JPH0779696B2 - 新規調整物及びその製法 - Google Patents
新規調整物及びその製法Info
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- JPH0779696B2 JPH0779696B2 JP62231965A JP23196587A JPH0779696B2 JP H0779696 B2 JPH0779696 B2 JP H0779696B2 JP 62231965 A JP62231965 A JP 62231965A JP 23196587 A JP23196587 A JP 23196587A JP H0779696 B2 JPH0779696 B2 JP H0779696B2
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- C12P41/009—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving hydantoins or carbamoylamino compounds
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- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素的経路によるＤ（−）α−アミノ酸の製造
において使用される固定化調製物に関し、とりわけ抗生
物質アモキシリンを製造する際の出発物質として使用さ
れるＤ（−）（ｐ−ヒドロキシフエニル）グリシンのよ
うなＤ（−）（置換フエニル）グリシンの製法において
有用な調製物に関する。
において使用される固定化調製物に関し、とりわけ抗生
物質アモキシリンを製造する際の出発物質として使用さ
れるＤ（−）（ｐ−ヒドロキシフエニル）グリシンのよ
うなＤ（−）（置換フエニル）グリシンの製法において
有用な調製物に関する。
（従来の技術） ５−（置換フエニル）ヒダントイン化合物をＤ−α−ア
ミノ酸に転化しうる多くの酵素が存在することは、例え
ば英国特許第1452591号および同第1506067号から知られ
ている。大多数の適当な酵素は細菌によつて産生され英
国特許第1534426号および同第1564982号は５−（置換フ
エニル）ヒダントイン化合物Ｄを（−）Ｎ−カルバモイ
ル−（置換フエニル）グリシンに加水分解するヒダント
イナーゼ産生生物を開示している。さらに英国特許第15
87116号は５−（置換フエニル）ヒダントインからＤ−
α−アミノ酸を製造する酵素的方法を開示している。
ミノ酸に転化しうる多くの酵素が存在することは、例え
ば英国特許第1452591号および同第1506067号から知られ
ている。大多数の適当な酵素は細菌によつて産生され英
国特許第1534426号および同第1564982号は５−（置換フ
エニル）ヒダントイン化合物Ｄを（−）Ｎ−カルバモイ
ル−（置換フエニル）グリシンに加水分解するヒダント
イナーゼ産生生物を開示している。さらに英国特許第15
87116号は５−（置換フエニル）ヒダントインからＤ−
α−アミノ酸を製造する酵素的方法を開示している。
酵素産生細胞または酵素の固定化が比較的きれいな酵素
反応液をもたらし、その後の抽出工程において有利であ
ることは、当分野でよく知られている。英国特許第1564
982号は、ヒダントイナーゼ産生生物の細胞または処理
細胞が慣用技術により固定化されることを示している。
しかしながら、実際にはこのようにして作られた固定化
系は商業的に実行しうる方法を提供するのに十分なほど
安定ではない。商業的に実行しうる系は、その調製物の
コストを回収するのに十分な回数の酵素反応のために再
利用できるものでなければならない。一般にこれは15回
位であるだろう。
反応液をもたらし、その後の抽出工程において有利であ
ることは、当分野でよく知られている。英国特許第1564
982号は、ヒダントイナーゼ産生生物の細胞または処理
細胞が慣用技術により固定化されることを示している。
しかしながら、実際にはこのようにして作られた固定化
系は商業的に実行しうる方法を提供するのに十分なほど
安定ではない。商業的に実行しうる系は、その調製物の
コストを回収するのに十分な回数の酵素反応のために再
利用できるものでなければならない。一般にこれは15回
位であるだろう。
（発明が解決しようとする問題点） 驚くべきことに、このような固定化酵素系中に２価金属
イオンが存在すると、その調製物が安定化されて再利用
可能となることが見出された。
イオンが存在すると、その調製物が安定化されて再利用
可能となることが見出された。
従つて、本発明は適当な支持体内または支持体上に固定
化された５−（任意置換フエニル）ヒダントインを加水
分解しうるヒダントイナーゼ酵素を産生する生物の細胞
または処理細胞、もしくは正に荷電したポリマー支持体
に吸着された又は官能化ポリマー支持体に共有結合され
た上記生物由来の酵素と、有効量の安定化用２価金属イ
オンと、から成る５−（任意置換フエニル）ヒダントイ
ンからＤ（−）（任意置換フエニル）グリシンまはたそ
のＮ−カルバモイル誘導体を製造するのに有用な固定化
酵素調製物を提供する。
化された５−（任意置換フエニル）ヒダントインを加水
分解しうるヒダントイナーゼ酵素を産生する生物の細胞
または処理細胞、もしくは正に荷電したポリマー支持体
に吸着された又は官能化ポリマー支持体に共有結合され
た上記生物由来の酵素と、有効量の安定化用２価金属イ
オンと、から成る５−（任意置換フエニル）ヒダントイ
ンからＤ（−）（任意置換フエニル）グリシンまはたそ
のＮ−カルバモイル誘導体を製造するのに有用な固定化
酵素調製物を提供する。
（問題点を解決するための手段） ここに記載される安定化用２価金属イオンの有効量は使
用するイオンに依存し、微量（すなわち添加された２価
金属イオンの過剰量を除去した後に酵素調製物に結合し
て残存する量）から、例えば２ミリモル（酵素調製物を
水性媒体中に懸濁する場合）のレベルまでの範囲内で変
化しうる。
用するイオンに依存し、微量（すなわち添加された２価
金属イオンの過剰量を除去した後に酵素調製物に結合し
て残存する量）から、例えば２ミリモル（酵素調製物を
水性媒体中に懸濁する場合）のレベルまでの範囲内で変
化しうる。
安定化用２価金属イオンには周期表の第II族金属（但し
亜鉛を除外する）および２価でありうるある種の遷移金
属の２価イオンが含まれる。適当な２価金属イオンは例
えばMn++，Co++，Fe++，Ni++およびMg++である。好適な
安定化用２価金属イオンは遷移金属の２価イオンであ
り、特にMn++，Co++およびNi++である。最適な２価金属
イオンはMn++である。
亜鉛を除外する）および２価でありうるある種の遷移金
属の２価イオンが含まれる。適当な２価金属イオンは例
えばMn++，Co++，Fe++，Ni++およびMg++である。好適な
安定化用２価金属イオンは遷移金属の２価イオンであ
り、特にMn++，Co++およびNi++である。最適な２価金属
イオンはMn++である。
本明細書中で用いるＤ（−）（任意置換フエニル）グリ
シンなる用語は、Ｄ（−）フエニルグリシンおよびＤ
（−）（モノ−，ジ−またはトリ−置換フエニル）グリ
シンを意味する。適当な置換基にはヒドロキシ基、C1-6
アルキル基、C1-6アルコキシ基およびハロゲン原子が含
まれる。好適なＤ（−）（置換フエニル）グリシンには
Ｄ（−）（ｐ−ヒドロキシフエニル）グリシンおよびＤ
（−）（3,4−ジヒドロキシフエニル）グリシンが含ま
れる。
シンなる用語は、Ｄ（−）フエニルグリシンおよびＤ
（−）（モノ−，ジ−またはトリ−置換フエニル）グリ
シンを意味する。適当な置換基にはヒドロキシ基、C1-6
アルキル基、C1-6アルコキシ基およびハロゲン原子が含
まれる。好適なＤ（−）（置換フエニル）グリシンには
Ｄ（−）（ｐ−ヒドロキシフエニル）グリシンおよびＤ
（−）（3,4−ジヒドロキシフエニル）グリシンが含ま
れる。
本明細書中で用いる５−（任意置換フエニル）ヒダント
インなる用語は、５−フエニルヒダントインまたはフエ
ニル基が３個以下の基（ヒドロキシ基、C1-6アルキル
基、C1-6アルコキシ基およびハロゲン原子を含む）で置
換された５−（置換フエニル）ヒダントインを意味す
る。代表例は５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダント
インおよび５−（3,4−ジヒドロキシフエニル）ヒダン
トインである。
インなる用語は、５−フエニルヒダントインまたはフエ
ニル基が３個以下の基（ヒドロキシ基、C1-6アルキル
基、C1-6アルコキシ基およびハロゲン原子を含む）で置
換された５−（置換フエニル）ヒダントインを意味す
る。代表例は５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダント
インおよび５−（3,4−ジヒドロキシフエニル）ヒダン
トインである。
本明細書中で用いる“固定化酵素調製物”なる用語は完
全細胞、破壊細胞または無細胞（細胞不含）酵素の固定
化調製物を意味する。酵素は粗製のもの、部分精製した
もの、または精製したもののいずれであつてもよい。好
ましくは固定化酵素調製物は固定化された無細胞酵素調
製物である。
全細胞、破壊細胞または無細胞（細胞不含）酵素の固定
化調製物を意味する。酵素は粗製のもの、部分精製した
もの、または精製したもののいずれであつてもよい。好
ましくは固定化酵素調製物は固定化された無細胞酵素調
製物である。
ヒダントイナーゼ酵素を産生する生物は、好ましくは英
国特許第1564982号、同第1587116号および同第1534426
号に記載されるバチルス属、シユードモナス属の菌株の
ような微生物、またはマイコプラナ種のような他の適当
な生物である。
国特許第1564982号、同第1587116号および同第1534426
号に記載されるバチルス属、シユードモナス属の菌株の
ような微生物、またはマイコプラナ種のような他の適当
な生物である。
細胞または処理細胞を固定化するのに適した支持体はポ
リアクリルアミド、ポリウレタンまたはアルギン酸カル
シウムを含めたポリマー基材、もしくは軽石、アルミナ
および金属箔のような多孔質の無機または有機材料など
の当分野で通常使用されるものである。
リアクリルアミド、ポリウレタンまたはアルギン酸カル
シウムを含めたポリマー基材、もしくは軽石、アルミナ
および金属箔のような多孔質の無機または有機材料など
の当分野で通常使用されるものである。
無細胞酵素を固定化するのに適した正に荷電したポリマ
ー支持体には、陰イオン交換樹脂およびDEAEセルロース
のようなポリマー支持体が含まれる。適当な官能化ポリ
マー支持体にはアルデヒドで官能化された置換ポリメタ
クリル酸重合体、およびポリエチレンイミン／グルタル
アルデヒド複合体で被覆された高密度アルミナのような
材料が含まれる。
ー支持体には、陰イオン交換樹脂およびDEAEセルロース
のようなポリマー支持体が含まれる。適当な官能化ポリ
マー支持体にはアルデヒドで官能化された置換ポリメタ
クリル酸重合体、およびポリエチレンイミン／グルタル
アルデヒド複合体で被覆された高密度アルミナのような
材料が含まれる。
適当な陰イオン交換樹脂には強陰イオン交換樹脂と弱陰
イオン交換樹脂が含まれるが、後者が好ましい。好適な
陰イオン交換樹脂には第二アミンで官能化されたフエノ
ール−ホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂デユオライト
（Duolite）A568またはデユオライトDS17183（ローム・
アンド・ハース社から入手可能）、アンバーライト（Am
berlite）IRA935やアンバーライトIRA945（ローム・ア
ンド・ハース社から入手可能）のような第三アミンで官
能化されたポリスチレン樹脂、およびプロリツト（Puro
lit）A100が含まれる。その他の適当な樹脂には第四ア
ンモニウムイオンで官能化されたポリスチレンのアンバ
ーライトIRA901、および第一アミンで官能化されたポリ
スチレンのレワタイト（Lewattit）OC1037（ベイヤーAG
から入手可能）が含まれる。ジエタノール型の官能基を
もつポリスチレン樹脂例えばダイアイオン（Diaion）EX
−05（三菱化学工業から入手可能）もまた使用し得る。
イオン交換樹脂が含まれるが、後者が好ましい。好適な
陰イオン交換樹脂には第二アミンで官能化されたフエノ
ール−ホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂デユオライト
（Duolite）A568またはデユオライトDS17183（ローム・
アンド・ハース社から入手可能）、アンバーライト（Am
berlite）IRA935やアンバーライトIRA945（ローム・ア
ンド・ハース社から入手可能）のような第三アミンで官
能化されたポリスチレン樹脂、およびプロリツト（Puro
lit）A100が含まれる。その他の適当な樹脂には第四ア
ンモニウムイオンで官能化されたポリスチレンのアンバ
ーライトIRA901、および第一アミンで官能化されたポリ
スチレンのレワタイト（Lewattit）OC1037（ベイヤーAG
から入手可能）が含まれる。ジエタノール型の官能基を
もつポリスチレン樹脂例えばダイアイオン（Diaion）EX
−05（三菱化学工業から入手可能）もまた使用し得る。
安定性はその調製物をその場で、例えば水溶性ジアルデ
ヒドを用いて、架橋することによりさらに高められる。
好適な架橋剤はグルタルアルデヒドである。固定化され
た無細胞酵素の場合、その架橋剤は約１％以下、好まし
くは約0.2％のレベルで有利に使用される。
ヒドを用いて、架橋することによりさらに高められる。
好適な架橋剤はグルタルアルデヒドである。固定化され
た無細胞酵素の場合、その架橋剤は約１％以下、好まし
くは約0.2％のレベルで有利に使用される。
本発明の別の面によれば、空気の不在下に適当なヒダン
トイナーゼ酵素で５−（任意置換フエニル）ヒダントイ
ンを加水分解することによるＤ（−）（任意置換フエニ
ル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体の製法
が提供され、その際上記酵素は適当な支持体内または支
持体上に固定化された該酵素を産生する生物の細胞また
は処理細胞、もしくは正に荷電したポリマー支持体上に
吸着されたあるいは官能化ポリマー支持体に共有結合さ
れた上記生物由来の酵素と、有効量の安定化用２価金属
イオンと、から成る固定化酵素調製物の形で提供される
点に特徴がある。
トイナーゼ酵素で５−（任意置換フエニル）ヒダントイ
ンを加水分解することによるＤ（−）（任意置換フエニ
ル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体の製法
が提供され、その際上記酵素は適当な支持体内または支
持体上に固定化された該酵素を産生する生物の細胞また
は処理細胞、もしくは正に荷電したポリマー支持体上に
吸着されたあるいは官能化ポリマー支持体に共有結合さ
れた上記生物由来の酵素と、有効量の安定化用２価金属
イオンと、から成る固定化酵素調製物の形で提供される
点に特徴がある。
加水分解工程の間と固定化細胞調製物を回収して再利用
する間は、空気を排除することが必要である。空気の侵
入は、恐らくヒダントインの酸化的分解産物による、酵
素の阻害へ導くことが判明した。この反応は好ましくは
窒素や他の不活性ガスの雰囲気下で行われる。窒素また
は希ガスを反応混合物中に吹き込むことも好適である。
する間は、空気を排除することが必要である。空気の侵
入は、恐らくヒダントインの酸化的分解産物による、酵
素の阻害へ導くことが判明した。この反応は好ましくは
窒素や他の不活性ガスの雰囲気下で行われる。窒素また
は希ガスを反応混合物中に吹き込むことも好適である。
好適な本発明方法では、0.2〜２ミリモル好ましくは0.5
〜1.0ミリモルのレベルの安定化用２価金属イオンが反
応混合物に添加される。これは反応中の酵素活性の低下
を最小限に抑えるのに役立つ。
〜1.0ミリモルのレベルの安定化用２価金属イオンが反
応混合物に添加される。これは反応中の酵素活性の低下
を最小限に抑えるのに役立つ。
加水分解反応は好ましくは少なくともpH8、より好まし
くはpH8.5〜pH9.5の範囲内で実施される。好適なpHは約
9.0である。これは例えばアルカリの添加または適当な
緩衝剤の使用により、反応の間中制御される。一般に反
応は30〜60℃最も好ましくは40〜50℃の温度で、６〜48
時間一般には12〜24時間行われる。
くはpH8.5〜pH9.5の範囲内で実施される。好適なpHは約
9.0である。これは例えばアルカリの添加または適当な
緩衝剤の使用により、反応の間中制御される。一般に反
応は30〜60℃最も好ましくは40〜50℃の温度で、６〜48
時間一般には12〜24時間行われる。
固定化酵素調製物は約５〜25w/v％、好ましくは10〜20w
/v％、より好ましくは約15w/v％の５−（任意置換フエ
ニル）ヒダントインの水性スラリーおよび0.2〜２ミリ
モル好ましくは約0.5ミリモルの２価金属イオンと接触
させる。加水分解反応は攪拌タンク反応器または塔反応
器中で空気の不在下に行われる。
/v％、より好ましくは約15w/v％の５−（任意置換フエ
ニル）ヒダントインの水性スラリーおよび0.2〜２ミリ
モル好ましくは約0.5ミリモルの２価金属イオンと接触
させる。加水分解反応は攪拌タンク反応器または塔反応
器中で空気の不在下に行われる。
本発明のある種の固定化酵素調製物は５−（任意置換フ
エニル）ヒダントインをＤ（−）（任意置換フエニル）
グリシンに直接加水分解することができる。このような
酵素調製物は一般に英国特許第1587116号に記載される
微生物、特にシユードモナス属に属するものから誘導さ
れる。しかしながら、本発明の固定化酵素調製物は通常
５−（任意置換フエニル）ヒダントインを中間体Ｄ
（−）Ｎ−カルバモイル（任意置換フエニル）グリシン
に加水分解し、次いでこの中間体は所望により化学的ま
たは酵素的方法により加水分解されて対応するＤ（−）
（任意置換フエニル）グリシンを生成する。
エニル）ヒダントインをＤ（−）（任意置換フエニル）
グリシンに直接加水分解することができる。このような
酵素調製物は一般に英国特許第1587116号に記載される
微生物、特にシユードモナス属に属するものから誘導さ
れる。しかしながら、本発明の固定化酵素調製物は通常
５−（任意置換フエニル）ヒダントインを中間体Ｄ
（−）Ｎ−カルバモイル（任意置換フエニル）グリシン
に加水分解し、次いでこの中間体は所望により化学的ま
たは酵素的方法により加水分解されて対応するＤ（−）
（任意置換フエニル）グリシンを生成する。
中間体Ｄ（−）Ｎカルバモイル（任意置換フエニル）グ
リシンを化学的方法で加水分解する場合、その反応はオ
ーハシ（T.Ohashi）ら、Agric. Biol.Chem.1981,45
（４）,831−838に記載される如く亜硫酸を用いて有利
に実施される。Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル（任意置換フ
エニル）グリシンＤ（−）（任意置換フエニル）グリシ
ンに加水分解する適当な酵素的方法は、例えば英国特許
第2022581号に記載されるカルバモイラーゼを使用す
る。
リシンを化学的方法で加水分解する場合、その反応はオ
ーハシ（T.Ohashi）ら、Agric. Biol.Chem.1981,45
（４）,831−838に記載される如く亜硫酸を用いて有利
に実施される。Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル（任意置換フ
エニル）グリシンＤ（−）（任意置換フエニル）グリシ
ンに加水分解する適当な酵素的方法は、例えば英国特許
第2022581号に記載されるカルバモイラーゼを使用す
る。
本発明の固定化酵素調製物は使用前に湿つた状態で、好
ましくは低温（例えば約４℃）で貯蔵され、その後再利
用される。本発明の固定化酵素調製物は15回以上首尾よ
く利用でき、ある種の好適な固定化無細胞酵素調製物は
40回またはそれ以上再利用することができた。
ましくは低温（例えば約４℃）で貯蔵され、その後再利
用される。本発明の固定化酵素調製物は15回以上首尾よ
く利用でき、ある種の好適な固定化無細胞酵素調製物は
40回またはそれ以上再利用することができた。
本発明のさらに別の面によれば、Ｄ（−）（任意置換フ
エニル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体を
製造するのに有用な固定化酵素調製物の製法が提供さ
れ、その方法は５−（任意置換フエニル）ヒダントイン
を加水分解しうるヒダントイナーゼを産生する生物の処
理細胞または未処理細胞を適当な支持体内もしくは支持
体上に有効量の安定化用２価金属イオンの存在下で固定
させるか、あるいは上記生物由来の酵素と正に荷電した
または官能化されたポリマー支持体とを有効量の安定化
用２価金属イオンの存在下で接触させることから成る。
エニル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体を
製造するのに有用な固定化酵素調製物の製法が提供さ
れ、その方法は５−（任意置換フエニル）ヒダントイン
を加水分解しうるヒダントイナーゼを産生する生物の処
理細胞または未処理細胞を適当な支持体内もしくは支持
体上に有効量の安定化用２価金属イオンの存在下で固定
させるか、あるいは上記生物由来の酵素と正に荷電した
または官能化されたポリマー支持体とを有効量の安定化
用２価金属イオンの存在下で接触させることから成る。
処理細胞または未処理細胞を有効量の安定化用２価金属
イオンの存在下で適当な支持体内または支持体上に固定
化する技法は、当分野で通常使用される技法と類似して
いる。こうして処理細胞はポリアクリルアミド、ポリウ
レタンおよびアルギン酸カルシウムを含めたポリマー基
材のような適当な支持体内に閉じ込められるか、あるい
は軽石、アルミナおよび金属箔を含めた多孔質の無機ま
たは有機材料のような適当な支持体へ化学的に結合され
る。
イオンの存在下で適当な支持体内または支持体上に固定
化する技法は、当分野で通常使用される技法と類似して
いる。こうして処理細胞はポリアクリルアミド、ポリウ
レタンおよびアルギン酸カルシウムを含めたポリマー基
材のような適当な支持体内に閉じ込められるか、あるい
は軽石、アルミナおよび金属箔を含めた多孔質の無機ま
たは有機材料のような適当な支持体へ化学的に結合され
る。
本発明のさらに別の面によれば、Ｄ（−）（任意置換フ
エニル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体の
製造において有用な固定化無細胞酵素調製物の製法が提
供され、その方法は５−（任意置換フエニル）ヒダント
インを加水分解しうるヒダントイナーゼ酵素を調製し、
その酵素の溶液と正に荷電したまたは官能化されたポリ
マー支持体とを有効量の安定化用２価金属イオンの存在
下で接触させて固定化酵素調製物をつくり、そして固定
化酵素調製物をその水性懸濁液から分離することから成
る。
エニル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体の
製造において有用な固定化無細胞酵素調製物の製法が提
供され、その方法は５−（任意置換フエニル）ヒダント
インを加水分解しうるヒダントイナーゼ酵素を調製し、
その酵素の溶液と正に荷電したまたは官能化されたポリ
マー支持体とを有効量の安定化用２価金属イオンの存在
下で接触させて固定化酵素調製物をつくり、そして固定
化酵素調製物をその水性懸濁液から分離することから成
る。
ヒダントイナーゼ酵素は好ましくは適当な発酵培地中で
の適当な微生物の発酵により産生される。適当な微生物
および培地は当分野で習熟した者によく知られており、
その例は英国特許第1564982号、同第1534426号および同
第1587116号に記載されている。
の適当な微生物の発酵により産生される。適当な微生物
および培地は当分野で習熟した者によく知られており、
その例は英国特許第1564982号、同第1534426号および同
第1587116号に記載されている。
１つの好適な微生物は英国特許第1587116号に記載の培
地または類似の培地中で生育するバチルス・ブレビス
（Bacillus brevis）IFO 12333である。上記培地は有利
にはその酵素の誘導物質（例えばヒダントインまたはDL
−５−メチルヒダントイン）およびヒダントイナーゼ生
産を刺激すると報告された２価金属イオン（例えばM
n++，Mg++，Co++およびFe++）を含有する。好適な方法
では、バチルス・ブレビスを栄養種培地中で適当な期間
（例えば44時間）生育させ、その後誘導物質および適当
な２価金属イオンを含む発酵培地中約25℃で生育させ
る。初期成長期の間はpHを７〜８に維持する。発酵は約
44時間後に完了する。
地または類似の培地中で生育するバチルス・ブレビス
（Bacillus brevis）IFO 12333である。上記培地は有利
にはその酵素の誘導物質（例えばヒダントインまたはDL
−５−メチルヒダントイン）およびヒダントイナーゼ生
産を刺激すると報告された２価金属イオン（例えばM
n++，Mg++，Co++およびFe++）を含有する。好適な方法
では、バチルス・ブレビスを栄養種培地中で適当な期間
（例えば44時間）生育させ、その後誘導物質および適当
な２価金属イオンを含む発酵培地中約25℃で生育させ
る。初期成長期の間はpHを７〜８に維持する。発酵は約
44時間後に完了する。
その後細胞を例えば遠心により収穫し、次に超音波処理
または当分野で知られた他の技術により細胞を破壊して
ヒダントイナーゼを放出させる。この酵素を部分精製す
るために、例えば硫酸マンガンを20ミリモルの濃度にな
るまで添加して、核酸を沈殿させることが好ましい。熱
に不安定なタンパク質を沈殿させるためには酵素を50〜
65℃好ましくは55〜60℃の温度で約30分間加熱し、その
後４℃に冷却する。次に酵素溶液は遠心して細胞破砕物
を除き、核酸とタンパク質を沈殿させる。酵素溶液は２
価金属イオンをそのまま保持させるために、吸着に先立
つて透析を行わないことが好ましい。この場合には固定
化酵素調積物の製造のために２価金属イオンを新たに添
加する必要がない。
または当分野で知られた他の技術により細胞を破壊して
ヒダントイナーゼを放出させる。この酵素を部分精製す
るために、例えば硫酸マンガンを20ミリモルの濃度にな
るまで添加して、核酸を沈殿させることが好ましい。熱
に不安定なタンパク質を沈殿させるためには酵素を50〜
65℃好ましくは55〜60℃の温度で約30分間加熱し、その
後４℃に冷却する。次に酵素溶液は遠心して細胞破砕物
を除き、核酸とタンパク質を沈殿させる。酵素溶液は２
価金属イオンをそのまま保持させるために、吸着に先立
つて透析を行わないことが好ましい。この場合には固定
化酵素調積物の製造のために２価金属イオンを新たに添
加する必要がない。
固定化された無細胞酵素調製物を製造するために、部分
精製した酵素溶液は適当な２価金属イオンの存在下でポ
リマー支持体と混合される。酵素の負荷量はそれぞれの
型のポリマー支持体について最適化されねばならず、一
般には支持体1gにつき３〜７単位である。この混合物は
吸着が生じるまで（例えば約24時間）約25℃で攪拌され
る。ポリマー支持体は食塩水中で洗つたのち約pH8〜９
に平衡化して、吸着のために予備処理することが望まし
い。
精製した酵素溶液は適当な２価金属イオンの存在下でポ
リマー支持体と混合される。酵素の負荷量はそれぞれの
型のポリマー支持体について最適化されねばならず、一
般には支持体1gにつき３〜７単位である。この混合物は
吸着が生じるまで（例えば約24時間）約25℃で攪拌され
る。ポリマー支持体は食塩水中で洗つたのち約pH8〜９
に平衡化して、吸着のために予備処理することが望まし
い。
固定化無細胞酵素調製物を架橋するために、その調製物
を吸着溶液から取し、pH8〜９において架橋剤の溶液
で処理することが望ましい。その後架橋された調製物は
蒸留水で洗い、さらに緩衝液（好ましくは適当な２価金
属イオンを含む）で洗つたのち、密閉容器中に低温（約
４℃）で湿つた状態のまま貯蔵される。
を吸着溶液から取し、pH8〜９において架橋剤の溶液
で処理することが望ましい。その後架橋された調製物は
蒸留水で洗い、さらに緩衝液（好ましくは適当な２価金
属イオンを含む）で洗つたのち、密閉容器中に低温（約
４℃）で湿つた状態のまま貯蔵される。
今や、いくつかの実施例を以下に説明する。
実施例１ ヒダントイナーゼ酵素は次の方法を用いて細菌発酵によ
り生産した。以下の諸成分： 酵母エキス 200g KH2PO4 10g K2HPO410g (NH4)2SO4 50g MgSO4 5g FeSO4 0.1g MnSO4 0.1g CaCl2 0.8g 消泡剤 15g を含む発酵培地9lを用意して、pH7.0に調整した。この
培地を12lの発酵槽に入れ、121℃で60分間オートクレー
ブ滅菌した。20w/v％グルコース溶液および２％DL−５
−メチルヒダントイン溶液を別々に滅菌し、それぞれ50
0mlずつを無菌条件下で発酵槽に加えた。
り生産した。以下の諸成分： 酵母エキス 200g KH2PO4 10g K2HPO410g (NH4)2SO4 50g MgSO4 5g FeSO4 0.1g MnSO4 0.1g CaCl2 0.8g 消泡剤 15g を含む発酵培地9lを用意して、pH7.0に調整した。この
培地を12lの発酵槽に入れ、121℃で60分間オートクレー
ブ滅菌した。20w/v％グルコース溶液および２％DL−５
−メチルヒダントイン溶液を別々に滅菌し、それぞれ50
0mlずつを無菌条件下で発酵槽に加えた。
発酵槽には、トリプトン・ソヤ・プロス（Tryptone Soy
a Broth）上にて25℃で44時間生育させたバチルス・ブ
レビスIFO 12333の種培養物を接種した。発酵は25℃に
保ち、6l/分で通気した。pHは24時間の間HClで7.0に制
御し、その後水酸化アンモニウムを用いてpH7.5に上
げ、28時間目にpH8.0に上げ、その後は自由に上昇させ
た。
a Broth）上にて25℃で44時間生育させたバチルス・ブ
レビスIFO 12333の種培養物を接種した。発酵は25℃に
保ち、6l/分で通気した。pHは24時間の間HClで7.0に制
御し、その後水酸化アンモニウムを用いてpH7.5に上
げ、28時間目にpH8.0に上げ、その後は自由に上昇させ
た。
発酵を46時間行つたあと、細胞を遠心により収穫した。
この細胞沈殿物は0.2Mトリス/HCl緩衝液（pH8.5）中に
再懸濁し、超音波処理して溶液中にヒダントイナーゼを
放出させた。
この細胞沈殿物は0.2Mトリス/HCl緩衝液（pH8.5）中に
再懸濁し、超音波処理して溶液中にヒダントイナーゼを
放出させた。
酵素の部分精製は次のように行つた： 20mM MnSO4の添加により核酸を沈殿させ、その酵素溶液
を58℃で30分間加熱処理し、その後４℃に冷却した。４
℃で18時間貯蔵後、この調製物を遠心して細胞破砕物を
除き、核酸とタンパク質を沈殿させた。この調製物はヒ
ダントイナーゼ活性を測定するために検定した。0.2Mト
リス/HCl緩衝液（pH8.5）中の１％DL−５−（４−ヒド
ロキシフエニル）ヒダントインの懸濁液を42℃で飽和が
生じるまで攪拌した。次いで酵素調製物のアリコートを
加え、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−（４−ヒドロキシフ
エニル）グリシンの生成をHPLCで調べた。１単位のヒダ
ントイナーゼはDL−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒ
ダントイン１ミリモルをＤ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンに１時間で転化す
る酵素の量として定義される。
を58℃で30分間加熱処理し、その後４℃に冷却した。４
℃で18時間貯蔵後、この調製物を遠心して細胞破砕物を
除き、核酸とタンパク質を沈殿させた。この調製物はヒ
ダントイナーゼ活性を測定するために検定した。0.2Mト
リス/HCl緩衝液（pH8.5）中の１％DL−５−（４−ヒド
ロキシフエニル）ヒダントインの懸濁液を42℃で飽和が
生じるまで攪拌した。次いで酵素調製物のアリコートを
加え、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−（４−ヒドロキシフ
エニル）グリシンの生成をHPLCで調べた。１単位のヒダ
ントイナーゼはDL−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒ
ダントイン１ミリモルをＤ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンに１時間で転化す
る酵素の量として定義される。
実施例２ 商業的供給源から入手した陰イオン交換樹脂のサンプル
を1M NcCl中で１時間洗浄したの、0.2Mトリス/HCl緩衝
液（pH8.5）中で一晩平衡化した。平衡化した樹脂は
過により回収して必要になるまで貯蔵した。実施例１に
記載の如く調製した部分精製酵素は固定化方法において
使用した。樹脂1g（湿潤重量）当たり酵素溶液10ml（3.
5〜7.0単位/g樹脂）を25℃で24時間混合することによ
り、酵素を樹脂に吸着させた。この酵素−樹脂複合体を
取し、pH8.5にて１％グルタルアルデヒドで処理し
た。１時間後樹脂サンプルを再度取し、蒸留水で３回
洗浄した。最後に、酵素−樹脂複合体を0.2Mトリス/HCl
緩衝液（pH8.5）で洗い、密閉容器中に４℃で湿つた状
態のまま貯蔵した。
を1M NcCl中で１時間洗浄したの、0.2Mトリス/HCl緩衝
液（pH8.5）中で一晩平衡化した。平衡化した樹脂は
過により回収して必要になるまで貯蔵した。実施例１に
記載の如く調製した部分精製酵素は固定化方法において
使用した。樹脂1g（湿潤重量）当たり酵素溶液10ml（3.
5〜7.0単位/g樹脂）を25℃で24時間混合することによ
り、酵素を樹脂に吸着させた。この酵素−樹脂複合体を
取し、pH8.5にて１％グルタルアルデヒドで処理し
た。１時間後樹脂サンプルを再度取し、蒸留水で３回
洗浄した。最後に、酵素−樹脂複合体を0.2Mトリス/HCl
緩衝液（pH8.5）で洗い、密閉容器中に４℃で湿つた状
態のまま貯蔵した。
この方法で製造したそれぞれの酵素−樹脂複合体は、実
施例１に記載のようにその比活性を測定すべく検定し
た。表１はこの方法で処理した一連の市販のイオン交換
樹脂に対して得られた比活性を示す。
施例１に記載のようにその比活性を測定すべく検定し
た。表１はこの方法で処理した一連の市販のイオン交換
樹脂に対して得られた比活性を示す。
実施例３ 実施例１で調製した部分精製酵素溶液（活性＝0.59単位
/ml）440mlをデユオライトA568樹脂40gに添加した。こ
の混合物を25℃で24時間穏やかに攪拌してヒダントイナ
ーゼを支持体に吸着させた。次いで酵素−樹脂複合体を
過により分離し、蒸留水で３回洗い、最後に0.2Mトリ
ス/HCl緩衝液（pH8.5）で洗つた。この酵素−樹脂は密
閉容器中に４℃で湿つた状態のまま貯蔵した。固定化酵
素は実施例１のようにして検定し、その比活性は3.9u/g
であつた。
/ml）440mlをデユオライトA568樹脂40gに添加した。こ
の混合物を25℃で24時間穏やかに攪拌してヒダントイナ
ーゼを支持体に吸着させた。次いで酵素−樹脂複合体を
過により分離し、蒸留水で３回洗い、最後に0.2Mトリ
ス/HCl緩衝液（pH8.5）で洗つた。この酵素−樹脂は密
閉容器中に４℃で湿つた状態のまま貯蔵した。固定化酵
素は実施例１のようにして検定し、その比活性は3.9u/g
であつた。
DL−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイン200g
およびMnSO40.23gをジヤケツト付き容器中の蒸留水1.8l
に加えた。窒素ガスをこの混合物に吹き込んだ。この懸
濁液を攪拌し、温度を40℃に制御し、水酸化アンモニウ
ムでpH8.7に調整した。この系を平衡化した後、150単位
のヒダントイナーゼ（酵素−樹脂複合体38.5g）を加え
て24時間反応させ、その間水酸化アンモニウムでpH8.7
に調整した。24時間後、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンの収率は97％であ
ることがHPLCにより測定された。この方法で製造した生
成物は慣用手段で単離することができ、高い光学純度を
もつことが判明した。
およびMnSO40.23gをジヤケツト付き容器中の蒸留水1.8l
に加えた。窒素ガスをこの混合物に吹き込んだ。この懸
濁液を攪拌し、温度を40℃に制御し、水酸化アンモニウ
ムでpH8.7に調整した。この系を平衡化した後、150単位
のヒダントイナーゼ（酵素−樹脂複合体38.5g）を加え
て24時間反応させ、その間水酸化アンモニウムでpH8.7
に調整した。24時間後、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンの収率は97％であ
ることがHPLCにより測定された。この方法で製造した生
成物は慣用手段で単離することができ、高い光学純度を
もつことが判明した。
この方法で使用した酵素−樹脂は、反応の終了時に酵素
を窒素雰囲気下に保つよう注意しながらＤ（−）Ｎ−カ
ルバモイル−（４−ヒドロキシフエニル）グリシンをデ
カントし、その代わりに予め平衡化しておいた基質懸濁
液を新たに装填することにより50回再利用した。これら
のサイクル全体を通して、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンへの転化率は95％
またはそれ以上であつた。
を窒素雰囲気下に保つよう注意しながらＤ（−）Ｎ−カ
ルバモイル−（４−ヒドロキシフエニル）グリシンをデ
カントし、その代わりに予め平衡化しておいた基質懸濁
液を新たに装填することにより50回再利用した。これら
のサイクル全体を通して、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンへの転化率は95％
またはそれ以上であつた。
実施例４ ヒダントイナーゼ酵素はまた高分子量のポリエチレンイ
ミン−グルタルアルデヒド複合体を含浸させたアルミナ
系支持体UOP IPS−100上に固定化した。UOP IPS−100は
イリノイ州デスプレイネス、UOP社の商品である。実施
例１のようにして調製した部分精製酵素溶液（活性＝0,
23単位/ml）250mlをUOP支持体7.5gに加えた。この混合
物を25℃で穏やかに18時間攪拌した。このようにして形
成された酵素−支持体複合体は過により分離し、蒸留
水次いで0.2Mトリス/HCl緩衝液（pH8.5）で洗つた。こ
の固定化酵素は実施例１に記載の標準方法により検定し
て、4.68単位/gの比活性をもつことがわかつた。この不
溶化酵素は密閉容器中に４℃で湿つた状態のまま貯蔵し
た。
ミン−グルタルアルデヒド複合体を含浸させたアルミナ
系支持体UOP IPS−100上に固定化した。UOP IPS−100は
イリノイ州デスプレイネス、UOP社の商品である。実施
例１のようにして調製した部分精製酵素溶液（活性＝0,
23単位/ml）250mlをUOP支持体7.5gに加えた。この混合
物を25℃で穏やかに18時間攪拌した。このようにして形
成された酵素−支持体複合体は過により分離し、蒸留
水次いで0.2Mトリス/HCl緩衝液（pH8.5）で洗つた。こ
の固定化酵素は実施例１に記載の標準方法により検定し
て、4.68単位/gの比活性をもつことがわかつた。この不
溶化酵素は密閉容器中に４℃で湿つた状態のまま貯蔵し
た。
実施例５ バチルス・ブレビスIFO 12333のヒダントイナーゼ含有
細胞800リツトルを実施例１に記載の培地で生育させ
た。誘導物質５−メチルヒダントインは培地中で滅菌
し、金属イオンは脱イオン水に溶解して滅菌直前に培地
に加えた。グルコースは滅菌40w/w％溶液として加え、
最終濃度を1w/v％とした。トリプトン・ソヤ・ブロス40
0mlを含む12個の振とうフラスコ中25℃で36時間生育さ
せた細胞を上記培地に接種した。1.0バールの圧力およ
び0.3v.v.m-1の空気流下に25℃で発酵させた。pHは最初
の36時間の間7.0以下に保ち、36時間から48時間の収穫
時まで7.5に上昇させた。最終的な細胞収率は6.0％であ
り、その比活性は1.8u/gであつた。
細胞800リツトルを実施例１に記載の培地で生育させ
た。誘導物質５−メチルヒダントインは培地中で滅菌
し、金属イオンは脱イオン水に溶解して滅菌直前に培地
に加えた。グルコースは滅菌40w/w％溶液として加え、
最終濃度を1w/v％とした。トリプトン・ソヤ・ブロス40
0mlを含む12個の振とうフラスコ中25℃で36時間生育さ
せた細胞を上記培地に接種した。1.0バールの圧力およ
び0.3v.v.m-1の空気流下に25℃で発酵させた。pHは最初
の36時間の間7.0以下に保ち、36時間から48時間の収穫
時まで7.5に上昇させた。最終的な細胞収率は6.0％であ
り、その比活性は1.8u/gであつた。
細胞はウエストフアリア・デスラツジング（Westphalia
desludging）遠心機を使つて収穫し、得られた細胞ス
ラリー（100l）はAPVマントン−ゴーリン（K6）装置で
ホモジナイゼーシヨン（均質化）するのに先立つてアン
モニア溶液でpH8.5に上昇させた。その後ホモジネート
を軟化水で270lに希釈し、続いてMnSO4・4H2Oを20mMに
なるまで加え、pHをアンモニア溶液で8.5〜8.6に維持し
た。引き続いて60℃で１時間熱処理した。その後凝集し
たホモジネートを30℃に冷却し、デスラツジング遠心機
を通過させて澄明化した。
desludging）遠心機を使つて収穫し、得られた細胞ス
ラリー（100l）はAPVマントン−ゴーリン（K6）装置で
ホモジナイゼーシヨン（均質化）するのに先立つてアン
モニア溶液でpH8.5に上昇させた。その後ホモジネート
を軟化水で270lに希釈し、続いてMnSO4・4H2Oを20mMに
なるまで加え、pHをアンモニア溶液で8.5〜8.6に維持し
た。引き続いて60℃で１時間熱処理した。その後凝集し
たホモジネートを30℃に冷却し、デスラツジング遠心機
を通過させて澄明化した。
1M NaClで洗浄し且つNH4OHで１時間にわたつてpH8.5に
調整した陰イオン交換樹脂デユオライトA568 8.2kgを、
澄明化した酵素溶液（活性＝189u/l）130lに加えた。酵
素の樹脂への吸着はNH4OHでpH8.5に保ちながら攪拌下で
20時間にわたつて行つた。その後樹脂を過により回収
し、pH8.5で0.2w/v％グルタルアルデヒド溶液100lに加
えた。架橋反応は攪拌しながら１時間行つた。次いで酵
素−樹脂を過により回収し、１1mMMnSO4を含む0.05M
トリス/HCl緩衝液（pH8.5）で30分間洗つた。1.7u/gの
比活性をもつ酵素−樹脂8.6kgを回収した。
調整した陰イオン交換樹脂デユオライトA568 8.2kgを、
澄明化した酵素溶液（活性＝189u/l）130lに加えた。酵
素の樹脂への吸着はNH4OHでpH8.5に保ちながら攪拌下で
20時間にわたつて行つた。その後樹脂を過により回収
し、pH8.5で0.2w/v％グルタルアルデヒド溶液100lに加
えた。架橋反応は攪拌しながら１時間行つた。次いで酵
素−樹脂を過により回収し、１1mMMnSO4を含む0.05M
トリス/HCl緩衝液（pH8.5）で30分間洗つた。1.7u/gの
比活性をもつ酵素−樹脂8.6kgを回収した。
実施例６ 実施例５に記載の方法で製造した酵素−樹脂（活性＝1.
1u/g）6.65kgを用いて、MnSO411gを含む軟化水65l中でD
L−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイン9.75k
gを加水分解した。加水分解反応はこの混合物にN2を吹
き込んで酸素を排除しながら40℃、pH9.3〜9.5で23時間
行つた。反応の終了時に、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンの収率は96.4％で
あると測定された。
1u/g）6.65kgを用いて、MnSO411gを含む軟化水65l中でD
L−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダントイン9.75k
gを加水分解した。加水分解反応はこの混合物にN2を吹
き込んで酸素を排除しながら40℃、pH9.3〜9.5で23時間
行つた。反応の終了時に、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−
（４−ヒドロキシフエニル）グリシンの収率は96.4％で
あると測定された。
実施例７ 実施例６の酵素−樹脂を使用して、10％DL−５−（４−
ヒドロキシフエニル）ヒダントインを12回加水分解して
平均収率96.4％を得、その後さらに15％基質を11回加水
分解して平均収率95.6％を得た。
ヒドロキシフエニル）ヒダントインを12回加水分解して
平均収率96.4％を得、その後さらに15％基質を11回加水
分解して平均収率95.6％を得た。
実施例８ 実施例１に記載の培地で生育させたバチルス・ブレビス
IFO12333の細胞を遠心により発酵ブロス6lから収穫し
た。その細胞を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）500ml中に再
懸濁し、次いで6w/v％プロタナール（Protanal）LP/10/
60（ノルウエー，ドラムメン，ブロタン社）500mlと混
合した。この細胞懸濁液を注射針で吸い上げて0.1M塩化
カルシウム溶液の浴中に入れ、アルギン酸カルシウム中
に固定化された細胞を沈殿させてスプール上に糸として
回収した。固定化細胞の最終重量は787.4gであつた。
IFO12333の細胞を遠心により発酵ブロス6lから収穫し
た。その細胞を0.1Mトリス緩衝液（pH9.0）500ml中に再
懸濁し、次いで6w/v％プロタナール（Protanal）LP/10/
60（ノルウエー，ドラムメン，ブロタン社）500mlと混
合した。この細胞懸濁液を注射針で吸い上げて0.1M塩化
カルシウム溶液の浴中に入れ、アルギン酸カルシウム中
に固定化された細胞を沈殿させてスプール上に糸として
回収した。固定化細胞の最終重量は787.4gであつた。
固定化細胞の一部（330g）を使用して、MnSO40.44gを含
む水１中でDL−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダ
ントイン100gを加水分解した。加水分解反応はこの混合
物にN2を吹き込んで酸素を排除しながら50℃、pH9.1で2
3時間行つた。pHは5M NaOHを添加して調整した。反応の
終了時に、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−（４−ヒドロキ
シフエニル）グリシンの収率は40％であると測定され
た。
む水１中でDL−５−（４−ヒドロキシフエニル）ヒダ
ントイン100gを加水分解した。加水分解反応はこの混合
物にN2を吹き込んで酸素を排除しながら50℃、pH9.1で2
3時間行つた。pHは5M NaOHを添加して調整した。反応の
終了時に、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−（４−ヒドロキ
シフエニル）グリシンの収率は40％であると測定され
た。
Claims (12)
- 【請求項１】５−（任意置換フエニル）ヒダントインか
らＤ（−）（任意置換フエニル）グリシンまたはそのＮ
−カルバモイル誘導体を製造するのに有用な固定化酵素
調製物であつて、適当な支持体内または支持体上に固定
化された５−（任意置換フエニル）ヒダントインを加水
分解しうるヒダントイナーゼ酵素を産生する生物の細胞
または処理細胞、もしくは正に荷電したポリマー支持体
に吸着されたまたは官能化ポリマー支持体に共有結合さ
れた上記生物由来の酵素、並びに有効量の安定化用２価
金属イオンから成る上記の固定化酵素調製物。 - 【請求項２】固定化酵素は細胞を含まない特許請求の範
囲第１項記載の調製物。 - 【請求項３】酵素はバチルス属（Bacillus）、シユード
モナス属（Pseudomonas）またはマイコプラナ属（Mycop
lana）の菌株から得られる特許請求の範囲第１項または
第２項記載の調製物。 - 【請求項４】酵素はバチルス・ブレビス（Bacillus bre
vis）IFO 12333から得られる特許請求の範囲第３項記載
の調製物。 - 【請求項５】２価金属イオンはMn++，Co++，Fe++，Ni++
およびMg++より成る群から選ばれる特許請求の範囲第１
〜４項のいずれか一つの項記載の調製物。 - 【請求項６】２価金属イオンはMn++である特許請求の範
囲第５項記載の調製物。 - 【請求項７】酵素は架橋により支持体に結合される特許
請求の範囲第１〜６項のいずれか一つの項記載の調製
物。 - 【請求項８】空気の不在下に適当なヒダントイナーゼ酵
素で５−（任意置換フエニル）ヒダントインを加水分解
してＤ（−）（任意置換フエニル）グリシンまたはその
Ｎ−カルバモイル誘導体を製造する方法であつて、該酵
素が適当な支持体内または支持体上に固定化された該酵
素を産生する生物の細胞または処理細胞、もしくは正に
荷電したポリマー支持体に吸着されたまたは官能化ポリ
マー支持体に共有結合された上記生物由来の酵素、並び
に有効量の安定化用２価金属イオンから成る固定化酵素
調製物の形で提供される点に特徴がある上記の製造方
法。 - 【請求項９】固定化酵素調製物は特許請求の範囲第２〜
７項のいずれか一つの項に記載のものである特許請求の
範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】Ｄ（−）（４−ヒドロキシフエニル）グ
リシンまたはＤ（−）Ｎ−カルバモイル（４−ヒドロキ
シフエニル）グリシンを製造するための特許請求の範囲
第８項または第９項に記載の方法。 - 【請求項１１】Ｄ（−）（任意置換フエニル）グリシン
またはそのＮ−カルバモイル誘導体の製造において有用
な固定化酵素調製物の製法であつて、有効量の安定化用
２価金属イオンの存在下で、適当な支持体内または支持
体上に５−（任意置換フエニル）ヒダントインを加水分
解しうるヒダントナーゼを産生する生物の処理細胞また
は未処理細胞を固定化するか、あるいは上記細胞由来の
酵素と正に荷電したポリマー支持体または官能化された
ポリマー支持体とを接触させることから成る固定化酵素
調製物の製法。 - 【請求項１２】固定化酵素調製物は細胞を含まず、上記
方法はその水性懸濁液から固定化酵素調製物を分離する
ことをさらに含む、特許請求の範囲第11項記載の方法。
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