JPH0773509B2 - ビブリオ属細菌の迅速検出方法 - Google Patents
ビブリオ属細菌の迅速検出方法Info
- Publication number
- JPH0773509B2 JPH0773509B2 JP12399888A JP12399888A JPH0773509B2 JP H0773509 B2 JPH0773509 B2 JP H0773509B2 JP 12399888 A JP12399888 A JP 12399888A JP 12399888 A JP12399888 A JP 12399888A JP H0773509 B2 JPH0773509 B2 JP H0773509B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vibrio
- medium
- rapid detection
- sample
- nutrient medium
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は食中毒菌であるビブリオ属細菌の迅速検出法に
関するものである。
関するものである。
ビブリオ属細菌は細菌性食中毒の原因菌として最も高率
で検出される細菌であり、食品の衛生管理上汚染に最も
注意を払う必要のある細菌のひとつである。食品の細菌
検査は一般に短時間に行う必要があり、特に水産品はビ
ブリオ属細菌に汚染されやすいところからその迅速検出
法の開発は重要である。
で検出される細菌であり、食品の衛生管理上汚染に最も
注意を払う必要のある細菌のひとつである。食品の細菌
検査は一般に短時間に行う必要があり、特に水産品はビ
ブリオ属細菌に汚染されやすいところからその迅速検出
法の開発は重要である。
従来、食品中のビブリオ属細菌の検出方法としては、例
えば寒天平板塗抹法がある。この方法は食塩、ポリミキ
シンＢ等を含む寒天平板培地上に一定量の検体を塗抹し
て培養し、増殖した細菌を肉眼で判定しており、測定時
間に24時間以上要していた。
えば寒天平板塗抹法がある。この方法は食塩、ポリミキ
シンＢ等を含む寒天平板培地上に一定量の検体を塗抹し
て培養し、増殖した細菌を肉眼で判定しており、測定時
間に24時間以上要していた。
一方、微生物数を迅速に検出する方法としては、微生物
の増殖に伴う培地のインピーダンスの変化、培養液のpH
の変化、消費酸素量あるいは発生炭酸ガス量等を測定
し、これらと微生物数の相関から微生物数を求める方法
が最近研究されている。この他、検体を直接顕微鏡観察
し微生物数を求める方法もある。
の増殖に伴う培地のインピーダンスの変化、培養液のpH
の変化、消費酸素量あるいは発生炭酸ガス量等を測定
し、これらと微生物数の相関から微生物数を求める方法
が最近研究されている。この他、検体を直接顕微鏡観察
し微生物数を求める方法もある。
しかしながら、前述の寒天平板塗抹法は結果が判明する
までに時間がかかりすぎ、特に鮮度が商品価値等として
重要な水産品等の食品の検査方法としては不適当であっ
た。
までに時間がかかりすぎ、特に鮮度が商品価値等として
重要な水産品等の食品の検査方法としては不適当であっ
た。
また、培地のインピーダンスの変化等を測定する方法等
はいずれも微生物が培地1ml当り105個以上にならないと
検出が出来ず、また、検体由来の非生物物質により上記
の量は変化することがあり、微生物の検出限界、検出精
度の点から満足できる方法とはいえず実用化されるに至
っていない。直接顕微鏡観察による微生物検出方法も微
生物の生死を識別出来ないこと、検体由来の非微生物夾
雑物と微生物の区別がつきにくいことなどらか満足出来
る方法とはいえない。
はいずれも微生物が培地1ml当り105個以上にならないと
検出が出来ず、また、検体由来の非生物物質により上記
の量は変化することがあり、微生物の検出限界、検出精
度の点から満足できる方法とはいえず実用化されるに至
っていない。直接顕微鏡観察による微生物検出方法も微
生物の生死を識別出来ないこと、検体由来の非微生物夾
雑物と微生物の区別がつきにくいことなどらか満足出来
る方法とはいえない。
本発明はこのような問題点のないビブリオ属細菌を短時
間に高精度で検出しうる方法を提供しうるものである。
かかる本発明の方法は一定量の検体を栄養培地に加えて
培養し、増殖した細菌菌体をEDTAの存在下でベンゾイル
アルギニンメチルクマリン酸（Bz−Arg−MCA）と接触さ
せることによりなる。
間に高精度で検出しうる方法を提供しうるものである。
かかる本発明の方法は一定量の検体を栄養培地に加えて
培養し、増殖した細菌菌体をEDTAの存在下でベンゾイル
アルギニンメチルクマリン酸（Bz−Arg−MCA）と接触さ
せることによりなる。
検体の種類は問うところではなく、検体が固体の場合は
粉粒体ならばそのまま栄養培地に投入すればよく、それ
より大きな固体であれば必要により表面を拭くなどの抽
出処理を行って測定に供することができる。また、気体
であればそのまま栄養培地に吹き込めばよい。本発明の
方法が適用される検体は通常は食品である。食品が液体
の場合にはそのまま栄養培地に投入し、固体の場合には
必要によりミキサー等で均一に粉砕して所定量を栄養培
地に投入すればよい。本発明の方法で検出されるビブリ
オ属細菌はBz−Arg−MCAのArg−MCA間の結合を切断する
酵素を有するものであれば特に制限されるものではな
く、例えばビブリオ・パラヘモリチクス（Vibrio parah
aemolyticus）IFO 12711,などを挙げることができる。
粉粒体ならばそのまま栄養培地に投入すればよく、それ
より大きな固体であれば必要により表面を拭くなどの抽
出処理を行って測定に供することができる。また、気体
であればそのまま栄養培地に吹き込めばよい。本発明の
方法が適用される検体は通常は食品である。食品が液体
の場合にはそのまま栄養培地に投入し、固体の場合には
必要によりミキサー等で均一に粉砕して所定量を栄養培
地に投入すればよい。本発明の方法で検出されるビブリ
オ属細菌はBz−Arg−MCAのArg−MCA間の結合を切断する
酵素を有するものであれば特に制限されるものではな
く、例えばビブリオ・パラヘモリチクス（Vibrio parah
aemolyticus）IFO 12711,などを挙げることができる。
栄養培地はビブリオ属細菌が生育し増殖できる培地であ
る。ビブリオ属細菌を選択的に増殖させるために培地に
は食塩及びポリミキシンＢを含有させることが好まし
く、これらにヘキサメタリン酸を加えたものが更に好ま
しい。含有量は、食塩が10g/以上、例えば10〜40g/
程度、ポリミキシンＢが100U/ml以上、例えば、100〜50
0U/ml程度、そしてヘキサメタリン酸が0.1g/以上、例
えば0.1〜0.5g/程度がそれぞれ適当である。その他の
培地成分はビブリオ属細菌用の公知の栄養培地と同様で
よく、アラビノース等の炭素源、バクトトリプトン、ペ
プトン等の窒素源、炭酸ナトリウム等の無機塩類、酵母
エキス等の有機栄養物を含むものを用いる。培地の例と
してはバクトトリプトン培地、ペプトン培地、アラビノ
ース培地、等を挙げることができる。
る。ビブリオ属細菌を選択的に増殖させるために培地に
は食塩及びポリミキシンＢを含有させることが好まし
く、これらにヘキサメタリン酸を加えたものが更に好ま
しい。含有量は、食塩が10g/以上、例えば10〜40g/
程度、ポリミキシンＢが100U/ml以上、例えば、100〜50
0U/ml程度、そしてヘキサメタリン酸が0.1g/以上、例
えば0.1〜0.5g/程度がそれぞれ適当である。その他の
培地成分はビブリオ属細菌用の公知の栄養培地と同様で
よく、アラビノース等の炭素源、バクトトリプトン、ペ
プトン等の窒素源、炭酸ナトリウム等の無機塩類、酵母
エキス等の有機栄養物を含むものを用いる。培地の例と
してはバクトトリプトン培地、ペプトン培地、アラビノ
ース培地、等を挙げることができる。
培養条件としては、pH8〜９程度、温度30〜37℃程度で
４〜８時間程度、好ましくは６〜８時間程度静置あるい
は振盪培養すればよい。
４〜８時間程度、好ましくは６〜８時間程度静置あるい
は振盪培養すればよい。
栄養培地の培地成分がその後の測定を妨害する場合には
培養物を遠心して培地成分を分離除去する。
培養物を遠心して培地成分を分離除去する。
遠心して集めた細菌にEDTAの存在下でベンゾイルアルギ
ニンメチルクマリン酸（Bz−Arg−MCA）と接触させる。
EDTAとBz−Arg−MCAは別々に細菌に加えてもよいが両者
を含む混合溶液を加える方法が簡便である。含有量とし
てはEDTAが0.5mM以上、0.5〜2mM程度が適当である。Bz
−Arg−MCAの量はその分解反応又は分解産物を分析する
測定感度等によって定まり、例えば0.01〜0.1mM程度が
適当である。
ニンメチルクマリン酸（Bz−Arg−MCA）と接触させる。
EDTAとBz−Arg−MCAは別々に細菌に加えてもよいが両者
を含む混合溶液を加える方法が簡便である。含有量とし
てはEDTAが0.5mM以上、0.5〜2mM程度が適当である。Bz
−Arg−MCAの量はその分解反応又は分解産物を分析する
測定感度等によって定まり、例えば0.01〜0.1mM程度が
適当である。
ビブリオ属細菌にBz−Arg−MCAを資化させる反応はpH7
〜８程度、30〜40℃程度で30〜60分間程度行わせればよ
い。所定時間反応させた後は通常は反応停止剤を加えて
反応を停止させる。反応停止はpHを上昇あるいは低下さ
せて行ってもよく、加熱処理あるいは酵素インイビター
その他の酵素不活性化剤を加えて行ってもよい。
〜８程度、30〜40℃程度で30〜60分間程度行わせればよ
い。所定時間反応させた後は通常は反応停止剤を加えて
反応を停止させる。反応停止はpHを上昇あるいは低下さ
せて行ってもよく、加熱処理あるいは酵素インイビター
その他の酵素不活性化剤を加えて行ってもよい。
反応後はBz−Arg−MCAの資化によって生じる系の変化を
測定してビブリオ属細菌の量を求める。系の変化を測定
する方法は問わないが、生成したメチルクマリン酸が蛍
光物質であるところからこれを蛍光分析法によって定量
する方法が簡便である。蛍光分析法で分析する場合には
反応物を遠心して懸濁物を沈降させておくことが好まし
い。
測定してビブリオ属細菌の量を求める。系の変化を測定
する方法は問わないが、生成したメチルクマリン酸が蛍
光物質であるところからこれを蛍光分析法によって定量
する方法が簡便である。蛍光分析法で分析する場合には
反応物を遠心して懸濁物を沈降させておくことが好まし
い。
ベンゾイルアルギニンメチルクマリン酸（Bz−Arg−MC
A）はトリプシン酵素の基質であり、ビブリオ属細菌は
その保有する酵素がアルギニンとメチルクマリン酸の間
の結合を切断してメチルクマリン酸を生成させる。検体
が特に生ものの場合にはその他の酵素が数多く含まれて
おり、このなかには前記のアルギニンとメチルクマリン
酸の間の結合を切断するものもある。EDTAがこの酵素作
用を抑制することを見出しなされたのが本発明である。
A）はトリプシン酵素の基質であり、ビブリオ属細菌は
その保有する酵素がアルギニンとメチルクマリン酸の間
の結合を切断してメチルクマリン酸を生成させる。検体
が特に生ものの場合にはその他の酵素が数多く含まれて
おり、このなかには前記のアルギニンとメチルクマリン
酸の間の結合を切断するものもある。EDTAがこの酵素作
用を抑制することを見出しなされたのが本発明である。
ビブリオ属細菌は耐塩性かつ耐ポリミキシンＢ性である
ので栄養培地にこれらを含有させることによってビブリ
オ属細菌を選択的に増殖させることができる。この効果
はヘキサメタリン酸を加えることによって更に高めるこ
とができる。
ので栄養培地にこれらを含有させることによってビブリ
オ属細菌を選択的に増殖させることができる。この効果
はヘキサメタリン酸を加えることによって更に高めるこ
とができる。
実施例１ 腸炎ビブリオ菌であるビブリオ・パラヘモリチクスIFO
12711をバクトトリプトン培地で20時間培養し、この培
養液をバクトトリプトン培地で各種の希釈率で希釈し
た。
12711をバクトトリプトン培地で20時間培養し、この培
養液をバクトトリプトン培地で各種の希釈率で希釈し
た。
この各希釈液1mlに下記組成のBSP−HP培地6mlを加えて3
7℃で６時間100r.p.mで振盪培養した。
7℃で６時間100r.p.mで振盪培養した。
BSP−HP培地組成 バクトトリプトン 2g/ 食塩 30g/ ポリミキシンＢ 250U/ml ヘキサメタリン酸 0.25g/ pH 8.5 培養液を3,000r.p.m.で10分間遠心して上清液を除き、
沈澱に0.01mM Bz−Arg−MCA及び1mM EDTAを含むpH7.5の
50mMリン酸緩衝液を3ml加えた。この懸濁物を40℃で１
時間静置して反応させ、1mlの1Mグリシン緩衝液（pH11.
0）を加えて反応を停止させた。
沈澱に0.01mM Bz−Arg−MCA及び1mM EDTAを含むpH7.5の
50mMリン酸緩衝液を3ml加えた。この懸濁物を40℃で１
時間静置して反応させ、1mlの1Mグリシン緩衝液（pH11.
0）を加えて反応を停止させた。
反応物を3,000r.p.m.で10〜20分間遠心し、得られた上
清を励起波長360〜370nm、蛍光波長440〜450nmで蛍光分
析し蛍光強度を測定した。
清を励起波長360〜370nm、蛍光波長440〜450nmで蛍光分
析し蛍光強度を測定した。
一方、従来法として同じ各希釈液0.1mlをBTB寒天平板に
塗抹して37℃で24時間培養し、生成したコロニーをカウ
ントした。
塗抹して37℃で24時間培養し、生成したコロニーをカウ
ントした。
両法で得られた結果を第１図に示すが、同図に示すよう
に両者の間にはよい相関関係が得られた。
に両者の間にはよい相関関係が得られた。
実施例２ 市販の各種海産物及びこれにビブリオ・パラヘモリチク
スIFO 12711を102個/g又は104個/g接種した各検体につ
いてビブリオ属細菌の検体試験を行った。各検体をいず
れも10gずつ90mlの無菌リン酸緩衝液にホモジネートし
たものを試料とし、実施例１と同じ条件で測定した。得
られた結果を下表に示す。
スIFO 12711を102個/g又は104個/g接種した各検体につ
いてビブリオ属細菌の検体試験を行った。各検体をいず
れも10gずつ90mlの無菌リン酸緩衝液にホモジネートし
たものを試料とし、実施例１と同じ条件で測定した。得
られた結果を下表に示す。
〔発明の効果〕 本発明の方法によりビブリオ属細菌を短時間でかつ高精
度で検出することができる。
度で検出することができる。
第１図はビブリオ属細菌を含む試料を本発明の方法及び
従来法で測定して得られた結果の相関関係を示す図であ
る。
従来法で測定して得られた結果の相関関係を示す図であ
る。
Claims (2)
- 【請求項１】一定量の検体を栄養培地に加えて培養し、
増殖した細菌菌体をEDTAの存在下でベンゾイルアルギニ
ンメチルクマリン酸と接触させることを特徴とするビブ
リオ属細菌の迅速検出方法 - 【請求項２】栄養培地が食塩及びポリミキシンＢを含む
ものである請求項１に記載のビブリオ属細菌の迅速検出
方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12399888A JPH0773509B2 (ja) | 1988-05-23 | 1988-05-23 | ビブリオ属細菌の迅速検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12399888A JPH0773509B2 (ja) | 1988-05-23 | 1988-05-23 | ビブリオ属細菌の迅速検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01296998A JPH01296998A (ja) | 1989-11-30 |
| JPH0773509B2 true JPH0773509B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=14874508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12399888A Expired - Lifetime JPH0773509B2 (ja) | 1988-05-23 | 1988-05-23 | ビブリオ属細菌の迅速検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0773509B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101425660B1 (ko) * | 2012-11-14 | 2014-08-05 | 대구가톨릭대학교산학협력단 | D-타가토오스를 함유하는 배지 및 이를 이용한 인체장내세균의 탄소원 이용 검증방법 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69834319T2 (de) | 1997-02-04 | 2007-04-12 | Aps Mycometer | Methode zur selektiven bestimmung der biomasse von pilzen |
| SK287315B6 (sk) | 2006-06-02 | 2010-06-07 | Biotika, A. S. | Spôsob izolácie polymyxínu B z vyfermentovanej pôdy |
| SK287293B6 (sk) | 2006-06-15 | 2010-05-07 | Biotika, A. S. | Spôsob fermentácie polymyxínu B pomocou produkčného mikroorganizmu Bacillus polymyxa |
-
1988
- 1988-05-23 JP JP12399888A patent/JPH0773509B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101425660B1 (ko) * | 2012-11-14 | 2014-08-05 | 대구가톨릭대학교산학협력단 | D-타가토오스를 함유하는 배지 및 이를 이용한 인체장내세균의 탄소원 이용 검증방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01296998A (ja) | 1989-11-30 |
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