JP2009537147A - インフルエンザウイルスに対する中和抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インフルエンザA型ウイルスに対する中和抗体を同定し、産生し、さらに、遺伝子操作する方法および手段、ならびに産生された中和抗体に関する。特に、本発明は、例えば、H1、H2、H3、およびH5サブタイプのすべてなど2つ以上のH1、H2、H3、H5、H7およびH9に対する中和抗体を含む、種々のインフルエンザA型ウイルスサブタイプに対する中和抗体およびこの種の抗体を作る方法および手段に関する。さらに具体的に述べると、本発明は、インフルエンザA型ウイルスサブタイプの分離株を1つより多く、好ましくはすべてを中和し得る抗体に関する。
インフルエンザは、インフルエンザウイルスにより引き起こされる接触伝染性の呼吸器疾患である。該ウイルスは軽症から重篤までの疾患を引き起こし、時には死に至ることもある。毎年米国では、国民の5〜20%がインフルエンザにかかり、約200,000人が入院させられ、約36,000人が死亡する。
特に明記しない限り、本明細書で使われる技術・科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,NY 1994)は、本出願において使われる多くの用語の手引書を当業者に提供する。
抗体鎖に関連した用語「可変」は、抗体内の配列で広範に違いがあり、その特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および選択性に関与する該抗体の部分を意味するのに使われる。この種の可変性は、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインにおいて超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに濃縮されている。可変ドメイン類のより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FR:framework region)と呼ばれる。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメイン類は、各々が、4つのFR(FR1、FR2、FR3およびFR4、それぞれ)を含み、大抵が3つの超可変領域により接続されたβ−シート配置を採用し、該超可変領域は、ループ接続、および一部の場合にはβ−シート構造の一部を形成している。各鎖の超可変領域は、FR類により、および他の鎖からの超可変領域を用いて近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991),pages 647−669を参照のこと)。定常ドメイン類は、抗体の抗原への結合には直接には関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など種々のエフェクター機能を示す。
B.一般的技法
本発明の方法を行う技法は、当該技術において周知であり、例えば、Ausubel et al.,Current Protcols of Molecular Biology,John Wiley and Sons(1997);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,J.Sambrook and D.W.Russel,eds.Cold Spring Harbor,New York,USA,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001;Antibody Phage Display:Methods and Protocols,P.M.O’Brian and R.Aitken,eds.,Humana Press,In:Methods in Molecular Biology,Vol.178;Phage Display:A Laboratory Manual,C.F.Barbas III et al.,eds.Cold Spring Harbor,New York,USA,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001;and Antibodies,G.Subramanian,ed.,Kluwer Academic,2004;を含む研究室用標準教科書に記載されている。突然変異誘発は、例えば、部位特異的な突然変異誘発を用いて行うことができる(Kunkcl et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488−492(1985))。
C.好ましい実施形態に関する詳細な説明
本発明は、絶滅株の分離株を含むインフルエンザA型サブタイプの1つより多くの株(分離株)を中和するモノクローナル抗体、ならびにH5ヘマグルチニンの存在を特徴とするサブタイプを含む、1つより多くのインフルエンザA型サブタイプに対する中和抗体の選択、産生および使用に関する。特定の実施形態では、本発明は、1つより多くのインフルエンザA型のサブタイプおよび/または1つより多くの分離株、または2つより多い分離株、または3つより多い分離株、または4つより多い分離株、または5つより多い分離株、など、最も好ましくは1つ以上のサブタイプのすべての分離株を中和するモノクローナル抗体の選択、産生および使用に関する。
包括的なヒトインフルエンザ抗体ライブラリーは、以前のいろいろなインフルエンザ、季節的突発的流行、および1968年の香港風邪(H3N2)、1957年のアジア風邪(H2N2)、1918年のスペイン風邪(H1N1)、および2004/2005年の鳥インフルエンザ(H5N1)を含むパンデミックの回復期の患者から得られた抗体から作り出すことができる。この種のライブラリーを作るために、インフルエンザウイルスに感染したことが分かっているか、またはその疑いがある個体から血液または骨髄の試料を集める。周辺の血液試料、特に地理学的に離れた供給源からの試料は、輸送、および使用の前に安定化させる必要がある。このためのキットが周知であり、リンパ球の遠心精製の場合、BD Vacutainer(登録商標)CPT(商標)細胞調製チューブが商業的に入手でき、グアニジウム、Trizol、またはRNAlaterを用いて該試料を安定化する。安定化されたリンパ球または全骨髄を受領すると、当該技術分野において周知の免疫グロブリンオリゴプライマーを用いて、重鎖および軽鎖のレパートリーを救出するためにRT−PCRが行われる。PCRレパートリー製品は、当該技術分野で周知の手順に続いて、m13pIIIを用いてフレーム内で直接クローン化するために、リンカーオリゴと併用してscFvライブラリーを作成する。
本発明の方法では、合成ヒト抗体レパートリーは、普遍的抗体ライブラリーにより表すことができ、このライブラリーは、当該技術分野で周知または販売元から得た方法により作ることができる。したがって、この種のライブラリーのサブセットを含む普遍的免疫グロブリンライブラリーは、2003年12月11日に発行された米国特許出願公開第2003−0228302号で説明され、その全体の開示は、引用により明らかに本明細書に組み込まれている。要するに、この特許発行物は、興味深い原型免疫グロブリンのライブラリーについて説明しており、該免疫グロブリンでは、所定の単一アミノ酸が、興味深い免疫グロブリンの1つ以上の相補性決定領域における1つ以上の位置において置換されている。この種のライブラリーのサブセットには、突然変異した免疫グロブリンがあり、該免疫グロブリンでは、所定のアミノ酸が、可能なすべての組み合わせにおいて免疫グロブリンの6つの相補性決定領域における1つ以上の位置において置換されている。この種の突然変異は、例えば、米国特許第5,798,208、5,830,650、6,649,340号、および米国特許出願公開第2003−0194807号に記載されたウォークスルー突然変異誘発により作ることができ、これらの開示内容の全体が引用により本明細書に明らかに組み込まれている。ウォークスルー突然変異誘発では、免疫グロブリンのライブラリーは、該ライブラリーにおいて所定の単一アミノ酸が、該免疫グロブリンの1つ以上の相補性決定領域(CDR:complementarity determining region)またはフレームワーク(FR)領域などの該免疫グロブリンにおいて興味深い、規定された領域、またはいくつかの規定された領域の各位置に少なくとも一度組み込まれる。得られる突然変異免疫グロブリンは、原型免疫グロブリンにおける同じ位置(単数および複数)に存在した「未変性」または「野生型」アミノ酸の代わりに、該免疫グロブリンの1つ以上の領域(例えば、CDRまたはFR領域)内で、これらの免疫グロブリンが1つ以上の位置に組み込まれた所定の単一アミノ酸を有することに、原型免疫グロブリンとの違いがある。突然変異された免疫グロブリンのセットには、興味深い規定された領域の各位置に対して個別に突然変異された免疫グロブリンがあり、したがって、興味深い規定された領域の各位置に対して(例えば、CDRまたはFR)、突然変異された各免疫グロブリンは、原型免疫グロブリンに存在するアミノ酸か、または所定のアミノ酸および可能なすべての改変体を含む突然変異されたすべての免疫グロブリンの混合物を有する。
この方法では、抗体ライブラリーは、マカクまたはヒヒなどの過剰免疫を受けたヒト以外の霊長類から救出される。具体的には、ヒト以外の霊長類は、インフルエンザA型ウイルスの種々のサブタイプまたは種々のヘマグルチニン(H)タンパク質の免疫がある。免疫があるインフルエンザA型ウイルスまたはヘマグルチニンを認識している抗体のタイターを発現している動物は、犠牲にされ、該動物の脾臓を収集した。該免疫動物の血液または骨髄を集め、包括的なインフルエンザ抗体ライブラリーのために、上で説明したように産生された抗体を集め、増幅した。
用いた単数または複数の抗体ライブラリーの型とは無関係に、2種類のインフルエンザAサブタイプおよび/または同じサブタイプの2つの株(分離株)、および/またはヒトおよびヒト以外の分離株と反応性を示すなどの2元特異性を有する抗体は、発見し、制御された交差反応性選択および/または定方向のコンビナトリアルな遺伝子操作および/または突然変異誘発遺伝子操作によって最適化することができる。
特定の実施形態では、本発明は、多重(二重を含む)特異性を有する中和モノクローナル抗体を機能的に発見するためにファージディスプレイ抗体ライブラリーを利用する。この種の抗体は、H5およびH1,H5およびH2,H5およびH3,H5、H1およびH2,H5、H1およびH3,H5、H2およびH3,H1、H2およびH3などのサブタイプなどの、H5、H7および/またはH9サブタイプを含む、例えば、1つより多くのインフルエンザA型ウイルスサブタイプ、および/または同じサブタイプの1つより多くの株(分離株)を中和し得るモノクローナル抗体でよい。
所望の中和特性を有する抗体を選別する方法は、上で説明した。反応性は、所望のヘマグルチニンタンパク質への直接結合に基づいて評価することができる。
ヘマグルチニン(HA)タンパク質は、組換えDNA技術により産生することができる。この方法では、HA遺伝子は、適切なベクター、ヨトウガ(Sf9)細胞などのバキュロウイルス感染昆虫細胞において発現するために、バキュロウイルス発現ベクターにクローン化されるのが好ましい。
C−末端エピトープ標識がある場合とない場合がある、Bac−to−Bac(Invitrogen)などのバキュロウイルス発現ベクター内に挿入される。ポリ−his標識は、ニッケルキレート・クロマトグラフィによる簡易精製を提供する。
HAタンパク質は、上で説明したライブラリーを選別するために、マイクロタイターウエルまたは磁気ビードの表面に固定する。特定の実施形態では、各ライブラリーは、4度で2時間H5タンパク質を結合することができ、次いで、冷PBSを用いて十分洗浄し、0.2Mグリシン−HClバッファー(pH2.5)を用いてHA特異結合クローンを溶離する。回収されたファージは、pHは中性で、感受性宿主大腸菌を感染させることにより増幅される。次いで、陽性クローンの濃縮および死傷者分類のためのその後のクローン単離を繰り返すために、ファージミド産生を誘発することができる。十分濃縮されると、プール全体は、可溶性scFvタンパク質を発現するためにHB2151などの非アンバー抑制大腸菌株内に感染により移される。一方、プール(単数および複数)は、pBADなどのモノマー性scFv発現ベクター内にサブクローン化され、組換え可溶性scFvタンパク質は、下で説明するように、インビトロ分析およびキャラクテリゼーションのために発現される。
H5クローンは、まず、上で説明した、産生されたH5タンパク質への結合親和性についてテストする。特定の実施例では、2004H5タンパク質(Refseq AAS65618,Isolate;A/Thailand/2(SP−33)/2004(H5N1))への結合がテストされ、および1997H5タンパク質(Refseq AAF74331,Isolate;A/Hong Kong/486/97(H5N1))に対する並行テストがなされ、他の分離株も単独または何らかの組み合わせで使用することができる。2004および1997H5タンパク質を用いて得られた陽性クローンは、2つの広義のカテゴリー;2004selectiveおよび2004/1997nonselectiveに入る。中和に関する典型的な機能テストは、赤血球に対する全ウイルス結合を用いたヘマグルチニン抑制アッセイを含む。安全面の懸念により、組換えタンパク質および赤血球を用いた、代わりのヘマグルチニンアッセイが好ましい。全血の必要性を排除するために、ヘマグルチニン結合抑制アッセイは気道上皮細胞について行うことができる。この結合アッセイは、フローサイトメトリーまたは細胞ELISA(cELISA)をベースにしたアッセイを含む、無制限に、何らかの形態で行うことができる。cELISAを用いると、高価なフローサイトメトリー装置を使用しなくてすみ、より高度に自動化されたクローン・アセスメントおよびより大きなデータコレクションが得られる利点がある。一方、フローサイトメトリーには、感度が高く、一貫性に優れ、高速である利点もある。
鳥類ウイルス(H5)により引き起こされたヒトの感染と関連した潜在的パンデミックを含むインフルエンザの流行およびパンデミックに効率的に対応するために、H5タンパク質、ならびに将来の突然変異など、Hタンパク質の現在の分離株を効率的に中和する抗体が必要である。この目標を達成するために、標的となるヘマグルチニンサブタイプ(単数および複数)の既知のすべての分離株に結合する、様々なH(例えば、H5)中和クローンを同定する必要がある。
誤りがちなPCR(Leung et al.,Technique 1:11−15(1989);Cadwell and Joyce,PCR Method Applic.2:28−33(1992))は、クローン化遺伝子内にランダムポイント突然変異を導入する改変ポリメラーゼ連鎖反応(PCR:polymerase chain reaction)技法である。得られるPCR産生物は、クローン化してランダム突然変異体ライブラリーを作るか、またはT7プロモーターが適切なPCRプライマー内に組み込まれるならば、直接転写することができる。
所望の中和特性を有する抗体が、一旦、同定されると、抗体断片を含むこの種の抗体は、例えば、ハイブリドーマ技法または組換えDNA技術を含む当該技術分野で周知の方法により産生することができる。
本発明のインフルエンザ中和抗体は、A型インフルエンザ感染の予防および/または処置に使用することができる。治療に使う場合は、抗体または分子類は、それらの送達が、抗体(単数および複数)をベースにする輸送配列を用いることにより容易になり、通常、医薬組成物の形で使われる。技法および処方は、一般に、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition, Mack Publishing Co.(Easton,Pa.1990)に記載されている。また、Wang and Hanson”Parenteral Formulations of Proteins and Peptides;Stability and Stabilizers,”Journal of Parenteral Science and Technology,Technical Report No.10,Supp.42−2S(1988)も参照のこと。
物質および方法
骨髄プロトコルおよび血清製剤
血液は、標準静脈穿刺により採血し、凝血させ、処理して血清を回収した。血清は、ドライアイスにのせて出荷するまで、3〜4日間−20℃で貯蔵した。ドナーは、局所麻酔薬を注入して麻酔にかけ、5mlの骨髄を各H5N1生存者の骨盤から採取した。次に、5mlの骨髄を45mlのRNAlater(Ambion)を含む無菌の50mlのチューブに入れた。この混合物を、目視できる凝集塊がなくなるまで、約8〜20回丁寧に反転させ、骨髄とRNAlaterとをよく混合させた。次に、この試料を2〜10℃で一晩冷蔵した。一晩冷蔵後、試料は、ドライアイスにのせて出荷するまで、3〜4日間−20℃で貯蔵した。受け取り次第直ぐに、RNAlater/髄および血清含有チューブは、処理するまで−80℃で貯蔵した。
ELISAプレート(Thermo,Immulon 4HBX 96W)は、1X ELISAプレートコーティング溶液(BioFX)中で100μlの100ng/mLのH5ヘマグルチニン(Protein Sciences,A/Vietnam/1203/2004)で被覆し、室温で一晩インキュベーションした。次の日複数のプレートを300μlのPBS/0.05%Tween−20(PBST)で3度洗浄した。洗浄後、300μlのブロッキング溶液(PBS/0.05%Tween−20中4%無脂肪ドライミルク)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ブロッキングステップの後、これらのプレートは、300μlのPBS/0.05%Tween−20(PBST)で3度洗浄した。次に、PBS/0.05%Tween中で1:20,000に希釈した100μlの血清試料を、室温で1〜2時間インキュベートし、次いで、300μlのPBS/0.05%Tween−20で3度洗浄した。PBS/0.05%Tween中で1:5,000に希釈した抗ヒトFc−HRP接合体の100μlを室温で1〜2時間インキュベートし、次いで、300μlのPBS/0.05%Tween−20で3度洗浄した。この最終洗浄の後、100μlの発色基質溶液(TMB1基質、BioFX)を添加し、十分な時間が経過した後、100μlのSTOP溶液(BioFX)を添加して終結させた。450nmにおける吸光度をプレートリーダー(Softmax Proソフトウエアを備えたMolecular Devices Thermomaxマイクロプレートリーダー)で読み取り、データを記録し、次いで、エクセル(マイクロソフト)を用いてプロットした。
予め−80℃で貯蔵した骨髄(20mlのRNAlater中約2.5ml)を、RNAlaterを除去するために遠心分離により回収し、次いで、300μlの酢酸を含む11.25mlのTRIBD試薬(Sigma)に再懸濁した。次いで、このペレットは、激しく渦流状にした。次に、1.5mlのBCP(1−ブロモ−3−クロロプロパン,Sigma)を添加し、渦流にすることにより混合し、室温で5分間インキュベートし、次いで、4℃で15分間12000×gで遠心分離した。界面を乱さないように、水相を注意して除去した。次に、水相からの全RNA25mlのイソプロパノールを添加して沈殿させ、室温で10分間インキュベートし、4℃で10分間12000×gで遠心分離した。イソプロパノールを添加後、残留RNAlaterにより2相が形成され、界面に沈殿RNAが沈降しているのが認められた。残留RNAlaterを排除し、RNAを最大限に回収するために、H2O中50%のイソプロパノールの5mlアリコートを添加し、相分離が認められなくなるまで混合し、その点で4℃で10分間12000×gで遠心分離によりRNAをペレット化した。RNAペレットを75%EtOHで洗浄し、RNAseフリーの1.6mlマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により再び回収した。最後に、RNAペレットを100μlの1mM燐酸ナトリウム、pH8.2に再懸濁させ、RNA純度を決めるためにA260およびA280を読みとった。
逆転写(RT:reverse transcription)反応は、75〜100ngのmRNAを、2μlの10X Accuscript RT Buffer(Stratagene)、0.8μlの100mM dNTP、およびN9(300ng)と
オリゴdTプライマー(100ng)とのいずれかとを一緒に混合し、次いで、水で最後に、容積を17μlにした。これらの混合物を65℃で5分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。次に、2μlのDTT、0.5μlのRNase Block(Stratagene)、0.5μlのAccuscript RT(Stratagene)を、各反応物に添加した。次に、N9で予め刺激を受けた反応物を室温で10分間インキュベートし、オリゴ−dTで予め刺激を受けた反応物を氷上で10分間インキュベートした。最後に、両方の反応物を42℃で60分間、次いで、70℃で15分間インキュベートし、酵素を撲滅した。
抗体の重鎖および軽鎖のレパートリーは、ヒトの生殖細胞VおよびJ領域に基づいて先に説明した方法および縮重プライマーを用いて本質的に骨髄cDNAから増幅された(O’Brien,P.M.,Aitken R.Standard protocols for the construction of scFv Libraries.Antibody Phage Display−Methods and Protocols,vol 178,59−71,2001,Humana Press)。
個々の鳥類インフルエンザの生存者に関する個別の抗体ライブラリーは、末端のpIIIストップコドンに続いて未翻訳領域に挿入した3−ヌクレオチドを同定する独特のバーコードを用いて構築した。
プールされたカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖をドナーにつき各々1μgは、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて1.5%アガロースTAEゲルから精製したゲル、ならびにNotIおよびBamHIを用いて消化した。5μgの各ベクターは、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて1%アガロースTAEゲルから精製したゲル、ならびにNotIおよびBamHIを用いて消化した。ライブラリーの連結は、200mgのゲル精製カッパまたはラムダの挿入物および1μgのゲル精製ベクターを用いて、60μl中RTで1時間または14℃で一晩行った。連結は、Edge BioSystem Perfromaスピンカラムを用いて脱塩した。このライブラリーは、80μlのTG−1またはXL−1ブルーのアリコートにおいて5つの電気穿孔中で形質転換し、各々1mlのSOCとして回収し、プールし、37℃で1時間増殖させた。形質転換体の総数は、形質転換の各々からのアリコートを蒔くことによりこの増殖後に測定した。残りの電気穿孔は、200mlの2YT+50μg/mlのAmpicillin+2%グルコース中37℃で一晩増殖することにより増幅させた。次の軽鎖ライブラリーは、Qiagen高速Maxiprepキットを用いてこれらの一晩培養物からプラスミド精製により回収した。
各々が1.5〜2μgのドナー特異性重鎖類(VH1、VH2、5、6プール、VH3、およびVH4)は、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて1.5%アガロースTAEゲルから精製したゲル、ならびにSfiIおよびXhoIを有する
40ユニット過剰/μgのDNAを用いて消化した。15μgの各軽鎖ライブラリーベクターは、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて1.5%アガロースTAEゲルから精製したゲル、ならびにSfiIおよびXhoIを有する40ユニット/μgのDNAを用いて消化した。ライブラリー連結は、消化された1.2μgのSfiI/XhoI、ゲル精製重鎖ドナーコレクションおよび5μgの14℃で一晩置かれた各軽鎖ライブラリー(カッパおよびラムダ)を併用して作成した。次いで、ライブラリー連結物は、Edge BioSystem Pefromaスピンカラムを用いて脱塩し、80μlのTG−1アリコート中でライブラリーあたり20個の電気穿孔を介して形質転換され、各々は1mlのSOC中に回収され、プールされ、37℃で1時間増殖された。再び、この増殖の後、アリコートの各々を用いて、形質転換体の総数を測定し、残りは、1Lの2YT+50μg/mlのAmpicillin+2%グルコースに移され、OD600が約0.3になるまで激しく曝気処理しながら、37℃で増殖させた。次のM13K07ヘルパーファージは、5:1の感染多重度(MOI:multiplicity of infection)で添加し、撹拌せずに37℃で1時間インキュベートした。次に、遠心分離により細胞を取得し、1Lの2YT+50μg/mlのAmpicillin、70μg/mlのKanamycin中に再懸濁させ、scFvファージミドを産生させるために激しく曝気しながら37℃で一晩増殖させた。次の朝、遠心分離により細胞を集め、ファージミドを含む上澄みを集めた。ファージミドは、0.2容量の20%PEG/5MのNaCl溶液を添加し、氷上で1時間インキュベーションして上澄みから沈殿させた。次いで、ファージミド・ライブラリーストックは、遠心分離により取得し、20mlの無菌PBSに再懸濁させた。残りの細菌は、追加の遠心分離により除去し、最終ファージミド・ライブラリーは、PBS+50%グリセロール中−20℃で貯蔵した。
ELISAプレート(Immulon 4HBX平底、Nunc)を、ELISAプレートコーティング溶液(BioFX)中室温で一晩インキュベーションして100μlの100ng/mLのH5ヘマグルチニンタンパク質(Protein Sciences,A/Vietnam/1203/2004)で被覆した。次の日プレート類は、300μlのPBSTで3度洗浄した。洗浄後、300μlのブロッキング溶液(PBS/0.05%Tween−20中4%無脂肪ドライミルク)を添加し、氷上で30分間インキュベートした。ブロッキングステップの後、これらのプレートは300μlのPBSTで3度洗浄した。ファージパニングの直前に、Millipore Amicon Ultraカラムを用いて、凍結ファージミドストックからグリセロールを除去し、次いで、4%無脂肪ドライミルク中に15分間ブロックした。次に、ファージミドの100μlのアリコートを8つのウエル中に分配し、(全ファージ約1×1012CFU)4℃で2時間インキュベートし、次いで、300μlのPBSTで8度洗浄した。ファージミドは、室温で10分後に100μl/ウエルの溶離バッファー(0.2Mグリシン−HCl、pH2.2、1mg/mlBSA)に集めた。次いで、溶離液を、溶離液mlあたり56.25μlの2Mトリス塩基を添加して中和した。中和後、5mlのTG1細胞(OD600約0.3)を振とうなしで2−YT中37℃で30分間0.5mlの中和ファージで感染させた。このステップの後、一部の細胞をLB AMPグルコースプレート上に蒔き、ファージミドの総回収率を測定した。残りの接種液は、10mlのYATG(最終濃度2%グルコースおよび50μg/mlアンピシリン)に入れ、OD600が約0.3になるまで激しく曝気しながら37℃で増殖させた。次に、培養物を、5:1のMOIにてM13K07ヘルパーファージに感染させ、撹拌せずに37℃で30〜60分間インキュベートした。これらの細胞は、遠心分離により集め、25mlの2−YTAK(Ampicilin 50μg/ml,Kanamycin 70μg/ml)に再懸濁し、フレッシュな培養フラスコに移し、振とうしながら37℃で成長させた。その後のラウンドは、同様に回収し、増幅した。
バイオパンされたファージからの大腸菌のHB2151形質転換細胞の個々のコロニーを、1mlの2YT+100μg/mlのAMP中37℃で一晩増殖させた。次の朝、これらの細胞は遠心分離により取得し、1.5mlの周辺溶解バッファー(1mlのBBS(Teknova)+0.5mlの10mg/mlのリゾチーム+最終濃度が10mMになるEDTA)に再懸濁させた。これらの細胞は、遠心分離により再びペレット化し、周辺可溶化液を含むscFvを集めた。scFv可溶化液は、希釈バッファー(PBS/0.05%BSA)と1:1で混合し、先に抗原が希釈バッファーで被覆され、ブロックされたウエルに100μlを添加した。これらの試料を、室温で2時間インキュベートし、次いで、PBS/0.05%Tweenで3度洗浄した。次に、希釈バッファー中の1:5000に希釈したビオチン抗ヒスチジンマウス(Serotec)を100μl各ウエルに添加し、室温で1時間インキュベートした。このインキュベーションの後、これらのウエルはPBS/0.05%Tweenで3度洗浄し、次いで、各ウエルに100μlの1:2500のストレプトアビジン:HRP(Serotec)を添加し、室温で2時間インキュベートし、次いで、PBS/0.05%Tweenで3度洗浄した。この最終洗浄の後、100μlの発色基質溶液(TMB1基質、BioFX)を添加し、十分な時間が経過した後、100μlのSTOP溶液(BioFX)を添加して終結させた。450nmにおける吸光度は、プレートリーダー(Softmax Proソフトウエアを備えたMolecular Devices Thermomaxマイクロプレートリーダー)で読み取り、データを記録し、次いで、エクセル(マイクロソフト)を用いてプロットした。
重鎖および軽鎖の配列を推定するために、個々のクローンを増殖させ、プラスミドDNAを抽出した(Qiagen)。プラスミドDNAは、標準DNA塩基配列決定法により配列を決めた。
ヘマグルチニン抑制は、本質的には、Rogers et al.,Virology131:394−408(1983)の方法により、ウイルスまたはタンパク質/ウエルの4HAU(ヘマグルチネート化ユニット)を用いて丸底マイクロタイタープレート(Corning)において行った。HAI測定では、精製単一鎖可変断片(scFv)の25μlの試料が、各マイクロタイターウエルにおいてテストウイルスの4HAUを含むがこれらに限定されない25μlのPBSと混合した。室温における15分の予備インキュベーションの後、25μlの0.75%ヒト赤血球を添加し、混合した。HAI抗体活性は、室温で60分インキュベーション後目視検査により測定した。
骨髄および血液の試料は、2006年1月トルコで起きたH5N1鳥類インフルエンザの大流行の6名の生存者から、大流行の約4ヶ月後に採取した。6名の生存者全員について、トルコの保健省により承認された、理学的検査、臨床試験、および分子診断測定に続いて鳥インフルエンザの初期診断がなされた。これらの生存者のうち4名は、さらに、世界保健機関(WHO)により確認された。血清試料は、上で説明した血清学プロトコルを用いてH5ヘマグルチニン(A/Vietnam/1203/2004)に対する抗体の存在を確認するために分析した。図7に示したように、6名の患者全員の血液試料(それぞれ、SLB H1−H6と指定した)は、H5抗原に対する抗体の存在を示した。このことを確認後、これらの個体の骨髄試料からRNAを抽出し、上で説明したプロトコルを用いて骨髄mRNAを精製し、逆転写した。次いで、抗体の重鎖および軽鎖のレパートリーを、上で説明した骨髄cDNAから増幅し、個別の抗体の重鎖および軽鎖のファージミドライブラリーを、個々のライブラリーを区別するために、上で説明した3ヌクレオチドバーコードを用いて各生存者について別々にクローン化した。
Claims (93)
- インフルエンザA型ウイルスサブタイプの1つより多くの分離株および/または前記インフルエンザA型ウイルスの1つより多くのサブタイプを中和する中和抗体。
- インフルエンザA型ウイルスH1サブタイプの1つより多くの分離株を中和する、請求項1に記載の中和抗体。
- インフルエンザA型ウイルスH3サブタイプの1つより多くの分離株を中和する、請求項1に記載の中和抗体。
- インフルエンザA型ウイルスH1およびH3サブタイプを中和する、請求項1に記載の中和抗体。
- インフルエンザA型ウイルスH1および/またはH3サブタイプの1つより多くの分離株を中和する、請求項4に記載の中和抗体。
- インフルエンザA型ウイルスサブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項1に記載の中和抗体。
- 前記サブタイプが、H5、H7およびH9サブタイプからなる群から選択される、請求項1または請求項6に記載の中和抗体。
- 前記サブタイプが、前記H5サブタイプである、請求項7に記載の中和抗体。
- 前記抗体が、インフルエンザA型ウイルスH5サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項8に記載の中和抗体。
- 前記サブタイプが、前記H7サブタイプである、請求項7に記載の中和抗体。
- 前記抗体が、前記インフルエンザA型ウイルスH7サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項10に記載の中和抗体。
- 前記サブタイプが、前記H9サブタイプである、請求項7に記載の中和抗体。
- 前記抗体が、前記インフルエンザA型ウイルスH9サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項12に記載の中和抗体。
- 前記抗体が、さらに、インフルエンザA型ウイルスの追加のHサブタイプを少なくとも1つ中和する、請求項7に記載の中和抗体。
- 前記追加Hサブタイプが、H1、H2およびH3サブタイプからなる群から選択される、請求項14に記載の中和抗体。
- 前記インフルエンザA型ウイルスの追加Hサブタイプの1つより多くの分離株を中和する、請求項15に記載の中和抗体。
- 前記インフルエンザA型ウイルスのH5N1サブタイプを中和する、請求項1に記載の中和抗体。
- 前記インフルエンザA型ウイルスのH5N1サブタイプの1つより多くの分離株を中和する、請求項17に記載の中和抗体。
- 前記分離株の少なくとも1つがヒトに感染する能力を有する、請求項18に記載の中和抗体。
- 前記分離株の少なくとも1つがヒト対象から得られた、請求項19に記載の中和抗体。
- 前記ヒト対象が病気に罹患している、請求項20に記載の中和抗体。
- 前記ヒト対象が前記インフルエンザA型ウイルスのH5N1サブタイプ感染から回復した、請求項20に記載の中和抗体。
- 前記分離株の少なくとも1つがヒト以外の動物から得られた、請求項19に記載の中和抗体。
- 前記ヒト以外の動物が鳥類である、請求項23に記載の中和抗体。
- 前記ヒト以外の動物が野鳥である、請求項24に記載の中和抗体。
- 前記ヒト以外の動物がニワトリである、請求項24に記載の中和抗体。
- 前記インフルエンザA型ウイルスのH5N1サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項18に記載の中和抗体。
- 前記H5N1サブタイプおよびH1N1、H2N2、およびH3N2サブタイプからなる群から選択された少なくとも1つの追加サブタイプを中和する、請求項17に記載の中和抗体。
- 前記インフルエンザA型ウイルスのH5N1サブタイプのより多くの分離株を中和する、請求項28に記載の中和抗体。
- 前記インフルエンザA型ウイルスのH5N1サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項29に記載の中和抗体。
- 前記追加サブタイプの1つより多くの分離株を中和する、請求項30に記載の中和抗体。
- 前記追加サブタイプの実質的にすべての分離株を中和する、請求項31に記載の中和抗体。
- 前記抗体がH5タンパク質に結合する、請求項1に記載の中和抗体。
- 前記抗体が前記H5タンパク質の1つより多くの改変体に結合する、請求項33に記載の中和抗体。
- 前記抗体が前記H5タンパク質のすべての改変体に結合する、請求項34に記載の中和抗体。
- 前記抗体が少なくとも1つの追加のHタンパク質に結合する、請求項35に記載の中和抗体。
- 前記追加のHタンパク質が、H1、H2およびH3タンパク質からなる群から選択される、請求項36に記載の中和抗体。
- 前記抗体が前記追加のHタンパク質の1つより多くの改変体に結合する、請求項37に記載の中和抗体。
- 前記抗体が前記追加のHタンパク質の実質的にすべての改変体に結合する、請求項38に記載の中和抗体。
- 請求項1から39までのいずれか1項に記載の中和抗体を含む組成物。
- インフルエンザA型ウイルスサブタイプの1つより多くの分離株またはインフルエンザA型ウイルスの1つより多くのサブタイプを中和し得る抗体を同定する方法であって、
前記インフルエンザA型ウイルスサブタイプの第1および第2の分離株の両方、または前記インフルエンザA型ウイルスの第1および第2のサブタイプと反応する抗体を、抗体ライブラリーにおいて同定すること、および前記第1および第2の分離株、または前記第1および第2のサブタイプそれぞれに結合する抗体の能力に基づいて、同定した前記抗体に選択の連続的交互ラウンドを受けさせることを含む、方法。 - 少なくとも2ラウンドの選択を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記第1および第2の分離株が、前記インフルエンザA型ウイルスのH5N1サブタイプの異なる分離株である、請求項41に記載の方法。
- 第1および第2のインフルエンザA型ウイルスサブタイプ分離株の両方と反応する前記抗体が、それぞれ、前記第1分離株および前記第2分離株と反応する抗体の少なくとも2ラウンドの別々の濃縮により同定され、同定された前記抗体を組み換える、請求項41に記載の方法。
- 前記第1および前記第2のインフルエンザA型サブタイプ分離株の両方と反応し得る前記抗体が、前記第1および第2の分離株それぞれに結合する抗体の能力に基づいて、選択の前記連続交互ラウンドを受ける前に突然変異誘発を受ける、請求項41に記載の方法。
- 前記抗体ライブラリーがファージディスプレイ・ライブラリーである、請求項41に記載の方法。
- 選択がバイオパニングによってなされる、請求項46に記載の方法。
- 前記インフルエンザA型ウイルスサブタイプがH5N1サブタイプである、請求項41に記載の方法。
- 前記第1分離株が前記H5N1ウイルスの2006年のトルコ分離株である、請求項48に記載の方法。
- 前記第1分離株が前記H5N1ウイルスの2003/2004年のベトナム分離株である、請求項48に記載の方法。
- 前記第2分離株が前記H5N1ウイルスの2003/2004年のベトナム分離株である、請求項48に記載の方法。
- 前記第2分離株が前記H5N1ウイルスの1997年の香港分離株である、請求項50に記載の方法。
- 前記第1および第2の分離株が異なる種に由来する、請求項48に記載の方法。
- 前記種の少なくとも1つがヒトである、請求項53に記載の方法。
- 前記種の少なくとも1つが鳥類である、請求項53に記載の方法。
- 前記第1および第2の分離株に結合し得る前記抗体が、さらに、1つより多くのインフルエンザA型サブタイプに結合する前記抗体の能力に基づいて選択される、請求項41に記載の方法。
- 請求項41〜56のいずれか1項に記載の方法により同定された前記中和抗体により共有される配列コレクション。
- 配列コレクションであって、図11、12、13、および14A−Dに示された独特の1つ以上の重鎖および/または軽鎖の配列、または前記配列に基づくコンセンサス配列または改変体配列を含む、コレクション。
- 請求項41〜56のいずれか1項に記載の方法により同定可能な中和抗体またはその断片。
- 図11、12、13、および14A−Dに示された独特の配列から選択された重鎖および/または軽鎖の配列、または前記配列に基づくコンセンサス配列または改変体配列またはこれらの断片を含む、請求項59に記載の中和抗体。
- インフルエンザA型ウイルス感染に対して鳥類または哺乳類の対象に受動免疫を与えることができる、請求項59または請求項60に記載の中和抗体または抗体断片。
- 前記哺乳類の対象がヒトである、請求項61に記載の中和抗体または抗体断片。
- 前記インフルエンザA型ウイルス感染が、H5N1、H1N1、H2N2、およびH3N2サブタイプからなる群から選択されるウイルスにより引き起こされる、請求項62に記載の中和抗体または抗体断片。
- 対象においてA型インフルエンザ感染を予防および/または処置する方法であって、前記対象に請求項40に記載の組成物を有効量投与することを含む、方法。
- 対象のA型インフルエンザ感染を処置する方法であって、前記対象に請求項59に記載の中和抗体を有効量投与することを含む、方法。
- 前記対象がヒトの患者である、請求項64または請求項65に記載の方法。
- A型インフルエンザ感染を予防する方法であって、A型インフルエンザ感染を発症するリスクのある対象に請求項40に記載の組成物を有効量投与することを含む、方法。
- A型インフルエンザ感染を予防する方法であって、A型インフルエンザ感染を発症するリスクのある対象に請求項59に記載の中和抗体を有効量投与することを含む、方法。
- 前記対象がヒトの患者である、請求項67または請求項68に記載の方法。
- 多様な多機能性抗体コレクションを作る方法であって、
(a)少なくとも2つの機能が異なる抗体のCDR配列を整列させ、(b)前記整列させられたCDR配列の間に保存されたアミノ酸残基を同定し、(c)前記整列させられたCDR配列の複数の改変体を産生するために、突然変異誘発された非保存位置における機能が異なる抗体に存在する少なくとも前記アミノ酸残基をコードする縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記整列させられたCDR配列の少なくとも1つの配列において複数の非保存アミノ酸残基の突然変異誘発を行い、そして、望ましいならば、前記抗体コレクションが望ましい程度の多様性またはサイズに達するまで前記改変体の1つ以上を用いてステップ(b)および(c)を反復することを含む、方法。 - 前記整列させられたCDR配列が同じ長さを有する、請求項70に記載の方法。
- ステップ(c)において産生された前記突然変異誘発された改変体が、前記整列させられたCDR配列の少なくとも2つに存在する保存されたすべての残基を保持する、請求項70に記載の方法。
- ステップ(c)において産生された前記突然変異誘発された改変体が、前記整列させられたCDR配列のすべてに存在する保存されたすべての残基を保持する、請求項70に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体が標的抗原上で異なるエピトープに結合する、請求項70に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体が異なる標的抗原に結合する、請求項70に記載の方法。
- 前記異なる標的抗原が前記同じ抗原の改変体である、請求項75に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体が異なる結合親和性を有する、請求項70に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体が異なる生物学的特性を有する、請求項70に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体がインフルエンザA型ウイルスに結合する、請求項70に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体の少なくとも2つが同じインフルエンザA型ウイルスについて異なるエピトープに結合する、請求項79に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体が異なるインフルエンザA型ウイルスサブタイプに結合する、請求項79に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体の少なくとも2つが同じインフルエンザA型ウイルスサブタイプの異なる分離株に結合する、請求項79に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体の少なくとも2つが同じインフルエンザA型ウイルスサブタイプの異なる分離株および異なるインフルエンザA型ウイルスサブタイプに結合する、請求項79に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体の少なくとも2つが異なる親和性を有する、請求項70〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記機能的に異なる抗体の少なくとも2つは、これらが結合するインフルエンザA型ウイルスを中和する能力に違いがある、請求項70〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの特性が互いに異なる複数の中和抗体を含む、抗体コレクション。
- 少なくとも約100の中和抗体を含む、請求項86に記載の抗体コレクション。
- 請求項70〜83のいずれか1項に記載の方法により調製された請求項87に記載の抗体コレクション。
- コレクション中の核酸を独自に同定する方法であって、前記コレクション中に存在する核酸配列に連結または前記配列に組み込まれる独特のバーコードで前記核酸を標識することを含む、方法。
- 前記バーコードが、1〜約24個のヌクレオチド長の非コードヌクレオチド配列である、請求項89に記載の方法。
- 前記非コードヌクレオチド配列が、標識された前記核酸配列の3’非コード領域に連結される、請求項90に記載の方法。
- 前記バーコードが、標識された前記核酸配列内に組み込まれる1つ以上のサイレント突然変異のコード配列である、請求項89に記載の方法。
- 前記バーコードが、ペプチドまたはポリペプチドの配列である、請求項89に記載の方法。
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A521 | Request for written amendment filed |
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