JPH078268A

JPH078268A - 海洋性微細藻類の培養方法およびこれを用いたドコサヘキサエン酸の製造方法

Info

Publication number: JPH078268A
Application number: JP6077336A
Authority: JP
Inventors: Daizo Takeuchi; 内大造武; Tokio Iizuka; 塚時男飯; Kenichi Uehara; 原健一上
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 1995-01-13

Abstract

(57)【要約】【目的】海洋性微細藻類を連続培養して生産した藻体か
らドコサヘキサエン酸を抽出して、工業的に安定して安
価な魚臭のないドコサヘキサエン酸を得る方法の提供。【構成】海洋性微細藻類を通気攪拌条件下で連続培養
し、該海洋性微細藻類の藻体を製造することを特徴とす
る海洋性微細藻類の培養方法およびこれを用いたドコサ
ヘキサエン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コレステロール低下作
用、抗血液凝固作用、制ガン作用、さらには脳代謝系に
関連して記憶学習能力の向上、老人性痴呆症の予防、ア
ルツハイマー疾病の治療薬、稚魚の成長必須脂肪酸など
として、その生理作用が注目されている高度不飽和脂肪
酸の一つであるドコサヘキサエン酸の製造方法に関す
る。特に、海洋性微細藻類を連続培養して効率良く大量
培養生産した海洋性微細藻類の藻体からドコサヘキサエ
ン酸を安定して安価に供給することからなるドコサヘキ
サエン酸の製造方法に関する。本発明は、ドコサヘキサ
エン酸（以下、ＤＨＡと略称する場合もある）を海洋性
微細藻を連続培養により得た藻体から抽出して製造する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの生理活性機能を持つドコサヘキサ
エン酸は魚油に含まれることが知られていたが、魚油か
ら分離抽出することが困難であったため、実用的な利用
が遅れていた。近年、魚油でもマグロの眼窩脂肪などド
コサヘキサエン酸を高濃度に含有する原料が発見された
ことや、脂肪酸の高度精製技術が発達したことなどか
ら、ドコサヘキサエン酸の生理活性機能の解明や実用化
の研究が活発に進められるようになった。ドコサヘキサ
エン酸の精製方法および用途としては、血栓症予防およ
び治療剤（特開昭５７−１８３７１６号）、高度不飽和
脂肪酸、又はそのエステルの分離精製法（特開昭６１−
３７７５２号）、高度不飽和脂肪酸を含有する抗ガン性
組成物（特開昭６３−２５８８１６号）、高度不飽和脂
肪酸アルキルエステルの分離精製方法（特開昭６３−８
３５６号）、ドコサヘキサエノイルモノグリセリドを有
効成分とする制ガン剤（特開平１−２０３３２２号）、
ＤＨＡおよびそのエステルを有効成分とする脳機能向上
剤（特開平１−１５３６２９号）、脳機能改善組成物、
学習能力増強剤、記憶力増強剤、痴呆予防剤、痴呆治療
剤または脳機能改善効果を有する機能性食品（特開平２
−４９７２３号）など多くの報告がなされている。

【０００３】現在、ドコサヘキサエン酸あるいはその含
有油のほとんどは、マグロ、イワシ、カツオなどの魚油
から抽出、精製されているが、魚類の回遊性等から安定
な供給源となりにくい点や、魚油の組成上の理由から、
ＤＨＡと他の不飽和脂肪酸との分離が困難である点や、
魚油特有の異臭があるなどの欠点がある。一方魚油以外
の原料による生産方法としては、モルティエレラ属菌の
変換による高度不飽和脂肪酸の製法（特開昭６３−１８
５３８９号）、アラキドン酸を生産できる微生物による
高度不飽和脂肪酸強化油脂の製法（特開平１−３０４８
９２号）、海洋微生物からの高度不飽和脂肪酸含有脂質
の製法（特開平２−１４２４８６号）、Echinosporangi
um属菌による高度不飽和脂肪酸の製法（特開平２−２３
８７８号）、Echinosporangium Transversalie ATTCC 1
6960, 18036 の培養物より高度不飽和脂肪酸を取得する
製法（欧開−３５５９７２号）などの特許出願が知られ
ている。さらに、細菌（Delong,E.F.& Yayanos,A.A.:Ap
pl.Environ.Microbiol.,51(4),730(1986))、真菌Thraus
tochytrium(Haskins,R.H.et al;Can.J.Microbiol.10,18
7(1964))、Entomophthora(Tyrrell;Can.J.Microbiol.,1
3,755(1967))、Japonochytrium sp. ATCC 28207(特開平
１−１９９５８８号）、藻類では渦鞭毛藻、ハプト藻を
用いる方法などが知られている（Joseph.J.D.;Lipids,1
0,395(1975)あるいはNichols,P.D.et al;Phytochemistr
y,23,1043(1984)) が、これらは自然増殖方法であった
り、たんなる静置培養であって積極的に藻体を増大させ
る工夫をされているものはない。またこれらの方法で
は、ＤＨＡの生産量が少なく、工業上の利用性の点で魚
油由来品に及ばなかった。

【０００４】一般に、微生物の培養方式のうち、回分培
養（バッチ培養）や流加培養（フェドバッチ培養）で
は、二次代謝産物や老廃物の蓄積によって微生物の増殖
が抑えられてしまうため、高生産性を維持するのが困難
であるのにたいし、培養中に微生物相の増殖活性を高い
状態に維持制御できる連続培養の方が生産効率上有利で
あることが広く知られている。このことは、多くの微生
物タンパク（ＳＣＰ）の生産プロセスなど、既に多くの
報告例が見られる。しかし、海洋性微細藻類の培養で
は、藻体が攪拌による剪断力に耐性を持たないことか
ら、ほとんど全て攪拌による剪断力のかからない静置培
養で行われてきており、振盪培養さえも検討されてこな
かった。そのため、このような連続培養はできないもの
とされてきた。

【０００５】なお、振盪培養については、僅かに、Cryp
thecodinium cohniiのDHA 生成に及ぼす環境条件(D.H.B
EACH et al;Biochimica et Biophysica Acta,316,56-65
(1975)、および成書：David J.kyle et al;Industrial
Application of Single CellOils,(American Oil Chemi
st's Society,1992)chapter 16, 287-300が知られてい
るが、工業的に生産するには生産性は低い。また、最
近、Crypthecodinium cohnii MK-8840(ATCC 40750) に
よるドコサヘキサエン酸の製造とその含有物に関する発
明が出願（ＷＯ９１／１１９１８）され、海洋性微細藻
類の振盪培養方法が開示された。しかし、この方法で藻
体中のＤＨＡ含有脂質を増やそうとすると、発明が藻体
の増殖に必要な栄養成分を制限し、藻体の増殖を犠牲に
して藻体中のＤＨＡ含有成分の増大を計る方法であるた
め、栄養成分の枯渇を必須要件とするため、連続培養は
できず、工業生産上の不利益は免れない。したがって、
これら既に知られている方法を実用化するには多くの技
術的課題を克服することを必要としており、経済的採算
性から工業的な実用生産は困難であるとされてきた。

【０００６】また、これまでの方法では、連続培養では
藻体生産性は高まるが、目的とする生産物の含有率が低
下すること、比増殖速度の小さい微生物では二次代謝産
物の生産は回分培養に比べ、コスト的に不利とされるな
ど報告されている〔発酵工学の基礎：P.F.Stanbury, A.
Whitaker; 石崎文林訳p239(1988)（学会出版センタ
ー）〕。

【０００７】海洋性微細藻クリプテコディニウム・コー
ニー（Crypthecodinium cohnii）は通常、無性生殖によ
っても有性生殖によっても増殖することが知られてい
る。無性生殖では、栄養体が球形細胞になった後、細胞
質が１〜３回の細胞***を行ない、２〜８個の遊走細胞
を放出する。この細胞が細胞***することによって藻固
体を増やしていく。

【０００８】一方、有性生殖では、遊走細胞が配偶子と
なって２個の配偶子の接合により接合子となって４本の
鞭毛を持つ。やがてこの鞭毛が消失して球形の接合子に
移行して減数***を行ない個々の細胞が栄養体となり増
殖を行なっている。

【０００９】本発明者らは、この海洋性微細藻クリプテ
コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）の
無性生殖の生活史に注目し、無性生殖のみで安定に長期
間増殖を行なう株を取得し、さらにこの株が安定に増殖
する培養条件を見い出したことによって本発明を完成し
たものである。

【００１０】

【発明が解決しようとする問題点】ドコサヘキサエン酸
は、制ガン効果など多くの生理活性が期待されている
が、原料を魚油に依存するため供給が不安定で品質が一
定しない。さらに魚油特有の臭いを除去するために精製
に多くの工程と費用を要している。しかもこの工程によ
っても魚油特有の臭いが充分に除去できないために利用
しにくいなど、多くの解決すべき技術的課題を要するた
め製品が高価になっている問題点がある。

【００１１】本発明の目的は、これらの問題点を解決す
るために魚以外の工業的に安定して一定品質の生産、供
給が可能な海洋性微細藻類を用いて連続培養することに
よって、藻体中のドコサヘキサエン酸含量および藻体生
産性を従来よりも飛躍的に高めることができ、この藻体
から得られるドコサヘキサエン酸を安定して安価に製造
する方法を提供することである。

【００１２】

【問題点を解決するための手段】本発明者は、これらの
問題点を解決するために鋭意努力した結果、従来、藻体
増殖がバッチ培養法のみによって行われていた海洋性微
細藻類を連続培養によって高濃度に藻体を生産すること
に成功して、さらにこの方法によってドコサヘキサエン
酸の藻体中の含有量を飛躍的に高めることが出来ること
を見出し、藻体を回収してそのまま、あるいは、乾燥し
た後藻体からドコサヘキサエン酸を抽出・精製するドコ
サヘキサエン酸の製造法に関する本発明を完成した。

【００１３】すなわち、本発明は、海洋性微細藻類を通
気攪拌条件下で連続培養し、該海洋性微細藻類の藻体を
製造する海洋性微細藻類の培養方法およびこの藻体から
ドコサヘキサエン酸を製造する方法を提供する。ここ
で、前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニウム・コ
ーニー（Crypthecodinium cohnii）である方法を提供す
る。また、海洋性微細藻類を通気攪拌条件下で連続培養
して増殖させる方法を提供する。さらに、前記クリプテ
コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）
が、界面活性剤耐性で、振盪培養耐性、かつ、連続培養
に耐性を有する方法を提供する。さらに、前記培地に、
さらにポリオール類、ピルビン酸、トリオレインおよび
／またはアミノ酸類を添加する方法を提供する。さら
に、前記クリプテコディニウム・コーニー（Crypthecod
inium cohnii）の無性生殖期を利用する方法を提供す
る。また、通気攪拌条件下で連続培養に耐性を有し、か
つドコサヘキサエン酸の産生能を有するクリプテコディ
ニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）を提供す
る。さらに、界面活性剤耐性、振盪培養耐性、および連
続培養に耐性を有し、かつドコサヘキサエン酸の産生能
を有するクリプテコディニウム・コーニー（Crypthecod
inium cohnii）を提供する。

【００１４】

【作用】本発明は、従来、静置培養以外は困難とされて
いた海洋性微細藻類から振盪培養、連続培養でも増殖可
能な連続培養耐性藻体株の単細胞分離の繰り返しと培養
馴化により連続培養に耐え得るCrypthecodinium cohnii
藻株の発見と育種に成功したことによって本発明を成し
得たものである。本発明の効果は、液体振盪培養の継代
によって増殖能が低下した従来の方法や技術あるいはそ
の延長上にある考え方ではとうてい到達することができ
なかった発明であり、従来とは全く異なる技術的な成功
により到達することが可能となり得たものである。

【００１５】本発明において利用する微生物は、海洋性
微細藻類に属し、ドコサヘキサエン酸を生成する藻類で
あればよく、たとえばクリプテコディニウム・コーニー
などがある。これらは公知の藻類であり、たとえばＡＴ
ＣＣ（American Type Culture Collection) などの保存
機関より入手可能である。具体例としては、クリプテコ
ディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１、３０５４
３、３０５５６、３０５７１、３０５７２、３０５７
５、５００５１、５００５３、５００５５、５００５
６、５００５８、５００６０等が挙げられる。特に、ク
リプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１株で
あるのが好ましい。

【００１６】上記の藻類の藻株について、単細胞分離の
繰り返しと培養馴化により連続培養に耐性を持つ藻株と
して育成することにより得た藻体を使用する。このよう
な藻体の育成方法としては、培養藻体を１．０〜３．５
％生理食塩水で細胞数が１０²〜１０³個／ｍｌとなる
ように希釈して、グルコースを２〜４重量％、酵母エキ
スを０．２〜０．５重量％含有する寒天培地上に塗末
し、３〜４日間インキュベートしてコロニーを形成させ
る。次に、表４の組成の液体培地（ＩＩ）に培地中の濃
度が０．０１〜１．０ｇ／Ｌとなるように界面活性剤を
加えた培地１００ｍｌを、３００ｍｌ用三角フラスコに
取る。そして、生じたコロニーを釣株し、上記培地（Ｉ
Ｉ）に界面活性剤を加えた培地に接種して、２４〜３２
℃、１５０〜２５０ｒｐｍの条件下で、２〜８日間振盪
培養する。得られた培養液から遠心分離にかけて藻体を
回収し、その藻体からドコサヘキサエン酸を有機溶媒を
用いて抽出し、各藻株のドコサヘキサエン酸生産能を測
定する。

【００１７】さらに、これらの振盪培養して得られた藻
体を再び２％生理食塩水で懸濁して、以下、上記静置培
養および上記振盪培養と同様の操作を１０〜１５回繰り
返し、増殖の速い藻株で、界面活性剤耐性、振盪培養耐
性、かつ、ドコサヘキサエン酸生産能の高い藻株を、そ
の段階ごとに選抜する。ここで、選択した藻体をさらに
５Ｌ程度の小型ジャーファーメンターによる連続培養操
作を、上記培地（ＩＩ）に界面活性剤を添加した培地を
用い、２８〜３２℃、ｐＨ７．０、攪拌２００〜３５０
ｒｐｍ、通気量０．２〜１．５ｖｖｍ、の条件下で５〜
１０回繰り返して、増殖が速く、界面活性剤耐性で振盪
培養耐性、ドコサヘキサエン酸生産能が高く、かつ、連
続培養に耐性を有する藻株を育種する。

【００１８】単細胞分離に用いる培地としては、２％生
理食塩水にグルコース（２〜４重量％）、酵母エキス
（０．２〜０．５重量％）を添加した培地に寒天２重量
％程度を加えた寒天培地を使用し、培養馴化に用いる培
地としては、下記記載の連続培養に使用する培地が挙げ
られる。また、培養馴化のための振盪培養および連続培
養には、界面活性剤または消泡剤を培地中の濃度で、
０．０１〜１．０ｇ／Ｌとなるように添加する。

【００１９】次に、上述のようにして得た連続培養に耐
性を持つ藻株を用いて、連続培養を行う。以下に、連続
培養における培養条件について説明する。

【００２０】本発明において利用する藻類の培養のため
の培地としては、この藻類が良好に生育出来る培地であ
ればいかなる組成の培地も使用できる。培地成分とし
て、適切な炭素源、窒素源および無機塩などを含有し得
る。炭素源としては、本発明の藻類が利用出来る任意の
炭素源を使用出来る。かかる炭素源として使用出来る有
機物には、グリセリンなどの有機化合物、グルコース、
フラクトース、ガラクトースなどの炭水化物、クエン
酸、酢酸などの有機酸があり、いずれの基質を用いても
培養可能である。さらに、ポリオール類、ピルビン酸、
トリオレインおよび／またはアミノ酸類を加えるとＤＨ
Ａの生産性を高めることができる。また、アルギニン、
グルタミン酸など尿素サイクルに近いアミノ酸はＤＨＡ
生産にとって必須に近い窒素源として有効である。ポリ
オール類、ピルビン酸、トリオレインおよび／またはア
ミノ酸類の好ましい添加量は０．２５〜１０ｍＭであ
る。培地中の炭素源の濃度は、連続培養時に、０．１〜
６．０重量％、特に０．２〜３．０重量％であるのが、
藻体を回収分離した後の培養液処理操作を行う時に、培
養液に残存するグルコース量を減少させ、コストを下げ
る点、および、ドコサヘキサエン酸の収量を維持する点
で好ましい。

【００２１】また、窒素源としては、通常使用される硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合
物、およびペプトン、酵母エキス、カゼイン加水分解
物、グルタミン酸、コーンスチープリカーなどの有機窒
素源が利用出来る。培地中の窒素源の濃度は、連続培養
時に、培地中の炭素源に対して、１／１０〜１／５であ
るのが好ましい。

【００２２】無機塩類としては、自然海水がよいが、人
工的に調整した既に公知の各種人工海水が広く使用出来
る他、各種のナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、ホウ酸塩、炭酸塩などが使用出来る。
さらに、微量の重金属塩、例えば、鉄塩、マンガン塩、
コバルト塩、亜鉛塩、塩素化合物、臭素化合物が利用出
来る。これらの重金属塩も、本発明の方法においては無
機塩類に包含される。

【００２３】培養方法としては、クリプテコディニウム
・コーニー（Crypthecodinium cohnii）の無性生殖によ
る増殖を利用する連続培養法方法を用いる。これによっ
て、藻体中のドコサヘキサエン酸含量が飛躍的に高ま
る。無性生殖とする条件は、淡水渦べん毛藻で、栄養枯
渇条件下で有性生殖の形態となることが報告されてお
り：Phycologia, 14(1), 1〜8(1975) 栄養枯渇とならな
いよう培養条件を保持する。ドコサヘキサエン酸の生産
性を高めるためには本発明で使用するクリプテコディニ
ウム・コーニーにおいてドコサヘキサエン酸が藻体内に
含有・蓄積されることから、藻体の生産性を高めること
によってドコサヘキサエン酸の生産性を高めることが可
能である。さらに、本発明で使用する海洋性微細藻類ク
リプテコディニウム・コーニーでは連続培養によっても
代謝産物であるドコサヘキサエン酸の含有率は実施例に
示すごとく、低下しない。

【００２４】藻体濃度を連続培養開始の一定濃度、例え
ば１５g/L まで高めるための培養および連続培養時の培
養温度は１５〜３２℃で行うことが出来るが、２８〜３
２℃が最適である。ｐＨは中性付近、培養日数は炭素源
の残量、培地中への分泌物量によって決めることが出来
る。培地中の糖濃度は、藻株の比増殖速度が良好なグル
コース濃度６．０重量％以下、特に、０．２〜３．０重
量％にコントロールして連続培養を行う。窒素源とし
て、酵母エキスをグルコース濃度の１／５〜１／１０倍
の濃度で使用して、ミネラル類は、表３の組成の培地を
使用して行う。

【００２５】また、連続培養、ジャーファーメンター通
気攪拌連続培養も脂肪酸エステル系、シリコン系などの
界面活性剤および消泡剤を添加して行う。培地中に界面
活性剤または消泡剤として、グリセリンモノ脂肪酸エス
テル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、シリコン系消泡
剤、例えば、グリセリンモノオレート、グリセリンモノ
ステアレート、グリセリンモノパルミテート、グリセリ
ンモノリノレート、ソルビタンモノオレート、シリコン
ＫＭ−７５などが挙げられる。培地中の界面活性剤また
は消泡剤の含有量は、０．０１〜１．０ｇ／Ｌであるの
が、藻体のＤＨＡ生産能を保持し、かつ、発泡を防ぐ上
で好ましい。

【００２６】本発明の連続培養を行う方法とは、ジャー
・ファーメンターや大型タンクを用い、藻体濃度が一定
濃度に達すると、新規培地を連続的に供給し、この供給
量に対応する量の培養液を回収する方法である。回収さ
れた培養液から増殖した藻体を遠心分離、ろ過等によっ
て回収する。新規培地の希釈率は、液空間速度０．２５
ｈｒ^-1以下で連続培養可能であるが、０．１〜０．２ｈ
ｒ^-1が最も高い生産性が得られる。０．２５ｈｒ^-1超で
は、クリプテコディニウム・コーニーの無性生殖による
比増殖速度以上であり、培養液がウォッシュドアウトさ
れて安定した連続培養はできない。希釈は、連続培養中
一定としてもよいが、例えば、１０時間ごとに、徐々に
希釈率をあげていく方式が好ましい。連続培養の温度
は、２６〜３０℃が好ましく、通気は、０．２〜１．０
ＶＶＭが好ましく、攪拌は、攪拌翼を使用する場合、翼
の先端周速で５０〜２５０ｃｍ／ｓｅｃであるのが好ま
しい。上述の培養条件が、一定に保持されるように、培
地を添加しながら、連続培養させる。また、連続的に注
入する培地としては、表５に示すグルコース、酵母エキ
スを添加した培地（ＩＩＩ）が使用出来る。

【００２７】取り出した培養液からの藻体の回収は、一
般的な遠心分離、ろ過等の方法、例えば、１０℃、８，
０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって行う。回収し
た藻体は生藻のまま、あるいは凍結乾燥および加熱、通
風乾燥により乾燥藻体として、これからドコサヘキサエ
ン酸を抽出することが出来る。

【００２８】藻体からのドコサヘキサエン酸の抽出、精
製は、α−トコフェロールなどの脂肪酸の酸化防止剤を
添加した上で、あるいは窒素などの不活性ガス中で行う
のが好ましい。また、実施例に示すようなメタノール／
クロロホルムなどの有機溶媒を使用する抽出方法によっ
て脂質を抽出する方法や、Folch,Lees, Stanley らの精
製方法によって行うことが出来る。得られた粗精製物を
各種のカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの
方法によって精製することも出来る。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。

【００３０】（実施例１）クリプテコディニウム・コー
ニー（Crypthecodinium cohnii）ＡＴＣＣ３００２１を
２％生理食塩水で細胞数が１０²〜１０³個／ｍｌとな
るように希釈して、グルコースを２重量％、酵母エキス
を０．２重量％含有する寒天培地上に塗末し、２８℃で
４日間インキュベートしてコロニーを形成させた。次
に、表４の組成の液体培地（ＩＩ）に培地中の濃度が
０．５ｇ／Ｌとなるように界面活性剤を加えた培地（Ｉ
Ｖ）１００ｍｌを、３００ｍｌ用三角フラスコに取っ
た。そして、生じたコロニーを釣株し、上記培地（Ｉ
Ｖ）に接種して、２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で、５
日間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離にかけ
て藻体を回収し、その藻体からドコサヘキサエン酸を有
機溶媒を用いて抽出し、各藻株のドコサヘキサエン酸生
産能を測定し、ドコサヘキサエン酸の生産能が優れてい
る藻株を選抜した。

【００３１】さらに、これらの選抜した藻体を再び２％
生理食塩水で懸濁して、以下、上記静置培養および上記
振盪培養と同様の操作を１２回繰り返し、増殖の速い藻
株で、界面活性剤耐性、振盪培養耐性、かつ、ドコサヘ
キサエン酸生産能の高い藻株を、その段階ごとに選抜し
た。ここで、選択した藻体をさらに５Ｌの小型ジャーフ
ァーメンターによる連続培養操作を、下記培地（ＩＶ）
を用い、２８℃、ｐＨ７．０、攪拌３００ｒｐｍ、通気
量０．３ｖｖｍ、の条件下で７回繰り返して増殖が速
く、界面活性剤耐性で振盪培養耐性、ドコサヘキサエン
酸生産能が高く、かつ、連続培養に耐性を有する藻株を
育種した。以下の培養には、連続培養耐性株を使用し、
無性生殖を繰り返す条件下で行った。

【００３２】培地は表３の組成のものにグルコース２％
（ｖ／ｖ）、酵母エキス０．２％（ｖ／ｖ）となるよう
にグルコースおよび酵母エキスを加えて、１２０℃で１
５分間オートクレープ滅菌した後、冷却したものを培地
（ＩＩ）（表４）として使用した。

【００３３】培地（ＩＩ）１００ｍｌにクリプテコディ
ニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）ＡＴＣＣ
30021 の１白金耳を接種し、初発ｐＨ５．５〜７．５
で培養を開始した。培養温度は、２８℃で７日間静置培
養した（以下、これによって得られた藻体を静置培養藻
体とする）。得られた培養液の１０ｍｌを、各々培地
（ＩＩ）１００ｍｌを仕込んだ３００ｍｌ容フラスコ５
本に接種して５日間、温度２８℃、ｐＨ６．８、回転数
１８０r.p.m でロータリーシェーカーで振盪培養を行な
った（以下、これによって得られた藻体を振盪培養藻体
とする）。５本のフラスコで得られた培養液を合わせて
母菌として、連続培養は１０Ｌ容ジャーファーメンター
で行った（以下、これによって得られた藻体を連続培養
藻体とする）。

【００３４】ジャーファーメンター培養は、ロータリー
シェーカー振盪培養で得られた培養液５００ｍｌを、７
Ｌの培地（ＩＩ）を仕込んだ１０Ｌ容ジャー・ファーメ
ンターに接種し、培養を行った。ジャーファーメンター
培養の培養条件は、温度２８℃、ｐＨ７．０、攪拌３０
０r.p.m 、通気量０．３V.V.M.であった。また、界面活
性剤（消泡剤）として脂肪酸エステル系界面活性剤であ
るグリセリンモノオレート０．７５ｇを使用した。

【００３５】培養開始後、藻体濃度を測定し、藻体濃度
が、１０５℃、５時間乾燥で、５g/L に達した段階から
表５に記載の培地（ＩＩＩ）を希釈率０．１hr^-1で連続
フィードし、その他の培養条件は上記ジャーファーメン
ター培養の条件と同じにして連続培養を行なった。さら
に連続培養開始から、段階的に希釈率を０．１２hr^-1，
０．１４hr^-1，０．１６hr^-1と０．０２づつ上げ、さら
に、グルコース濃度を０．５〜３．０重量％に保つよう
に希釈率を調節しながら連続培養を、連続フィード開始
後３日間行った。この連続培養開始後は、培養液中に複
数の鞭毛を持つ藻体は観察されなかった。取り出した培
養液は、藻体を１０℃、８，０００×ｇ、１５分の遠心
分離によって回収し、凍結乾燥した。また、菌体収量
は、１０５℃、５時間乾燥して求め、乾燥藻体重１５．
０g/L、藻体の生産性は１．８g/hr/Lであった。

【００３６】得られた凍結乾燥藻体からのドコサヘキサ
エン酸の抽出、精製は藻体量の５倍のメタノール／クロ
ロホルム（１／２）を加えたワーニング・ブレンダーを
使用する常法の抽出法Bligh-Dyer法（新生化学実験講座
４脂質II ｐ９〜（1991）（株）東京化学同人）に
準じて行ない、粗精製物を得た。この粗精製物をメチル
エステル化する（同上、ｐ５４）ことによってガスクロ
マトグラフによるオーセンチックなドコサヘキサエン酸
を標準物質とした分析により定量した。また、常法通り
液体クロマト（ＯＤＳカラム、移動相メタノール：水＝
９５：５、流量１．０ml/min、検出ＲＩ）法によってＤ
ＨＡを分取し、純度９９．２％のドコサヘキサエン酸を
生産生０．１２ｇ／Ｌ／ｈｒで得た。

【００３７】藻体中の脂肪酸組成のガスクロマトグラフ
での分析値は以下のようであった。脂肪酸静置培養藻体振盪培養藻体連続培養藻体 C 12:0 33.4 % 5.7 % 3.0 % C 14:0 40.2 % 27.5 % 16.2 % C 16:0 10.9 % 22.7 % 23.7 % C 18:0 0.9 % 1.6 % 1.8 % C 18:1 3.3 % 8.0 % 9.1 % C 22:6 11.3 % 34.5 % 45.2 % （ドコサヘキサエン酸） ───── ────── ────── ────── 100.0 % 100.0 % 100.0 %

【００３８】（実施例２）下記に記載の海洋性微細藻類
であるCrypthecodinium cohnii(C.cohnii)ＡＴＣＣの各
藻株について実施例１と同様の条件で培養を行った。培
養結果について、時間当たりの藻体収量とドコサヘキサ
エン酸（ＤＨＡ）収量を表１に示す。（ＡＴＣＣ30021
のみ連続培養３日間、他は１日間の連続培養結果を示
す）。

【００３９】

【００４０】（比較例１）（流加培養）クリプテコディニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１を
使用藻体株として用い、実施例１と同じ条件で静置培養
および振盪培養を行い、得られた培養液５００ｍｌを母
菌として、７Ｌの培地（ＩＩ）を仕込んだ１０Ｌ容ジャ
ー・ファーメンターに接種し、培養を行った。ジャー・
ファーメンター培養では、藻体濃度が５g/L （乾燥藻
体）に達するまでは、２８℃、ｐＨ６．８、攪拌３００
ｒｐｍ、通気量０．３ＶＶＭで通気・攪拌バッチ培養を
行い、培養の経過に伴って培養の開始から、６０時間
後、８０時間後、１００時間後に、炭素源としてグルコ
ース、窒素源として酵母エキスおよびミネラル類を無菌
的に追加して累計１０重量％の炭素源とこれと同じ比率
（１０重量％）の窒素源、表３の濃度のミネラル類を追
加する流加培養を行った。また、温度は２８℃で一定に
行ったが、攪拌は、培地の追加に応じて３００r.p.mか
ら段階的に、６０時間後に３１５ｒｐｍ、８０時間後に
３３０ｒｐｍ、１００時間後に３５０r.p.m に高め、通
気量も０．３V.V.M.から段階的に、６０時間後に０．３
５v.v.m.、８０時間後に０．４v.v.m.、１００時間後に
０．５v.v.m.に増加させた。消泡剤としてソルビタン脂
肪酸エステル２．２５ｇ（総量）を、随時添加した。１
２０時間後に１Ｌ当り２６．３ｇの乾燥藻体を得た。培
養後には、培養液中に複数の鞭毛を持つ藻体が観察され
た。得られた乾燥藻体から実施例１と同様の方法で抽
出、処理して、１Ｌ当り１．１５ｇのドコサヘキサエン
酸を得た。１時間、１Ｌ当りの乾燥藻体の生産性は、
０．２１g/hr/Lであり、ドコサヘキサエン酸の生産性
は、９．５８mg/hr/L であった。

【００４１】（比較例２）比較例１で得られた藻体株を
使用して、実施例１と同様の培養方法で培養し、藻体乾
燥濃度１５g/L に達した段階で希釈率０．３５／ｈｒで
連続培養を行ったが、連続培養実施１２時間後には培地
の追加速度に比べ、藻体の増殖速度が追いつかず安定な
濃度で連続培養を行うことが出来なかった。

【００４２】（比較例３）表２に記載のクリプテコディ
ニウム・コーニーＡＴＣＣの各株を用い、比較例１と同
じ条件で流加培養を行った結果を表２に示す。

【００４３】

【００４４】表３培地（Ｉ）の組成アクアマリン組成（八洲薬品株式会社）ＭｇＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏ１１．１１ｇＫＢｒ０．１０ｇＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ１．５４ｇＨ₃ＢＯ₃ ０．０３ｇＳｒＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ０．０４ｇＮａＦ０．００３ｇＫＣｌ０．６９ｇＮａＣｌ２４．５３ｇＮａＨＣＯ₃ ０．２０ｇＮａ₂ＳＯ₄ ４．０９ｇ蒸留水１．０ＬｐＨ７．０（１Ｎ−ＨＣｌで調整）表４培地（ＩＩ）の組成表３の培地（Ｉ）の組成にグルコース２％（ｖ／ｖ）、
酵母エキス０．２％（ｖ／ｖ）となるようにグルコース
および酵母エキスを添加した培地表５培地（ＩＩＩ）の組成表３の培地（Ｉ）の組成にグルコース２４％（ｖ／
ｖ）、酵母エキス２．４％となるようにグルコースおよ
び酵母エキスを添加した培地表６培地（ＩＶ）の組成表４の培地（ＩＩ）の組成に０．５ｇ／Ｌの界面活性剤
を添加した培地海水千葉市中央区川崎町先の海水を採取して使用した。

【００４５】（実施例３）実施例２と同じ培養条件で、
クリプテコディニウム・コーニー（Crypthecodinium co
hnii）ＡＴＣＣ３００２１を用いて、培地に、さらに、
アルギニン０．２６７ｍＭ／Ｌを添加して連続培養を行
ない、ＤＨＡ生産性０．１６ｇ／Ｌを得た。

【００４６】（実施例４）実施例３と同じ培養条件で、
培地にさらにグリセロール４．５６ｇ／Ｌを添加して連
続培養を行ない、ＤＨＡ生産性０．１２ｇ／Ｌを得た。

【００４７】（実施例５）実施例３と同じ培養条件で、
培地にさらにピルビン酸５．０ｇ／Ｌを添加して連続培
養を行ない、ＤＨＡ生産性０．１４ｇ／Ｌを得た。

【００４８】

【発明の効果】以上に説明したように、本発明の方法に
より、従来はマグロ、イワシ油などの天然品のため時
期、地域により生産量、品質の不安定な魚油から抽出・
生産していたドコサヘキサエン酸を高濃度に工業的に安
定して生産できる海洋性微細藻類の液体連続培養から生
産した藻体からドコサヘキサエン酸を抽出して、安定し
て安価に魚臭のないドコサヘキサエン酸を供給すること
ができる。

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】海洋性微細藻類を通気攪拌条件下で連続培
養し、該海洋性微細藻類の藻体を製造することを特徴と
する海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項２】前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニ
ウム・コーニー（Crypthecodiniumcohnii）である請求
項１に記載の海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項３】前記クリプテコディニウム・コーニー（Cr
ypthecodinium cohnii）が、界面活性剤耐性で、振盪培
養耐性、かつ、連続培養に耐性を有する請求項２に記載
の海洋性微細藻類の培養方法。
【請求項４】前記培地に、さらにポリオール類、ピルビ
ン酸、トリオレイン類および／またはアミノ酸類を添加
する請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項５】前記クリプテコディニウム・コーニー（Cr
ypthecodinium cohnii）の無性生殖期を利用する請求項
２〜４のいずれかに記載の培養方法。
【請求項６】海洋性微細藻類を通気攪拌条件下で連続培
養し、該海洋性微細藻類の藻体からドコサヘキサエン酸
を得ることを特徴とするドコサヘキサエン酸の製造方
法。
【請求項７】前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニ
ウム・コーニー（Crypthecodiniumcohnii）である請求
項６に記載のドコサヘキサエン酸の製造方法。
【請求項８】前記クリプテコディニウム・コーニー（Cr
ypthecodinium cohnii）が、界面活性剤耐性で、振盪培
養耐性、かつ、連続培養に耐性を有する請求項７に記載
のドコサヘキサエン酸の製造方法。
【請求項９】前記培地に、さらにポリオール類、ピルビ
ン酸、トリオレイン類および／またはアミノ酸類を添加
する請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】前記クリプテコディニウム・コーニー
（Crypthecodinium cohnii）の無性生殖期を利用する請
求項７〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】通気攪拌条件下で連続培養に耐性を有
し、かつドコサヘキサエン酸の産生能を有することを特
徴とするクリプテコディニウム・コーニー（Crypthecod
inium cohnii）。
【請求項１２】界面活性剤耐性、振盪培養耐性、および
連続培養に耐性を有し、かつドコサヘキサエン酸の産生
能を有することを特徴とするクリプテコディニウム・コ
ーニー（Crypthecodinium cohnii）。