JPH078266A

JPH078266A - 海洋性微細藻類の継代方法

Info

Publication number: JPH078266A
Application number: JP5157359A
Authority: JP
Inventors: Daizo Takeuchi; 内大造武; Tokio Iizuka; 塚時男飯; Kenichi Uehara; 原健一上
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1993-06-28
Filing date: 1993-06-28
Publication date: 1995-01-13

Abstract

(57)【要約】【目的】ドコサヘキサエン酸を生産する海洋性微細藻類
の種母培養において、藻体株の安定した種母を供給する
ことを可能とし、ドコサヘキサエン酸が安定した生産量
で得られる継代方法の提供。【構成】海洋性微細藻類を、該海洋性微細藻類が通常の
増殖を示す培地の１／２〜１／５の塩濃度で静置培養す
ることを特徴とする海洋性微細藻類の継代方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、海洋性微細藻類を低塩
濃度培地で安定して継代する方法に関する。さらに、本
発明は、コレステロール低下作用、抗血液凝固作用、制
ガン作用、さらには脳代謝系に関連して記憶学習能力の
向上、老人性痴呆症の予防、アルツハイマー疾病の治療
薬、稚魚の成長必須脂肪酸など、その生理作用が注目さ
れている高度不飽和脂肪酸の一つであるドコサヘキサエ
ン酸を生成する海洋性微細藻類を液体静置培養により安
定に継代することからなる海洋性微細藻クリプテコディ
ニウム・コーニーの継代方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ドコサヘキサエン酸は魚油成分の
一つとして、多くの生理活性機能を持つことが知られて
いたが、魚油から分離抽出することが困難であったた
め、実用化が遅れていた。近年、ドコサヘキサエン酸を
高濃度に含有する原料（マグロ眼窩脂肪）の発見と、さ
らに新たな高度精製技術の開発により、ドコサヘキサエ
ン酸の生理活性機能の解明が多くの研究機関で活発に進
められている。ドコサヘキサエン酸の精製方法および用
途としては、血栓症予防および治療剤（特開昭５７−１
８３７１６号）、高度不飽和脂肪酸を含有する抗ガン性
組成物（特開昭６３−２５８８１６号）、ドコサヘキサ
エノイルモノグリセリドを有効成分とする制ガン剤（特
開平１−２０３３２２号）、ＤＨＡおよびそのエステル
を有効成分とする脳機能向上剤（特開平１−１５３６２
９号）、脳機能改善組成物、学習能力増強剤、記憶力増
強剤、痴呆予防剤、痴呆治療剤または脳機能改善効果を
有する機能性食品（特開平２−４９７２３号）など多く
の報告がなされている。

【０００３】一方、ドコサヘキサエン酸の生産方法とし
ては、マグロ、イワシ、カツオなどからの魚油から抽
出、精製されている以外の方法としては、モルティエレ
ラ属菌の変換による高度不飽和脂肪酸の製法（特開昭６
３−１８５３８９号）、アラキドン酸を生産できる微生
物による高度不飽和脂肪酸強化油脂の製法（特開平１−
３０４８９２号）、海洋微生物からの高度不飽和脂肪酸
含有脂質の製法（特開平２−１４２４８６号）、Echino
sporangium属菌による高度不飽和脂肪酸の製法（特開平
２−２３８７８号）、Echinosporangium Transversalie
ATCC 16960 , 18036 の培養物より高度不飽和脂肪酸を
取得する製法（欧開−３５５９７２号）などの特許出願
や、細菌(DeLong, E. F. & Yaynos, A. A. Appl. Envir
on. Microbiol., 51(4), 730(1986)) 、真菌Thraustoch
ytrium (Haskins, R. H. et al; Can.J. Microbiol. 1
0, 187(1964))、Entomophthora(Tyrrell; Can. J. Micr
obiol., 13, 755(1967)) 、Japonochytrium sp.ATCC 28
207（特開平１−１９９５８８号）、藻類では渦鞭毛
藻、ハブト藻など(Joseph. J. D.; Lipids, 10, 395(19
75))、(Nichols, P. D. et al; Phytochemistry, 23,10
43(1984)) による生産が知られているが、これらは自然
増殖法であったり、単なる静置培養であって積極的に藻
体を増大させる工夫をされているものは少ない。僅か
に、CrypthecodiniumcohniiのＤＨＡ生成に及ぼす環境
条件(D. H. BEACH et al; Biochimica et Biophysica A
cta, 316, 56-65(1975))、および成書：David J. Kyle
et al; Industrial Application of Single Cell Oils,
(American Oil Chemist's Society, 1992) chapter 16,
287-300などが知られているが、種母の安定的な継代の
重要性については全く報告されていない。また、魚以外
から工業的に安定して一定品質のドコサヘキサエン酸を
生産、供給することが可能な海洋性微細藻類（特願平４
−７７１８９号）が知られている。従来法における、こ
れらの海洋性微細藻類の種母の継代培養は、例えば、炭
素源の濃度が２．０〜５．０重量％、無機塩類の濃度、
３．５〜４重量％の高炭素源、高塩類濃度で行われてい
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところが、このような
高塩濃度培地で継代培養した藻を種母として、本培養を
行うと、全体の藻体濃度の低下はないにもかかわらず、
個々の藻体中の株ごとのドコサヘキサエン酸量の変化が
激しく、藻体中のドコサヘキサエン酸量が、ほとんど変
化しない株から、大幅に低下する株などが発生し、結果
として得られるドコサヘキサエン酸生産量が安定した収
量を得ることが困難であった。これを解決するため、本
発明の目的は、継代培養において、形質の安定した種母
を調製し、次の段階の本培養において安定した藻体増殖
とドコサヘキサエン酸収量が得られるような継代培養方
法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決するために鋭意努力した結果、海洋性微細
藻類の藻体を、低塩濃度培地を用いて継代培養すること
によって、形質の安定した種母、安定した品質の藻株を
調製することが可能となり、次の段階の培養において安
定した藻体増殖とドコサヘキサエン酸生産が得られるこ
とを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類を、
該海洋性微細藻類が通常の増殖を示す培地の１／２〜１
／５の無機塩濃度を有する培地で静置培養することを特
徴とする海洋性微細藻類の継代方法を提供する。さら
に、前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニウム・コ
ーニー(Crypthecodinium cohnii)である上記の海洋性微
細藻類の継代方法を提供する。

【０００７】ここで、通常の増殖を示す塩濃度とは、海
水と同程度の３．５〜４重量％程度の濃度をいう。

【０００８】本発明の効果は、藻体の増殖能の低下を生
じる従来の高濃度塩培地で見られた方法とは全く異なる
技術的な成功、すなわち、低塩濃度培地を用いた静置培
養による継代培養法によって到達することが可能となり
得たものである。

【０００９】本発明において利用する微生物は、海洋性
微細藻類に属し、ドコサヘキサエン酸を生成する藻類で
あればよく、たとえば、クリプテコディニウム・コーニ
ー（Crypthecodinium cohnii ）に属する藻類などがあ
る。これらは公知のものにもあり、たとえばＡＴＣＣ(A
merican Type culture Collection)などの保存機関より
入手可能である。具体的には、 Crypthecodinium cohni
i ATCC 30021, 30543,30556, 30571, 30572, 30775, 50
051, 50053, 50055, 50056, 50058, 50060 等が挙げら
れる。中でも、Crypthecodinium cohnii ATCC 30021 で
あると、ＤＨＡ含有量が高いので好ましい。

【００１０】本発明において藻類の継代培養のための培
地としては、低塩濃度の培地を使用する。このような培
地は、培地成分として、適当な炭素源、窒素源および無
機塩などを含有し得る。ここで、低塩濃度とは、無機塩
類の濃度が、天然海水や人工海水中の無機塩類に対し
て、１／２〜１／５である。

【００１１】無機塩類としては、自然海水がよいが、人
工的に調整した既に公知の各種人工海水が広く使用でき
る他、各種のナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、ホウ酸塩、炭酸塩などが使用できる。
このような無機塩類の具体例としては、ＭｇＳＯ₄・６
Ｈ₂Ｏ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、ＳｒＣｌ₃・６Ｈ
₂Ｏ、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ₃、ＫＢｒ、Ｈ₃ＢＯ₃、Ｎ
ａＦ、ＮａＣｌ、Ｎａ₂ＳＯ₄などが挙げられる。従
来、海洋性微細藻類の継代培養は、海洋性微細藻類の藻
体の増殖を向上させるために、天然海水や人工海水に含
まれる塩類濃度の培地が使用されてきた。例えば、表７
に示される八洲製品株式会社製のアクアマリン（培地
（Ｉ））が使用されている。しかし、本発明の継代培養
の方法では、上述の海水中の通常の塩濃度の濃度に対し
て、１／２〜１／５の塩濃度の培地として、静置培養に
より継代培養することによりドコサヘキサエン酸の生成
量が安定した藻体を得ることができる。すなわち、培地
中の塩類の合計の濃度は、２２〜８ｇ／Ｌ、特に、２０
〜１０ｇ／Ｌであるのが好まし。さらに、塩類の各々の
濃度は、各々の成分が、通常の海水の塩濃度の１／２〜
１／５、特に、１／３〜１／４であるのが好ましい。１
／２の塩濃度を超えると、ドコサヘキサエン酸の生成量
が安定せず、１／５の塩濃度未満では、藻体の生育が悪
い。これらの無機塩類のそれぞれの濃度比は、特に限定
されないが、代表的には海水中の比率が挙げられる。

【００１２】さらに、微量の金属塩、例えば鉄塩、マン
ガン塩、コバルト塩、亜鉛塩等の塩素化合物、臭素化合
物も利用できる。

【００１３】炭素源としては、本発明の藻類が利用でき
る任意の炭素源を使用できる。かかる炭素源として利用
できる有機物には、グルコース、ガラクトースなどの炭
水化物、グリセリンなどの有機化合物、酢酸などの有機
酸があり、いずれの基質を用いても培養可能である。ま
た窒素源としては通常使用される硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、およびペプト
ン、酵母エキス、カゼイン加水分解物、グルタミン酸、
コーンスチープリカーなどの有機窒素源が利用できる。

【００１４】このような、低塩濃度培地の具体的な例
は、天然海水や人工海水、たとえば、八洲製品株式会社
製のアクアマリンに、それらの海水に対して、等量〜４
倍量のイオン交換水を加える、さらに、必要量の炭素
源、窒素源等を添加することによって得られる。一例と
しては、表９に示される培地（ＩＩＩ）が挙げられる。
さらにまた、培地（ＩＩＩ）に示される成分含有率にす
るように、イオン交換水に各成分を添加することによっ
ても得られる。

【００１５】培養方法としては、藻体をゆるやかに増殖
されるため静置培養法の方法により行なう。培養温度は
１５〜３２℃で行なうことができるが、２４〜２８℃が
最適である。ｐＨは、中性付近であるのが好ましい。培
養日数は、炭素源の残量、培地中への老廃物の分泌物量
によって決めることができるが、７〜１４日間程度で安
定した継代種母が得られる。本発明の継代方法では、低
塩濃度の培地を用いて前培養を行う。継代培養後の本培
養では、通常の塩濃度の培地を用いてもよいし、また、
継代方法で用いた低塩濃度の培地を用いてもよい。本発
明の継代方法を用いることにより、本培養における藻体
中のドコサヘキサエン酸の量が藻体個体間でばらつきの
少ない安定化した藻株を得ることができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。（実施例１）下記表９の組成の培地（ＩＩＩ）を培地と
して使用した。培地（ＩＩＩ）１００ｍｌにクリプテコ
ディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１の１白金耳
を接種し、表１に示すように２４℃または２５℃で１４
日間静置培養した（前培養）。得られた培養液の１０ｍ
ｌを培地（Ｉ）１００ｍｌを仕込んだ３００ｍｌ容フラ
スコに接種して７日間、温度２４℃、初発ｐＨ６．８で
静置培養を行なった（本培養）。各々乾燥藻体０．２２
ｇ、０．２２５ｇを得た（対グルコース収率：４４％、
４５％）。得た乾燥藻体より常法により脂肪酸を抽出
し、エステル化した後ガスクロマトグラフィーにより脂
肪酸分析を行ない、表１に示す結果を得た。安定したド
コサヘキサエン酸の収量が得られた。

【００１７】

【００１８】（実施例２）海水をイオン交換水で２倍希
釈し、これにグルコース、酵母エキスを各々０．５％、
０．０５％となるように加えて１２０℃、１５分間オー
トクレーブ滅菌して調製した培地を用いる以外は、実施
例１と同じ培養条件で、表２に示した海洋性微細藻類で
あるクリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣの各藻株
の前培養を行った。本培養は、培地として、表７に示さ
れる培地（Ｉ）を滅菌処理して使用し、これに実施例１
と同様に、前培養で得られた培養液１０ｍｌを本培養の
培地（Ｉ）１００ｍｌに接種して７日間、静置培養を行
った。培養結果について藻体量とドコサヘキサエン酸
（ＤＨＡ）収量を表２にまとめて示す。

【００１９】

【００２０】（実施例３）下記表７の組成の培地（Ｉ）
をイオン交換水で１／５濃度に希釈して、これにグルコ
ース０．５％、酵母エキス０．０５％となるように加え
て、１２０℃、１５分間オートクレーブ滅菌して調製し
た培地を前培養の培地に使う以外は実施例１と同じ培養
条件を設定して海洋性微細藻類であるクリプテコディニ
ウム・コーニーＡＴＣＣの各藻株の前培養を行った。本
培養には、培地として、表７に示される培地（Ｉ）を滅
菌処理して使用し、これに実施例１と同様に、前培養で
得られた培養液１０ｍｌを本培養の培地（Ｉ）１００ｍ
ｌに接種して７日間、静置培養を行った。培養結果につ
いて藻体量とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）収量を表３
にまとめて示す。

【００２１】

【００２２】（比較例１）高塩濃度培地での培養結果培地として、下記表１０の組成の培地（ＩＶ）を使用し
た。培地（ＩＶ）１００ｍｌを滅菌し、クリプテコディ
ニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１の１白金耳を接
種し、２８℃で７日間静置培養した（前培養）。得られ
た培養液の１０ｍｌを培地（ＩＶ）１００ｍｌを仕込ん
だ３００ｍｌ容フラスコに接種して７日間、温度２４
℃、初発ｐＨ６．８で静置培養を行なった。乾燥藻体
０．７４ｇを得た（対グルコース収率：３７％）。各藻
株毎の前培養、本培養の結果を表４および表５に示す。

【００２３】

【００２４】

【００２５】（比較例２）下記表７の組成の培地（Ｉ）
をイオン交換水で１／６濃度に希釈して、これにグルコ
ース０．５％、酵母エキス０．０５％となるように加え
て、１２０℃、１５分間オートクレーブ滅菌して調製し
た培地を前培養の培地として使う以外は実施例２と同じ
培養条件で海洋性微細藻類であるクリプテコディニウム
・コーニーＡＴＣＣの各藻株の前培養および本培養を行
なった。本培養の結果について藻体量とドコサヘキサエ
ン酸（ＤＨＡ）収量を表６に結果をまとめて示す。藻体
の生成量が低下した。

【００２６】

【００２７】

【００２８】

【００２９】

【００３０】

【００３１】海水千葉市中央区川崎町の海水を採取して使用した。

【００３２】

【発明の効果】以上に説明したように、本発明の方法に
より、従来不安定であったドコサヘキサエン酸を生産す
る海洋性微細藻類の種母培養を低濃度塩で継代培養する
ことによって藻株の代謝を抑制して変異を防止し、藻体
増殖の安定した種母を供給することが可能となり、ドコ
サヘキサエン酸を生産する海洋性微細藻クリプテコディ
ニウム・コーニーの藻体を安定して生産する技術的課題
を解決することができる。また、本発明の継代方法によ
り藻体生産に対するグルコース収率は向上する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】海洋性微細藻類を、該海洋性微細藻類が通
常の増殖を示す培地の１／２〜１／５の無機塩濃度を有
する培地で静置培養することを特徴とする海洋性微細藻
類の継代方法。
【請求項２】前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニ
ウム・コーニー(Crypthecodinium cohnii)である請求項
１に記載の海洋性微細藻類の継代方法。