JPH0438398B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＬ−２−アミノ−４−フエニル酪酸の
製法に関する。 本発明の目的化合物Ｌ−２−アミノ−４−フエ
ニル酪酸は医薬品原料として重要な物質であり、
又必須アミノ酸Ｌ−フエニルアラニンの類似化合
物として生化学分野で種々の用途を有する有用な
物質である。 従来、Ｌ−２−アミノ−４−フエニル酪酸の製
法としては、化合的に合成されたDL−２−アミ
ノ−４−フエニル酪酸を光学分割する方法（V.
Du Vigneaud and O.J.Irish.J.Biol.Chem.122349
（1938））等が知られているが、これらの方法は収
率や操作の点で問題があり、工業的に有利な方法
とは言い難い。一方、α−ケト酸を生化学的に直
接α−アミノ酸に変換する代表的な方法として
は、例えば酵素を利用して還元的にアミノ化する
方法或は他のα−アミノ酸のアミノ基を転移させ
る方法等があるが、かかる生化学反応を利用する
場合には、例えばピルピン酸をＬ−アラニンに変
換させる酵素はオキサル酢酸を殆んどの場合Ｌ−
アスパラギン酸へ変化させない等、使用酵素に通
常高い基質特異性が認められる。それ故、生体内
物質の化学変化にはその反応を触媒する酵素が存
在するとしても、生体内物質ではない２−オキソ
−４−フエニル酪酸を処理するに際し、かかる生
化学的手法を利用しうるか否かは、同化合物をＬ
−２−アミノ−４−フエニル酪酸の転換せしめる
酵素がこれまで発見されていないことからも、従
来全く予測しえなかつた。 かかる状況に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発
明者らはある種の微生物に２−オキソ−４−フエ
ニル酪酸をＬ−２−アミノ−４−フエニル酪酸へ
転換せしめる酵素の存在することを見出し、本発
明を完成するに至つた。 即ち、本発明によれば、Ｌ−２−アミノ−４−
フエニル酪酸はアクロモバクター
（Achromobacter）属、アシネトバクター
（Acinetobacter）属、バチルス（Bacillus）属、
パラコツカス（Paracoccus）属に属し、２−オ
キソ−４−フエニル酪酸からＬ−２−アミノ−４
−フエニル酪酸を生成せしめる能力を有する微生
物の培養液、該培養液から得た菌体又は菌体処理
物をＬ−アミノ酸存在下２−オキソ−４−フエニ
ル酪酸に作用させることにより製造することがで
きる。 本発明に使用する微生物としてはアクロモバク
ター属、アシネトバクター属、バチルス属、パラ
コツカス属に属し、２−オキソ−４−フエニル酪
酸からＬ−２−アミノ−４−フエニル酪酸を生成
せしめる能力を有するものであればいずれも使用
でき、例えばアクロモバクター、リキダム
（Achrombacter liquidum）OUT 8012（微工研
菌寄第12684号）、アシネトバクター、カルコアセ
チカス（Acinetobacter calcoacetics）IFO
12552、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）
IFO 3001、パラコツカス・デニトリフイカンス
（Paracoccus denitrificans）IFO 12442等が好適
に挙げられる。 上記微生物の培養は通常の条件下で行うことが
できる。即ち、栄養培地の炭素源としては、上記
微生物の利用可能なものであればいずれも使用で
き、例えば、グルコース、フルクトース、シユク
ロース、マルトース、デキストリン等の糖類、グ
リセロース、ソルビトール等の糖アルコール、フ
マール酸、クエン酸等の有機酸を使用することが
できる。培地への添加量は通常、0.1〜10％程度
とするのが好ましい。窒素源としては、例えば塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマール
酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉
エキス、酵母エキス、コーンステープリカー、カ
ゼイン加水分解物等の天然有機窒素源等を使用す
ることができ、このうち有機窒素源は多くの場
合、炭素源として兼用することもできる。窒素源
の添加量は通常、0.1〜10％の範囲が好適である。
また、無機塩類としては例えば、リン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウムの如きリン酸アルカリ金
属、塩化カリウム、塩化ナトリウムの如き塩化ア
ルカリ金属、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄の如
き、金属硫酸塩等を好適に使用することができ、
その使用量は通常、0.001〜１％の範囲が好適で
ある。微生物の培養にはPH約５〜８、20〜40℃
で、とりわけPH約６〜７、30〜37℃で好気的条件
下に実施するのが好ましい。 次いで、上記の如くして得られた培養液、該培
養液より得た菌体又は該菌体の処理物を酵素源と
し、これをＬ−アミノ酸の存在下基質である２−
オキソ−４−フエニル酪酸に作用させることによ
りＬ−２−アミノ−４−フエニル酪酸を製するこ
とができる。培養液より得た菌体としては例え
ば、遠心分離、過等により分離された菌体が挙
げられ、菌体の処理物としては凍結乾燥菌体、ア
セトン乾燥菌体、洗浄菌体、菌体磨砕物、菌体の
自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物又
はこれらをゲル抱括法や吸着法等のそれ自体公知
の固定化方法により固定化したものが挙げられ
る。固定化したものの具体例としては培養液、菌
体ないし菌体処理物を例えばポリアクリルアミド
ゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナン、フアーセ
レラン等）、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、
ポリビニルアルコールゲル、寒天ゲル等で固定し
たものが挙げられる。さらに本発明の酵素源たる
菌体処理物としては菌体抽出物から公知の方法を
組合せて精製・採取した酵素をそれ自体も使用す
ることができる。 該反応は培養液の菌体を含む培養液に基質を加
えて実施してもよく、又該培養液より得た菌体又
は該菌体処理物を基質の水溶液に加えて反応させ
てもよい。上記本反応に用いるＬ−アミノ酸とし
ては例えば、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン酸又はＬ−アラニン等があげられ、基質に対し
て当モル以上用いるのが好ましい。 また、反応時間の短縮或いはＬ−２−アミノ−
４−フエニル酪酸の蓄積量の増加をはかるために
は界面活性剤及び／又は補酵素等の存在下に実施
するのが好ましい。この目的に用いうる界面活性
剤としては例えば、臭化セチルトリメチルアンモ
ニウム、ポリエチレングリコール、ｐ−イソオク
チルフエニルエーテル（ローム アンド ハース
社製 商品名：トリトン Ｘ−100）等を用いる
ことができ、その使用量は反応液に対し0.0001〜
0.1％程度とするのが好ましい。又、上記目的に
用いうる補酵素としては例えば、ピリドキサール
リン酸を挙げることができ、概ね反応液に対して
0.001〜1mM程度の濃度で用いるのが好ましい。 このようにして反応液中に蓄積したＬ−２−ア
ミノ−４−フエニル酪酸はそれ自体は水に殆ど不
溶であり、過又は遠心分離等通常の手段を用い
て容易に反応液から分離・採取することができ
る。また、Ｌ−２−アミノ−４−フエニル酪酸は
酸又はアルカリ性塩にすると水に可溶性となるた
め、反応液に酸又はアルカリを加え過して不純
物を除き、液を中和してＬ−２−アミノ−４−
フエニル酪酸結晶を析出させた後、過、遠心分
離等の常法で反応液から分離・採取することもで
きる。 以下、実施例を挙げて本発明を具体例に説明す
る。 尚、実施例中の２−オキソ−４−フエニル酪酸
及びＬ−２−アミノ−４−フエニル酪酸の定量は
液体クロマトグラフイー法により行ない、Ｌ−２
−アミノ−４−フエニル酪酸の確認は取得結晶の
元素分析値並びに予め合成したＮ−アセチル−
DL−２−アミノ−４−フエニル酪酸に市販のア
ミノアシラーゼを作用させて製したＬ−２−アミ
ノ−４−フエニル酪酸と比旋光度、NMR及びIR
スペクトルを比較する等して行なつた。本明細書
中”％”はいずれも”重量／容量（ｇ／ml）”を
意味するものとする。 実施例 １ (1) グルコース１％、カゼイン加水分解物１％、
酵母エキス１％、リン酸水素２アンモニウム
0.2％、リン酸２水素カリウム0.1％、硫酸マグ
ネシウム0.05％、硫酸第１鉄0.001％、塩化カ
ルシウム0.01％及びカラリン102（三洋化成工業
株式会社製商品名）0.003％から成る培地50ml
（PH7.0）を120℃で10分間滅菌した。該培地に
パラコツカス・デニトリフイカンス
（Paracoccus denitrificans）IFO 12442を１白
金耳接種後、30℃で18時間振盪培養した。培養
後、培養液を遠心分離して集菌した後、菌体を
凍結乾燥することにより、凍結乾燥菌体0.5ｇ
を調製した。 (2) ２−オキソ−４−フエニル酪酸４ｇ、Ｌ−ア
スパラギン酸3.2ｇ及びピリドキサールリン酸
0.003ｇを水に溶解し、アンモニア水でPH8.5と
した後、水を加えて全体を100mlとした基質溶
液に上記(1)で調製した凍結乾燥菌体１ｇを加え
30℃で２日間反応させた。該反応液に塩酸を加
えて生成物を溶解させ、活性炭２ｇを加えて吸
引過した。液を水酸化ナトリウムで中和
し、析出した結晶を取することによりＬ−２
−アミノ−４−フエニル酪酸3.1ｇを得た。収
率78％ 融点：286〜288℃（分解） 〔α〕²² _D＋47℃（Ｃ＝１、1N−HCl） 実施例２〜４ 実施例１−(1)と同様にして下記第１表に示す微
生物を培養し、その培養液100mlから遠心分離に
よつて集菌した菌体を基質溶液（２−オキソ−４
−フエニル酪酸４ｇ、Ｌ−アスパラギン酸3.2ｇ、
臭化セチルトリメチルアンモニウム10mgを100ml
の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でPH8.5
として調製）に懸濁した。この懸濁液を30℃で２
日間反応させることにより、Ｌ−２−アミノ−４
−フエニル酪酸が得られた。結果は下記表に示す
通りである。

【表】 実施例 ５ グルコース100ｇ、カゼイン加水分解物150ｇ、
コーンステープリカー50ｇ、酵母エキス100ｇ、
リン酸水素２アンモニウム20ｇ、リン酸水素２カ
リウム10ｇ、硫酸マグネシウム５ｇ、硫酸第１鉄
0.1ｇ、塩化カシンウム１ｇ、カラリン102（三洋
化成工業株式会社製商品名）0.3ｇ及び水10か
ら成る培地（PH7.0）を丸菱株式会社製MSJ−ｕ
型20容ジヤーフアメンターに仕込み120℃で10
分間滅菌した。該培地に30℃で18時間振盪下フラ
スコ培養したパラコツカス・デニトリフイカンス
（Paracoccus denitrificans）IFO 12442の菌体液
100mlを接種し、１／2vwm、400rpm、30℃で20
時間培養した。次いで、該培養液に２−オキソ−
４−フエニル酪酸400ｇ、Ｌ−アスパラギン酸320
ｇ、臭化セチルトリメチルアンモニウム１ｇを加
え、アンモニア水でPH8.5に調整した後、37℃で
２日間反応させた。２日後培養液中には、２−オ
キソ−４−フエニル酪酸が認められず、Ｌ−２−
アミノ−４−フエニル酪酸360ｇが生成蓄積して
いた。遠心過機で該反応液から菌体及び培養液
等の不純物を除き、残存結晶を純水に懸濁して洗
浄することにより、Ｌ−２−アミノ−４−フエニ
ル酪酸の結晶320ｇを得た。収率79.5％。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ２−オキソ−４−フエニル酪酸からＬ−２−
   アミノ−４−フエニル酪酸を生成せしめる能力を
   有するアクロモバクター属、アシネトバクター
   属、バチルス属又はパラコツカス属微生物の培養
   液、該培養液から得た菌体又は該菌体の処理物を
   Ｌ−アミノ酸の存在下２−オキソ−４−フエニル
   酪酸に作用させ、生成したＬ−２−アミノ−４−
   フエニル酪酸を採取することを特徴とするＬ−２
   −アミノ−４−フエニル酪酸の製法。 ２ Ｌ−アミノ酸がＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グ
   ルタミン酸又はＬ−アラニンである特許請求の範
   囲第１項記載の製法。