KR860000699B1 - 균체 고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

균체 고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법

본 발명은 페니실린지 아실라제 효소를 고정한 것을 이용하는 공지방법 대신 효소생산 미생물을 배양하여 얻은 균사체를 고정화한 다음 이것을 이용하여 페니실린지에서 6-아미노페니실란산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

공지의 고정화 페니실린지 아실라제를 이용하는 특허는 고정화 지지체에 특징이 있는 것으로 네델랜드 특허공개 제7265609호에서는 셀룰로우스트리아세테이트 섬유를, 미국특허 제3887432호에서는 수용성 무수 말레인산/메틸비닐 공중합체를, 미국특허 제4167446호에서는 덱스트탄올, 미국특허 제3953291호에서는 폴리아크릴아미드를, 미국특허 제4001264호에서는 메타크릴산의 비수용성 중합체내지는 공중합체를, 한국특허공보(공고번호 : 83-1446호)에서는 다공성 구조의 아크릴로니트릴 중합체를 지지체로 사용하는 방법이다. 그러나, 이들 고정화 효소를 이용하는 방법은 효소를 준비하기 위하여 배양된 미생물 균체에 물리적인 힘을 가하여 세포를 파괴해야 하고, 효소정제과정에서 전체 효소역가의 약 50%가 손실되며, 효소정제공정에 많은 노력과 시간이 소요되는 등의 난점이 있고, 효소를 지지체에 고정화할려면, 지지체에 유리아미노기가 있어야 효소와 공유결합을 하여 고정화되기 때문에 복잡한 공정을 거쳐야 하는 등의 여러가지 결점이 있었다.

본 발명은 상기한 공지방법에서와 같은 결점이 없는 것으로 페니실린지 아실라제를 대량 생산하는 미생물 균주, 예를 들면, KFCC-84-3 등을 공지방법으로 배양하여 얻은 균체에서 효소를 별도로 제조하지 않고, 균체자체를 소듐알긴산겔 지지체에 구슬형태(Bead type)로 고정화시킨 다음, 이 고정화 균체를 이용하여 공지방법에서와 같이 회분법이나, 컬럼법 등의 연속방법으로 6-아미노페니실란산을 제조한다.

이와 같은 본 발명 방법을 좀더 상세히 설명하면 박토펩톤, 박토이스트엑기스, 염화나트륨, PH 5인 멸균된 통상의 액체배지에서 페니실린지 아실라제 생산균주인 에세리키와 콜리, KFCC-84-3을 25-45℃에서 진탕배양하고, 원심분리에 의하여 균체를 수확하여 인산완충액에 현탁시킨다. 소듐알긴산겔을 상기와 동일 인산완충액에 녹인 용액에 동량의 상기에서 얻은 미생물 균체 현탁액을 혼합하여 혼합액을 직경 1mm의 주사바늘을 통하여 염화칼슘용액에 적하시켜 균체를 고정화시킨다. 이와 같이 하여 얻은 고정화 균체는 물에 불용성이며, 구슬형태를 이루고 있기 때문에 공지방법에서와 같이 회분법이나, 컬럼법과 같은 연속방법에 의하여 페니실린을 탈아실화하여 6-아미노페니실란산을 제조하는데 사용할 수 있다.

예를 들면, 회분법에서는 페니실린 용액의 PH를 일정하게 유지시키면서 고정화 균체를 가하고 고정화 균체가 부유되도록 교반시켜 주면, 탈아실화 반응이 일어난다. 반응이 종료되면 여과나 원심분리에 의하여 고정화 균체를 분리하고, 반응액에서 6-아미노페니실란산을 분리정제하여 6-아미노페니실란산을 제조한다.

컬럼법에서는 고정화 균체를 컬럼에 충전하고, 이 컬럼속으로 페니실린 용액을 통과시킨다. 이때, 고정화 균체의 불활성화와 페니실린의 분해를 방지하고, 탈아실화반응을 촉진시키기 위하여 알카리 수용액으로 PH를 6.5-9.5로 유지시킨다. 반응유출액은 재순환시키는데, 재순환시 유속은 10-150ℓ/h가 되도록 하여 알카리의 소모가 거의 없을 때까지 재순환을 계속한다.

반응을 수행하는 온도는 통상 15-40℃이고, 반응에 소요되는 시간은 역가기질의 유량, 유속등에 따라 차이가 있으나, 통상 1-10시간이며, 페니실린 용액의 농도는 1-20%로 사용하나, 3-12%가 바람직하다. 반응액에서 6-아미노페니실란산의 분리, 정제는 공지방법으로 수행되는데, 예를 들면, 반응액에 잔존하는 페니실린과 카복실산을 메틸이소부틸케톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 등의 유기용매로 추출 제거한 다음, PH를 3-6으로 조정하여 등전점 침전방법으로 6-아미노 페니실란산을 정제한다.

페니실린지 아실라제의 역가측정법은 통상 파라-디메틸아미노 벤즈알데히드에 의한 발색반응이 이용되나, 본 발명에서는 페닐아세트산을 중화하는데 소요되는 알카리의 양으로 측정하였다. 본 발명의 상세한 실시에는 다음과 같다.

[실시예 1]

(공여 대장균 ATCC 11105로부터 제한효소를 이용하여 페니실린지 아실라제의 유전자를 분리하여, 동일 제한효소로 처리된 플라스미스피비알 322에 접합시켜 재조합플라스미스를 만들고, 이것을 이용하여 대장균 에치비 101에 형질전환시켜 유전자 조작된 새로운 균주(KFCC-84-3)을 만들었다.)

박토트립톤 1%, 이스트엑기스 1%, 과당 1%, 비프엑기스 0.5%, 염화나트륨 0.25%, PH 7.5%를 함유하는 배지 500ml를 통상의 방법으로 멸균한 뒤 페니실린지 아실라제를 대량생산하는 미생물균주(KFCC-84-3)를 접종하여 30℃에서 12시간 배양한다. 원심분리하여 미생물균체를 수확한 뒤, 0.1몰 인산완충액에 현탁시킨다. 소듐알긴산 2g을 100ml 인산완충액에 녹이고, 여기서 상기 미생물 균체 현탁액 100ml를 주가한 다음, 이 용액을 직경 1mm인 주사바늘을 통하여 0.1몰 염화칼슘용액을 적하한다. 2시간동안 방치하고, 2.5% 글루타르알데히드에 1시간 반응시키고, 실온에서 건조시켜 직경 200-400마이크로미터인 고정화 균체를 얻는다. 2.5x90cm의 컬럼에 고정화 균체를 충전하고, 페니실린 5%용액 150ml를 PH 8.0으로 조절한 뒤, 상기 고정화 균체가 충전된 컬럼으로 통과시키고, 반응유출액을 재순환시킨다. 이 조작을 2시간동안 계속하여 수산화암모늄의 소모속도가 거의 없는 단계에서 재순환을 중지한다. 이때 반응액내의 6-아미노페니실란산 전환율은 90%였다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 고정화 균체 20g을 500ml 반응조에 옮기고, 페니실린자 5%용액 150ml를 PH 8.0으로 조절하면서 2시간 반응시킨다. 이때 반응액내의 6-아미노페니실란산 전환율은 85%였다. 이러한 회분식의 방법으로 2시간씩 250회 반응시켰을 때, 고정화 균체의 역가는 초기보다 50%정도 감소하였다.

Claims (3)

1. 페니실린지 아실라제를 대량 생산하는 미생물균주를 공지의 방법으로 배양하여 얻은 미생물 균체 현탁액과 소듐알긴산 용액을 혼합하여 염화칼슘용액에 적하시켜 구슬상의 고정화 균체를 이용하여 회분법이나, 컬럼법으로 6-아미노페니실란산을 제조하는 균체 고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 고정화 균체를 제조할 때, 소듐알긴산의 농도범위를 1-5%로 하는 균체 고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 고정화 균체를 제조할 때, 소듐알긴산과 배양된 미생물 균체의 혼합액을 0.01-0.1몰범위의 염화칼슘용액에 적하하는 균체 고정화에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법.