡ／Okuda ／５７、Ａ／Adachi／２／５７、
Ａ／Kumamoto／１／６５、Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ａ
／Izumi ／５／６５（以上、大阪大学微生物病研究所保
存株）、Ａ２／Japan ／３０５／５７〔インフルエンザ
Ａ（Ｈ２Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−１００〕がある。あ
るいはこれらのウイルスから得られるＨＡ分子、若しく
は遺伝子組換え技術を用いて調製されるＨＡポリペプチ
ド、若しくは本発明の抗体の認識部位、すなわちＨＡ分
子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有する組換えポリ
ペプチド、又はＨＡ分子中の幹領域の抗原部位を分子内
に含有する合成ポリペプチドで免疫することができる。

【０００９】次に免疫動物より得られた脾臓細胞を、例
えばマウスのミエローマ細胞と融合させ、得られるハイ
ブリドーマから、下記（Ａ）〜（Ｃ）の性質を有する抗
体を産生する細胞を選択し、該細胞を培養することによ
って調製することができる。 （Ａ）上述の各Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタ
イプのウイルスに結合性及び中和活性を有する。 （Ｂ）Ｈ３Ｎ２サブタイプのウイルス、例えばＡ／Fuku
oka ／Ｃ２９／８５、Ａ／Sichuan ／２／８７、Ａ／Ib
araki ／１／９０、Ａ／Suita ／１／９０、Ａ／Kitaky
ushu／１５９／９３（以上、大阪大学微生物病研究所保
存株）、Ａ／PortChalmers ／１／７３〔インフルエン
ザＡ（Ｈ３Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８１０〕、Ａ２／
Aichi ／２／６８〔インフルエンザＡ、ＡＴＣＣ ＶＲ
−５４７〕、及びＢ型のウイルス、例えばＢ／Nagasaki
／１／８７（大阪大学微生物病研究所保存株）、Ｂ／Al
len ／４５〔インフルエンザＢ、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０
２〕には結合性及び中和活性を有さない。 （Ｃ）Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨ
Ａ分子は認識するが、ＨＡ分子中の球状部領域が関与す
る血球凝集活性は阻害せず、ＨＡ分子中の幹領域が関与
する膜融合活性は阻害する。

【００１０】このハイブリドーマの調製に関しては、ネ
ーチャー( Nature )、第２５６巻、第４９５〜４９７頁
（１９７５）を基に行う。免疫用マウスとしては、Balb
／ｃ系マウス、Balb／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１
マウスなどが用いられる。免疫はマウス１匹に対して、
例えばウイルス粒子（１００〜１０００ＨＡ単位）を抗
原として用い、２〜５月間に例えば３回行う。なおマウ
スの飼育及び脾臓細胞の採取は常法に従う。

【００１１】ミエローマ細胞としてはＳＰ２／０−Ａｇ
１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、ｐ３×６３Ａｇ８
Ｕ．１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９７）、ｐ３×６３Ａｇ
８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、ｐ３×６３−Ａｇ８．６５
３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）等が好適に用いられ
る。脾臓細胞とミエローマ細胞は１：１〜１０：１の割
合で混合し、融合はＮａＣｌ（約0.８５％）、ジメチル
スルホキシド〔１０〜２０％（ｖ／ｖ）〕及び分子量１
０００〜６０００のポリエチレングリコールを含有する
リン酸緩衝液（ｐＨ7.２〜7.４）中で、両細胞の混合物
を３５〜３７℃で１〜５分間保温することによって行
う。融合細胞の選択は、ＨＡＴ培地を用い、生育してく
る細胞として選択する。融合細胞のクローン化は限界希
釈法にて少なくとも３回繰返して行う。

【００１２】ハイブリドーマを通常の動物細胞と同様に
して培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体を得る
ことができる。また該ハイブリドーマをプリスタン処理
のヌードマウス、又はBalb／ｃマウスの腹腔内に移植し
て増殖させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄積さ
せることができる。すなわち、これらのマウス腹腔内に
プリスタン0.５〜１mgを接種し、その後２〜３週目に腹
腔に５×１０⁶ 〜１×１０⁷ 個のハイブリドーマを移植
する。通常７〜１０日後に腹水が蓄積し、これを採取す
る。培養物及び腹水中のモノクローナル抗体は通常の手
段で精製される。

【００１３】得られたモノクローナル抗体はＨ１Ｎ１サ
ブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子の幹領域を
認識し、該ウイルスの膜融合活性を阻害することによ
り、該ウイルスを中和し、詳細には以下の性状を有して
いる。

【００１４】（ａ）染色試験により、Ｈ１Ｎ１サブタイ
プ及びＨ２Ｎ２サブタイプでそれぞれ感染したＭＤＣＫ
細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）を認識し、Ｈ３Ｎ２サブ
タイプで感染したＭＤＣＫ細胞は認識しない。染色試験
は４種類の抗体（本発明のモノクローナル抗体、ウサギ
抗マウスイムノグロブリンＧ血清、ヤギ抗ウサギイムノ
グロブリンＧ血清、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオ
キシダーゼ複合体）を用い、ジャーナル オブ クリニ
カル ミクロバイオロジー（Ｊ．Clin. Microbiol ) 、
第２８巻、第１３０８〜１３１３頁（１９９０）に記載
の方法に準じ行う。

【００１５】（ｂ）免疫沈降法により、Ｈ１Ｎ１サブタ
イプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子を認識し、Ｈ３
Ｎ２サブタイプのＨＡ分子は認識しない。

【００１６】（ｃ）血球凝集試験において、Ｈ１Ｎ１サ
ブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプの
それぞれの血球凝集活性を阻害しない。

【００１７】（ｄ）ＨＡ分子をコードする遺伝子解析に
より特定される、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブ
タイプのＨＡ分子中の幹領域に特有の共通保存領域を認
識し、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に特有
の共通保存領域は認識しない。

【００１８】ＨＡ分子をコードする遺伝子の解析は次の
様に行う。ウイルス粒子でＭＤＣＫ細胞を感染させ、翌
日感染細胞を集め、グアニジンイソチオシアネートを用
い、細胞中よりウイルスＲＮＡを抽出する。次に、Ｈ１
Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２各サブタイプの（−）鎖ＲＮ
Ａの３′末端に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオ
チドプライマー、例えば配列表の配列番号５で表される
プライマー５を調製し、該プライマーを用いてｃＤＮＡ
を合成する。該ｃＤＮＡの増幅を行うため、Ｈ１Ｎ１、
Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２各サブタイプの（＋）鎖ＲＮＡの
３′末端に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチド
プライマー、例えば配列表の配列番号６で表されるプラ
イマー６を調製し、該プライマーとプライマー５を用い
て、ｃＤＮＡをＰＣＲ( Polymerase chain reaction )
法により、効率よく増幅することができる。増幅ＤＮＡ
中の約1.７kbp のＨＡ遺伝子をアガロースゲル電気泳動
で分離後、例えばプライマー５、６を用いセカンドＰＣ
Ｒを行い、増幅ＤＮＡを、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレ
ングリコール６０００／2.５Ｍ ＮａＣｌを用い遠心分
離し、沈殿精製画分を得る。次に、ウイルスの各サブク
ラスのＨＡ遺伝子配列より選択したシークエンスプライ
マーを調製し、該プライマーを〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰで標
識した後、該標識プライマーと、前出の精製画分をアニ
ーリングさせ、サーマルサイクラーを利用したジデオキ
シ法〔バイオテクニクス( BioTechniques ) 、第９巻、
第６６〜７２頁（１９９０）〕にて塩基配列を決定す
る。

【００１９】例えば配列表の配列番号７〜１４でそれぞ
れ表されるプライマー７〜１４はＨ１Ｎ１サブタイプ用
のシークエンスプライマーであり、配列表の配列番号１
５〜２３でそれぞれ表されるプライマー１５〜２３はＨ
２Ｎ２サブタイプ用のシークエンスプライマーであり、
配列表の配列番号２４〜２６でそれぞれ表されるプライ
マー２４〜２６はＨ３Ｎ２サブタイプ用のシークエンス
プライマーである。なお、ＰＣＲ用プライマーとしてプ
ライマー９、１３を使用し、シークエンスプライマーと
してプライマー１１、１２を使用することにより、Ｈ１
Ｎ１サブタイプのＨＡ分子の幹領域をコードする遺伝子
の一部が効率よく増幅され、解析される。また、ＰＣＲ
用プライマーとしてプライマー１７、２１を使用し、シ
ークエンスプライマーとしてプライマー１９、２０を使
用することによって、Ｈ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子の
幹領域をコードする遺伝子の一部が効率よく増幅され、
解析される。更に、ＰＣＲ用プライマーとしてプライマ
ー２４、２６を使用し、シークエンスプライマーとして
プライマー２５、２６を使用することによって、Ｈ３Ｎ
２サブタイプのＨＡ分子の幹領域をコードする遺伝子の
一部が効率よく増幅され、解析される。

【００２０】ウイルスサブタイプ間のＨＡ分子中の共通
保存領域としては、本発明者らが見出した、Ｈ１Ｎ１サ
ブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域
の配列表の配列番号１で表されるＴＧＬＲＮポリペプチ
ド配列と配列表の配列番号２で表されるGITNKVNSVIEKポ
リペプチド配列がある。図１にＨＡ分子の三次構造の模
式図〔ウィリー（ Wiley )ら、ネーチャー、第２８９
巻、第３７３〜３７８頁（１９８１）〕、及びＨ１Ｎ１
サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ間のＨＡ分子中の共通
保存領域の位置を示す。図中Ａ領域、Ｂ領域で示す両ポ
リペプチド配列は、図１に示す様にＨＡ分子の幹領域の
中央で互に近接して位置しており、抗体の一例のHybrid
oma Ｃ１７９〔ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１７）の生産する
モノクローナル抗体Ｃ１７９は、該ＨＡ分子中の幹領域
の配列表の配列番号１で表されるＴＧＬＲＮポリペプチ
ド配列と配列表の配列番号２で表されるGITNKVNSVIEKポ
リペプチド配列とを認識する。

【００２１】（ｅ）中和活性試験において、Ｈ１Ｎ１サ
ブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのプラーク形成能又は
フォーカス形成能を阻害し、Ｈ３Ｎ２サブタイプのプラ
ーク形成能、又はフォーカス形成能は阻害しない。中和
活性試験は前出のジャーナルオブ クリニカル ミクロ
バイオロジー記載のプラークリダクション中和試験又は
インフルエンザウイルス迅速フォーカスリダクション中
和試験で行う。すなわち、抗体とウイルスとを混合し、
一定時間保温した後、ＭＤＣＫ細胞に感染させ、プラー
ク又はフォーカスの出現の減少より、中和能を判定す
る。

【００２２】（ｆ）融合活性試験において、Ｈ１Ｎ１サ
ブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプの膜融合活性を阻害
し、Ｈ３Ｎ２サブタイプの膜融合活性は阻害しない。融
合活性試験はネーチャー、第３００巻、第６５８〜６５
９頁（１９８２）記載の方法に準じ行う。すなわちＣＶ
−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）にウイルスを感染さ
せた後、抗体処理を行い、ポリカリオン形成の有無で融
合活性阻害能を判定した。

【００２３】モノクローナル抗体Ｃ１７９はＨＡ分子中
の幹領域に結合し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サ
ブタイプの膜融合活性を阻害し、該ウイルス株の感染力
を強力に中和する。したがって、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及
びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に結合し、
Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプの膜融合活
性を阻害し、該ウイルスの感染力を強力に中和する抗体
（以下、Ｃ１７９型抗体と略す）を誘導するポリペプチ
ドはインフルエンザ用のワクチンとして使用することが
できる。すなわち、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サ
ブタイプのＨＡ分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を
有し、Ｃ１７９型抗体を誘導するポリペプチドを免疫原
として用いれば、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブ
タイプのインフルエンザの流行を予防、治療することが
できる。該免疫原性ポリペプチドとしては、Ｈ１Ｎ１サ
ブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプより調製されるＨＡ分
子、遺伝子組換え技術により調製されるＨＡポリペプチ
ドも使用できるが、抗原決定基となりやすく、かつ抗原
変異の生じやすいＨＡ分子中の球状部領域を欠失させ
た、ＨＡ分子中の幹領域を構成成分とするポリペプチド
（以下、幹領域ポリペプチドと略す）は、Ｃ１７９型抗
体を特異的に誘導する免疫原性ポリペプチドとして特に
有効である。

【００２４】この幹領域ポリペプチドは、ＨＡ分子やＨ
Ａポリペプチドの球状部領域を酵素学的に限定分解、除
去し、得ることができる。例えばＨ１Ｎ１サブタイプ又
はＨ２Ｎ２サブタイプのウイルス粒子より精製したＨＡ
分子を、プロテアーゼで限定分解することにより、該幹
領域ポリペプチドを調製することができる。またウイル
ス粒子、ウイルス粒子を不活性化して得られるスプリッ
トワクチン、ウイルス粒子を界面活性剤で処理した抽出
物をそれぞれプロテアーゼで処理し、該幹領域ポリペプ
チドを調製、使用しても良い。

【００２５】使用するプロテアーゼとしてはＨＡ分子中
の幹領域の抗原性を欠失することなく、球状部領域を分
解できるプロティナーゼが望ましい。本発明で使用でき
るプロティナーゼとしては、トリティラチウム アルバ
ム（Tritirachium album) の産生するアルカリ性プロテ
ィナーゼであるプロティナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．
１４）、（ベーリンガー社製）が１例として挙げられ
る。このプロティナーゼＫと同等の結果を示すプロティ
ナーゼを用いて、本発明の幹領域ポリペプチドを調製す
ることができる。なお、プロティナーゼとペプチダーゼ
を組合せ、プロティナーゼ処理後に、ペプチダーゼ処理
をしても良い。またＨＡ分子は溶液中で強固な３量体を
とるため、プロテアーゼ消化を受け難く、そのためＨＡ
分子をグアニジン塩酸、尿素等の変性剤の存在下でＨＡ
分子のプロテアーゼ処理を行うことにより、効率よくＨ
Ａ分子のプロテアーゼ処理を行うことができる。変性剤
の濃度としては、目的の幹領域ポリペプチドの不可逆的
変性が生じず、かつプロテアーゼも作用する濃度であれ
ば良い。変性剤として尿素を使用する場合は、0.１〜８
Ｍの範囲、好ましくは１〜３Ｍの尿素の存在下でプロテ
アーゼ消化を行えば良い。プロテアーゼ処理は、セファ
ロース等の樹脂にプロテアーゼを固定化した樹脂を用い
て行うこともでき、反応終了後、遠心分離により簡便に
プロテアーゼ固定化樹脂を除去することができる。反応
液中の変性剤、低分子物は透析処理により除去すること
ができ、ＨＡ分子のプロテアーゼ処理物を調製すること
ができる。ＨＡ分子のプロテアーゼ処理物の分子量はゲ
ル電気泳動を行うことにより測定することができる。

【００２６】またプロテアーゼ処理物とＣ１７９型抗体
との結合性、プロテアーゼ処理物の血球凝集活性を測定
することにより、目的の幹領域ポリペプチドの確認を行
うことができる。プロテアーゼ処理によって得られる幹
領域ポリペプチドとはＨＡ分子中の幹領域と実質上同一
の抗原性（Ｃ１７９型抗体への結合性）を有し、球状部
領域の生物活性（血球凝集活性）の欠失したポリペプチ
ドであり、ＨＡ分子中のＨＡ１の幹領域由来のポリペプ
チド部分とＨＡ２由来のポリペプチド部分で構成されて
いる。この点において、前述のＨＡ２由来のポリペプチ
ドで構成されるグラーテ Ｈ．らのワクチンと本質的に
異なる。

【００２７】また、遺伝子組換え技術や化学合成法によ
り、天然のＨＡ分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を
有し、ＨＡ分子中の球状部領域が欠失したポリペプチド
を調製し、使用しても良い。例えばＨ１Ｎ１サブタイプ
又はＨ２Ｎ２サブタイプのウイルスのＲＮＡより、ＨＡ
遺伝子を調製し、該遺伝子中の球状部領域をコードする
部位を制限酵素により切断、除去した後、ベクターに組
込み、動物細胞、例えばＣＶ−１細胞で発現させること
によって、目的のポリペプチドを得ることができる。ま
た、ＨＡ遺伝子をベクターに組込んだ後、ＰＣＲ法によ
り、ＨＡ遺伝子中の球状部領域をコードする部位を選択
的に欠失させることもでき、該遺伝子を含有するベクタ
ーを用い、動物細胞、例えばＣＶ−１細胞で幹領域ポリ
ペプチドを発現させることによって、目的のポリペプチ
ドを得ることができる。これらの幹領域ポリペプチドの
抗原性はＣ１７９型抗体の結合性により確認することが
できる。幹領域ポリペプチドとしては、分子内にＨ１Ｎ
１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹
領域中の共通保存領域を有し、Ｃ１７９型抗体を誘導で
きるものであれば良い。共通保存領域を有する幹領域ポ
リペプチドとしては、例えば分子内に配列表の配列番号
１で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列及び配列表の
配列番号２で表されるGITNKVNSVIEKポリペプチド配列を
有し、該配列の立体配置が天然のＨＡ分子中の、これら
の配列と実質上同一の抗原性を有する立体配置であるポ
リペプチドを調製し、使用しても良い。なお、幹領域ポ
リペプチドとしては、その免疫原性に影響の無い範囲で
アミノ酸の欠失、置換、挿入、転置、付加又は再配置さ
れたものでも良く、例えば幹領域ポリペプチドのＣ末端
部位及び／又はＮ末端部位ポリペプチドの一部が欠失し
たものでも良く、また、ＨＡ分子のシグナルペプチド
や、球状部領域の一部が付加されたものでも良い。

【００２８】ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ
２サブタイプのＨＡ分子幹領域中の共通部位を特異的に
認識する抗体は、モノクローナル抗体として、次の様に
調製することができる。例えばマウス、モルモット、ウ
サギのような、ほ乳動物を下記抗原で免疫する。抗原と
しては次の様な物質を使用することができる。Ｈ３Ｎ２
サブタイプより選択されるウイルス粒子を使用すること
ができる。あるいはこれらのウイルスから得られるＨＡ
分子、若しくは遺伝子組換え技術を用いて調製されるＨ
Ａポリペプチド、若しくは本発明の抗体の認識部位、す
なわちＨＡ分子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有す
る組換えポリペプチド、又はＨＡ分子中の幹領域の抗原
部位を分子内に含有する合成ポリペプチドで免疫するこ
とができる。

【００２９】次に、免疫動物より得られた脾臓細胞を、
例えばマウスのミエローマ細胞と融合させ、得られるハ
イブリドーマから、下記（Ｄ）〜（Ｆ）の性質を有する
抗体を産生する細胞を選択し、該細胞を培養することに
よって調製することができる。 （Ｄ）Ｈ３Ｎ２のサブタイプウイルスに結合性を有す
る。 （Ｅ）Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのウ
イルスに結合性を有さない。 （Ｆ）Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子は認識するが、Ｈ
Ａ分子中の球状部領域が関与する血球凝集活性は阻害し
ない。

【００３０】得られたモノクローナル抗体はＨ３Ｎ２サ
ブタイプのＨＡ分子の幹領域を認識し、詳細には以下の
性状を有している。

【００３１】（ｇ）染色試験により、Ｈ３Ｎ２サブタイ
プで感染したＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ３４）を認
識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプで感
染したＭＤＣＫ細胞は認識しない。

【００３２】（ｈ）免疫沈降法により、Ｈ３Ｎ２サブタ
イプのＨＡ分子を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２
Ｎ２サブタイプのＨＡ分子は認識しない。

【００３３】（ｉ）血球凝集試験において、Ｈ１Ｎ１サ
ブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプの
それぞれの血球凝集活性を阻害しない。

【００３４】（ｊ）ＨＡ分子をコードする遺伝子解析に
より特定される、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹
領域に特有の共通保存領域を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイ
プ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に特有
の共通保存領域は認識しない。

【００３５】Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の共通保
存領域としては、本発明者らが見出した、Ｈ３Ｎ２サブ
タイプのＨＡ分子中の幹領域の配列表の配列番号３で表
されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号
４で表されるQINGKLNR（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配
列がある。図２にＨＡ分子中の三次構造の模式図〔前出
ウィリーら〕、及びＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の
共通保存領域の位置を示す。図中Ａ′領域、Ｂ′領域で
示す両ポリペプチド配列は、図２に示す様にＨＡ分子中
の幹領域の中央で互に近接して位置しており、抗体の一
例のHybridomaＡＩ３Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６）
の生産するモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃは、該ＨＡ分子
中の幹領域の配列表の配列番号３で表されるＴＧＭＲＮ
ポリペプチド配列と配列表の配列番号４で表されるQING
KLNR（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列とを認識する。

【００３６】このＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹
領域に特有の共通保存領域を特異的に認識する抗体（以
下、ＡＩ３Ｃ型抗体と略す）を誘導するポリペプチドは
インフルエンザ用のワクチンとして使用することができ
る。すなわち、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領
域と実質上同一の抗原性を有し、ＡＩ３Ｃ型抗体を誘導
するポリペプチドを免疫原として用いれば、Ｈ３Ｎ２サ
ブタイプのインフルエンザの流行を予防、治療すること
ができる。該免疫原性ポリペプチドとしては、Ｈ３Ｎ２
サブタイプより調製されるＨＡ分子、遺伝子組換え技術
により調製されるＨＡポリペプチドを使用できるが、抗
原決定基となりやすく、かつ抗原変異の生じやすいＨＡ
分子の球状部領域を欠失させたＨＡ分子の幹領域を構成
成分とする幹領域ポリペプチドは、ＡＩ３Ｃ型抗体を特
異的に誘導する免疫原性ポリペプチドとして特に有効で
ある。

【００３７】この幹領域ポリペプチドは、ＨＡ分子やＨ
Ａポリペプチドの球状部領域を酵素学的に限定分解、除
去し、得ることができる。例えばＨ３Ｎ２サブタイプの
ウイルス粒子より精製したＨＡ分子を、プロテアーゼで
限定分解することにより、該幹領域ポリペプチドを調製
することができる。またウイルス粒子、ウイルス粒子を
不活性化して得られるスプリットワクチン、ウイルス粒
子を界面活性剤で処理した抽出物をそれぞれプロテアー
ゼで処理し、該幹領域ポリペプチドを調製、使用しても
良い。使用するプロテアーゼとしては、ＨＡ分子中の幹
領域の抗原性を欠失することなく、球状部領域を分解で
きるプロティナーゼが望ましい。本発明で使用できるプ
ロティナーゼとしては前述のプロティナーゼＫが一例と
して挙げられる。このプロティナーゼＫと同等の結果を
示すプロティナーゼを用いて、本発明の幹領域ポリペプ
チドを調製することができる。なお、プロティナーゼと
ペプチダーゼを組合せ、プロティナーゼ処理後に、ペプ
チダーゼ処理をしても良い。またＨＡ分子は溶液中で強
固な３量体をとるため、プロテアーゼ消化を受け難く、
そのためＨＡ分子をグアニジン塩酸、尿素等の変性剤の
存在下でＨＡ分子のプロテアーゼ処理を行うことによ
り、効率よくＨＡ分子のプロテアーゼ処理を行うことが
できる。変性剤の濃度としては、目的の幹領域ポリペプ
チドの不可逆的変性が生じず、かつプロテアーゼも作用
する濃度であれば良い。変性剤として尿素を使用する場
合は、0.１〜８Ｍの範囲、好ましくは１〜３Ｍの尿素の
存在下でプロテアーゼ消化を行えば良い。プロテアーゼ
処理は、セファロース等の樹脂にプロテアーゼを固定化
した樹脂を用いて行うこともでき、反応終了後、遠心分
離により簡便にプロテアーゼ固定化樹脂を除去すること
ができる。反応液中の変性剤、低分子物は透析処理によ
り除去することができ、ＨＡ分子のプロテアーゼ処理物
を調製することができる。ＨＡ分子のプロテアーゼ処理
物の分子量はゲル電気泳動を行うことにより測定するこ
とができる。

【００３８】またプロテアーゼ処理物とＣ１７９型抗体
との結合性、プロテアーゼ処理物の血球凝集活性を測定
することにより、目的の幹領域ポリペプチドの確認を行
うことができる。プロテアーゼ処理によって得られる幹
領域ポリペプチドとはＨＡ分子中の幹領域と実質上同一
の抗原性（ＡＩ３Ｃ型抗体への結合性）を有し、球状部
領域の生物活性（血球凝集活性）の欠失したポリペプチ
ドであり、ＨＡ分子中のＨＡ１の幹領域由来のポリペプ
チド部分と、ＨＡ２由来のポリペプチド部分で構成され
ている。

【００３９】また、遺伝子組換え技術や化学合成法によ
り、天然のＨＡ分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を
有し、ＨＡ分子中の球状部領域が欠失したポリペプチド
を調製し、使用しても良い。例えばＨ３Ｎ２サブタイプ
のウイルスのＲＮＡより、ＨＡ遺伝子を調製し、該遺伝
子中の球状部領域をコードする部位を制限酵素により切
断、除去した後、ベクターに組込み、動物細胞、例えば
ＣＶ−１細胞で発現させることによって、目的のポリペ
プチドを得ることができる。また、ＨＡ遺伝子をベクタ
ーに組込んだ後、ＰＣＲ法により、ＨＡ遺伝子中の球状
部領域をコードする部位を選択的に欠失させることもで
き、該遺伝子を含有するベクターを用い、動物細胞、例
えばＣＶ−１細胞で幹領域ポリペプチドを発現させるこ
とによって、目的のポリペプチドを得ることができる。
これらの幹領域ポリペプチドの抗原性はＡＩ３Ｃ型抗体
の結合性により確認することができる。

【００４０】幹領域ポリペプチドとしては、分子内にＨ
３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子の幹領域中の共通保存領域
を有し、ＡＩ３Ｃ型抗体を誘導できるものであれば良
い。共通保存領域を有する幹領域ポリペプチドとして
は、例えば分子内に配列表の配列番号３で表されるＴＧ
ＭＲＮポリペプチド配列及び配列表の配列番号４で表さ
れるQINGKLNR（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列を有
し、該配列の立体配置が天然のＨＡ分子中の、これらの
配列と実質上同一の抗原性を有する立体配置であるポリ
ペプチドを調製し、使用しても良い。なお、幹領域ポリ
ペプチドとしては、その免疫原性に影響の無い範囲でア
ミノ酸の欠失、置換、挿入、転置、付加又は再配置され
たものでも良く、例えば幹領域ポリペプチドのＣ末端部
位及び／又はＮ末端部位ポリペプチドの一部が欠失した
ものでも良く、また、ＨＡ分子のシグナルペプチドや、
球状部領域の一部が付加されたものでも良い。

【００４１】これらのポリペプチドをワクチンとして使
用する場合、適当なキャリアーを選択すれば、その抗原
性を上昇させることができる。キャリアーとしては例え
ばアルブミン、ポリアミノ酸等を用いれば良い。本発明
のワクチンは従来の能動免疫方式で投与され得、すなわ
ち投与調剤に適合可能な方法で、予防、治療に有効で免
疫原性を有する量を１回又は頻数回投与される。またワ
クチンは通常の製剤化を行えば良く、また、免疫応答を
向上するためのアジュバンドを含んでいても良い。投与
されるポリペプチドの投与量は、使用するワクチンの性
質、製剤中の濃度、投与経路等に依存するが、通常成人
に対して１μｇ〜１００mg、好ましくは１０μｇ〜１０
mgを投与すれば良い。

【００４２】以下、本発明で使用した抗インフルエンザ
ウイルス抗体につき参考例により説明する。 参考例Ａ １．ウイルスの調製 Ｈ１Ｎ１サブタイプとしてＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ba
ngkok ／１０／８３、Ａ／Yamagata／１２０／８６、Ａ
／Osaka ／９３０／８８、Ａ／Suita ／１／８９、Ａｌ
／ＦＭ／１／４７を用いた。Ｈ２Ｎ２サブタイプとして
Ａ／Okuda ／５７、Ａ／Adachi／２／５７、Ａ／Kumamo
to／１／６５、Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ａ／Izumi ／
５／６５を用いた。Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてＡ２／Ai
chi ／２／６８、Ａ／Fukuoka ／Ｃ２９／８５、Ａ／Si
chuan ／２／８７、Ａ／Ibaraki／１／９０、Ａ／Suita
／１／９０、Ａ／Kitakyushu／１５９／９３を用い
た。Ｂ型ウイルスとしてＢ／Nagasaki／１／８７を用い
た。それぞれのウイルスを１１日齢の発育鶏卵の尿膜腔
内に接種し、３４℃で４日間培養後、各ウイルスを採取
した。

【００４３】２．モノクローナル抗体の調製 （１）参考例Ａ−１で調製したＡ／Okuda ／５７のウイ
ルス（３２０ＨＡ単位）をフロイント完全アジュバント
に使用前に懸濁し、１か月間隔で、Balb／ｃマウス腹腔
内注射により、２度免疫し、その１か月後に、同抗原
（３２０ＨＡ単位）のＰＢＳ懸濁液を用い腹腔内注射し
ブーストした。その３日後に、マウスより脾臓を摘出
し、脾細胞を調製した。マウスミエローマとしてはｐ３
×６３Ａｇ８を１０％牛胎児血清添加ＤＭＥ培地で継代
後２日間培養したものを、細胞融合前に生理食塩水で洗
浄し、調製した。次に脾細胞とミエローマ細胞を細胞数
１：５の割合で混合し、遠心分離して上清を除き、沈殿
した細胞塊を充分ほぐした後、かくはんしながら、１ml
の混合液〔ポリエチレングリコール−４０００（２
ｇ）、ＭＥＭ（２ml）、ジメチルスルホキシド〕に加
え、５分間３７℃に保温した後、液の全量が１０mlにな
るようにゆっくりＭＥＭを加えた。次に、遠心分離後、
上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした。これに正常培
地〔ＰＲＭＩ−１６４０に牛胎児血清１０％を加えたも
の〕３０mlを加え、メスピペットを用いてゆるやかに細
胞を懸濁した。

【００４４】懸濁液を９６穴の培養プレートに分注し、
５％のＣＯ₂ を含む培養器中で、３７℃で２４時間培養
した。次にＨＡＴ培地を加え、１０〜１４日間培養し
た。続いて培養上清の一部を採り、ハイブリドーマのス
クリーニングを行った。

【００４５】（２）インフルエンザＡ型ウイルスのサブ
タイプ間で交さ反応するモノクローナル抗体を得るため
に、希釈していない、上記培養上清を１次抗体として用
い、３種のサブタイプ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ
２）のそれぞれに感染したＭＤＣＫ細胞の染色試験を行
った。染色試験は前出のジャーナル オブ クリニカル
ミクロバイオロジーに記載の方法に準じて行った。すな
わち９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３０
７２：ベクトン ディキンソン社製）上で、ヒトインフ
ルエンザＡ型ウイルスの各サブタイプ株（Ｈ１Ｎ１：Ａ
／yamagata／１２０／８６、Ｈ２Ｎ２：Ａ／Okuda ／５
７、Ｈ３Ｎ２：Ａ／Fukuoka ／Ｃ２９／８５）に感染さ
せたＭＤＣＫ細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ7.４）で洗浄後、無
水エタノールで室温下、１０分間固定した。次にこれら
の細胞を４種類の抗体〔モノクローナル抗体を含有する
前記培養上清、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清
（オルガノテクニカ社製）の１０００倍希釈液、ヤギ抗
ウサギイムノグロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社
製）の５００倍希釈液、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペ
ルオキシダーゼ複合体（オルガノテクニカ社製）の１０
００倍希釈液〕で連続的に、４０分間ずつ反応させ、処
理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反
応を、0.０１％のＨ₂ Ｏ₂ と0.３mg／mlの３，３′−ジ
アミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液を用い、グラハ
ム、カルノフスキー( Graham、Karnovsky )の方法〔ジ
ャーナル オブ ヒストケミストリー アンド サイト
ケミストリー（Ｊ．Histochem. Cytochem. )、第１４
巻、第２９１〜３０２頁（１９６６）〕で行った。染色
された細胞は通常の光学顕微鏡で観察し、Ｈ１Ｎ１サブ
タイプ感染のＭＤＣＫ細胞及びＨ２Ｎ２サブタイプ感染
のＭＤＣＫ細胞をそれぞれ認識する抗体を選抜した。次
に該抗体産生の確認された細胞が増殖している穴の細胞
を取り出し、限界希釈法を３回行い、目的の細胞をクロ
ーニングし、クローニングされたハイブリドーマ株をHy
bridoma Ｃ１７９、該ハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体をモノクローナル抗体Ｃ１７９と命名し
た。

【００４６】なお、Hybridoma Ｃ１７９は、Hybridoma
Ｃ１７９と表示して、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ ＢＰ−４５１７として寄託されている。

【００４７】（３）プリスタン処理したBalb／ｃマウス
に上記ハイブリドーマ株を５×１０⁶個／匹マウスの腹
腔内に投与した。１０〜２１日後に、腹水ガンが誘発さ
れたマウスから腹水を採り、３０００rpm ／５分の遠心
処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。腹水
液１ml中には約５mgのモノクローナル抗体Ｃ１７９（以
下、単にＣ１７９と略す）が含有されていた。Ｃ１７９
はプロテインＡ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）で精製され、ＩｇＧ２ａタイプの抗体であった。

【００４８】３．モノクローナル抗体の性状 （１）参考例Ａ−２−（３）記載の腹水液の１００倍希
釈液を段階希釈し、参考例Ａ−２−（２）記載の染色試
験を行い、Ｃ１７９の抗原認識性を検討した。Ｈ１Ｎ１
サブタイプとしてはＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Bangkok
／１０／８３、Ａ／Yamagata／１２０／８６、Ａ／Osak
a ／９３０／８８、Ａ／Suita ／１／８９、Ａ１／ＦＭ
／１／４７、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてはＡ／Okuda ／
５７、Ａ／Adachi／２／５７、Ａ／Kumamoto／１／６
５、Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ａ／Izumi ／５／６５、
Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてＡ／Aichi ／２／６８、Ａ／
Fukuoka ／Ｃ２９／８５、Ａ／Sichuan ／２／８７、Ａ
／Ibaraki ／１／９０、Ａ／Suita ／１／９０、Ａ／Ki
takyushu／１５９／９３、更にインフルエンザＢ型ウイ
ルスとしてＢ／Nagasaki／１／８７を用いた。Ｃ１７９
はすべてのＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプ
を認識し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、Ｂ型ウイルスは認識し
なかった。

【００４９】（２）抗体の中和活性測定は前出のインフ
ルエンザウイルス迅速フォーカスリダクション中和試験
を、アーカイブズ オブ ビロロジー( Arch. Virol.
)、第８６巻、第１２９〜１３５頁（１９８５）、ミク
ロバイオロジー アンド イムノロジー( Microbiol. I
mmunol. ) 、第２９巻、第３２７〜３３５頁（１９８
５）に準じて行った。抗体としては参考例Ａ−２−
（３）の腹水液を用い、該抗体は使用前に３倍容のレセ
プター分解酵素（ＲＤＥ：武田薬品工業社製）溶液を加
え、３７℃、１８時間反応後、５６℃、４５分間の加熱
処理でＲＤＥを失活させ、最終的に腹水液の１６倍希釈
液として調製し、被検液とし、次の様に測定を行った。

【００５０】すなわち９６穴マイクロプレートにＭＤＣ
Ｋ細胞を１０⁴ 個／穴、分注し、翌日、前記抗体（１６
倍希釈液）の４段階希釈液と、３０フォーカス形成単位
／穴に調製した参考例Ａ−３−（１）記載のそれぞれの
ウイルス液を等量混合し、３７℃で１時間保温した。次
にこの混合液の２５μｌを、前記ＭＤＣＫ細胞の入った
マイクロタイタプレートの各穴に分注し、３０分間、３
７℃で保温した。次に各穴中の溶液を除去し、ＰＢＳで
各穴を洗浄し、次に0.５％トラガカンスガム（和光純
薬）及び５μｇ／mlのトリプシンを含有するＭＥＭを添
加した。３７℃で２０〜２４時間、保温後、添加液を除
去し、各穴をＰＢＳで洗浄後、細胞を、室温下、無水エ
タノールで１０分間処理し、細胞を固定した。次に乾燥
し、参考例Ａ−２−（２）記載の染色試験に準じ、細胞
の染色を行った。染色後、細胞を水道水で洗浄し、乾燥
後、光学顕微鏡下、染色されたフォーカス数を、計測し
た。

【００５１】Ｃ１７９は、すべてのＨ１Ｎ１サブタイプ
及びＨ２Ｎ２サブタイプのフォーカス形成を阻害し、強
いウイルス中和活性を示し、一方、Ｈ３Ｎ２サブタイ
プ、Ｂ型ウイルスのフォーカス形成には影響を与えなか
った。また、プラークリダクション中和試験においても
同様な結果を示した。

【００５２】（３）抗体の血球凝集阻害活性（ＨＩ）は
次の様に行った。参考例Ａ−３−（２）と同様にＲＤＥ
処理した抗体（３２倍希釈液）を用い、段階希釈液を調
製し、次に参考例Ａ−３−（１）記載の各ウイルス（１
６ＨＡ単位）と混合し、室温で３０分間反応させた。そ
の後、ニワトリ赤血球を加えよく混和し、各ウイルスの
血球凝集活性に及ぼす抗体の影響を検討した。Ｃ１７９
はすべてのサブタイプのウイルスの血球凝集活性に影響
を与えなかった。

【００５３】（４）抗体の融合阻止活性測定は前出のネ
ーチャー、第３００巻、第６５８〜６５９頁（１９８
２）の方法を改変し行った。すなわち、ＣＶ−１細胞の
モノレーヤー培養物に、参考例Ａ−３−（１）記載の各
ウイルス株をそれぞれ感染させた。２４時間後に、細胞
をＤＭＥＭで２回洗浄し、次にトリプシン添加（１０μ
ｇ／ml）のＤＭＥＭ中で１５分間、３７℃で保温した。
次に細胞をＤＭＥＭで２度洗浄後、参考例Ａ−２−
（３）の腹水液のＤＭＥＭ希釈液を添加し、３７℃で３
０分間保温した。その後、細胞を、ｐＨ5.０に調整した
融合培地（Ｎａ₂ ＣＯ₃無添加のＰＲＭＩ、0.２％ウシ
血清アルブミン、１０mM ＭＥＳ、１０mM ＨＥＰＥ
Ｓ）にて、３７℃、２分間処理し、続いて、ＤＭＥＭで
２回洗浄し、融合培地を除去した後、２％ウシ胎児血清
を含むＤＭＥＭで３７℃、３時間保温した。次に、無水
メタノールで細胞を固定し、ギムザ染色した後、光学顕
微鏡でポリカリオン形成の有無を判定した。Ｃ１７９
は、すべてのＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイ
プのポリカリオン形成を阻止し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ及
びＢ型ウイルスのポリカリオン形成は阻止しなかった。

【００５４】以上、Ｃ１７９はＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ
２Ｎ２サブタイプを特異的に認識し、ウイルスの膜融合
を阻害し、中和活性を示す抗体であった。これらの結果
を表１に示す。

【００５５】

【表１】

【００５６】表中の数字は参考例Ａ−２−（３）の腹水
液の希釈倍数であり、染色力価は染色試験で細胞を染色
可能な該腹水液の最大希釈倍数、中和活性においては対
照の抗体無添加区のフォーカス数の半分まで、フォーカ
スの出現を抑制可能な該腹水液の最大希釈倍数を示す。
また＋はポリカリオン形成が１０００倍希釈の該腹水液
の抗体溶液で完全に阻害されることを意味し、−は１０
倍希釈の該腹水液を用いた時にも全く阻害がみられなか
ったことを意味する。また、３２倍希釈の該腹水液を用
いてもＨＩ活性は認められない。

【００５７】４．エピトープの決定 （１）Ｃ１７９の認識タンパク質がＨＡ分子であること
を免疫沈降反応によって決定した。すなわち、Ｈ２Ｎ２
サブタイプのＡ／Okuda ／５７を３０分間ＭＤＣＫ細胞
に吸着、感染させた後、培地中のメチオニンを１０μCi
の「³⁵Ｓ〕メチオニンで置換したＭＥＭで２４時間培養
し、感染細胞を標識した。次に該細胞を集め、次にＲＩ
ＰＡ緩衝液〔５０mMトリス（ｐＨ7.４）、１５０mM Ｎ
ａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％ノニデットＰ−４０、１
％デオキシコール酸、0.１％ＳＤＳ〕に再懸濁した。続
いて不溶物を遠心除去した後、上清を得た。次に該上清
をＣ１７９と混合し、１時間、４℃で保温した後、プロ
テインＡ−セファロースＣＬ４Ｂビーズを添加し、室温
で２時間保持し、免疫沈降物をビーズに吸着させた。次
に該ビーズを集め、ＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄した後、
沸騰し、Ｃ１７９の結合タンパク質を遊離させた。次に
該タンパク質のＳＤＳ−１2.５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、ゲルを固定し、１Ｍサリチル酸ナト
リウムに浸してから乾かし、オートラジオグラフィーを
行った。Ｃ１７９の結合する標識タンパク質は、その電
気泳動パターンより、Ａ／Okuda ／５７のＨＡ分子と同
定された。同様の試験をＨ１Ｎ１サブタイプ、他のＨ２
Ｎ２サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプをそれぞれ用い行
った。Ｃ１７９はすべてのＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２
Ｎ２サブタイプのＨＡ分子と特異的に免疫沈降したが、
Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子とは結合性を示さなかっ
た。

【００５８】（２）Ｃ１７９存在下でＨ１Ｎ１サブタイ
プ又はＨ２Ｎ２サブタイプで感染させたＭＤＣＫ細胞を
培養し、Ｃ１７９に感受性を示さない抗原変異株を得
た。すなわち、親株としてＨ１Ｎ１サブタイプのＡ／Su
ita ／１／８９、Ｈ２Ｎ２サブタイプのＡ／Izumi ／５
／６５を用い、該ウイルスでそれぞれ感染させたＭＤＣ
Ｋ細胞をＣ１７９存在下で培養し、Ｃ１７９存在下でも
生育可能な変異株をそれぞれＭＤＣＫ細胞のプラークよ
り純粋分離し、Ａ／Suita ／１／８９の変異株をＡ／Su
ita ／１／８９（Ｒ）、Ａ／Izumi ／５／６５の変異株
をＡ／Izumi ／５／６５（Ｒ）とそれぞれ命名した。こ
の２変異株は染色試験、中和試験で全くＣ１７９に反応
性を示さなかった。また、この変異株は両株とも、ＭＤ
ＣＫ細胞でのプラーク形成能も弱く、実験動物マウスに
は病原性を示さず、培養細胞でのみ生育可能な、弱感染
株であった。

【００５９】（３）抗体の抗原認識部位を特定するため
に、ＨＡ分子をコードする遺伝子（以下ＨＡ遺伝子と略
す）の解析を行った。 （ａ）プライマーの合成：プライマー５〜プライマー２
６をＤＮＡ合成機を用いて合成し、脱保護の後、イオン
交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム）
で精製し、セプ−パク（Ｓｅｐ−ｐａｋ）Ｃ１８で脱塩
し、各ＤＮＡ約５０μｇを得た。

【００６０】（ｂ）Ａ／Suita ／１／８９で感染させた
ＭＤＣＫ細胞を集め、グアニジンイソチオシアネートを
加え注射器で５回注入、注出を繰返し細胞を溶解させ
た。溶解後の細胞抽出液を塩化セシウム溶液に重層し、
超遠心分離を行った。遠心チューブの底の沈殿を緩衝液
に溶解し、フェノール、クロロホルム処理をしたのちエ
タノール沈殿を行い、回収したＲＮＡをウイルスゲノム
ＲＮＡのサンプルとした。次にプライマー５を用いてｃ
ＤＮＡを合成し、続いて、プライマー５、プライマー６
を用いてＰＣＲ法により、該合成ｃＤＮＡの増幅を行っ
た。次に増幅ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離
し、ＨＡ遺伝子に対応する1.７kbp のｃＤＮＡのバンド
を溶出した。このｃＤＮＡをプライマー５、６を用い、
ＰＣＲ法により更に増幅し、増幅フラグメントを２０％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、2.５Ｍ
ＮａＣｌ溶液を６０％（ｖ／ｖ）加え遠心分離し、沈殿
精製画分を得た。

【００６１】次に〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰでラベルされたＨ
１Ｎ１サブタイプのシークエンシング用プライマー、プ
ライマー７〜１４を用い、精製された遺伝子の塩基配列
を、前述バイオテクニクス記載のサーマルサイクラーを
利用したジデオキシ法で次の様に行った。すなわち、２
pmolのプライマーと１pmolの精製フラグメントを９５
℃、３分間加熱し、急冷することによりアニーリングさ
せた。次にタックポリメラーゼを加え、デオキシヌクレ
オチドとジデオキシヌクレオチドを含む緩衝液中で７２
℃、１０分間保温し、ポリメラーゼ伸長反応を行った。
その後伸長反応を完全に行うため、サーマルサイクラー
の反応へと移した。サーマルサイクラーの条件は９０
℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、３分間のサイク
ルを１０回行った。次にサイクル終了物をホルムアミド
存在下で９５℃３分間加熱した後氷中で急冷したものを
８％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動
後のゲルは乾燥させＸ線フィルムによる露光の後、塩基
配列を読み取ってゆき、配列表の配列番号２７に示すＨ
Ａ遺伝子全体の塩基配列を決定した。

【００６２】（ｃ）Ａ／Suita ／１／８９（Ｒ）のＨＡ
遺伝子の塩基配列の解析を、参考例Ａ−４−（３）−
（ｂ）の方法に準じて行い、そのＨＡ遺伝子全体の塩基
配列を決定し、親株のＨＡ遺伝子との比較を行った。変
異株のＨＡ遺伝子には３か所のヌクレオチド置換があっ
た。すなわち、配列表の配列番号２７で示した親株のＨ
Ａ遺伝子の塩基番号６２７番のＧがＡに、塩基番号７３
６番のＧがＡに、塩基番号１０１８番のＣがＡにそれぞ
れ変異していた。ＨＡ分子はプロテアーゼによって１か
所切断されることによって、ウイルスの感染性が活性化
されるが、該プロテアーゼ切断後の大きい方のポリペプ
チドをＨＡ１、小さい方がＨＡ２と呼ばれている。そし
てこれら両ポリペプチドはＳ−Ｓ結合により結ばれてい
るが、今回の変異は、ＨＡ１の１８９、２２５及び３１
８番目においてアミノ酸置換を伴うものであった。アミ
ノ酸残基１８９番及び２２５番は高度に可変な領域にあ
り、３１８番目の置換、Ｔｈｒ→Ｌｙｓ（ヌクレオチド
レベルではＡＣＡ→ＡＡＡ）が変異株のＣ１７９への無
反応性を担っていた。なお、本明細書におけるＨＡ分子
のアミノ酸番号は、ウイルス( Virus ) 、第１１巻、第
２５７〜２６６頁（１９６１）に記載のＨ３番号法に基
づく。

【００６３】（ｄ）Ａ／Izumi ／５／６５及びＡ／Izum
i ／５／６５（Ｒ）のそれぞれのＨＡ遺伝子の塩基配列
の解析を、参考例Ａ−４−（３）−（ｂ）の方法に準
じ、ただし、Ｈ２Ｎ２サブタイプのシークエンシング用
プライマー、プライマー１５〜２３を用い行った。Ａ／
Izumi ／５／６５のＨＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配
列番号２８に示す。変異株のＨＡ遺伝子には１か所のヌ
クレオチド置換があった。配列番号２８で示した親株の
ＨＡ遺伝子の塩基番号１１９７番のＴがＡに変異してお
り、この変異はＨＡ２の５２番目においてアミノ酸置換
を伴うものであり、この５２番目の置換、Ｖａｌ→Ｇｌ
ｕ（ヌクレオチドレベルではＧＴＡ→ＧＡＡ）が変異株
のＣ１７９の無反応性を担っていた。

【００６４】（ｅ）Ｈ１Ｎ１サブタイプのＡ／ＰＲ／８
／３４、Ａ／Bangkok ／１０／８３、Ａ／Yamagata／１
２０／８６、Ａ／Osaka ／９３０／８８、Ｈ２Ｎ２サブ
タイプのＡ／Okuda ／５７、Ａ／Adachi／２／５７、Ａ
／Kumamoto／１／６５、Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ｈ３
Ｎ２サブタイプのＡ２／Aichi ／２／６８、Ａ／Fukuok
a ／Ｃ２９／８５、Ａ／Sichuan ／２／８７、Ａ／Ibar
aki ／１／９０、Ａ／Suita ／１／９０のＨＡ分子のＨ
Ａ１の３１８番目付近のアミノ酸配列、ＨＡ２の５２番
目付近のアミノ酸配列を特定するために、各ＨＡ遺伝子
の一部の塩基配列の解析を行った。

【００６５】Ｈ１Ｎ１サブタイプについては、参考例Ａ
−４−（３）−（ｂ）の方法に準じ各ウイルスのＲＮＡ
ゲノムのｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡに対してプラ
イマー９、１３を用いてＰＣＲ増幅を行った。得られた
ＤＮＡ断片を鋳型としてプライマー１１、１２を用い、
サーマルサイクラーを利用したジデオキシ法にて塩基配
列を決定した。

【００６６】Ｈ２Ｎ２株については参考例Ａ−４−
（３）−（ｂ）の方法に準じ各ウイルスのＲＮＡゲノム
のｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡに対してプライマー
１７、２１を用いてＰＣＲ増幅を行った。得られたＤＮ
Ａ断片を鋳型としてプライマー１９、２０を用い、同様
にジデオキシ法にて塩基配列を決定した。

【００６７】Ｈ３Ｎ２株については参考例Ａ−４−
（３）−（ｂ）の方法に準じウイルスゲノムＲＮＡに対
するｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡに対してプライマ
ー２４、２６を用いＰＣＲ増幅を行った。得られたＤＮ
Ａ断片を鋳型としてプライマー２５、２６を用い、同様
にジデオキシ法にて塩基配列を決定した。

【００６８】Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ
には、配列表の配列番号１で表されるＨＡ１領域の３１
８〜３２２番のＴＧＬＲＮポリペプチド配列（Ａ領
域）、及び配列表の配列番号２で表されるＨＡ２領域の
４７〜５８番のGITNKVNSVIEKポリペプチド配列（Ｂ領
域）が保存されており、一方、Ｈ３Ｎ２サブタイプに
は、配列表の配列番号３で表されるＨＡ１領域の３１８
〜３２２番のＴＧＭＲＮポリペプチド配列（Ａ′領域）
と、配列表の配列番号４で表されるＨＡ２領域の４７〜
５８番のQINGKLNR（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列
（Ｂ′領域）が保存されている。Ａ領域とＡ′領域は１
アミノ酸が異なり、Ｂ領域とＢ′領域は５〜６アミノ酸
残基の差が認められる。この両領域の差が抗体の抗原認
識性の差であり、血清学的及び融合阻害試験において、
抗体がＨ３Ｎ２サブタイプと反応できなかった原因であ
る。

【００６９】図１に示す様に、Ａ領域の配列表の配列番
号１で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列とＢ領域の
配列表の配列番号２で表されるGITNKVNSVIEKポリペプチ
ド配列は、ＨＡ分子の幹領域の中央で互いに近接して位
置しており、Ｃ１７９は該両配列を認識しており、該部
位がＣ１７９のエピトープである。Ｃ１７９は、このＨ
Ａ分子の幹領域に結合し、ＨＡ分子の膜融合機能を阻害
し、ウイルスを中和する。

【００７０】Ｈ１Ｎ１サブタイプ：配列表の配列番号２
７に示したＡ／Suita ／１／８９のＨＡ遺伝子の塩基番
号１０１７〜１０３１がＡ領域をコードし、塩基番号１
１９１〜１２２６がＢ領域をコードしている。配列表の
配列番号２９はＡ／ＰＲ／８／３４のＨＡ遺伝子の一部
を示し、その塩基番号７６〜９０はＡ領域をコードし、
その塩基番号２５０〜２８５はＢ領域をコードしてい
る。配列表の配列番号３０はＡ／Bangkok ／１０／８３
のＨＡ遺伝子の一部を示し、その塩基番号７６〜９０は
Ａ領域をコードし、その塩基番号２５０〜２８５はＢ領
域をコードしている。配列表の配列番号３１はＡ／Yama
gata／１２０／８６のＨＡ遺伝子の一部を示し、その塩
基番号７６〜９０はＡ領域をコードし、その塩基番号２
５０〜２８５はＢ領域をコードしている。配列表の配列
番号３２はＡ／Osaka ／９３０／８８のＨＡ遺伝子の一
部を示し、その塩基番号７６〜９０はＡ領域をコード
し、その塩基番号２５０〜２８５はＢ領域をコードして
いる。

【００７１】Ｈ２Ｎ２サブタイプ：配列表の配列番号２
８で示したＡ／Izumi ／５／６５のＨＡ遺伝子の塩基番
号１００７〜１０２１がＡ領域をコードし、塩基番号１
１８１〜１２１６がＢ領域をコードしている。配列表の
配列番号３３はＡ／Okuda ／５７のＨＡ遺伝子の一部を
示し、その塩基番号９４〜１０８はＡ領域をコードし、
その塩基番号２６８〜３０３はＢ領域をコードしてい
る。配列表の配列番号３４はＡ／Adachi／２／５７のＨ
Ａ遺伝子の一部を示し、その塩基番号１０３〜１１７は
Ａ領域をコードし、その塩基番号２７７〜３１２はＢ領
域をコードしている。配列表の配列番号３５はＡ／Kuma
moto／１／６５のＨＡ遺伝子の一部を示し、その塩基番
号１０４〜１１８はＡ領域をコードし、その塩基番号２
７８〜３１３はＢ領域をコードしている。配列表の配列
番号３６はＡ／Kaizuka ／２／６５のＨＡ遺伝子の一部
を示し、その塩基番号８８〜１０２はＡ領域をコード
し、その塩基番号２６２〜２９７はＢ領域をコードして
いる。

【００７２】Ｈ３Ｎ２サブタイプ：配列表の配列番号３
７はＡ２／Aichi ／２／６８、配列番号３８はＡ／Fuku
oka ／Ｃ２９／８５、配列番号３９はＡ／Sichuan ／２
／８７、配列番号４０はＡ／Ibaraki ／１／９０、配列
番号４１はＡ／Suita ／１／９０のそれぞれのＨＡ遺伝
子の一部を示し、それぞれの塩基番号８４〜９８はＡ′
領域をコードし、それぞれの塩基番号２５８〜２９３は
Ｂ′領域をコードしている。

【００７３】 ５．インフルエンザウイルスに対する予防効果 インフルエンザウイルスのマウス感染実験を行い、Ｃ１
７９の予防効果を調べた。１０匹のBalb／ｃマウスにＣ
１７９のＰＢＳ溶液（１mg／ml）１匹当り１mlずつ腹腔
内に投与した。１日後に１０００倍希釈したＨ１Ｎ１サ
ブタイプのＡ１／ＦＭ／１／４７（４０００ＨＡ単位）
を２５μｌずつ鼻腔内接種した。対照として１２匹のマ
ウスにはウイルスだけを接種した。

【００７４】図３に示す様に、対照群のマウスは８匹死
亡（５日後に２匹、６日後に５匹、８日後に１匹）し
た。また、他の生存マウスは著しく、衰弱していた。一
方、Ｃ１７９を投与したマウスは正常であり、１４日を
経過しても、すべて元気であった。図３はＣ１７９の投
与群、非投与群の生存率を示す図であり、縦軸は生存
率、横軸はウイルス感染後の日数を表す。

【００７５】参考例Ｂ １．ウイルスの調製 Ｈ５Ｎ３サブタイプとしてはＡ／whistling swan／shim
ane ／４７６／８３、Ｈ６Ｎ６サブタイプとしてはＡ／
whistling swan／shimane ／３７／８０、Ｈ７Ｎ７サブ
タイプとしてはＡ／turfted duck／shimane ／１２４Ｒ
／８０、Ｈ８Ｎ４サブタイプとしてはＡ／turky ／Onta
rio ／６１１８／６８、Ｈ１０Ｎ７サブタイプとしては
Ａ／chicken ／Germany " Ｎ "／４９を用い、それぞれ
のウイルスを１１日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に接種し、
３４℃で４日間培養後、各ウイルスを採取した。これら
のウイルス株はいずれも大阪大学微生物病研究所保存株
であり、Ａ／chicken ／Germany " Ｎ "／４９のＨＡ分
子には配列表の配列番号３、４でそれぞれ表されるアミ
ノ酸配列が保存されている。

【００７６】２．モノクローナル抗体の調製 （１）参考例Ａ−１で調製したＡ２／Aichi ／２／６８
のウイルス（３２０ＨＡ単位）をフロイント完全アジュ
バントに使用前に懸濁し、１か月間隔で、Balb／ｃマウ
ス腹腔内注射により、２度免疫し、その１か月後に、同
抗原（３２０ＨＡ単位）のＰＢＳ懸濁液を用い腹腔内注
射しブーストした。その３日後に、マウスより脾臓を摘
出し、脾細胞を調製した。マウスミエローマとしてはｐ
３×６３Ａｇ８を１０％牛胎児血清添加ＤＭＥ培地で継
代後２日間培養したものを、細胞融合前に生理食塩水で
洗浄し、調製した。次に脾細胞とミエローマ細胞を細胞
数１：５の割合で混合し、遠心分離して上清を除き、沈
殿した細胞塊を充分ほぐした後、かくはんしながら、１
mlの混合液〔ポリエチレングリコール−４０００（２
ｇ）、ＭＥＭ（２ml）、ジメチルスルホキシド〕に加
え、５分間３７℃に保温した後、液の全量が１０mlにな
るようにゆっくりＭＥＭを加えた。次に、遠心分離後、
上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした。これに正常培
地〔ＰＲＭＩ−１６４０に牛胎児血清１０％を加えたも
の〕３０mlを加え、メスピペットを用いてゆるやかに細
胞を懸濁した。

【００７７】懸濁液を９６穴の培養プレートに分注し、
５％のＣＯ₂ を含む培養器中で、３７℃で２４時間培養
した。次にＨＡＴ培地を加え、１０〜１４日間培養し
た。続いて培養上清の一部を採り、ハイブリドーマのス
クリーニングを行った。

【００７８】（２）インフルエンザＡ型ウイルスのＨ３
Ｎ２タイプに保存されているＡ′領域、Ｂ′領域に反応
するモノクローナル抗体を得るために、希釈していな
い、上記培養上清を１次抗体として用い、３種のサブタ
イプ（Ｈ３Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１Ｎ１）のそれぞれに
感染したＭＤＣＫ細胞の染色試験を行った。染色試験は
参考例Ａ−２−（２）に記載の方法に準じて行った。す
なわち９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３
０７２：ベクトン ディキンソン社製）上で、ヒトイン
フルエンザＡ型ウイルスの各サブタイプ株（Ｈ３Ｎ２：
Ａ２／Aichi ／２／６８、Ｈ１０Ｎ７：Ａ／chicken ／
Germany " Ｎ "／４９、Ｈ１Ｎ１：Ａ／ＰＲ／８／３
４）に感染させたＭＤＣＫ細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ7.４）
で洗浄後、無水エタノールで室温下、１０分間固定し
た。次にこれらの細胞を４種類の抗体〔モノクローナル
抗体を含有する前記培養上清、ウサギ抗マウスイムノグ
ロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社製）の１０００倍
希釈液、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ血清（オルガ
ノテクニカ社製）の５００倍希釈液、ペルオキシダーゼ
−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体（オルガノテクニカ
社製）の１０００倍希釈液〕で連続的に、４０分間ずつ
反応させ、処理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオ
キシダーゼ反応を、0.０１％のＨ₂ Ｏ₂ と0.３mg／mlの
３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液を用
い、グラハム、カルノフスキー( Graham、Karnovsky )
の方法で行った。染色された細胞は通常の光学顕微鏡で
観察し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ感染のＭＤＣＫ細胞及びＨ
１０Ｎ７サブタイプ感染のＭＤＣＫ細胞をそれぞれ認識
する抗体を選抜した。次に該抗体産生の確認された細胞
が増殖している穴の細胞を取り出し、限界希釈法を３回
行い、目的の細胞をクローニングし、クローニングされ
たハイブリドーマ株をHybridoma ＡＩ３Ｃ、該ハイブリ
ドーマが産生するモノクローナル抗体をモノクローナル
抗体ＡＩ３Ｃと命名した。なお、該モノクローナル抗体
ＡＩ３Ｃの製品名はモノクローナル抗体Ｆ４９（宝酒造
社製）である。

【００７９】このHybridoma ＡＩ３Ｃは、Hybridoma Ａ
Ｉ３Ｃと表示して、工業技術院生命工学工業技術研究所
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６として寄託されている。

【００８０】（３）プリスタン処理したBalb／ｃマウス
に上記ハイブリドーマ株を５×１０⁶個／匹マウスの腹
腔内に投与した。１０〜２１日後に、腹水ガンが誘発さ
れたマウスから腹水を採り、３０００rpm ／５分の遠心
処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。腹水
液１ml中には約５mgのモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃ（以
下、単にＡＩ３Ｃと略す）が含有されていた。ＡＩ３Ｃ
はプロテインＡ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）で精製された。

【００８１】３．モノクローナル抗体の性状 （１）参考例Ｂ−２−（３）記載の腹水液の１００倍希
釈液を段階希釈し、参考例Ａ−２−（２）記載の染色試
験を行い、ＡＩ３Ｃの抗原認識性を検討した。Ｈ１Ｎ１
サブタイプとしてはＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Bangkok
／１０／８３、Ａ／Yamagata／１２０／８６、Ａ／Osak
a ／９３０／８８、Ａ／Suita ／１／８９、Ａ１／ＦＭ
／１／４７、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてはＡ／Okuda ／
５７、Ａ／Adachi／２／５７、Ａ／Kumamoto／１／６
５、Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ａ／Izumi ／５／６５、
Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてＡ／Aichi ／２／６８、Ａ／
Fukuoka ／Ｃ２９／８５、Ａ／Sichuan ／２／８７、Ａ
／Ibaraki ／１／９０、Ａ／Suita ／１／９０、Ａ／Ki
takyushu／１５９／９３、更にインフルエンザＢ型ウイ
ルスとしてＢ／Nagasaki／１／８７を用い、参考例Ｂ−
１記載のウイルスも用いた。ＡＩ３ＣはすべてのＨ３Ｎ
２サブタイプ及びＡ／chicken ／German" Ｎ "／４９を
認識し、他のサブタイプ、Ｂ型ウイルスは認識しなかっ
た。

【００８２】（２）抗体の血球凝集阻害活性（ＨＩ）は
次の様に行った。参考例Ａ−３−（２）と同様にＲＤＥ
処理した抗体（３２倍希釈液）を用い、段階希釈液を調
製し、次に参考例Ｂ−３−（１）、及び参考例Ｂ−１記
載の各ウイルス（１６ＨＡ単位）と混合し、室温で３０
分間反応させた。その後、ニワトリ赤血球を加えよく混
和し、各ウイルスの血球凝集活性に及ぼす抗体の影響を
検討した。ＡＩ３Ｃはすべてのサブタイプのウイルスの
血球凝集活性に影響を与えなかった。

【００８３】エピトープの決定 （１）ＡＩ３Ｃの認識タンパク質がＨＡ分子であること
を免疫沈降反応によって決定した。すなわち、Ｈ３Ｎ２
サブタイプのＡ／Aichi ／２／６８を３０分間ＭＤＣＫ
細胞に吸着、感染させた後、培地中のメチオニンを１０
μCiの「³⁵Ｓ〕メチオニンで置換したＭＥＭで２４時間
培養し、感染細胞を標識した。次に該細胞を集め、次に
ＲＩＰＡ緩衝液〔５０mMトリス（ｐＨ7.４）、１５０mM
ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％ノニデットＰ−４
０、１％デオキシコール酸、0.１％ＳＤＳ〕に再懸濁し
た。続いて不溶物を遠心除去した後、上清を得た。次に
該上清をＡＩ３Ｃと混合し、１時間、４℃で保温した
後、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂビーズを添加
し、室温で２時間保持し、免疫沈降物をビーズに吸着さ
せた。次に該ビーズを集め、ＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄
した後、沸騰し、ＡＩ３Ｃの結合タンパク質を遊離させ
た。次に該タンパク質のＳＤＳ−１2.５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、ゲルを固定し、１Ｍサリチ
ル酸ナトリウムに浸してから乾かし、オートラジオグラ
フィーを行った。ＡＩ３Ｃの結合する標識タンパク質
は、その電気泳動パターンより、Ａ２／Aichi ／２／６
８のＨＡ分子と同定された。同様の試験をＨ１Ｎ１サブ
タイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ、他のＨ３Ｎ２サブタイプ
及び参考例Ｂ−１記載のウイルスをそれぞれ用い行っ
た。ＡＩ３ＣはすべてのＨ３Ｎ２サブタイプ及びＡ／ch
icken ／Germany " Ｎ "／４９のＨＡ分子と特異的に免
疫沈降したが、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタ
イプのＨＡ分子とは結合性を示さなかった。

【００８４】

【実施例】以下に本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００８５】実施例１ 抗原ポリペプチドの作製 （１）プライマーの合成：Ｈ２Ｎ２サブタイプの（−）
鎖ＲＮＡの３′末端に相補的な配列を含有するオリゴヌ
クレオチドプライマー（プライマー２７、プライマー２
８）、及び（＋）鎖ＲＮＡの３′末端に相補的な配列を
含有するオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー２
９、プライマー３０）をＤＮＡ合成機を用いて合成し、
脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ＤＥＡ
Ｅ−２ＳＷカラム）で精製し、セプ−パク（Ｓｅｐ−ｐ
ａｋ）Ｃ１８で脱塩し、各ＤＮＡ約５０μｇを得た。プ
ライマー２７〜３０のそれぞれの塩基配列を配列表の配
列番号４２〜４５に示す。

【００８６】（２）Ａ／Okuda ／５７で感染させたＭＤ
ＣＫ細胞を集め、グアニジンイソチオシアネートを加え
注射器で５回注入、注出を繰返し細胞を溶解させた。溶
解後の細胞抽出液を塩化セシウム溶液に重層し、超遠心
分離を行った。遠心チューブの底の沈殿を緩衝液に溶解
し、フェノール、クロロホルム処理をしたのちエタノー
ル沈殿を行い、回収したＲＮＡをウイルスゲノムＲＮＡ
のサンプルとした。次にプライマー５を用いてｃＤＮＡ
を合成し、続いて、プライマー２７、プライマー２９を
用いてＰＣＲ法により、該合成ｃＤＮＡの増幅を行っ
た。次に増幅ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離
し、ＨＡ遺伝子に対応する1.８kbp のｃＤＮＡのバンド
を溶出した。このｃＤＮＡをプライマー２８、３０を用
い、ＰＣＲ法により更に増幅し、1.８kbp の２次増幅Ｄ
ＮＡフラグメントを２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリ
コール６０００、2.５Ｍ ＮａＣｌ溶液を６０％（ｖ／
ｖ）加え遠心分離し、沈殿精製画分を得た。

【００８７】（３）Ａ／Okuda ／５７のＨＡ遺伝子の塩
基配列の解析を、参考例Ａ−４−（３）−（ｂ、ｄ）の
方法に準じて行った。Ａ／Okuda ／５７のＨＡ遺伝子の
塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号４６に示
す。配列番号４６において、塩基番号１〜５はプライマ
ー３０由来の配列、塩基番号６〜４８はノンコーディン
グ領域、塩基番号４９〜９３はシグナルペプチドをコー
ドする領域、塩基番号９４〜２３１は、幹領域のＮ末端
側をコードする領域、塩基番号２３２〜８７３は球状部
領域をコードする領域、塩基番号８７４〜１７３４は幹
領域のＣ末端側をコードする領域、塩基番号１７３５〜
１７７５はノンコーディング領域、塩基番号１７７６〜
１７８３はプライマー３０由来の配列である。

【００８８】（４）プラスミドの作製 （ａ）実施例１−（３）で調製した1.８kbp の２次増幅
ＤＮＡフラグメントの末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑化した。次に平滑化フラグメントと、プラス
ミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造社製）のＳｍａＩ切断物
（2.７kbp ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーション
し、ＨＡ遺伝子の組込まれたプラスミドを作製した。次
に該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得ら
れたカナマイシン耐性の形質転換株よりプラスミドを分
離した。該プラスミドはプラスミドｐＨ２−２９９と命
名した。

【００８９】プラスミドｐＨ２−２９９で形質転換した
大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichiacoli JM109／pH2-299
と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１３４３１として寄託されている。

【００９０】（ｂ）プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ〔ニュー
クレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Rese
arch）、第１８巻、第５３２２頁（１９９０）〕のＡａ
ｔII切断物と、プラスミドｐＭＡＭ_neo-s （クロンテッ
ク社製）をＢａｍＨＩで切断して得られる2.６kbp のＢ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲ
ーションし、2.６kbp のＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片が組込
まれた動物細胞、大腸菌用シャトルベクターのプラスミ
ドを作製した。次に該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換株よ
りプラスミドを分離し、分離プラスミドをプラスミドpE
F-BOS/NeoAと命名した。

【００９１】プラスミドｐＨ２−２９９をＮｈｅＩで切
断し、配列表の配列番号４６で表されるｃＤＮＡの塩基
番号４〜１７８０の配列の1.８kbp のＤＮＡ断片を調製
した。次に該ＤＮＡ断片と、プラスミドpEF-BOS/NeoAの
ＸｂａＩ切断物（7.９kbp ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
ライゲーションし、ＨＡ遺伝子の組込まれたシャトルベ
クターを作製した。次に該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換
株よりプラスミドを分離した。該プラスミドはプラスミ
ドｐＥＢＮａＨ２と命名した。また該プラスミドで形質
転換した大腸菌ＪＭ１０９株をEscherichia coli JM109
/pEBNaH2と命名した。

【００９２】（ｃ）配列表の配列番号４７、４８で表さ
れるオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー３１、
プライマー３２）をＤＮＡ合成機を用いて合成し、脱保
護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ＤＥＡＥ−
２ＳＷカラム）で精製し、セプ−パク（Ｓｅｐ−ｐａ
ｋ）Ｃ１８で脱塩し、各ＤＮＡ約５０μｇを得た。プラ
イマー３１は配列表の配列番号４６で表されるＨＡ遺伝
子の塩基番号２０７〜２３１のＤＮＡ配列に相当するｍ
ＲＮＡに対しアンチセンス鎖のプライマーであり、プラ
イマー３２は塩基番号８７４〜８９９のＤＮＡ配列に相
当するｍＲＮＡに対してセンス鎖のプライマーである。

【００９３】プライマー３１及びプライマー３２を用い
ることにより、プラスミドｐＨ２−２９９よりＨＡ遺伝
子の球状部領域をコードする領域のみを除いた3.８kbp
のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ法での増幅を試みた。Es
cherichia coli JM109/pH2-299（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４
３１）よりプラスミドｐＨ２−２９９を調製し、該プラ
スミド0.０５pmol、プライマー３１、プライマー３２各
５０pmolを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は９０
℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、３分間のサイク
ルを２５回行い、3.８kbp のＤＮＡ増幅物を調製した。
次にこの3.８kbp のＤＮＡフラグメントをＴ４カイネー
スを用いてリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、環
状プラスミドを調製した。次に該プラスミドで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換し、得られたカナマイシン耐性の形
質転換株よりプラスミドを分離した。該プラスミドはプ
ラスミド p299H2S_n-c と命名した。

【００９４】プラスミド p299H2S_n-c をＮｈｅＩで切断
することにより、ＨＡ遺伝子より、球状部領域をコード
する領域（配列番号４６の塩基番号２３２〜８７３に相
当）が除去された1.１kbp のＤＮＡフラグメントを調製
した。該フラグメントの塩基配列を配列表の配列番号４
９に、該フラグメントがコードするアミノ酸配列を配列
表の配列番号５０に示す。次にこの1.１kbp のＤＮＡフ
ラグメントと、シャトルベクターのプラスミドpEF-BOS/
NeoAのＸｂａＩ切断物（7.９kbp ）をＴ４ＤＮＡリガー
ゼでライゲーションし、ＨＡ遺伝子の幹領域のＮ末端側
をコードする領域と、Ｃ末端側をコードする領域が直接
結合したＤＮＡが組込まれたプラスミドを作製した。次
に該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性の形質転換株よりプラスミドを分
離した。該プラスミドはpENH2dHO1 と命名した。

【００９５】プラスミドはpENH2dHO1 で形質転換した大
腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia coli JM109/pENH2dHO1
と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−４１９０として寄託されている。

【００９６】（５）ポリペプチドの発現：Escherichia
coli JM109/pENH2dHO1（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１９０）よ
り、ＨＡ分子の球状部領域を欠失したポリペプチドをコ
ードする遺伝子を組込んだプラスミドpENH2dHO1 を調製
し、Escherichia coli JM109/pEBNaH2より、ＨＡ分子を
コードする遺伝子を組込んだプラスミドpEBNaH2 をそれ
ぞれ調製した。約５×１０⁶ 個のＣＶ−１細胞をトリプ
シンで処理後、１０％ＦＣＳ−ＭＥＭ（ダルベッコ社
製）２０mlで１回、ＰＢＳで２回洗浄し、１mlのＰＢＳ
に懸濁した。そのうちの0.８mlをバイオラッド社の遺伝
子導入装置ジーンパルサー用のキュベットに入れ、プラ
スミドpENH2dHO1 を３０μｇ加え、パスツールピペット
にてかくはんし、０℃で１０分間静置した。キュベット
を遺伝子導入装置ジーンパルサーにセットし、２５０
Ｖ、９６０μＦＤの条件で処理した後、０℃で１０分間
静置し、ＣＶ−１細胞の形質転換を行った。次にこの形
質転換細胞を３０mlの１０％ＦＣＳ−ＭＥＭに入れ、５
mlずつ直径６cmのシャーレで２日間培養した。培養した
ＣＶ−１細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ7.４）で洗浄後、無水エ
タノールで室温下、１０分間固定した。次にこれらの細
胞を４種類の抗体〔Ｃ１７９、ウサギ抗マウスイムノグ
ロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社製）の１０００倍
希釈液、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ血清（オルガ
ノテクニカ社製）の５００倍希釈液、ペルオキシダーゼ
−ウサギペルオキシダーゼ複合体（オルガノテクニカ社
製）の１０００倍希釈液〕で連続的に、４０分間ずつ反
応させ、処理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキ
シダーゼ反応を、0.０１％のＨ₂ Ｏ₂ と0.３mg／mlの
３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液を用
い、グラハム、カルノフスキー( Graham、Karnovsky)の
方法で行った。プラスミドpENH2dHO1 で形質転換したＣ
Ｖ−１細胞は茶色に染色され、この細胞はＨＡ分子の球
状部領域は欠失したが、幹領域の高次構造は正常に保持
したポリペプチドを発現した。

【００９７】この発現ポリペプチドは抗原決定基となり
やすく、かつ抗原性変異の生じやすい球状部領域を欠失
しているため、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイ
プの幹領域を特異的に認識し、ウイルスを中和する抗体
を誘導するワクチンとして使用することができる。

【００９８】プラスミドpEBNaH2 を用い、同様にＣＶ−
１細胞を形質転換し、形質転換体の培養を行い、培養細
胞のＣ１７９を用いた染色試験を行った。プラスミドpE
BNaH2 で形質転換したＣＶ−１細胞は茶色に染色され、
この細胞も幹領域において正常な高次構造を持つＨＡポ
リペプチドを発現していた。

【００９９】実施例２ 抗原ポリペプチドの作製 （１）プライマーの合成：Ｈ３Ｎ２サブタイプの（−）
鎖ＲＮＡの３′末端に相補的な配列を含有するオリゴヌ
クレオチドプライマー（プライマー３３）、及び（＋）
鎖ＲＮＡの３′末端に相補的な配列を含有するオリゴヌ
クレオチドプライマー（プライマー３４、プライマー３
５）をＤＮＡ合成機を用いて合成し、脱保護の後、イオ
ン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ＤＥＡＥ−２ＳＷカラ
ム）で精製し、セプ−パク（Ｓｅｐ−ｐａｋ）Ｃ１８で
脱塩し、各ＤＮＡ約５０μｇを得た。プライマー３３〜
３５のそれぞれの塩基配列を配列表の配列番号５１〜５
３に示す。

【０１００】（２）Ａ２／Aichi ／２／６８で感染させ
たＭＤＣＫ細胞を集め、グアニジンイソチオシアネート
を加え注射器で５回注入、注出を繰返し細胞を溶解させ
た。溶解後の細胞抽出液を塩化セシウム溶液に重層し、
超遠心分離を行った。遠心チューブの底の沈殿を緩衝液
に溶解し、フェノール、クロロホルム処理をしたのちエ
タノール沈殿を行い、回収したＲＮＡをウイルスゲノム
ＲＮＡのサンプルとした。次にプライマー５を用いてｃ
ＤＮＡを合成し、続いて、プライマー３３、プライマー
３４を用いてＰＣＲ法により、該合成ｃＤＮＡの増幅を
行った。次に増幅ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で
分離し、ＨＡ遺伝子に対応する1.８kbp のｃＤＮＡのバ
ンドを溶出した。このｃＤＮＡをプライマー３３、３５
を用い、ＰＣＲ法により更に増幅し、1.８kbp の２次増
幅ＤＮＡフラグメントを２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレン
グリコール６０００、2.５Ｍ ＮａＣｌ溶液を６０％
（ｖ／ｖ）加え遠心分離し、沈殿精製画分を得た。

【０１０１】（３）Ａ２／Aichi ／２／６８のＨＡ遺伝
子の塩基配列の解析を、参考例Ａ−４−（３）−（ｂ、
ｄ）の方法に準じ行った。Ａ２／Aichi ／２／６８のＨ
Ａ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番
号５４に示す。配列番号５４において、塩基番号１〜８
はプライマー３３由来の配列、塩基番号９〜３６はノン
コーディング領域、塩基番号３７〜８４はシグナルペプ
チドをコードする領域、塩基番号８５〜２４６は、幹領
域のＮ末端側をコードする領域、塩基番号２４７〜９０
３は球状部領域をコードする領域、塩基番号９０４〜１
７３４は幹領域のＣ末端側をコードする領域、塩基番号
１７３５〜１７６９はノンコーディング領域、塩基番号
１７７０〜１７７７はプライマー３５由来の配列であ
る。

【０１０２】（４）プラスミドの作製 （ａ）実施例２−（３）で調製した1.８kbp の２次増幅
ＤＮＡフラグメントの末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑化した。次に平滑化フラグメントと、プラス
ミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のHincII切断物（1.８
kbp ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、Ｈ
Ａ遺伝子の組込まれたプラスミドを作製した。次に該プ
ラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性の形質転換株よりプラスミドを分離し
た。該プラスミドはプラスミド pU118H3_xxn と命名し
た。

【０１０３】プラスミド pU118H3_xxn で形質転換した大
腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia coli JM109／ pU118H3
_xxn と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３５６７として寄託されてい
る。

【０１０４】（ｃ）配列表の配列番号５５、５６で表さ
れるオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー３６、
プライマー３７）をＤＮＡ合成機を用いて合成し、脱保
護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ＤＥＡＥ−
２ＳＷカラム）で精製し、セプ−パク（Ｓｅｐ−ｐａ
ｋ）Ｃ１８で脱塩し、各ＤＮＡ約５０μｇを得た。プラ
イマー３６は配列表の配列番号５４で表されるＨＡ遺伝
子の塩基番号２２７〜２４６のＤＮＡ配列に相当するｍ
ＲＮＡに対しアンチセンス鎖のプライマーであり、プラ
イマー３７は塩基番号９０４〜９２３のＤＮＡ配列に相
当するｍＲＮＡに対してセンス鎖のプライマーである。

【０１０５】プライマー３６及びプライマー３７を用い
ることにより、プラスミド pU118H3_xxn よりＨＡ遺伝子
の球状部領域をコードする領域のみを除いた4.３kbp の
ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ法での増幅を試みた。Esch
erichia coli JM109/pU118H3_xxn ( ＦＥＲＭ Ｐ−１３
５６７）よりプラスミド pU118H3_xxn を調製し、該プラ
スミド0.０５pmol、プライマー３６、プライマー３７各
５０pmolを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は９０
℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、３分間のサイク
ルを２５回行い、4.３kbp のＤＮＡ増幅物を調製した。
次にこの4.３kbp の増幅ＤＮＡフラグメントをＴ４カイ
ネースを用いてリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーション
し、環状プラスミドを調製した。次に該プラスミドで大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたアンピシリン耐
性の形質転換株よりプラスミドを分離した。該プラスミ
ドはプラスミドp118H3dHO1_xxn と命名した。

【０１０６】プラスミドp118H3dHO1_xxn をＸｂａＩ、Ｎ
ｈｅＩで切断することにより、ＨＡ遺伝子より、球状部
領域をコードする領域（配列番号５４の塩基番号２４７
〜９０３に相当）が除去された1.１kbp のＤＮＡフラグ
メントを調製した。該フラグメントの塩基配列を配列表
の配列番号５７に、該フラグメントがコードするアミノ
酸配列を配列表の配列番号５８に示す。次にこの1.１kb
p のＤＮＡフラグメントと、シャトルベクターのプラス
ミドpEF-BOS/NeoAのＸｂａＩ切断物（7.９kbp）をＴ４
ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、ＨＡ遺伝子の幹領
域のＮ末端側をコードする領域と、Ｃ末端側をコードす
る領域が直接結合したＤＮＡが組込まれたプラスミドを
作製した。次に該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換株よりプ
ラスミドを分離した。該プラスミドはpENH3dHO1 と命名
した。

【０１０７】プラスミドpENH3dHO1 で形質転換した大腸
菌ＪＭ１０９株はEscherichia coliJM109/pENH3dHO1と
命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所に
ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１８として寄託されている。

【０１０８】（５）ポリペプチドの発現：Escherichia
coli JM109/pENH3dHO1（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１８）よ
り、ＨＡ分子の球状部領域を欠失したポリペプチドをコ
ードする遺伝子を組込んだプラスミドpENH3dHO1 を調製
した。約５×１０⁶ 個のＣＶ−１細胞をトリプシンで処
理後、１０％ＦＣＳ−ＭＥＭ（ダルベコ社製）２０mlで
１回、ＰＢＳで２回洗浄し、１mlのＰＢＳに懸濁した。
そのうちの0.８mlをバイオラッド社の遺伝子導入装置ジ
ーンパルサー用のキュベットに入れ、プラスミドpENH3d
HO1 を３０μｇ加え、パスツールピペットにてかくはん
し、０℃で１０分間静置した。キュベットを遺伝子導入
装置ジーンパルサーにセットし、２５０Ｖ、９６０μＦ
Ｄの条件で処理した後、０℃で１０分間静置し、ＣＶ−
１細胞の形質転換を行った。次にこの形質転換細胞を３
０mlの１０％ＦＣＳ−ＭＥＭに入れ、５mlずつ直径６cm
のシャーレで２日間培養した。

【０１０９】培養したＣＶ−１細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ7.
４）で洗浄後、無水エタノールで室温下、１０分間固定
した。次にこれらの細胞を４種類の抗体（ＡＩ３Ｃ、ウ
サギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清（オルガノテクニ
カ社製）の１０００倍希釈液、ヤギ抗ウサギイムノグロ
ブリンＧ血清（オルガノテクニカ社製）の５００倍希釈
液、ペルオキシダーゼ−ウサギペルオキシダーゼ複合体
（オルガノテクニカ社製）の１０００倍希釈液〕で連続
的に、４０分間ずつ反応させ、処理細胞をＰＢＳで洗浄
した。最後にペルオキシダーゼ反応を、0.０１％のＨ₂
Ｏ₂ と0.３mg／mlの３，３′−ジアミノベンジジン四塩
酸のＰＢＳ溶液を用い、グラハム、カルノフスキー( Gr
aham、Karnovsky ) の方法で行った。プラスミドpENH3d
HO1 で形質転換したＣＶ−１細胞は茶色に染色され、こ
の細胞はＨＡ分子の球状部領域は欠失したが、幹領域の
高次構造は正常に保持したポリペプチドを発現した。こ
の発現ポリペプチドは抗原決定基となりやすく、かつ抗
原性変異の生じやすい球状部領域を欠失しているため、
Ｈ３Ｎ２サブタイプの幹領域を特異的に認識する抗体を
誘導するワクチンとして使用することができる。

【０１１０】実施例３ 抗原ポリペプチドの作製 （１）ＨＡ分子の調製 参考例Ａ−１で調製したＡ／Yamagata／３２／８９のウ
イルス粒子（４０mg）を２７mlの５mMトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ8.０）に懸濁し、３mlの２０％ＮＰ−４０を加え
た後、３０分間３７℃に保温した。次に遠心分離後、上
清を集め、0.８μｍフィルターユニット（マイレクス−
ＰＦ：ミリポア社製）を用いてろ過を行った。次いで、
５mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）で平衡化したイオン交
換膜（memSep DEAE ：ミリポア社製）にろ過液を負荷
し、同緩衝液にて洗浄した。更に、１Ｍ ＮａＣｌを含
む同緩衝液を用いて、ＨＡ分子を溶出させた。

【０１１１】（２）ＨＡ分子のプロティナーゼ処理 実施例３−（１）で調製したＨＡ分子（2.６μｇ）をＮ
−エチルモルホリン緩衝液（ｐＨ7.５）中で、各々４pm
olのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）、
Ｖ８プロテアーゼ（シグマ社製）、キモトリプシン（ベ
ーリンガー社製）を用いて３７℃で１時間、消化を行っ
た。実施例３−（１）で調製したＨＡ分子（2.６μｇ）
を２Ｍの尿素存在下、１時間、４２℃に保温し変性させ
た。次にリジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアー
ゼ、キモトリプシン、ズブチリシン（ベーリンガー社
製）、プロティナーゼＫ（ベーリンガー社製）、プロナ
ーゼ（ベーリンガー社製）、サーモライシン（ベーリン
ガー社製）の４pmolを用い、５０mMトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ7.６）中で、３７℃、１２時間消化を行った後、
ＰＢＳに対して透析を行った。これら消化液の一部をと
り、Ｃ１７９を用いたドットブロット法、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により消化断片の解析を
行った。ドットブロット法は以下の様に行った。ニトロ
セルロースフィルター（ＭＳＩ社製）上に、消化液１μ
ｌを負荷し、乾燥させた。同様の操作を５回繰返し、計
５μｌの消化液を負荷した後、ブロックエース（雪印社
製）を用いてブロッキングを行った。次いで、これらを
Ｃ１７９溶液の５００倍希釈液と室温で１時間ずつ反応
させた。0.０２％トゥイーン（Tween)２０を含むトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ7.６）で洗浄し、更にトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ7.６）で１０分間の洗浄を３回行った。更
に、これらをアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリンＧ溶液（オルジェニクス社製）の５０
０倍希釈液と室温で１時間反応させ、同様に洗浄を行っ
た。最後に、アルカリホスファターゼ反応を、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートと、ニト
ロブルーテトラゾリウムの炭酸−炭酸ナトリウム溶液
（ｐＨ9.０）を用いて、１mM ＭｇＣｌ₂ の存在下で行
った。その結果、尿素非存在下ではいずれのプロテアー
ゼを用いた場合でも、ＨＡ分子の大部分が未消化であっ
た。尿素により変性させたＨＡ分子を基質とした場合、
Ｖ８プロテアーゼ、サーモライシン、プロナーゼでは消
化されなかった。リジルエンドペプチダーゼ、キモトリ
プシン、ズブチリシンでは過度に消化が進み、Ｃ１７９
に対する抗原性は完全に消失した。一方、プロティナー
ゼＫを用いた場合、ＨＡ分子が消化を受け、Ｃ１７９と
の結合能を有する断片ポリペプチドの生成が認められ
た。

【０１１２】（３）幹領域ポリペプチドの調製 実施例３−（１）で調製したＨＡ分子（２５０μｇ／１
４００μｌ）に１００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
7.６）、５００μｌの８Ｍ尿素を各々加え、１時間、４
２℃に保温した。この溶液に２０００μｌの固定化プロ
ティナーゼＫゲルを加え、振とうしながら７時間、３７
℃に保温した。次に、遠心分離によって得られる反応液
をＰＢＳに対して１２時間透析し、幹領域ポリペプチド
を得た。なお固定化プロティナーゼＫゲルの調製は下記
の通りに行った。４mgのプロティナーゼＫを１mlのＨ₂
Ｏに溶解し、0.１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ5.０に調製
し、１mlのＥＣＨ−セファロース（ファルマシア社
製）、１mlの0.２Ｍ ＥＤＣ（ｐＨ5.０）を加えた後、
２４時間４℃に保温した。ゲルを１０mlのＰＢＳで３回
洗浄し、固定化プロティナーゼＫゲルを得た。

【０１１３】（４）幹領域ポリペプチドの性状 実施例３−（３）記載の幹領域ポリペプチドを被験試料
として、Ｃ１７９に対する抗原性を ELISA法により検討
した。すなわち、マイクロタイタープレート（マキシソ
ープ：ヌンク社製）上に、幹領域ポリペプチドの希釈液
を加え、３７℃で１時間３０分固定した後、ブロックエ
ース（雪印社製）を用いてブロッキングを行った。次い
でこれらを２種類の抗体〔Ｃ１７９溶液（１０mg／ml）
の２００倍希釈液、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリンＧ溶液（カッペル社製）の５００倍希
釈液〕で連続的に、１時間３０分ずつ反応させ、ＰＢＳ
で洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反応を0.０３％の
Ｈ₂ Ｏ₂ と１mg／mlのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩
のクエン酸−リン酸溶液（ｐＨ5.２）を用いて行った。
反応液の４９２nmにおける吸光度から抗原量を算出し
た。標準物質として実施例３−（１）記載のＨＡ分子を
用いた。ELISA法の結果から、幹領域ポリペプチドはＨ
Ａ分子と同等の抗原性を示すことが明らかとなった。幹
領域ポリペプチドの血球凝集活性（ＨＡ価）は以下のよ
うに測定した。Ｕ型底９６穴プレート（ファルコン３９
１１：ベクトン ディキンソン社製）上で、ＰＢＳを用
いて試料液の２倍段階希釈を行い、これに等量の0.５％
ニワトリ赤血球懸濁液を加えてよくかくはんした。室温
で１時間反応させた後に赤血球の凝集を観察した。凝集
の認められた最大希釈倍率をＨＡ価とした。幹領域ポリ
ペプチドのＨＡ価は、ＨＡ分子が有するＨＡ価の１／１
０００以下であった。

【０１１４】以上、プロテアーゼ処理により調製した幹
領域ポリペプチドは、ＨＡ分子と同等の抗原性を有し、
かつ球状部領域に由来する血液凝集活性は実質的に消失
していることが明らかとなった。このポリペプチドは抗
原決定基となりやすく、かつ抗原性変異の生じやすい球
状部領域が消化されているため、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、
Ｈ２Ｎ２サブタイプの幹領域を特異的に認識し、ウイル
スを中和する抗体を誘導するワクチンとして使用するこ
とができる。

【０１１５】実施例４ 抗原ポリペプチドの作製 （１）ＨＡ分子の調製 参考例Ａ−１で調製したＡ／Kitakyushu／１５９／９３
のウイルス粒子（４０mg）を２７mlの５mMトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ8.０）に懸濁し、３mlの２０％ＮＰ−４０を加
えた後、３０分間３７℃に保温した。次に遠心分離後、
上清を集め、0.８μｍフィルターユニット（マイレクス
−ＰＦ：ミリポア社製）を用いてろ過を行った。次い
で、５mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.０）で平衡化したイオ
ン交換膜（memSep DEAE ：ミリポア社製）にろ過液を負
荷し、同緩衝液にて洗浄した。更に、１Ｍ ＮａＣｌを
含む同緩衝液を用いて、ＨＡ分子を溶出させた。

【０１１６】（２）ＨＡ分子のプロティナーゼ処理 実施例４−（１）で調製したＨＡ分子（2.６μｇ）を、
Ｎ−エチルモルホリン緩衝液（ｐＨ7.５）中で、各々４
pmolのリジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、
キモトリプシンを用いて３７℃で１時間、消化を行っ
た。実施例４−（１）で調製したＨＡ分子（2.６μｇ）
を、２Ｍの尿素存在下、１時間、４２℃に保温し、変性
させた。次に、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテ
アーゼ、キモトリプシン、ズブチリシン、プロティナー
ゼＫ、プロナーゼ、サーモライシンの４pmolを用い、５
０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.６）中で、３７℃、１
２時間消化を行った後、ＰＢＳに対して透析を行った。
これら消化液の一部をとり、ＡＩ３Ｃを用いたドットブ
ロット法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により消化断片の解析を行った。その結果、尿素非存在
下では、いずれのプロテアーゼを用いた場合でもＨＡ分
子の大部分が未消化であった。尿素により変性させたＨ
Ａ分子を基質とした場合、Ｖ８プロテアーゼ、サーモラ
イシン、プロナーゼでは消化されなかった。リジルエン
ドペプチダーゼ、キモトリプシン、ズブチリシンでは過
度に消化が進み、ＡＩ３Ｃに対する抗原性は完全に消失
した。一方、プロティナーゼＫを用いた場合、ＨＡ分子
が消化を受け、ＡＩ３Ｃとの結合能を有する断片ポリペ
プチドの生成が認められた。

【０１１７】（３）幹領域ポリペプチドの調製 実施例４−（１）で調製したＨＡ分子（２５０μｇ／１
４００μｌ）に１００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
7.６）、５００μｌの８Ｍ尿素を各々加え、１時間、４
２℃に保温した。この溶液に２０００μｌの固定化プロ
ティナーゼＫゲルを加え、振とうしながら７時間、３７
℃に保温した。次に、遠心分離によって得られる反応液
をＰＢＳに対して１２時間透析し、幹領域ポリペプチド
を得た。

【０１１８】（４）幹領域ポリペプチドの性状 実施例４−（３）記載の幹領域ポリペプチドを被験試料
として、ＡＩ３Ｃに対する抗原性を ELISA法により検討
した。すなわち、マイクロタイタープレート（マキシソ
ープ：ヌンク社製）上に、幹領域ポリペプチドの希釈液
を加え、３７℃で１時間３０分固定した後、ブロックエ
ース（雪印社製）を用いてブロッキングを行った。次い
でこれらを２種類の抗体〔ＡＩ３Ｃ溶液（１０mg／ml）
の２００倍希釈液、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリンＧ溶液（カッペル社製）の５００倍希
釈液〕で連続的に、１時間３０分ずつ反応させ、ＰＢＳ
で洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反応を0.０３％の
Ｈ₂ Ｏ₂ と１mg／mlのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩
のクエン酸−リン酸溶液（ｐＨ5.２）を用いて行った。
反応液の４９２nmにおける吸光度から抗原量を算出し
た。標準物質として実施例４−（１）記載のＨＡ分子を
用いた。ELISA法の結果から、幹領域ポリペプチドはＨ
Ａ分子と同等の抗原性を示すことが明らかとなった。幹
領域ポリペプチドの血球凝集活性（ＨＡ価）は以下のよ
うに測定した。Ｕ型底９６穴プレート（ファルコン３９
１１：ベクトン ディキンソン社製）上で、ＰＢＳを用
いて試料液の２倍段階希釈を行い、これに等量の0.５％
ニワトリ赤血球懸濁液を加えてよくかくはんした。室温
で１時間反応させた後に赤血球の凝集を観察した。凝集
の認められた最大希釈倍率をＨＡ価とした。幹領域ポリ
ペプチドのＨＡ価は、ＨＡ分子が有するＨＡ価の１／１
０００以下であった。

【０１１９】以上、プロテアーゼ処理により調製した幹
領域ポリペプチドは、ＨＡ分子と同等の抗原性を有し、
かつ球状部領域に由来する血液凝集活性は実質的に消失
していることが明らかとなった。該ポリペプチドは抗原
決定基となりやすく、かつ抗原性変異の生じやすい球状
部領域が消化されているため、Ｈ３Ｎ２サブタイプの幹
領域を特異的に認識する抗体を誘導するワクチンとして
使用することができる。

【０１２０】実施例５ インフルエンザウイルスに対する予防効果 Escherishia coli JM109／pENH2dH01 （ＦＥＲＭ ＢＰ
−４１９０）より、Ａ／Okuda ／５７（Ｈ２Ｎ２）のＨ
Ａ分子の球状部領域を欠失したポリペプチドをコードす
る遺伝子を組込んだプラスミドpENH2dH01 を調製した。
約５×１０⁶ 個のＣＶ−１細胞をトリプシンで処理後、
１０％ＦＣＳ−ＭＥＭ（ダルベッコ社製）２０mlで１
回、ＰＢＳで２回洗浄し、１mlのＰＢＳに懸濁した。そ
のうちの0.８mlをバイオラッド社の遺伝子導入装置ジー
ンパルサー用のキュベットに入れ、プラスミドpENH2dH0
1 を３０μｇ加え、パスツールピペットにてかくはん
し、０℃で１０分間静置した。キュベットを遺伝子導入
装置ジーンパルサーにセットし、２５０Ｖ、９６０μＦ
Ｄの条件で処理した後、０℃で１０分間静置し、ＣＶ−
１細胞の形質転換を行った。次にこの形質転換細胞を６
０mlの１０％ＦＣＳ−ＭＥＭに入れ、５mlずつ直径６cm
のシャーレで培養した。培養３日目にポリペプチドの発
現をＣ１７９を用いた染色試験で確認し、ポリペプチド
発現細胞はトリプシンを含むＰＢＳで処理し、次に遠心
により該細胞を集めた。次に集めた細胞をＰＢＳに懸濁
し、４週令の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹にそれぞれ
１×１０⁵ 個ずつワクチンとして腹腔内投与した。２週
間後に２回目の免疫を同様にして行った。なお対照とし
てpENH2dH01 で形質転換していないＣＶ−１細胞を用
い、同様に１０匹のマウスにそれぞれ１×１０⁵ 個を２
回腹腔内投与した。最終免疫から１週間後にＡｌ／ＦＭ
／１／４７（Ｈ１Ｎ１）をマウス１匹当り２５μｌ（８
×１０⁴ ＦＦＵ）ずつ鼻腔内接種し、以後、毎日マウス
の生死を調べた。結果を図４に示す。図４に示すように
抗原ポリペプチドを発現したＣＶ−１細胞で免疫した、
ワクチン投与マウス群（図４中、黒丸で示す）は、強毒
株であるＡｌ／ＦＭ／１／４７の接種後１５日目におい
て、１０匹中７匹が生存していた。一方、対照マウス群
（図４中、黒三角で示す）は、１０匹中９匹が死亡し
た。図４は抗原ポリペプチドの投与群、非投与群の生存
率を示す図であり、縦軸は生存率、横軸はウイルス感染
後の日数を表す。

【０１２１】以上、ＨＡ分子の球状部領域が欠失した抗
原ポリペプチドは、それがＨ２Ｎ２サブタイプ由来であ
っても、Ｈ１Ｎ１サブタイプのウイルスに対するワクチ
ンとなり得ることが判明した。この抗原ポリペプチドは
抗原決定基となりやすく、かつ抗原性変異の生じやすい
球状部領域を欠失しているため、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、
Ｈ２Ｎ２サブタイプの幹領域を特異的に認識し、ウイル
スを中和する抗体を誘導するワクチンとして使用するこ
とができる。

【０１２２】実施例６ インフルエンザウイルスに対する予防効果 実施例３に記載の幹領域ポリペプチドを被験試料とし
て、インフルエンザウイルスに対する感染防御効果を検
討した。幹領域ポリペプチドをＰＢＳに懸濁し、４週令
の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０μｇ／0.５mlずつ腹腔
内投与した。１週間の間隔で同量を腹腔内投与し合計３
回の免疫を行った。対照群にはＰＢＳのみを投与した。
最終免疫から１０日後にＡ１／ＦＭ／１／４７（Ｈ１Ｎ
１）ウイルスをマウス１匹当り２５μｌ（2.０×１０³
ＦＦＵ）ずつ鼻腔内接種し、マウスの生死、生存マウス
の体重変化を観察した。図５に示すように、幹領域ポリ
ペプチドで免疫したマウスの平均体重の減少率は、対照
群に対して有意に低かった。また、図６に示すように対
照群の１１匹のマウスのうち５匹がウイルス接種後７日
以内に死亡したが、幹領域ポリペプチドで免疫したマウ
ス１０匹のうち８匹はウイルス接種後１４日後において
も生存し、ウイルス接種後１４日後の生存率は８０％で
あった。一方、対照群のウイルス接種後１４日後の生存
率は５５％であった。なお図５は、幹領域ポリペプチド
投与群、対照群の体重変化を示す図であり、縦軸は各群
生存マウスの平均体重、横軸はウイルス接種後の日数を
示す。また図６は、幹領域ポリペプチド投与群、対照群
の生存率を示す図であり、縦軸は生存率、横軸はウイル
ス接種後の日数を示す。以上、幹領域ポリペプチドはイ
ンフルエンザウイルスに対するワクチンとなり得ること
が判明した。

【０１２３】

【発明の効果】本発明によりヒトインフルエンザＡ型ウ
イルスのサブタイプＨＡ分子の幹領域に特異的に結合す
る抗体産生能を有する免疫原性ポリペプチド、及び該ポ
リペプチドをコードする遺伝子が提供される。該ポリペ
プチドは遺伝子工学的、酵素学的に大量に供給すること
ができ、ＨＡ分子球状部領域の変化に起因する抗原性変
化の影響も無いためインフルエンザ予防用のワクチンと
して特に有用である。

【０１２４】

【配列表】

【０１２５】配列番号：1 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１２６】配列番号：2 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１２７】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１２８】配列番号：4 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列の特徴：９番目のXaa はVal またはLeu である。

【０１２９】配列番号：5 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGCAAAAGCA GGGGATAAT 19

【０１３０】配列番号：6 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGTAGAAACA AGGGTGTTTT T 21

【０１３１】配列番号：7 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TCTTTTCGAG TACTGTGTCA ACA 23

【０１３２】配列番号：8 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCCCCACTAC AATTGGGGAA ATG 23

【０１３３】配列番号：9 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTTACAGAA ATTTGCTATG GCTG 24

【０１３４】配列番号：10 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACTCCCCTAT TGTGACTGGG TGTA 24

【０１３５】配列番号：11 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GGTTATCATC ATCAGAATGA AC 22

【０１３６】配列番号：12 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGTTCACCTT GTTTGTAATC CCGT 24

【０１３７】配列番号：13 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CCATTTTTTA CTCTTTCCAT GCAT 24

【０１３８】配列番号：14 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATCTACTCAA CTGTCGCCAG TTCA 24

【０１３９】配列番号：15 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTGTGTCGAC CTTCTCTGTG GAA 23

【０１４０】配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TGTAGCATTG CCGGATGGCT 20

【０１４１】配列番号：17 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATTATCCGGT TGCCAAAGGA TCG 23

【０１４２】配列番号：18 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GAGAGCACTG GTAATCTGTT GCA 23

【０１４３】配列番号：19 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CCATCAAATG CCTTTTGAGT GGA 23

【０１４４】配列番号：20 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACTAGAAGCT CAGCATTGTA TGT 23

【０１４５】配列番号：21 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CATGCATTCA TCATCACATT TGTG 24

【０１４６】配列番号：22 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CATACTTGGG ATAATCATAC GTC 23

【０１４７】配列番号：23 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCCATTTATG CTACAGTAGC AGG 23

【０１４８】配列番号：24 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GATCAGATTG AAGTGACTAA TGCT 24

【０１４９】配列番号：25 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GAATGCATCA CTCCAAATGG AAGC 24

【０１５０】配列番号：26 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGGTCCTGAA TTCTCCCTTC TAC 23

【０１５１】配列番号：27 配列の長さ：1754 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Suita/1/89 配列 GGATAATAAA TACAACCAAA ATGAAAGCAA AACTACTAGT CCTGTTATGT GCATTTACAG 60 CTACAGATGC AGACACAATA TGTATAGGCT ACCATGCGAA CAACTCAACC GACACTGTTG 120 ACACAGTACT TGAGAAGAAC GTGACAGTGA CACACTCTGT CAACCTACTT GAGGACAGTC 180 ACAACGGAAA ACTATGTCGA CTAAAAGGAA TAGCCCCACT ACAATTGGGT AATTGCAGCA 240 TTGCCGGATG GATCTTAGGA AACCCAGAAT GCGAATCACT GTTTTCTAAG GAATCATGGT 300 CCTACATTGC AGAAACACCA AACTCCGAGA ATGGAACATG TTACCCAGGG TATTTCGCCG 360 ACTATGAGGA ACTGAGGGAG CAATTGAGTT CAGTATCATC ATTCGAGAGA TTCGAAATAT 420 TCCCCAAAGA AAGCTCATGG CCCAACCACA CCGTAACCAA AGGAGTAACG GCATCATGCT 480 CCCATAATGG GAAAAGCAGT TTTTACAGAA ATTTGCTATG GCTGACGGGG AAGAATGGCT 540 TGTACCCAAA TCTGAGCAAG TCCTATGTGA ACAACAAAGA GAAAGAAGTC CTTGTACTAT 600 GGGGTGTTCA TCACCCGTCT AACATAGGGG ACCAAAGGGC CATCTATCAT ACAGAAAATG 660 CTTATGTCTC TGTAGTGTCT TCACATTATA GCAGGAGATT CACCCCAGAA ATAGCAAAAA 720 GACCCAAAGT AAGAGGTCAA GAAGGAAGAA TTAACTACTA CTGGACTCTG CTGGAACCCG 780 GGGACACAAT AATATTTGAG GCAAATGGAA ATCTAATAGC GCCATGGTAT GCTTTCGCAC 840 TGAGTAGAGG CTTTGGGTCA GGAATCATCA CCTCAAACGC ATCAATGGAT GAATGTGACG 900 CGAAGTGTCA AACACCCCAG GGAGCTATAA ACAGTAGTCT TCCTTTCCAG AATGTACACC 960 CAGTCACAAT AGGAGAGTGT CCAAAGTATG TCAGGAGTAC AAAATTAAGG ATGGTTACAG 1020 GACTAAGGAA CATCCCATCC ATTCAATCCA GAGGTTTGTT TGGAGCCATT GCCGGTTTCA 1080 TTGAAGGGGG GTGGACTGGA ATGATAGATG GATGGTATGG TTATCATCAT CAGAATGAAC 1140 AAGGATCTGG CTATGCTGCG GATCAAAAAA GCACACAAAA TGCCATTAAC GGAATTACAA 1200 ACAAGGTGAA TTCTGTAATC GAGAAAATGA ACACTCAATT CACAGCTGTG GGCAAAGAAT 1260 TCAACAAATT AGAAAGAAGG ATGGAATACT TAAATAAAAA AGTTGATGAT GGATTTCTGG 1320 ACATTTGGAC ATATAATGCA GAATTGTTGG TTCTACTGGA AAATGAAAGG ACTTTGGATT 1380 TTCATGACTC AAATGTGAAG AATCTGTATG AGAAAGTAAA AAGCCAATTA AAGAATAATG 1440 CCAAAGAAAT AGGATACGGG TGTTTTGAAT TCTACCACAA GTGTAACAAT GAATGCATGG 1500 AAAGTGTGAA AAATGGAACT TATGACTATC CAAAATATTC CGAGGAATCA AAGTTAAACA 1560 GGGAAAAAAT TGATGGAGTG AAATTGGAAT CAATGGGAGT CTATCAGATT CTGGCGATCT 1620 ACTCAACTGT CGCCAGTTCA CTGGTGCTTT TGGTCTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA 1680 TGTGTTCTAA TGGGTCTTTG CAGTGTAGAA TATGCATCTG AGACCAGAAT TTCAGAAATA 1740 TAAGAAAAAA CACC 1754

【０１５２】配列番号：28 配列の長さ：1728 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Izumi/5/65 配列 ATAGACAACC AAAAGCATAA CAATGGCCAT CATCTATCTC ATACTCCTGT TCACAGCAGT 60 GAGGGGGGAC CAGATATGCA TTGGATACCA TGCCAATAAT TCCACAGAAA AGGTCGACAC 120 AATTCTAGAG CGGAATGTCA CTGTGACTCA TGCCAAGGAC ATCCTTGAGA AGACCCACAA 180 CGGAAAGCTA TGCAAACTAA ACGGAATCCC TCCACTTGAA CTAGGGGACT GTAGCATTGC 240 CGGATGGCTC CTTGGAAATC CAGAATGTGA TAGGCTTCTA AGGGTGCCAG AATGGTCCTA 300 TATAATGGAG AAAGAAAACC CGAGATACAG TTTATGTTAC CCAGGCAACT TCAATGACTA 360 TGAAGAATTG AAACATCTCC TCAGCAGCGT AAAACATTTC GAGAAAGTAA AGATTCTGCC 420 CAAAGATAGA TGGACACAGC ATACAACAAC TGGAGGTTCA AAGGCCTGCG CAGTGTCAGG 480 TAAACCATCA TTCTTCAGGA ACATGGTCTG GCTGACAAAG AAAGGACCAA ATTATCCGGT 540 TGCCAAAGGA TCGTACAACA ATACGAGCGG AGAGCAAATG CTAATAATTT GGGGAGTGCA 600 CCATCCTAAT GATGAGGCAG AACAAAGAGC ATTGTACCAG GAAGTGGGAA CCTATGTTTC 660 CGCAAGCACA TCAACATTGA ACAAAAGGTC AATCCCTGAA ATAGCAGCAA GGCCTAAAGT 720 GAATGGACTA GGAAGTAGAA TGGAATTCTC TTGGACCCTC TTGGATGTGT GGGACACCAT 780 AAATTTTGAG AGCACTGGTA ATCTAGTTGC ACCAGAGTAT GGATTCAAAA TATCGAAAAG 840 AGGTAGTTCA GGGATCATGA AGACAGAAGG AACACTTGGG AACTGTGAGA CCAAATGCCA 900 AACTCCTTTG GGAGCAATAA ATACAACACT ACCTTTTCAC AATGTCCACC CACTGACAAT 960 AGGTGAATGC CCCAAATATG TAAAATCGGA GAAATTGGTC TTAGCAACAG GACTAAGGAA 1020 TGTTCCCCAG ATTGAATCAA GAGGATTGTT TGGGGCAATA GCTGGCTTTA TAGAAGGAGG 1080 ATGGCAAGGA ATGGTTGATG GTTGGTATGG ATACCATCAC AGCAATGACC AGGGATCAGG 1140 GTATGCAGCA GACAAAGAAT CCACTCAAAA GGCATTTGAT GGAATCACCA ACAAGGTAAA 1200 TTCTGTGATT GAAAAGATGA ACACCCAATT TGAAGCTGTT GGGAAAGAAT TCAATAATTT 1260 AGAGAAAAGA CTGGAGAACT TGAACAAAAA GATGGAAGAC GGGTTTCTAG ATGTGTGGAC 1320 ATACAATGCT GAGCTTCTAG TTCTGATGGA AAATGAGAGG ACACTTGACT TCCATGATTC 1380 TAATGTCAAG AACCTGTATG ATAAAGTCAG AATGCAGCTG AGAGACAACG TCAAAGAACT 1440 AGGAAATGGA TGTTTTGAAT TTTATCACAA ATGTGACGAT GAATGCATGA ATAGTGTGAA 1500 AAACGGGACG TATGATTATC CCAAGTATGA AGAAGAATCT AAACTAAATA GAAATGAAAT 1560 CAAAGGGGTA AAATTGAGCA GCATGGGGGT TTACCAAATT CTTGCCATTT ATGCTACAGT 1620 TGCAGGTTCT CTGTCACTGG CAATCATGAT GGCTGGGATC TCTTTCTGGA TGTGCTCCAA 1680 CGGGTCTCTG CAGTGCAGAA TCTGCATATG ATTGTAATTT ATTTTATA 1728

【０１５３】配列番号：29 配列の長さ：442 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/PR/8/34 配列 CCTTTCCAGA ATATACACCC AGTCACAATA GGAGAGTGCC CAAAATACGT CAGGAGTGCC 60 AAATTGAGGA TGGTTACAGG ACTAAGGAAC ATCCCGTCCA TTCAATCCAG AGGTCTATTT 120 GGAGCCATTG CCGGTTTTAT TGAAGGGGGA TGGACTGGAA TGATAGATGG ATGGTATGGT 180 TATCATCATC AGAATGAACA GGGATCAGGC TATGCAGCGG ATCAAAAAAG CACACAAAAT 240 GCCATTAACG GGATTACAAA CAAGGTGAAC TCTGTTATCG AGAAAATGAA CACTCAATTC 300 ACAGCTGTGG GTAAAGAATT CAACAAATTA GAAAAAAGGA TGGAAAATTT AAATAAAAAA 360 GTTGATGATG GATTTCTGGA CATTTGGACA TATAATGCAG AATTGTTAGT TCTACTGGAA 420 AATGAAAGGA CTCTGGATTT CC 442

【０１５４】配列番号：30 配列の長さ：424 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Bangkok/10/83 配列 CCTTTCCAGA ATGTACACCC AGTCACAATA GGAGAGTGCC CAAAGTACGT CAGGAGTACA 60 AAATTAAGGA TGGTTACAGG ACTAAGGAAC ATCCCATCCA TTCAATCCAG AGGTTTGTTT 120 GGAGCCATTG CCGGTTTCAT TGAAGGGGGA TGGACTGGAA TGATAGATGG ATGGTATCGT 180 TATCATCATC AGAATGAACA AGGATCTGGC TATGCTGCGG ATCAAAAAAG CACACAAAAT 240 GCCATTAACG GGATTACAAA CAAGGTGAAC TCTGTAATCG AGAAAATGAA CACTCAATTC 300 ACAGCTGTGG GTAAAGAATT CAACAAATTA GAAAAAAGGA TGGAAAACTT AAATAAAAAA 360 GTTGATGATG GATTTCTGGA CATTTGGACA TATAATGCAG AATTGTTGGT TCTACTGGAA 420 AATG 424

【０１５５】配列番号：31 配列の長さ：424 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Yamagata/120/86 配列 CCTTTCCAGA ATGTACACCC AGTCACAATA GGAGAGTGCC CAAAGTATGT CAGGAGTACA 60 AAATTAAGGA TGGTTACAGG ACTAAGGAAC ATCCCATCCA TTCAATCCAG AGGTTTGTTT 120 GGAGCCATTG CCGGTTTCAT TGAAGGGGGG TGGACTGGAA TGATAGATGG ATGGTATGGT 180 TATCATCATC AGAATGAACA AGGATCTGGC TATGCTGCGG ATCAAAAAAG CACACAAAAT 240 GCCATTAACG GGATTACAAA CAAGGTGAAT TCTGTAATCG AGAAAATGAA CACTCAATTC 300 ACAGCTGTGG GCAAAGAATT CAACAAATTA GAAAGAAGGA TGGAAAACTT AAATAAAAAA 360 GTTGATGATG GATTTCTGGA CATTTGGACA TATAATGCAG AATTGTTGGT CCTACTGGAA 420 AATG 424

【０１５６】配列番号：32 配列の長さ：429 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Osaka/930/88 配列 CCTTTCCAGA ATGTACACCC AGTCACAATA GGAGAGTGCC CAAAGTATGT CAGGAGTACA 60 AAATTAAGGA TGGTTACAGG ACTAAGGAAC ATCCCATCCA TTCAATCCAG AGGTTTGTTT 120 GGAGCCATTG CCGGTTTCAT AGAAGGGGGG TGGACTGGAA TGATAGATGG ATGGTATGGT 180 TATCATCATC AGAATGAACA AGGATCTGGC TATGCTGCGG ATCAAAAAAG CACACAAAAT 240 GCCATTAACG GAATTACAAA CAAGGTGAAT TCTGTAATCG AGAAAATGAA CACTCAATTC 300 ACAGCTGTGG GCAAAGAATT CAACAAATTA GAAAGAAGGA TGGAAAACTT AAATAAAAAA 360 GTTGATGATG GATTTCTGGA CATTTGGACA TATAATGCAG AATTGTTGGT TCTACTGGAA 420 AATGAAAGG 429

【０１５７】配列番号：33 配列の長さ：400 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Okuda/57 配列 GCAATAAATA CAACATTACC TTTTCACAAT GTCCACCCAC TGACAATAGG TGAGTGCCCC 60 AAATATGTAA AATCGGAGAA GTTGGTCTTA GCAACAGGAC TAAGGAATGT TCCCCAGATT 120 GAATCAAGAG GATTGTTTGG GGCAATAGCT GGTTTTATAG AAGGAGGATG GCAAGGAATG 180 GTTGACGGTT GGTATGGATA CCATCACAGC AATGACCAGG GATCAGGGTA TGCAGCAGAC 240 AAAGAATCCA CTCAAAAGGC ATTTGATGGA ATCACCAACA AGGTAAATTC TGTGATTGAA 300 AAGATAAACA CCCAATTTGA AGCTGTTGGG AAAGAATTCG GTAACTTAGA GAAAAGACTG 360 GAGAACTTGA ACAAAAAGAT GGAAGACGGG TTTCTAGATG 400

【０１５８】配列番号：34 配列の長さ：409 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Adachi/2/57 配列 CGCCTTGGAG CAATAAATAC AACATTGCCT TTTCACAATG TCCACCCACT GACAATAGGT 60 GAGTGCCCCA AATATGTAAA ATCGGAGAAG TTGGTCTTAG CAACAGGACT AAGGAATGTT 120 CCCCAGATTG AATCAAGAGG ATTGTTTGGG GCAATAGCTG GTTTTATAGA AGGAGGATGG 180 CAAGGAATGG TTGATGGTTG GTATGGATAC CATCACAGCA ATGACCAGGG ATCAGGGTAT 240 GCAGCAGACA AAGAATCCAC TCAAAAGGCA TTTGATGGAA TCACCAACAA GGTAAATTCT 300 GTGATTGAAA AGATGAACAC CCAATTTGAA GCTGTTGGGA AAGAATTCGG TAACTTAGAG 360 AGAAGACTGG AGAACTTGAA CAAAAAGATG GAAGACGGGT TTCTAGATG 409

【０１５９】配列番号：35 配列の長さ：410 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Kumamoto/1/65 配列 CTCCTTTGGA GCAATAAATA CAACATTACC TTTTCACAAT GTCCACCCAC TGACAATAGG 60 TGAATGCCCC AAATATGTAA AATCGGAGAA ACTGGTCTTA GCAACAGGAC TAAGGAATGT 120 TCCCCAGATT GAATCAAGAG GATTGTTTGG GGCAATAGCT GGCTTTGTAG AAGGAGGATG 180 GCAAGGAATG ATTGATGGTT GGTATGGATA CCATCACAGC AATGATCAGG GATCAGGGTT 240 TGCAGCAGAC AAAGAATCCA CTCAAAAGGC ATTTGATGGA ATCACCAACA AGGTAAATTC 300 TGTGATTGAA AAGATGAACA CCCAATTTGA AGCTGTTGGG AAAGAATTCA ATAATTTAGA 360 GAAAAGACTG GAGAACTTGA ACAAAAGGAT GGAAGACGGG TTTCTAGATG 410

【０１６０】配列番号：36 配列の長さ：394 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Kaizuka/2/65 配列 AATACAACAC TACCTTTTCA CAATGTCCAC CCACTGACAA TAGGTGAATG CCCCAAATAT 60 GTAAAATCGG AGAAATTGGT CTTAGCAACA GGACTAAGGA ATGTTCCCCA GATTGAATCA 120 AGAGGATTGT TTGGGGCAAT AGCTGGCTTT ATAGAAGGAG GATGGCAAGG AATGGTTGAT 180 GGTTGGTATG GATACCATCA CAGCAATGAC CAGGGATCAG GGTATGCAGC AGACAAAGAA 240 TCCACTCAAA AGGCATTTGA TGGAATCACC AACAAGGTAA ATTCTGTGAT TGAAAAGATG 300 AACACCCAAT TTGAAGCTGT TGGGAAAGAA TTCAATAATT TAGAGAAAAG ACTGGAGAAC 360 TTGAACAAAA AGATGGAAGA CGGGTTTCTA GATG 394

【０１６１】配列番号：37 配列の長さ：329 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A2/Aichi/2/68 配列 ATGACAAGCC CTTTCAAAAC GTAAACAAGA TCACATATGG AGCATGCCCC AAGTATGTTA 60 AGCAAAACAC CCTGAAGTTG GCAACAGGGA TGCGGAATGT ACCAGAGAAA CAAACTAGAG 120 GCCTATTCGG CGCAATAGCA GGTTTCATAG AAAATGGTTG GGAGGGAATG ATAGACGGTT 180 GGTACGGTTT CAGGCATCAA AATTCTGAGG GCACAGGACA AGCAGCAGAT CTTAAAAGCA 240 CTCAAGCAGC CATCGACCAA ATCAATGGGA AATTGAACAG GGTAATCGAG AAGACGAACG 300 AGAAATTCCA TCAAATCGAA AAGGAATTC 329

【０１６２】配列番号：38 配列の長さ：334 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Fukuoka/C29/85 配列 ATGACAAACC CTTTCAAAAT GTAAACAAGA TCACATATGG GGCATGTCCC AGGTATGTTA 60 AGCAAAACAC TCTGAAATTG GCAACAGGGA TGCGGAATGT ACCAGAGAAA CAAACTAGAG 120 GCATATTCGG CGCAATAGCA GGTTTCATAG AAAATGGTTG GGAGGGAATG GTAGACGGTT 180 GGTACGGTTT CAGGCATCAA AATTCTGAGG GCACAGGACA AGCAGCAGAT CTTAAAAGCA 240 CTCAAGCAGC AATCGACCAA ATCAACGGGA AACTGAATAG GTTAATCGAG AAGACGAACG 300 AGAAATTCCA TCAAATCGAA AAGGAATTCT CAGA 334

【０１６３】配列番号：39 配列の長さ：329 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Sichuan/2/87 配列 ATGACAAACC CTTTCAAAAT GTAAACAAGA TCACATATGG GGCATGTCCC AGATATGTTA 60 AGCAAAACAC TCTGAAATTG GCAACAGGGA TGCGGAATGT ACCAGAGAAA CAAACTAGAG 120 GCATATTCGG CGCAATAGCA GGTTTCATAG AAAATGGTTG GGAGGGAATG GTAGACGGCT 180 GGTACGGTTT CAGGCATCAA AATTCTGAGG GCACAGGACA AGCAGCAGAT CTTAAAAGCA 240 CTCAAGCAGC AATCGACCAA ATCAACGGGA AACTGAATAG GTTAATCGAG AAGACGAACG 300 AGAAATTCCA TCAAACCGAA AAGGAATTC 329

【０１６４】配列番号：40 配列の長さ：334 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Ibaraki/1/90 配列 ATGACAAACC CTTTCAAAAT ATAAACAGGA TCACATATGG GGCATGTCCC AGATATGTTA 60 AGCAAAACAC TCTGAAATTG GCAACAGGGA TGCGGAATGT ACCAGAGAAA CAAACTAGAG 120 GCATATTCGG CGCAATCGCA GGTTTCATAG AAAATGGTTG GGAGGGAATG GTAGACGGTT 180 GGTACGGTTT CAGGCATCAA AATTCTGAGG GCACAGGACA AGCAGCAGAT CTTAAAAGCA 240 CTCAAGCAGC AATCGACCAA ATCAACGGGA AACTGAATAG GTTAATCGAG AAGACGAACG 300 AGAAATTCCA TCAAATCGAA AAGGAATTCT CAGA 334

【０１６５】配列番号：41 配列の長さ：329 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Suita/1/90 配列 ATGACAAACC CTTTCAAAAT GTAAACAGGA TCACATATGG GGCATGTCCC AGATATGTTA 60 AGCAAAACAC TCTGAAATTG GCAACAGGGA TGCGGAATGT ACCAGAAAAA CAAACTAGGG 120 GCATATTCGG CGCAATCGCA GGTTTCATAG AAAATGGTTG GGAGGGAATG GTAGACGGTT 180 GGTACGGTTT CAGGCATCAA AACTCTGAGG GCACAGGACA AGCAGCAGAT CTTAAAAGCA 240 CTCAAGCAGC AATCGACCAA ATCAACGGGA AACTGAATAG GTTAATCGAG AAGACGAACG 300 AGAAATTCCA TCAAACCGAA AAGGAATTC 329

【０１６６】配列番号：42 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GATCTAGAAG CAAAAGCAGG GGTTATACCA 30

【０１６７】配列番号：43 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGGCTAGCAA AAGCAGGGGT TATACCATAG 30

【０１６８】配列番号：44 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACAGATCTAG TAGAAACAAG GGTGTTTTT 29

【０１６９】配列番号：45 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGGCTAGCAG AAACAAGGGT GTTTTTAATT 30

【０１７０】配列番号：46 配列の長さ：1783 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Okuda/57 配列 CGGCTAGCAA AAGCAGGGGT TATACCATAG AAAACCAAAA 40 GCAAAACA ATG GCC ATC ATT TAT CTC ATT CTC CTG TTC ACA GCA GTG AGA GGG 93 Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly -15 -10 -5 GAC CAG ATA TGC ATT GGA TAC CAT GCC AAT AAT TCC ACA GAG AAG 138 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys 1 5 10 15 GTC GAC ACA ATT CTA GAG CGG AAC GTC ACT GTG ACT CAT GCC AAG 183 Val Asp Thr Ile Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys 20 25 30 GAC ATC CTT GAG AAG ACC CAT AAC GGA AAG TTA TGC AAA CTA AAC 228 Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn 35 40 45 GGA ATC CCT CCA CTT GAA CTA GGG GAC TGT AGC ATT GCC GGA TGG 273 Gly Ile Pro Pro Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp 50 55 60 CTC CTT GGA AAT CCA AAA TGT GAT AGG CTT CTA AGT GTG CCA GAA 318 Leu Leu Gly Asn Pro Lys Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu 65 70 75 CGG TCC TAT ATA TTG GAG AAA GAA AAC CCG AGA GAC GGT TTG TGT 363 Arg Ser Tyr Ile Leu Glu Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys 80 85 90 TAT CCA GGC AGC TTC AAT GAT TAT GAA GAA TTG AAA CAT CTC CTC 408 Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu 95 100 105 AGC AGC GTG AAA CAT TTC GAG AAA GTA AAG ATT CTG CCC AAA GAT 453 Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp 110 115 120 AGA TGG ACA CAG CAT ACA ACA ACT GGA GGT TCA CGG GCC TGC GCG 498 Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly Gly Ser Arg Ala Cys Ala 125 130 135 GTG TCT GGT AAT CCA TCA TTT TTC AGG AAC ATG GTC TGG CTG ACA 543 Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn Met Val Trp Leu Thr 140 145 150 AAG GAA GGA TCA GAT TAT CCG GTT GCC AAA GGA TCG TAC AAC AAT 588 Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly Ser Tyr Asn Asn 155 160 165 ACA AGC GGA GAA CAA ATG CTA ATA ATT TGG GGG GTG CAC CAT CCC 633 Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val His His Pro 170 175 180 ATT GAT GAG ACA GAA CAA AGA ACA TTG TAC CAG AAT GTG GGA ACC 678 Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val Gly Thr 185 190 195 TAT GTT TCC GTA GGC ACA TCA ACA TTG AAC AAA AGG TCA ACC CCA 723 Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr Pro 200 205 210 GAA ATA GCA ACA AGG CCT AAA GTG AAT GGA CAA GGA GGT AGA ATG 768 Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met 215 220 225 GAA TTC TCT TGG ACC CTC TTG GAT ATG TGG GAC ACC ATA AAT TTT 813 Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe 230 235 240 GAG AGT ACT GGT AAT CTA ATT GCA CCA GAG TAT GGA TTC AAA ATA 858 Glu Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile 245 250 255 TCG AAA AGA GGT AGT TCA GGG ATC ATG AAA ACA GAA GGA ACA CTT 903 Ser Lys Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu 260 265 270 GAG AAC TGT GAG ACC AAA TGC CAA ACT CCT TTG GGA GCA ATA AAT 948 Glu Asn Cys Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn 275 280 285 ACA ACA TTA CCT TTT CAC AAT GTC CAC CCA CTG ACA ATA GGT GAG 993 Thr Thr Leu Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu 290 295 300 TGC CCC AAA TAT GTA AAA TCG GAG AAG TTG GTC TTA GCA ACA GGA 1038 Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly 305 310 315 CTA AGG AAT GTT CCC CAG ATT GAA TCA AGA GGA TTG TTT GGG GCA 1083 Leu Arg Asn Val Pro Gln Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala 320 325 330 ATA GCT GGT TTT ATA GAA GGA GGA TGG CAA GGA ATG GTT GAC GGT 1128 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly 335 330 345 TGG TAT GGA TAC CAT CAC AGC AAT GAC CAG GGA TCA GGG TAT GCA 1173 Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala 350 355 360 GCA GAC AAA GAA TCC ACT CAA AAG GCA TTT GAT GGA ATC ACC AAC 1218 Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Phe Asp Gly Ile Thr Asn 365 370 375 AAG GTA AAT TCT GTG ATT GAA AAG ATA AAC ACC CAA TTT GAA GCT 1263 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Ile Asn Thr Gln Phe Glu Ala 380 385 390 GTT GGG AAA GAA TTC GGT AAC TTA GAG AAA AGA CTG GAG AAC TTG 1308 Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Lys Arg Leu Glu Asn Leu 395 400 405 AAC AAA AAG ATG GAA GAC GGG TTT CTA GAT GTG TGG ACA TAC AAT 1353 Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn 410 415 420 GCT GAG CTT TTA GTT CTG ATG GAA AAT GAG AGG ACA CTT GAC TTT 1398 Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe 425 430 435 CAT GAT TCT AAT GTC AAG AAT CTG TAT AGT AAA GTC AGA ATG CAG 1443 His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Ser Lys Val Arg Met Gln 440 445 450 CTG AGA GAC AAC GTC AAA GAA CTA GGA AAT GGA TGT TTT GAA TTT 1488 Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe 455 460 465 TAT CAC AAA TGT GAT GAT GAA TGC ATG AAT AGT GTG AAA AAC GGG 1533 Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly 470 475 480 ACA TAT GAT TAT CCC AAG TAT GAA GAA GAG TCT AAA CTA AAT AGA 1578 Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg 495 500 505 AAT GAA ATC AAA GGG GTA AAA TTG AGC AGC ATG GGG GTT TAT CAA 1623 Asn Glu Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln 510 515 520 ATC CTT GCC ATT TAT GCT ACA GTA GCA GGT TCT ATG TCA CTG GCA 1668 Ile Leu Ala Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Met Ser Leu Ala 525 530 535 ATC ATG ATG GCT GGG ATC TCT TTC TGG GTG TGC TCC AAC GGG TCT 1713 Ile Met Met Ala Gly Ile Ser Phe Trp Val Cys Ser Asn Gly Ser 540 545 550 CTG CAG TGC AGG ATC TGC ATA TGATTATAAG TCATTTTATA ATTAAAAACA 1764 Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 555 CCCTTGTTTC TGCTAGCCG 1783

【０１７１】配列番号：47 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TCCGTTTAGT TTGCATAACT TTCCG 25

【０１７２】配列番号：48 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TCCGGGATCA TGAAAACAGA AGGAAC 26

【０１７３】配列番号：49 配列の長さ：1135 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A/Okuda/57 配列 CTAGCAAAAG CAGGGGTTAT ACCATAGAAA ACCAAAAGCA AAACAATGGC CATCATTTAT 60 CTCATTCTCC TGTTCACAGC AGTGAGAGGG GACCAGATAT GCATTGGATA CCATGCCAAT 120 AATTCCACAG AGAAGGTCGA CACAATTCTA GAGCGGAACG TCACTGTGAC TCATGCCAAG 180 GACATCCTTG AGAAGACCCA TAACGGAAAG TTATGCAAAC TAAACGGATC CGGGATCATG 240 AAAACAGAAG GAACACTTGA GAACTGTGAG ACCAAATGCC AAACTCCTTT GGGAGCAATA 300 AATACAACAT TACCTTTTCA CAATGTCCAC CCACTGACAA TAGGTGAGTG CCCCAAATAT 360 GTAAAATCGG AGAAGTTGGT CTTAGCAACA GGACTAAGGA ATGTTCCCCA GATTGAATCA 420 AGAGGATTGT TTGGGGCAAT AGCTGGTTTT ATAGAAGGAG GATGGCAAGG AATGGTTGAC 480 GGTTGGTATG GATACCATCA CAGCAATGAC CAGGGATCAG GGTATGCAGC AGACAAAGAA 540 TCCACTCAAA AGGCATTTGA TGGAATCACC AACAAGGTAA ATTCTGTGAT TGAAAAGATA 600 AACACCCAAT TTGAAGCTGT TGGGAAAGAA TTCGGTAACT TAGAGAAAAG ACTGGAGAAC 660 TTGAACAAAA AGATGGAAGA CGGGTTTCTA GATGTGTGGA CATACAATGC TGAGCTTTTA 720 GTTCTGATGG AAAATGAGAG GACACTTGAC TTTCATGATT CTAATGTCAA GAATCTGTAT 780 AGTAAAGTCA GAATGCAGCT GAGAGACAAC GTCAAAGAAC TAGGAAATGG ATGTTTTGAA 840 TTTTATCACA AATGTGATGA TGAATGCATG AATAGTGTGA AAAACGGGAC ATATGATTAT 900 CCCAAGTATG AAGAAGAGTC TAAACTAAAT AGAAATGAAA TCAAAGGGGT AAAATTGAGC 960 AGCATGGGGG TTTATCAAAT CCTTGCCATT TATGCTACAG TAGCAGGTTC TATGTCACTG 1020 GCAATCATGA TGGCTGGGAT CTCTTTCTGG GTGTGCTCCA ACGGGTCTCT GCAGTGCAGG 1080 ATCTGCATAT GATTATAAGT CATTTTATAA TTAAAAACAC CCTTGTTTCT GCTAG 1135

【０１７４】配列番号：50 配列の長さ：348 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly -15 -10 -5 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys 1 5 10 15 Val Asp Thr Ile Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys 20 25 30 Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn 35 40 45 Gly Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys Glu 50 55 60 Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro 65 70 75 Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr 80 85 90 Val Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 95 100 105 Pro Gln Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 110 115 120 Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 125 130 135 His His Ser Asn Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 140 145 150 Ser Thr Gln Lys Ala Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser 155 160 165 Val Ile Glu Lys Ile Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu 170 175 180 Phe Gly Asn Leu Glu Lys Arg Leu Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met 185 190 195 Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu 200 205 210 Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 215 220 225 Val Lys Asn Leu Tyr Ser Lys Val Arg Met Gln Leu Arg Asp Asn 230 235 240 Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys 245 250 255 Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr 260 265 270 Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu Ile Lys 275 280 285 Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile 290 295 300 Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Met Ser Leu Ala Ile Met Met Ala 305 310 315 Gly Ile Ser Phe Trp Val Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg 320 325 330 Ile Cys Ile

【０１７５】配列番号：51 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GATCTAGAAG CAAAGCAGGG GATAATTCTA 30

【０１７６】配列番号：52 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACAGATCTAG TAGAAACAAG GGTGTTTTT 29

【０１７７】配列番号：53 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGGCTAGCAG AAACAAGGGT GTTTTTAATT 30

【０１７８】配列番号：54 配列の長さ：1778 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A2/Aichi/2/68 配列 GATCTAGAAG CAAAGCAGGG GATAATTCTA 30 TTAATC ATG AAG ACC ATC ATT GCT TTG AGC TAC ATT TTC TGT CTG GCT CTC 81 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Leu -15 -10 -5 GGC CAA GAC CTT CCA GGA AAT GAC AAC AGC ACA GCA ACG CTG TGC 127 Gly Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys 1 5 10 CTG GGA CAT CAT GCG GTG CCA AAC GGA ACA CTA GTG AAA ACA ATC 172 Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile 15 20 25 ACA GAT GAT CAG ATT GAA GTG ACT AAT GCT ACT GAG CTA GTT CAG 217 Thr Asp Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln 30 35 40 AGC TCC TCA ACG GGG AAA ATA TGC AAC AAT CCT CAT CGA ATC CTT 262 Ser Ser Ser Thr Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu 45 50 55 GAT GGA ATA GAC TGC ACA CTG ATA GAT GCT CTA TTG GGG GAC CCT 307 Asp Gly Ile Asp Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro 60 65 70 CAT TGT GAT GTT TTT CAA AAT GAG ACA TGG GAC CTT TTC GTT GAA 352 His Cys Asp Val Phe Gln Asn Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu 75 80 85 CGC AGC AAA GCT TTC AGC AAC TGT TAC CCT TAT GAT GTG CCA GAT 397 Arg Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 90 95 100 TAT GCC TCC CTT AGG TCA CTA GTT GCC TCG TCA GGC ACT CTG GAG 442 Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu 105 110 115 TTT ATC ACT GAG GGT TTC ACT TGG ACT GGG GTC ACT CAG AAT GGG 487 Phe Ile Thr Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly 120 125 130 GGA AGC AAT GCT TGC AAA AGG GGA CCT GGT AGC GGT TTT TTC AGT 532 Gly Ser Asn Ala Cys Lys Arg Gly Pro Gly Ser Gly Phe Phe Ser 135 140 145 AGA CTG AAC TGG TTG ACC AAA TCA GGA AGC ACA TAT CCA GTG CTG 577 Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Thr Tyr Pro Val Leu 150 155 160 AAC GTG ACT ATG CCA AAC AAT GAC AAT TTT GAC AAA CTA TAC ATT 622 Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asp Asn Phe Asp Lys Leu Tyr Ile 165 170 175 TGG GGG ATT CAC CAC CCG AGC ACG AAC CAA GAA CAA ACC AGC CTG 667 Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Asn Gln Glu Gln Thr Ser Leu 180 185 190 TAT GTT CAA GCA TCA GGG AGA GTC ACA GTC TCT ACC AGG AGA AGC 712 Tyr Val Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Arg Arg Ser 195 200 205 CAG CAA ACT ATA ATC CCG AAT ATC GGG TCC AGA CCC TGG GTA AGG 757 Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg 210 215 220 GGT CTG TCT AGT AGA ATA AGC ATC TAT TGG ACA ATA GTT AAG CCG 802 Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro 225 230 235 GGA GAC GTA CTG GTA ATT AAT AGT AAT GGG AAC CTA ATC GCT CCT 847 Gly Asp Val Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro 240 245 250 CGG GGT TAT TTC AAA ATG CGC ACT GGG AAA AGC TCA ATA ATG AGG 892 Arg Gly Tyr Phe Lys Met Arg Thr Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg 255 260 265 TCA GAT GCA CCT ATT GAT ACC TGT ATT TCT GAA TGC ATC ACT CCA 937 Ser Asp Ala Pro Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro 270 275 280 AAT GGA AGC ATT CCC AAT GAC AAG CCC TTT CAA AAC GTA AAC AAG 982 Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys 285 290 295 ATC ACA TAT GGA GCA TGC CCC AAG TAT GTT AAG CAA AAC ACC CTG 1027 Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu 300 305 310 AAG TTG GCA ACA GGG ATG CGG AAT GTA CCA GAG AAA CAA ACT AGA 1072 Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg 315 320 325 GGC CTA TTC GGC GCA ATA GCA GGT TTC ATA GAA AAT GGT TGG GAG 1117 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu 330 335 340 GGA ATG ATA GAC GGT TGG TAC GGT TTC AGG CAT CAA AAT TCT GAG 1162 Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu 345 350 355 GGC ACA GGA CAA GCA GCA GAT CTT AAA AGC ACT CAA GCA GCC ATC 1207 Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile 360 365 370 GAC CAA ATC AAT GGG AAA TTG AAC AGG GTA ATC GAG AAG ACG AAC 1252 Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Glu Lys Thr Asn 375 380 385 GAG AAA TTC CAT CAA ATC GAA AAG GAA TTC TCA GAA GTA GAA GGG 1297 Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly 390 395 400 AGA ATT CAG GAC CTC GAG AAA TAC GTT GAA GAC ACT AAA ATA GAT 1342 Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp 405 410 415 CTC TGG TCT TAC AAT GCG GAG CTT CTT GTC GCT CTG GAG AAT CAA 1387 Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln 420 425 430 CAT ACA ATT GAC CTG ACT GAC TCG GAA ATG AAC AAG CTG TTT GAA 1432 His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu 435 440 445 AAA ACA AGG AGG CAA CTG AGG GAA AAT GCT GAA GAG ATG GGC AAT 1477 Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Met Gly Asn 450 455 460 GGT TGC TTC AAA ATA TAC CAC AAA TGT GAC AAC GCT TGC ATA GAG 1522 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu 465 470 475 TCA ATC AGA AAT GGT ACT TAT GAC CAT GAT GTA TAC AGA GAC GAA 1567 Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu 480 485 490 GCA TTA AAC AAC CGG TTT CAG ATC AAA GGT GTT GAA CTG AAG TCT 1612 Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser 495 500 505 GGA TAC AAA GAC TGG ATC CTG TGG ATT TCC TTT GCC ATA TCA TGC 1657 Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys 510 515 520 TTT TTG CTT TGT GTT GTT TTG CTG GGG TTC ATC ATG TGG GCC TGC 1702 Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys 525 530 535 CAG AGA GGC AAC ATT AGG TGC AAC ATT TGC ATT TGAGTGTATT AGTAATTAAA 1755 Gln Arg Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile 40 545 550 AACACCCTTG TTTCTGCTAG CCG 1778

【０１７９】配列番号：55 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATTGTTGCAT ATTTTCCCCG 20

【０１８０】配列番号：56 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATTGATACCT GTATTTCTGA 20

【０１８１】配列番号：57 配列の長さ：1110 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 起源： 生物名：A2/Aichi/2/68 配列 CTAGAAGCAA AGCAGGGGAT AATTCTATTA ATCATGAAGA CCATCATTGC TTTGAGCTAC 60 ATTTTCTGTC TGGCTCTCGG CCAAGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120 TGCCTGGGAC ATCATGCGGT GCCAAACGGA ACACTAGTGA AAACAATCAC AGATGATCAG 180 ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGCTAGTT CAGAGCTCCT CAACGGGGAA AATATGCAAC 240 AATATTGATA CCTGTATTTC TGAATGCATC ACTCCAAATG GAAGCATTCC CAATGACAAG 300 CCCTTTCAAA ACGTAAACAA GATCACATAT GGAGCATGCC CCAAGTATGT TAAGCAAAAC 360 ACCCTGAAGT TGGCAACAGG GATGCGGAAT GTACCAGAGA AACAAACTAG AGGCCTATTC 420 GGCGCAATAG CAGGTTTCAT AGAAAATGGT TGGGAGGGAA TGATAGACGG TTGGTACGGT 480 TTCAGGCATC AAAATTCTGA GGGCACAGGA CAAGCAGCAG ATCTTAAAAG CACTCAAGCA 540 GCCATCGACC AAATCAATGG GAAATTGAAC AGGGTAATCG AGAAGACGAA CGAGAAATTC 600 CATCAAATCG AAAAGGAATT CTCAGAAGTA GAAGGGAGAA TTCAGGACCT CGAGAAATAC 660 GTTGAAGACA CTAAAATAGA TCTCTGGTCT TACAATGCGG AGCTTCTTGT CGCTCTGGAG 720 AATCAACATA CAATTGACCT GACTGACTCG GAAATGAACA AGCTGTTTGA AAAAACAAGG 780 AGGCAACTGA GGGAAAATGC TGAAGAGATG GGCAATGGTT GCTTCAAAAT ATACCACAAA 840 TGTGACAACG CTTGCATAGA GTCAATCAGA AATGGTACTT ATGACCATGA TGTATACAGA 900 GACGAAGCAT TAAACAACCG GTTTCAGATC AAAGGTGTTG AACTGAAGTC TGGATACAAA 960 GACTGGATCC TGTGGATTTC CTTTGCCATA TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG 1020 GGGTTCATCA TGTGGGCCTG CCAGAGAGGC AACATTAGGT GCAACATTTG CATTTGAGTG 1080 TATTAGTAAT TAAAAACACC CTTGTTTCTG 1110

【０１８２】配列番号：58 配列の長さ：346 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Leu -15 -10 -5 Gly Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys 1 5 10 Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile 15 20 25 Thr Asp Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln 30 35 40 Ser Ser Ser Thr Gly Lys Ile Cys Asn Asn Ile Asp Thr Cys Ile 45 50 55 Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro 60 65 70 Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Lys Tyr 75 80 85 Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val 90 95 100 Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 105 110 115 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe 120 125 130 Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 135 140 145 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg 150 155 160 Val Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu 165 170 175 Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val 180 185 190 Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu 195 200 205 Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu 210 215 220 Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn 225 230 235 Ala Glu Glu Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys 240 245 250 Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His 255 260 265 Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys 270 275 280 Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile 285 290 295 Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly 300 305 310 Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile 315 320 325 Cys Ile 330

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＡ分子の三次構造の模式図、及びＨ１Ｎ１サ
ブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ間のＨＡ分子中の共通保
存領域の位置を示す図である。

【図２】ＨＡ分子の三次構造の模式図、及びＨ３Ｎ２サ
ブタイプのＨＡ分子中の共通保存領域の位置を示す図で
ある。

【図３】インフルエンザウイルス感染群の生存率を示す
図である。

【図４】インフルエンザウイルス感染群の生存率を示す
図である。

【図５】インフルエンザウイルス感染群の体重変化を示
す図である。

【図６】インフルエンザウイルス感染群の生存率を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのヘマ
   グルチニン分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を有
   し、ヘマグルチニン分子中の球状部領域が欠失した免疫
   原性人工ポリペプチド。
2. 【請求項２】 分子内に少なくとも配列表の配列番号１
   で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列と、配列表の配
   列番号２で表されるGITNKVNSVIEKポリペプチド配列を有
   し、該両配列の立体配置がＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２
   Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域と実質
   上同一の抗原性を有することを特徴とする請求項１記載
   の免疫原性人工ポリペプチド。
3. 【請求項３】 分子内に少なくとも配列表の配列番号３
   で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と、配列表の配
   列番号４で表されるQINGKLNR（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプ
   チド配列を有し、該両配列の立体配置がＨ３Ｎ２サブタ
   イプのヘマグルチニン分子中の幹領域と実質上同一の抗
   原性を有することを特徴とする請求項１記載の免疫原性
   人工ポリペプチド。
4. 【請求項４】 ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのヘマ
   グルチニン分子のプロテアーゼ処理物より分離してなる
   ことを特徴とする請求項１記載の免疫原性人工ポリペプ
   チド。
5. 【請求項５】 ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのヘマ
   グルチニン分子中の幹領域と実質上同一の抗原性を有
   し、ヘマグルチニン分子中の球状部領域が欠失した免疫
   原性人工ポリペプチドをコードする遺伝子。