JP4278936B2 - 微生物計測方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の微生物を迅速に計測するための測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
臨床、食品、環境水質、医薬品等の様々な分野で、微生物の検査が行われている。例えば、食品検査の分野では、食品衛生法に基づく規格基準、衛生規範等で、大腸菌群，大腸菌，黄色ブドウ球菌等の細菌数を検査することが定められている。また、食品製造業者においては、法規制とは別に、自主的衛生管理のために特定微生物の検査を行っている。
【０００３】
従来、これらの検査は、公定法として定められた方法で行われるが、非常に煩雑かつ検査時間が長い（24〜48時間以上）ことから、特定の細菌を選択的に培養できる培地を用いた簡易培養法が一般的に用いられている。しかしながらこれらの方法を用いた場合でも、細菌が増殖してコロニーとして肉眼で判別できるようになるまで、24時間程度の時間が必要であり、より短時間で特定の細菌を計測できる方法が強く望まれている。また、コロニーのカウントは手間がかかり労力を要することから，より簡便な方法が望まれている。
【０００４】
一方、これらの方法とは別に、試料を特定の微生物を増殖培養できる液体培地で培養し、微生物の増殖にともなって変化する特性値を測定することによって微生物を計測する方法が開発されている。これらの微生物の増殖を検出する特性値としては、溶存酸素の減少，二酸化炭素の増加によるpH低下（ｐH指示薬の吸光度変化を検出），電気抵抗の変化などが利用されている。しかしながらこれらの方法を用いた場合でも、細菌の増殖を特性値の変化として間接的に検出するため、かなりの時間を要する。例えば、溶存酸素の変化を検出するには、初期濃度105個/mlの細菌を検出するために、６〜8時間の培養が必要であると報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑み、微生物を直接検出することにより、短時間で特定の微生物を検出する計測法を提供することを課題とする。
【０００６】
【問題を解決するための手段】
本発明の微生物計測方法は、以下の工程で特定の微生物を短時間で検出することを特徴とする。
１）測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程、
２）増殖した微生物を計数する工程、および
３）初期濃度既知の前記微生物を、培養培地、培養温度および増殖時間が前記工程１）と同じ条件で増殖培養して測定された増殖培養後濃度と前記初期濃度との関係に基づき作成された検量線を用いて、増殖後の微生物数から、初期微生物数を推定する工程。
【０００７】
【発明の実施の形態】
測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程とは、微生物を含む試料を、少なくとも測定対象の微生物が増殖可能であり、測定対象外の微生物の増殖を抑制することができる培地と混合して培養する工程である。具体的な方法は、測定対象とする試料，微生物によって異なり、実施の形態は特に限定されるものではない。微生物を選択的に増殖させる方法は、種々の方法が、文献，教科書等で開示されており、容易に入手可能である。例えば、測定対象とする微生物が細菌の場合は、特定の細菌を増殖させる液体培地が知られている。具体例としては、例えば、大腸菌を選択的に増殖させるためには、EC培地を用いて、44.5℃で培養する方法が、食品衛生検査指針に収載されている。大腸菌群を選択的に増殖させるためには、ＬＢ培地，BGLB培地などを用いて３７℃で培養する方法が知られている。腸炎ビブリオを選択的に増殖させるには食塩ポリミキシン培地で37℃で培養する方法が知られている。サルモネラを選択的に増殖させるには、ラパポート培地で37℃で培養する方法が知られている。上記の例はほんの一例に過ぎず、上記以外にも特定の細菌を選択的に増殖させる培地が数多く報告されており、本発明の実施形態は上記に記載した培地例に限定されるものではない。
【０００８】
培養に必要な時間は、測定対象とする細菌、培養条件によって異なるが、例えば、後述するように計数する工程としてフローサイトメータを使用する場合には、試料中の細菌濃度として102個/ml〜103個/ml以上が好適である。例えば、大腸菌を好適な培養条件で培養した場合、1個/mlの初期濃度の大腸菌を103個/ml以上の濃度まで増殖するには、約４〜５時間の培養時間が必要である。
【０００９】
本法では、細菌を直接検出して計数するために、従来法に比べ短時間の培養で細菌を検出する事ができる。理論的には１個から細菌を検出可能であるが、実用的なフローサイトメータでは数μl〜数百μlの試料を測定するために、前述のように試料中の細菌濃度として102個/ml〜103個/ml以上の濃度が好適である。
【００１０】
なお、測定対象試料が、食品試料等で固形物・半固形物の場合は、試料１容と生理食塩水等の溶液9容を混合し、ストマッカーで処理し、５０μm程度のフィルターで処理することが好適である。
【００１１】
増殖した微生物を計数する工程とは、前工程で増殖させた微生物を一個一個計数する工程であって、種々の粒子計測装置が利用可能である。使用する粒子計測装置は、約1〜20ミクロン程度の微粒子を計数できる粒子計測装置であれば特に限定されない。本発明に使用できる粒子計測装置としては、例えば、電気抵抗式粒子計測装置、フロー画像解析装置、フローサイトメータが好適に用いられる。試料が飲料水、清涼飲料水等で微生物以外の粒子成分を含まない場合は、電気抵抗式粒子計測装置が好適である。電気抵抗式粒子計測装置は、クールター原理として良く知られる測定原理を用いた粒子計測装置であり、例えば、シスメックス株式会社より販売されているSD-2000，CDA-500などの装置が好適に使用できる。これらの装置では、約１００μm程度のオリフィスの両サイドに電極を置き、微粒子がオリフィスを通過する際に生じる電気抵抗の変化を電気パルスとして検出し、微粒子を計数することができるまた、同時に微粒子の体積を正確に計測することが可能であり、体積の違いによって、微生物と微生物以外の粒子(以下デブリスと称する)を区別して計数することができる。一方、微生物とデブリスの体積が同じ場合は、電気抵抗式粒子計測装置で微生物のみを正確に計数することは困難である。この場合は、何らかの方法で、微生物とデブリスを区別して計数する必要がある。この場合には、シスメックス株式会社より発売されているFPIAシリーズなどのフロー式画像解析装置が好適に使用できる。この装置では、フローセルを流れる粒子画像を撮像し解析することにより、微粒子を計測することができる。本装置では、粒子画像を得ることができるため、微生物とデブリスを容易に弁別可能である。より好適にはフローサイトメータの使用が好適である。フローサイトメータとしては、ベックマン・クールター社より発売されているEPICSシリーズ，ベクトン・ディッキンソン社より発売されているFACSシリーズが良く知られている。本発明の実施はこれらの機種に限定されるものではなく、一般的に定義されているフローサイトメータであれば特に限定されるものではない。本発明のフローサイトメータとは、検出部を流れる粒子にレーザ等の光を照射し、粒子から発生する散乱光、蛍光等の光学的情報から粒子の大きさ、形態、あるいは、粒子が細胞の場合は、核酸量、蛋白量等の情報を計測する装置を言う。
【００１２】
フローサイトメータを用いる場合には、試料中の微生物をあらかじめ、微生物中の核酸（RNA,DNA）あるいは、蛋白、その他微生物の構成物質を特異的に染色する蛍光色素あるいは、蛍光色素を標識した抗体で染色することが好適である。特に核酸を染色する蛍光色素で染色することが好適である。染色に使用する染色液例としては、特開平9-104683，特開2001-258590に記載の試薬を用いた場合、１分以内に細菌を染色することができ、特に好適である。特にRNAを特異的に染色する蛍光色素を用いた場合には、増殖中の微生物は豊富なRNAを有し、強い蛍光を発することからデブリスと微生物の区別がより容易になるというメリットがある。さらに、RNA量は微生物の増殖活性を反映しており、蛍光強度は微生物の増殖活性の指標として使用することができる。染色液は基本的に蛍光色素と緩衝剤を含む水溶液であるが、染色性を改善するためあるいは微粒子の分散を改善するために界面活性剤等の添加物を含んでも良い。また、蛍光色素の安定性が悪い場合には，色素をエチレングリコール等の溶液で保存し、使用時に希釈液と混合して使用することが好適である。
【００１３】
増殖後の微生物数から初期微生物数を推定する工程とは、測定対象とする初期濃度既知の特定微生物を、「測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程」で増殖した後に、「増殖した微生物を計数する工程」で増殖後の微生物濃度を計数し、図１に示す、初期濃度−増殖後濃度の関係をプロットし得られた回帰直線式等を検量線として、初期濃度未知の試料を増殖した後の増殖後濃度から初期濃度を算出する工程を言う。
【００１４】
本発明の実施例を以下に示す。本発明の実施形態は以下の実施例に限定されるものでは無い。
【００１５】
【実施例】
初期濃度100,101,102,103,104個/mlとなるよう大腸菌をEC培地（日水製薬）に添加し、４時間44.5℃で培養し、大腸菌数を計数した。初期細菌濃度と4時間培養後の細菌数をプロットし、4時間培養後の細菌数から初期細菌濃度を推定するための検量線を作成した（図１）。
【００１６】
大腸菌数の測定は以下の方法を用いた。
▲１▼測定試料調製
一定時間培養後の大腸菌試料50μlに希釈液340μlを添加して希釈後、染色液10μlを添加し、42℃で20秒間インキュベートし測定用試料を調製した。希釈液,染色液の組成は、以下の組成を使用した。
【００１７】
（希釈液）
クエン酸二水塩 21.6ｇ/l
ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド 1g/l
精製水 1.0 l
NaOHでpH2.5に調製した
【００１８】
（染色液）
下記の構造を有する色素 50mg
【００１９】
【化１】
エチレングリコール 1.0 l
【００２０】
▲２▼細菌数測定
633nmの赤色半導体レーザを光源とするフローサイトメータを用いて、▲１▼で作成した試料を測定し、前方散乱光と赤色蛍光(650nm以上)を測定し、前方散乱光-赤色蛍光のスキャッタグラム（図２）を作成し、細菌領域内の粒子を細菌として計数し細菌濃度を求めた。
【００２１】
試料測定例
食品試料１（レタス），食品試料２（鶏ささみ肉）25gを生理食塩水225mlとともにストマック処理したのち、約50μmのフィルターで濾過した試料１ｍｌとEC培地10ｍｌを混合し44.5℃で４時間培養したのち、上記の方法で細菌濃度を計測した。図３に試料１の測定例を示す。
【００２２】
４時間培養後の計測値から図１の検量線を用いて初期細菌濃度を推定した。
【００２３】
対照の測定法として、XM-G寒天培地（日水製薬製）を用いた混釈法で大腸菌濃度を求めた。コロニーの計数は培養２４時間後に行った。
【００２４】
表１に示すように本法と対照法の測定結果は良く一致しており、本法を用いて短時間で細菌濃度が計数可能であることが確認できた。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、短時間で特定微生物の初期濃度を計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌をEC培地で４時間培養した場合の初期濃度と４時間培養後細菌濃度のプロットして求めた検量線である。
【図２】初期濃度103/ml試料の4時間培養後のスキャッタグラムである。
【図３】試料１の4時間培養後のスキャッタグラムである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の微生物を迅速に計測するための測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
臨床、食品、環境水質、医薬品等の様々な分野で、微生物の検査が行われている。例えば、食品検査の分野では、食品衛生法に基づく規格基準、衛生規範等で、大腸菌群，大腸菌，黄色ブドウ球菌等の細菌数を検査することが定められている。また、食品製造業者においては、法規制とは別に、自主的衛生管理のために特定微生物の検査を行っている。
【０００３】
従来、これらの検査は、公定法として定められた方法で行われるが、非常に煩雑かつ検査時間が長い（24〜48時間以上）ことから、特定の細菌を選択的に培養できる培地を用いた簡易培養法が一般的に用いられている。しかしながらこれらの方法を用いた場合でも、細菌が増殖してコロニーとして肉眼で判別できるようになるまで、24時間程度の時間が必要であり、より短時間で特定の細菌を計測できる方法が強く望まれている。また、コロニーのカウントは手間がかかり労力を要することから，より簡便な方法が望まれている。
【０００４】
一方、これらの方法とは別に、試料を特定の微生物を増殖培養できる液体培地で培養し、微生物の増殖にともなって変化する特性値を測定することによって微生物を計測する方法が開発されている。これらの微生物の増殖を検出する特性値としては、溶存酸素の減少，二酸化炭素の増加によるpH低下（ｐH指示薬の吸光度変化を検出），電気抵抗の変化などが利用されている。しかしながらこれらの方法を用いた場合でも、細菌の増殖を特性値の変化として間接的に検出するため、かなりの時間を要する。例えば、溶存酸素の変化を検出するには、初期濃度105個/mlの細菌を検出するために、６〜8時間の培養が必要であると報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑み、微生物を直接検出することにより、短時間で特定の微生物を検出する計測法を提供することを課題とする。
【０００６】
【問題を解決するための手段】
本発明の微生物計測方法は、以下の工程で特定の微生物を短時間で検出することを特徴とする。
１）測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程、
２）増殖した微生物を計数する工程、および
３）初期濃度既知の前記微生物を、培養培地、培養温度および増殖時間が前記工程１）と同じ条件で増殖培養して測定された増殖培養後濃度と前記初期濃度との関係に基づき作成された検量線を用いて、増殖後の微生物数から、初期微生物数を推定する工程。
【０００７】
【発明の実施の形態】
測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程とは、微生物を含む試料を、少なくとも測定対象の微生物が増殖可能であり、測定対象外の微生物の増殖を抑制することができる培地と混合して培養する工程である。具体的な方法は、測定対象とする試料，微生物によって異なり、実施の形態は特に限定されるものではない。微生物を選択的に増殖させる方法は、種々の方法が、文献，教科書等で開示されており、容易に入手可能である。例えば、測定対象とする微生物が細菌の場合は、特定の細菌を増殖させる液体培地が知られている。具体例としては、例えば、大腸菌を選択的に増殖させるためには、EC培地を用いて、44.5℃で培養する方法が、食品衛生検査指針に収載されている。大腸菌群を選択的に増殖させるためには、ＬＢ培地，BGLB培地などを用いて３７℃で培養する方法が知られている。腸炎ビブリオを選択的に増殖させるには食塩ポリミキシン培地で37℃で培養する方法が知られている。サルモネラを選択的に増殖させるには、ラパポート培地で37℃で培養する方法が知られている。上記の例はほんの一例に過ぎず、上記以外にも特定の細菌を選択的に増殖させる培地が数多く報告されており、本発明の実施形態は上記に記載した培地例に限定されるものではない。
【０００８】
培養に必要な時間は、測定対象とする細菌、培養条件によって異なるが、例えば、後述するように計数する工程としてフローサイトメータを使用する場合には、試料中の細菌濃度として102個/ml〜103個/ml以上が好適である。例えば、大腸菌を好適な培養条件で培養した場合、1個/mlの初期濃度の大腸菌を103個/ml以上の濃度まで増殖するには、約４〜５時間の培養時間が必要である。
【０００９】
本法では、細菌を直接検出して計数するために、従来法に比べ短時間の培養で細菌を検出する事ができる。理論的には１個から細菌を検出可能であるが、実用的なフローサイトメータでは数μl〜数百μlの試料を測定するために、前述のように試料中の細菌濃度として102個/ml〜103個/ml以上の濃度が好適である。
【００１０】
なお、測定対象試料が、食品試料等で固形物・半固形物の場合は、試料１容と生理食塩水等の溶液9容を混合し、ストマッカーで処理し、５０μm程度のフィルターで処理することが好適である。
【００１１】
増殖した微生物を計数する工程とは、前工程で増殖させた微生物を一個一個計数する工程であって、種々の粒子計測装置が利用可能である。使用する粒子計測装置は、約1〜20ミクロン程度の微粒子を計数できる粒子計測装置であれば特に限定されない。本発明に使用できる粒子計測装置としては、例えば、電気抵抗式粒子計測装置、フロー画像解析装置、フローサイトメータが好適に用いられる。試料が飲料水、清涼飲料水等で微生物以外の粒子成分を含まない場合は、電気抵抗式粒子計測装置が好適である。電気抵抗式粒子計測装置は、クールター原理として良く知られる測定原理を用いた粒子計測装置であり、例えば、シスメックス株式会社より販売されているSD-2000，CDA-500などの装置が好適に使用できる。これらの装置では、約１００μm程度のオリフィスの両サイドに電極を置き、微粒子がオリフィスを通過する際に生じる電気抵抗の変化を電気パルスとして検出し、微粒子を計数することができるまた、同時に微粒子の体積を正確に計測することが可能であり、体積の違いによって、微生物と微生物以外の粒子(以下デブリスと称する)を区別して計数することができる。一方、微生物とデブリスの体積が同じ場合は、電気抵抗式粒子計測装置で微生物のみを正確に計数することは困難である。この場合は、何らかの方法で、微生物とデブリスを区別して計数する必要がある。この場合には、シスメックス株式会社より発売されているFPIAシリーズなどのフロー式画像解析装置が好適に使用できる。この装置では、フローセルを流れる粒子画像を撮像し解析することにより、微粒子を計測することができる。本装置では、粒子画像を得ることができるため、微生物とデブリスを容易に弁別可能である。より好適にはフローサイトメータの使用が好適である。フローサイトメータとしては、ベックマン・クールター社より発売されているEPICSシリーズ，ベクトン・ディッキンソン社より発売されているFACSシリーズが良く知られている。本発明の実施はこれらの機種に限定されるものではなく、一般的に定義されているフローサイトメータであれば特に限定されるものではない。本発明のフローサイトメータとは、検出部を流れる粒子にレーザ等の光を照射し、粒子から発生する散乱光、蛍光等の光学的情報から粒子の大きさ、形態、あるいは、粒子が細胞の場合は、核酸量、蛋白量等の情報を計測する装置を言う。
【００１２】
フローサイトメータを用いる場合には、試料中の微生物をあらかじめ、微生物中の核酸（RNA,DNA）あるいは、蛋白、その他微生物の構成物質を特異的に染色する蛍光色素あるいは、蛍光色素を標識した抗体で染色することが好適である。特に核酸を染色する蛍光色素で染色することが好適である。染色に使用する染色液例としては、特開平9-104683，特開2001-258590に記載の試薬を用いた場合、１分以内に細菌を染色することができ、特に好適である。特にRNAを特異的に染色する蛍光色素を用いた場合には、増殖中の微生物は豊富なRNAを有し、強い蛍光を発することからデブリスと微生物の区別がより容易になるというメリットがある。さらに、RNA量は微生物の増殖活性を反映しており、蛍光強度は微生物の増殖活性の指標として使用することができる。染色液は基本的に蛍光色素と緩衝剤を含む水溶液であるが、染色性を改善するためあるいは微粒子の分散を改善するために界面活性剤等の添加物を含んでも良い。また、蛍光色素の安定性が悪い場合には，色素をエチレングリコール等の溶液で保存し、使用時に希釈液と混合して使用することが好適である。
【００１３】
増殖後の微生物数から初期微生物数を推定する工程とは、測定対象とする初期濃度既知の特定微生物を、「測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程」で増殖した後に、「増殖した微生物を計数する工程」で増殖後の微生物濃度を計数し、図１に示す、初期濃度−増殖後濃度の関係をプロットし得られた回帰直線式等を検量線として、初期濃度未知の試料を増殖した後の増殖後濃度から初期濃度を算出する工程を言う。
【００１４】
本発明の実施例を以下に示す。本発明の実施形態は以下の実施例に限定されるものでは無い。
【００１５】
【実施例】
初期濃度100,101,102,103,104個/mlとなるよう大腸菌をEC培地（日水製薬）に添加し、４時間44.5℃で培養し、大腸菌数を計数した。初期細菌濃度と4時間培養後の細菌数をプロットし、4時間培養後の細菌数から初期細菌濃度を推定するための検量線を作成した（図１）。
【００１６】
大腸菌数の測定は以下の方法を用いた。
▲１▼測定試料調製
一定時間培養後の大腸菌試料50μlに希釈液340μlを添加して希釈後、染色液10μlを添加し、42℃で20秒間インキュベートし測定用試料を調製した。希釈液,染色液の組成は、以下の組成を使用した。
【００１７】
（希釈液）
クエン酸二水塩 21.6ｇ/l
ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド 1g/l
精製水 1.0 l
NaOHでpH2.5に調製した
【００１８】
（染色液）
下記の構造を有する色素 50mg
【００１９】
【化１】
【００２０】
▲２▼細菌数測定
633nmの赤色半導体レーザを光源とするフローサイトメータを用いて、▲１▼で作成した試料を測定し、前方散乱光と赤色蛍光(650nm以上)を測定し、前方散乱光-赤色蛍光のスキャッタグラム（図２）を作成し、細菌領域内の粒子を細菌として計数し細菌濃度を求めた。
【００２１】
試料測定例
食品試料１（レタス），食品試料２（鶏ささみ肉）25gを生理食塩水225mlとともにストマック処理したのち、約50μmのフィルターで濾過した試料１ｍｌとEC培地10ｍｌを混合し44.5℃で４時間培養したのち、上記の方法で細菌濃度を計測した。図３に試料１の測定例を示す。
【００２２】
４時間培養後の計測値から図１の検量線を用いて初期細菌濃度を推定した。
【００２３】
対照の測定法として、XM-G寒天培地（日水製薬製）を用いた混釈法で大腸菌濃度を求めた。コロニーの計数は培養２４時間後に行った。
【００２４】
表１に示すように本法と対照法の測定結果は良く一致しており、本法を用いて短時間で細菌濃度が計数可能であることが確認できた。
【００２５】
【表１】
【発明の効果】
本発明によれば、短時間で特定微生物の初期濃度を計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌をEC培地で４時間培養した場合の初期濃度と４時間培養後細菌濃度のプロットして求めた検量線である。
【図２】初期濃度103/ml試料の4時間培養後のスキャッタグラムである。
【図３】試料１の4時間培養後のスキャッタグラムである。
Claims (4)
- １）測定対象の微生物を選択的に増殖させる工程、
２）増殖した微生物を計数する工程、および
３）初期濃度既知の前記微生物を、培養培地、培養温度および増殖時間が前記工程１）と同じ条件で増殖培養して測定された増殖培養後濃度と前記初期濃度の関係に基づき作成された検量線を用いて、増殖後の微生物数から、初期微生物数を推定する工程
からなる微生物計測方法。 - 測定対象の微生物が細菌であり、選択的に増殖させる工程が、細菌を選択的に増殖させる培地で培養する工程である請求項１の微生物計測方法。
- 微生物を計数する工程が、フローサイトメータ、フロー式画像解析装置、電気抵抗式粒子計数分析装置からなる群から選ばれた少なくともひとつの装置で微生物を計数する工程である、請求項１の微生物計測方法。
- 微生物を計数する工程が、計数の前に増殖した微生物を含む資料を核酸特異性のある蛍光色素で染色する工程を含むフローサイトメータで微生物を計数する工程である請求項３の微生物計測方法。
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004089039A JP2004089039A (ja) | 2004-03-25 |
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| JP5843095B2 (ja) * | 2010-07-02 | 2016-01-13 | 株式会社明治 | 大腸菌群の検出方法 |
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2002
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