DE69834319T2

DE69834319T2 - Methode zur selektiven bestimmung der biomasse von pilzen

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Publication number: DE69834319T2
Application number: DE69834319T
Authority: DE
Inventors: Aps Mycometer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2018-01-31
Also published as: WO1998033934A1; NO323988B1; CA2279378C; NO993755L; EP0973937B1; ATE324463T1; US6372446B1; CA2279378A1; DE69834319D1; AU5749098A; EP0973937A1; NO993755D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Bestimmung von pilzlicher Biomasse in einer Vielfalt von Proben einschließlich Umweltproben, Lebensmittelprodukten, Pflanzenmaterialien, Baumaterialien, menschlichen und tierischen Körperproben und industriellen Pilzkulturen.
TECHNISCHER HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
Pilzspezies werden bei der Fermentierung von Lebensmitteln und zur Herstellung von gewünschten Genprodukten wie Enzymen und Antibiotika verwendet. Pilze können auch das Verderben von Lebensmitteln und landwirtschaftlichen Produkten und das Verrotten von Baumaterialien verursachen und für Säuger einschließlich Menschen pathogen sein.
Derzeit verwendete Verfahren zum Nachweis von pilzlicher Biomasse umfassen die Extraktion von pilzspezifischen Zellkomponenten wie Ergosterol (Grant and West, 1986) und Phospholipid-Fettsäuren (PLFA) (Frostegård et al., 1993), selektive Färbung von Zellorganellen (Kropp, 1990, US 5,445,946 ), Nachweis von Pilzstoffwechselprodukten, die in Zellextrakten vorhanden sind, durch Fluoreszenz ( SU 1,744,114 ; JP 7,095,898 ), und dem immunologischen Nachweis von strukturellen Komponenten der pilzlichen Zellwand ( US 5,004,699 ).
Ein Verfahren zum Nachweis einer spezialisierten Mycoflora im Boden wurde von Rodriguez-Kabana et al., 1983, beschrieben. Das Verfahren basiert auf dem Prinzip des Messens von Chitinaseaktivität durch Zugabe von Chitin zum Boden und des Korrelierens der Aktivität mit der pilzlichen Population im Boden.
All diese Verfahren bringen jedoch mehrere Nachteile mit sich, insbesondere auf Grund der komplizierten Probenvorbereitungen, einschließlich des Aufbrechens von Zellen und Hyphen und der Isolierung von Zellkomponenten. Außerdem beinhalten die Verfahren im Allgemeinen ausgedehnte Testzeiten und sind außerdem zeit- und arbeitsaufwendig und erfordern spezialisierte technische Fertigkeiten.
Daher besteht Bedarf an einem verbesserten, einfachen und schnellen Verfahren zum selektiven Nachweis pilzlicher Biomasse, das ohne die vorstehenden Nachteile durchgeführt werden kann.
Es ist nun gefunden worden, dass eine reproduzierbare Korrelation zwischen β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivitäten (EC 3.2.1.52) und der Menge an pilzlicher Biomasse und/oder der Menge an pilzlichen Zellkomponenten besteht. Diese Entdeckung führte zur Entwicklung eines neuen Verfahrens zum Nachweis von pilzlicher Biomasse, das den vorstehenden Bedarf an einem verbesserten Verfahren nachkommt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demnach bezieht sich die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform auf ein Verfahren zum selektiven Nachweis einer pilzlichen Biomasse in einer Probe, umfassend die Schritte: (i) Nachweis der Menge, Anwesenheit oder Aktivität von β-N-Acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) in der Probe, und (ii) Korrelieren der Menge, Anwesenheit oder Aktivität von β-N-Acetylhexosaminidase mit mindestens einem pilzlichen Biomasse-Parameter, welcher in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis unter Bedingungen durchgeführt wird, unter denen β-N-Acetylhexosaminidase von nicht-pilzlichem Ursprung, falls vorhanden, nicht nachgewiesen werden kann.
Nach einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf ein Produkt zum Nachweis von pilzlicher Biomasse in einer Probe, umfassend (i) einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Substratmolekül, umfassend eine nachweisbare Einheit, welche von dem Substratmolekül in Anwesenheit von β-N-Acetylhexosaminidase freisetzbar ist, einer immunologisch aktiven Verbindung und einer Nucleotidsequenz, und (ii) ein Mittel zum Nachweis eines Signals, welches aus der Reaktion zwischen dem Wirkstoff und der β-N-Acetylhexosaminidase resultiert.
GENAUE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt, wie vorstehend erwähnt, ein Verfahren zum selektiven Nachweis einer pilzlichen Biomasse in einer Probe bereit, umfassend das Nachweisen der Menge, Anwesenheit oder Aktivität von β-N-Acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52), welche ein Enzym ist, das in im Wesentlichen allen Pilzspezies vorhanden ist und deren Menge, Anwesenheit oder Aktivität mit der Menge an pilzlicher Biomasse, die in der Probe vorhanden ist, korreliert ist. (Die vorstehende EC-Nummer bezieht sich auf die Enzymdatenbank, Ausgabe 21.0/Oktober 1996).
Wie er hier verwendet wird, besagt der Ausdruck "selektiver Nachweis", dass, wenn eine Probe gemäß der Erfindung getestet wird, die Testbedingungen so ausgewählt werden, dass jeglicher Nachweis von nicht-pilzlichen β-N-Acetylhexosaminidasen oder enzymatischen Aktivitäten, die ansonsten ein selektives Testen auf pilzliche Enzyme stören könnten, ausgeschlossen ist.
Im vorliegenden Kontext bezieht sich der Ausdruck "pilzliche Biomasse" auf alle Zellkomponenten von Pilzspezies, wie sie in Henderson's Dictionary of Biological Terms, 10. Auflage, Longman Scientific & Technical, 1990, definiert sind. Somit beinhaltet die pilzliche Biomasse, wie sie hier verwendet wird, einzelne Zellen, Myzelien, Thalli, Hyphen und Sporen der im vorstehenden Referenzbuch erwähnten Pilzspezies. Pilzspezies, wie sie hier definiert sind, beinhalten Spezies, die zu den Unterabteilungen Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina und Deuteromycotina gehören.
In einer Ausführungsform basiert das Verfahren der Erfindung auf dem Nachweis der Aktivität von mindestens einer pilzlichen β-N-Acetylhexosaminidase in einer zu testenden Probe durch Inkontaktbringen der Probe mit einem Substratmolekül, das eine nachweisbare Einheit umfasst, die von dem Substratmolekül in Gegenwart von pilzlicher β-N-Acetylhexosaminidase freisetzbar ist, gefolgt vom Nachweis der freigesetzten Einheit.
Somit kann ein Test zum Nachweis von pilzlicher β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität auf der spezifischen Spaltung eines Substratmoleküls in eine oder mehrere leicht nachweisbare Einheiten basieren. Fluorogene Einheiten können mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden, und die Verwendung von Substratmolekülen, die durch Fluoreszenz nachweisbare Einheiten umfassen, bei herkömmlichen Tests auf enzymatische Aktivitäten ist gut charakterisiert und kann gemäß der Erfindung eingesetzt werden. Als Beispiel hat die hohe Empfindlichkeit des Nachweises von fluorogenen Einheiten die Entwicklung von Tests zum Nachweis zum Beispiel von Chitinase, die durch bakterielle Spezies erzeugt wird (McCreath and Gooday, 1992), und β-Glucanase-Aktivitäten in Pilzspezies, einschließlich Hefe (Claeyssens et al., 1989), erleichtert.
Es ist ein bedeutender Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass eine große Vielfalt von Pilzspezies, wenn sie auf ihre Fähigkeit getestet werden, Substrate, die mit fluorogenen Einheiten markiert sind, enzymatisch zu spalten, β-N-Acetylhexosaminidase erzeugt, die durch Fluoreszenz nachweisbare Einheiten freisetzt, deren Menge mit der Menge von Ergosterin und pilzbezogenen Phospholipid-Fettsäuren (PLFA) korreliert ist, deren Vorliegen derzeit bei der Bestimmung einer pilzlichen Biomasse verwendet wird.
Überraschenderweise ist die Menge der freigesetzten, durch Fluoreszenz nachweisbaren Einheiten unmittelbar mit der Biomasse der getesteten Pilzspezies korreliert, die die vorstehende β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität erzeugt. Diese Korrelation zeigt eine konstitutive Expression von β-N-Acetylhexosaminidase an.
Das Verfahren umfasst einen weiteren Schritt der Korrelierung der Aktivität, Anwesenheit oder Menge von β-N-Acetylhexosaminidase mit einem pilzlichen Biomasse-Parameter der pilzlichen Biomasse wie zum Beispiel der Menge an pilzlicher Biomasse, die in der Probe vorhanden ist, wie sie durch direkte Messung des Gewichts der pilzlichen Biomasse bestimmt wird. Der pilzliche Biomasse-Parameter kann auch ein Stoffwechselprodukt, eine zusätzliche enzymatische Aktivität oder ein Indikator für den physiologischen Zustand der pilzlichen Biomasse sein. In diesem Zusammenhang umfassen geeignete pilzliche Stoffwechselprodukte Fettsäuren, Polysaccharide und Teile davon, Polyketide, Steroide, Shikimisäuren, Alkaloide, ein Pigment, das von einer Pilzspezies natürlich erzeugt wird, wie zum Beispiel Astaxanthin, Carotenoide, Riboflavine, Terpenoide und Derivate davon, Antibiotika wie z. B. Penicilline.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ist eine nachweisbare Einheit, die von einem Substrat für die β-N-Acetylhexosaminidase freigesetzt wird, mit der Menge an pilzlicher Biomasse korreliert, die in der Probe vorhanden ist, wie sie direkt durch Messen des Gewichts der pilzlichen Biomasse bestimmt wird. Vorzugsweise ist das Gewicht das Trockengewicht der pilzlichen Biomasse. Nach Erstellen einer derartigen Korrelation in Form zum Beispiel einer Standardkurve kann das Verfahren verwendet werden, um weitere geeignete Standardkurven zu erstellen, die z. B. unter geeigneten experimentellen und/oder industriell relevanten Bedingungen die Beziehung zwischen der Menge der freigesetzten Einheit und der Menge der pilzlichen Biomasse veranschaulichen. Standardkurven können für eine Reihe von experimentellen und/oder industriell relevanten Bedingungen erzeugt werden, um einen Satz von physiologischen Parametern zur Verfügung zu stellen, die mit dem physiologischen Zustand einer Pilzspezies unter einer Vielfalt von Bedingungen assoziiert sind. Derartige Parameter umfassen Wachstumsrate, Wachstumsphase, Temperatur, pH-Wert, Sauerstoffgehalt, Zusammensetzung des Wachstumsmediums, einschließlich Anwesenheit/Abwesenheit von vorzugsweise metabolisierbaren Nährstoffen, osmotische Stärke und die Anwesenheit oder Abwesenheit von wesentlichen Zellbestandteilen oder Vorläufern dafür.
Der Indikator für den physiologischen Zustand der pilzlichen Biomasse ist auch so zu verstehen, dass er die Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten Stoffwechselprodukten oder Polypeptiden einschließt, die i) in bestimmten Wachstumsphasen, ii) als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen oder iii) als Reaktion auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von zellulären oder chemischen Komponenten erzeugt werden.
Die Korrelation zwischen der freigesetzten nachweisbaren Einheit und einem Indikator für den physiologischen Zustand der pilzlichen Biomasse kann auch angewandt werden, um ein verläßliches Verfahren zum Bewerten der "physiologischen Eignung und Anpassbarkeit" einer pilzlichen Biomasse zu erstellen. Dies ist insbesondere wichtig beim Nachweis einer pilzlichen Biomasse, die gentechnisch hergestellt, selektiert oder anderweitig für einen besonderen Zweck verbessert wurde, normalerweise für eine erhöhte Produktion eines Stoffwechselprodukts, eines Antibiotikums oder eines gewünschten Genproduktes. Somit kann die Herstellung von homologen und/oder heterologen Polypeptiden in großen Mengen zur Fehlfaltung des hergestellten Polypeptids und/oder zur Überladung der zellulären Transport- oder Sekretionseinrichtung führen. Diese unerwünschten Phänomene neigen dazu, eine Stressreaktion zu induzieren, die, wenn sie in einem "semi-permanenten Zustand" vorhanden ist, dazu neigt, die Produktionsausbeute zu verringern.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren kann eine nachweisbare Einheit, die durch die β-N-Acetylhexosaminidase freigesetzt wird, durch jedes spektroskopische Verfahren nachgewiesen werden. Somit umfassen geeignete spektroskopische Verfahren Verfahren zum Bestimmen einer selektiven Absorption von elektromagnetischer Strahlung durch Substratmoleküle und Einheiten, die daraus freigesetzt werden, wie Fluorometrie, wobei die von der freigesetzten Einheit ausgestrahlte Fluoreszenz bestimmt wird. Ein selektiver Nachweis einer freigesetzten und durch Fluoreszenz nachweisbaren Einheit kann auch unter Verwendung eines Filters erreicht werden, das Licht von allen, außer den gewünschten, vorbestimmten Wellenlängen absorbiert, welche durch das Filter gehen, bevor sie nachgewiesen werden.
Wenn es gewünscht ist, mehr als eine Substrateinheit nachzuweisen, sollten die verschiedenen Einheiten Fluoreszenz ausstrahlen, die bei verschiedenen Wellenlängen und/oder durch Verwendung von geeigneten Filtern, wie vorstehend beschrieben, nachgewiesen wird.
Alternative Verfahren zum Nachweis von selektiver Absorption von elektromagnetischer Strahlung umfassen Ultraviolett-Spektroskopie, Infrarot-Spektroskopie, magnetische Kernresonanz(NMR)- Spektroskopie, einschließlich gepulste Fourier-Transformations-NMR, Massen-Spektrometrie, Röntgenbeugung, Mikrowellenabsorption, Elektronenspinresonanz, optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus.
Ultraviolett-Spektroskopie wird verwendet, um konjugierte Systeme nachzuweisen, da die Promotion von Elektronen derartiger Systeme vom Grundzustand in den Anregungszustand eine Absorption in diesem Bereich des Spektrums bewirkt. Infrarot-Spektroskopie wird verwendet, um die Schwingungen von Molekülen und insbesondere die charakteristischen Schwingungen der Doppel- und Dreifachbindungen nachzuweisen und zu identifizieren, die in vielen funktionellen Gruppen vorhanden sind.
Bei der magnetischen Kernresonanzspektroskopie wird eine längere Wellenlänge des elektromagnetischen Spektrums verwendet, um Änderungen der Ausrichtung von Kernmagneten in starken Magnetfeldern nachzuweisen. Die genaue Frequenz der Absorption ist ein sehr empfindliches Maß der magnetischen und damit der chemischen Umgebung derartiger Kerne. Außerdem beeinflussen die Anzahl und die Anordnung von benachbarten Magnetkernen das Erscheinen dieser Absorption auf eine gut definierte Weise. Daraus ergeben sich beträchtliche Informationen über die Anordnung von funktionellen Gruppen und Kohlenwasserstoffrückständen z. B. in einer Einheit, die ein Teil des Substratmoleküls ist oder von diesem freigesetzt wurde.
Die Massenspektrometrie misst das Masse-Ladung-Verhältnis von Substrateinheiten, die durch Elektronenbeschuss geladen wurden. Strukturelle Informationen ergeben sich aus der mäßig vorhersagbaren Zersplitterung von Substratmolekülen, einschließlich einer Korrelation von geladenen Einheiten mit ähnlichen Strukturen. Die Röntgenbeugung kann verwendet werden, um Zentren hoher Elektronendichte zu identifizieren, wie zum Beispiel Atome. Mikrowellenabsorption wird verwendet, um Molekülrotationen von Substrateinheiten zu messen.
Die Elektronenspinresonanz weist ungepaarte Elektronen nach und kann verwendet werden, um die Verteilung von Elektronendichten in Substrateinheiten wie z. B. freigesetzten Radikalen zu messen. Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus verwenden sichtbares und ultraviolettes Licht zum Bestimmen der Korrelation von Änderungen der Rotationsenergie von Substrateinheiten mit Änderungen von polarisiertem Licht; derartige Messungen können oft mit der absoluten Konfiguration von Molekülen in Beziehung gesetzt werden.
Somit versteht sich, dass Einheiten durch Anwendung von Ergebnissen "selektiv" nachweisbar sind, die durch eines oder mehrere der vorstehend erwähnten Verfahren erhältlich sind, wie z. B. UV-Maxima, IR-Frequenzen, chemische NMR-Verschiebungen und Kopplungskonstanten und übliche Massenfragmente, die sich in Massenspektren finden.
Das Verfahren der Erfindung eignet sich zum Nachweis von pilzlicher Biomasse, einschließlich Spezies, die zu Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina und Deuteromycotina oder einem Gemisch von diesen gehören. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung den Nachweis von pilzlicher Biomasse, die lebendige Propagationseinheiten in Form von Myzelien, Konidien, Sporen und einzelnen Zellen wie Hefe umfasst. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die pilzliche Biomasse in der getesteten Probe lebensfähige pilzliche Biomasse und/oder nicht lebensfähige pilzliche Biomasse.
Das Verfahren kann verwendet werden, um pilzliche Biomasse in geringen Mengen nachzuweisen, wie einer Menge, die höchstens 1 μg, vorzugsweise höchstens 0,1 μg, mehr bevorzugt höchstens 0,01 μg und am meisten bevorzugt höchstens 0,001 μg beträgt und nachweisbar ist.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den weiteren Schritt der Vorinkubation der Probe in einem geeigneten Medium, das das Wachstum von pilzlicher Biomasse unterstützt, bevor die Anwesenheit von dieser tatsächlich getestet wird. Das Ziel der Vorinkubation besteht darin, es jeglicher pilzlicher Biomasse zu ermöglichen, sich zu vermehren und somit zu einer erhöhten Empfindlichkeit des Testverfahrens, das hier nachstehend beschrieben ist, beizutragen. Die Vorinkubation kann die Zugabe einer Verbindung, die die nicht-pilzliche biologische Aktivität hemmt, zu einem geeigneten Wachstumsmedium einschließen. Verbindungen, die zum Hemmen von nicht-pilzlichen biologischen Aktivitäten nützlich sind, schließen Antibiotika wie z. B. Chloramphenicol und/oder Streptomycin, Bakteriocine und Chemikalien mit selektiven, das Wachstum hemmenden Wirkungen auf Bakterien wie z. B. Sulfite oder Metallionen ein. Die Länge der Vorinkubationszeit hängt von der Menge pilzlicher Biomasse und der Menge nicht-pilzlicher Biomasse, die in der Probe vorhanden ist, ab.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren kann eine Probe mehrmals unter Bedingungen vorinkubiert werden, die selektiv das Wachstum von pilzlicher Biomasse oder nicht-pilzlicher Biomasse unterdrücken. Derartige Vorinkubationen können einer Reihe von Testverfahren vorausgehen, wobei i) die gesamte Biomasse quantitativ bestimmt wird (d.h. keine Wachstumsunterdrückung), ii) pilzliche Biomasse quantitativ bestimmt wird (d.h. Unterdrückung des Wachstums von nicht-pilzlicher Biomasse), und iii) nicht-pilzliche Biomasse quantitativ bestimmt wird (d.h. Unterdrückung des Wachstums von pilzlicher Biomasse).
Das vorliegende Verfahren kann die Zugabe einer Induktorsubstanz einschließen, die in der Lage ist, die β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität zu induzieren oder zu steigern. Der Induktor kann i) während der Vorinkubationszeit, wie vorstehend erwähnt, ii) unmittelbar vor dem Testverfahren, oder iii) in geeigneten Zeitabständen während des Testverfahrens zugegeben werden. Wenn es bevorzugt wird, die Anwesenheit von nicht-pilzlicher Biomasse zu bestimmen, kann eine Induktorsubstanz, die in der Lage ist, die nicht-pilzliche β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität zu induzieren oder zu steigern, zugegeben werden.
Nützliche Induktoren umfassen Monomere und/oder Oligomere wie z. B. Dimere und Trimere von Substanzen, die Polysaccharide bilden, wie z.B. Cellulose, Hemicellulose, Amylose, Amylopectin, Chitin, Mannan, Xanthan, Xylan, Arabinan und Galactan. Besonders nützliche Induktoren sind Glucosamine wie z.B. N-Acetylglucosamin und Amino-substituierte Derivate davon.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung nach dem Testverfahren einen weiteren Schritt der Inkubation der Probe in einem geeigneten selektiven Medium, das das Wachstum nur von i) pilzlicher Biomasse oder ii) nicht-pilzlicher Biomasse erlaubt. Das Wachstum von nicht-pilzlicher Biomasse wie z. B. Bakterien kann somit zur Bestimmung von bakteriellen Spezies führen, die in der Probe enthalten sind, indem Techniken des Stands der Technik verwendet werden. Ähnlich kann die pilzliche Biomasse, die in der Probe enthalten ist, ferner durch Wachstum auf selektiven Medien differenziert oder identifiziert werden, die z. B. durch eine geeignete Kohlenstoffquelle ergänzt sind, die das Wachstum und/oder die Entwicklung von Phänotypeigenschaften von einer oder mehreren Pilzspezies, die z. B. zu Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina oder Deuteromycotina gehören, unterstützt.
Beim Nachweis von β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität gemäß der Erfindung sind nützliche Substratmoleküle, die durch Fluoreszenz und/oder chromogen nachweisbare Einheiten umfassen, besonders bevorzugt, wie Substratmoleküle, einschließlich einer fluorogenen und/oder chromogenen Einheit wie einer 4-Methylumbelliferoneinheit oder Derivaten davon, z. B. 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (4-MU-GlcNAc). Es ist gefunden worden, dass im Wesentlichen alle Pilzspezies in der Lage sind, dieses Substrat konstitutiv zu spalten, während keine einer Reihe von getesteten Bakterien diese Fähigkeit aufwies.
Alternative Substratmoleküle umfassen 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-2-acetamid-2-desoxy-β-D-gluco-pyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, Indolyl-2-acetamid-2-desoxy-β-D-gluco-pyranosid, 4-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, β-Trifluormethylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, N-Methylum-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, 5-Iod-3-indolyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N',N''-triacetylchitotriose, 4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N'-diacetylchitobiosid, 4-Methylumbelliferyl-7-(6-sulfo-2-acetamid-2-desoxy)-β-D-glucosaminid, 4-Methylumbelliferyl-7-(6-sulfo-2-acetamid-2-desoxy-β-D-glucopyronosid), 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, 4-Methylumbelliferyl-N-acetylgalactosaminid, Resorufin-N-acetyl-β-D-glucosaminid, 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminid und DDAO (9H-(1,3-Dichlor-9,9- dimethylacridin-2-on-7-yl)N-acetyl-β-D-glucosaminid) und alle N-actyl-β-D-glucosaminidoligomerderivate von DDAO.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die freigesetzte fluorometrisch und/oder chromogen nachweisbare Einheit in einer Menge von höchstens 100 Picomol, vorzugsweise höchstens 50 Picomol, mehr bevorzugt höchstens 20 Picomol, noch mehr bevorzugt höchstens 10 Picomol nachweisbar, und am meisten bevorzugt ist die freigesetzte Einheit in einer Menge von höchstens 1 Picomol nachweisbar.
Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung einen fluorometrischen und/oder chromogenen Nachweis der freigesetzten Einheit betreffen, schließt das Verfahren eine Ausführungsform ein, wobei die freigesetzte Einheit sichtbar nachweisbar ist, z. B. durch Lumineszenz ohne weitere Quantifizierung oder Datenverarbeitung.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, das den weiteren Schritt der Verwendung von mindestens einem zusätzlichen Substratmolekül umfasst, das eine freisetzbare Einheit umfasst, die nachweisbar ist. Diese Einheit kann entweder durch eine pilzliche enzymatische Aktivität, eine allgemeine mikrobielle enzymatische Aktivität oder eine nicht-pilzliche enzymatische Aktivität freigesetzt werden.
Die nachweisbare Einheit, die in dem zusätzlichen Substratmolekül enthalten ist, kann somit dazu dienen, zwischen i) einer oder mehreren Pilzspezies, die in der Probe enthalten sind, ii) mikrobieller Biomasse, die in der Probe enthalten ist, und iii) nicht-pilzlicher Biomasse, die in der Probe enthalten ist, zu differenzieren oder deren Identifizierung weiter zu erleichtern.
Die Verwendung des Verfahrens nach dieser besonderen Ausführungsform würde somit einen selektiven Nachweis von mikrobieller Biomasse, pilzlicher Biomasse bzw. nicht-pilzlicher Biomasse in der betreffenden Probe ermöglichen. Dies ist besonders relevant, wenn die zu testende Probe von einer Umgebung erhalten wird, die auch das Wachstum von z. B. nicht-pilzlicher Biomasse erlaubt.
Gemäß der Erfindung beträgt die Zeitdauer des Inkontaktbringens der Probe mit dem Substratmolekül höchstens 24 Stunden, vorzugsweise höchstens 6 Stunden wie höchstens 3 Stunden, mehr bevorzugt höchstens 30 Minuten, noch mehr bevorzugt höchstens 10 Minuten wie höchstens 1 Minute, und am meisten bevorzugt beträgt die Zeit des Inkontaktbringens der Probe mit dem Substratmolekül höchstens 30 Sekunden. Die Proben können in Mikrotiterplatten getestet werden.
Das Verfahren der Erfindung kann das Entnehmen von Proben und/oder den Nachweis der freigesetzten Einheit zu geeigneten Zeitpunkten über einen geeigneten Zeitabstand einschließen. Es wird auch ein Verfahren gemäß der Erfindung bereitgestellt, wobei die freigesetzte Einheit kontinuierlich zum Beispiel durch online-Analyse nachgewiesen wird. Das Substratmolekül kann anfangs einmal zugegeben werden und verbleiben, während Proben über die gewünschte Zeitdauer entnommen werden. In einer anderen Ausführungsform wird das Substratmolekül in einer geeigneten Menge zu jedem Zeitpunkt unmittelbar vor dem Nachweis der freigesetzten Einheit zugegeben. Wenn ein quantitativer Nachweis der freigesetzten Einheit gewünscht ist, muss das Substratmolekül in einer Konzentration vorliegen, die eine "Sättigung" darstellt. Dies kann auch unter Verwendung von Konzentrationen unterhalb der Sättigung erfolgen, wenn nur 10-20% der Substratmoleküle gespalten sind, vorzugsweise bei einer konstanten "Umsatz" Rate, um die nachweisbare Einheit mit einer konstanten Rate über einen geeigneten Zeitabstand freizusetzen.
Der weite Anwendungsbereich, der auf dem vorliegenden Verfahren basiert, wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass die Probe entweder in einem flüssigen oder in einem festen Medium mit einem Substratmolekül in Kontakt gebracht werden kann. Somit können sowohl pilzliche als auch bakterielle Spezies nach β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität durchmustert werden, indem ein geeignetes festes Medium verwendet wird, wie z. B. Bodenextraktagar (BEA)-Medium, ergänzt mit 4-MU-GlcNAc. Das Durchmusterungs-Medium kann auch mit Substanzen ergänzt werden, die mögliche, induzierende Wirkungen haben, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben wird.
Das Inkontaktbringen einer Probe mit dem Substratmolekül kann auch zu einem "in-situ-Nachweis" einer pilzlichen Biomasse führen. Wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein "in-situ-Nachweis" die Bestimmung der pilzlichen Biomasse an ihrem Wachstumsort wie z. B. einem natürlichen Lebensraum. Es wird auch ein Verfahren zur Bestimmung von pilzlicher Biomasse bereitgestellt, die unter den äußeren Oberflächen der Probe vorhanden ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Probe eine Umweltprobe aus Boden, Wasser oder Luft. Die Probe kann auch von einem Bauelement erhalten oder hergeleitet sein oder eine Probe von Holz sein. In einer besonderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweisen von Tuberaceae- und/oder Cantharellus-Biomasse in einer vom Boden entnommenen Probe bereitgestellt. Verfahren des Stands der Technik, die derzeit zum Bestimmen von Tuberaceae-Biomasse erhältlich sind, erfordern, außer dass sie zeit- und arbeitsaufwendig sind, die Verwendung von Versuchstieren wie z. B. Schweinen.
Gemäß der Erfindung können fermentierte Produkte für den Verbrauch durch Menschen oder Tiere, Ackerfrüchte oder ein Teil davon, eine Pflanze oder ein Teil davon, ein Gemüse und eine Frucht auf die Anwesenheit von pilzlicher Biomasse getestet werden. Das Testen von Körnern, Samen oder Nüssen auf die Anwesenheit von pilzlicher Biomasse ist eine besonders nützliche Anwendung.
Bei anderen Anwendungen wird eine Probe von Ackerfrüchten, einer Pflanze, eines Gemüses oder einer Frucht getestet und die Ergebnisse können im Zusammenhang mit der Überwachung und Kontrolle der Verteilung und Wirksamkeit von Fungiziden bewertet werden. Geerntete Produkte werden insbesondere während der Lagerung getestet, um das Maß der pilzlichen Kontaminierung zu bewerten. Die geernteten Produkte können getestet werden, indem eine Probe davon unmittelbar mit dem Substrat, wie vorstehend beschrieben, in Kontakt gebracht wird oder indem zunächst ein geeigneter Extrakt von dem geernteten, zu testenden Produkt hergestellt wird.
Das Verfahren ist zum Testen eines Lebensmittelproduktes, z. B. eines mit Wärme behandelten Produktes, einer Lebensmittelkomponente, eines Futterproduktes und einer Futterkomponente geeignet. Das Testen von Gewürzen, Tee, Kakao oder Kaffee ist auch eine nützliche Anwendung.
Die Verwendung der bereitgestellten Verfahren zum quantitativen Nachweis von pilzlicher Biomasse ergibt verlässliche Ergebnisse auf empfindliche Weise. Die erhaltenen Ergebnisse können verwendet werden, um das Einhalten allgemeiner Gesundheits- und/oder Sicherheitsrichtlinien zu bewerten. In manchen Fällen können derartige Ergebnisse auf Grundlage eines nicht quantitativen Nachweises von pilzlicher Biomasse erzeugt werden.
Als ein Beispiel für die Verwendung des Verfahrens zum Bewerten des Einhaltens von allgemeinen Gesundheits- und/oder Sicherheitsrichtlinien können die ökologischen und/oder toxikologischen Wirkungen z. B. von Chemikalien, einschließlich organischer Verbindungen mit vermutlich unerwünschten Wirkungen auf eine Umgebung, eingeschätzt werden. Derartige Chemikalien werden selektiven Proben z. B. von Boden, der eine pilzliche Biomasse enthält, zugegeben, und die Wirkung der Chemikalie auf das Wachstum der pilzlichen Spezies wird bestimmt. In einer besonderen Ausführungsform von Interesse wird die Diffusion von Fungiziden in eine Bodenprobe, die mit pilzlicher Biomasse ergänzt wurde, hinsichtlich der Überwachung des Überlebens der pilzlichen Biomasse bewertet. Dieses Überleben kann mit herkömmlichen Pilzindikatoren korreliert werden, wie z. B. Ergosterol und PLFA.
In einer besonderen Anwendung des Verfahrens umfasst die Probe eine pilzliche Biomasse, die bei der Herstellung eines gewünschten Produktes in Form eines Peptids wie eines Polypeptids, eines Enzyms, eines Epitops, eines Hormons, eines antiviralen Proteins, eines Antitumor-Proteins und eines Wachstumsfaktors verwendet wird. Die pilzliche Biomasse kann auch bei der Herstellung eines gewünschten Stoffwechselprodukts oder einer Zellkomponente verwendet werden. Die vorstehende pilzliche Biomasse kann mindestens eine rekombinante Pilzspezies oder eine Spezies umfassen, die ein Gen und/oder Expressionssignale umfasst, die mit den Pilzspezies nicht natürlich assoziiert sind. Der Begriff "rekombinant" bezieht sich auf jede Form von Gentechnik, die verwendet wird, um die rekombinanten Spezies herzustellen. Die pilzliche Biomasse kann auch eine sein, bei der die Produktion eines Polypeptids, eines Stoffwechselprodukts und/oder einer Zellkomponente reduziert oder eliminiert wurde, wobei die Reduktion und/oder Eliminierung durch herkömmliche Durchmusterungs-Techniken oder durch Techniken mit rekombinanter Genetik und/oder Gentechnik erreicht werden.
In einer möglichen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Mittel zum Nachweis der freigesetzten Einheit z. B. durch ein Fluorometer bereitgestellt. Demnach betrifft die Erfindung auch eine Einrichtung zum fluorometrischen und/oder chromogenen Nachweis von freigesetzten und nachweisbaren Einheiten, die in dem vorstehend beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Die Einrichtung ist geeigneterweise eine tragbare Einrichtung, die für "Plattform-" oder Feldversuche verwendet werden kann.
Bei noch einer weiteren möglichen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen einer mikrobiellen Biomasse durch Nachweis von β-N-Acetylhexosaminidase- Aktivität, die in der Biomasse vorhanden ist, bereitgestellt. Insbesondere wird ein mutmaßliches Verfahren bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Substratmolekül, welches eine nachweisbare Einheit umfasst, die von dem Substratmolekül in Anwesenheit einer selektiv nachweisbaren, mikrobiellen, enzymatischen Aktivität freisetzbar ist, und (ii) Nachweis der freigesetzten Einheit.
Eine weitere Anwendung von Interesse des vorliegenden Verfahrens ist der Nachweis von Pilzinfektionen in Menschen und Tieren. Es ist somit gefunden worden, dass das Verfahren den Nachweis von pilzlich hergeleiteter β-N-Acetylhexosaminidase, die in menschlichen Plasmaproben vorhanden ist, erlaubt. Es wurde jedoch auch entdeckt, dass menschliche Plasmaproben eine inhärente Hexosaminidase-Aktivität aufweisen, die z. B. durch Fällung mit Ammoniumsulfat aus dem Plasma entfernt werden könnte. Eine derartige Vorbehandlung beeinflusste nicht den Nachweis der pilzlich hergeleiteten β-N-Acetylhexosaminidase, die auch in dem Plasma vorhanden war. Es wird in Betracht gezogen, dass das vorliegende Verfahren im Allgemeinen zum Nachweis von Pilzen oder pilzlich hergeleiteter β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität in Körperproben von Menschen und Tieren verwendet werden kann.
Die Erfindung betrifft, wie es vorstehend erwähnt ist, ein Produkt, umfassend (i) einen Wirkstoff, der mit β-N-Acetylhexosaminidase reagiert, wobei die Menge oder Aktivität dieses Enzyms mit der Menge von pilzlicher Biomasse, die in einer Probe vorhanden ist, korreliert ist, wobei die Reaktion zwischen dem Enzym und dem Wirkstoff zu einem nachweisbaren Signal führt, und (ii) ein Mittel zum Nachweisen des Signals als ein kombiniertes System zum Nachweis einer pilzlichen Biomasse, die in der Probe vorhanden ist. Somit kann der Wirkstoff eines derartigen Produktes ausgewählt sein aus einem Substratmolekül, umfassend eine nachweisbare Einheit, die von dem Substratmolekül in Gegenwart der pilzlichen β-N-Acetylhexosaminidase freisetzbar ist, eine immunologisch aktive Verbindung, einschließlich eines polyclonalen oder monoclonalen Antikörpers, der in der Lage ist, an das pilzliche Enzym zu binden, und eine Nucleotidsequenz, welche in der Lage ist, mit einer DNA- oder RNA-Sequenz, die die pilzliche β-N-Acetylhexosaminidase codiert, zu hybridisieren.
Ein geeignetes Mittel zum Nachweisen des Signals umfasst ein Spektrometer von irgendeiner der vorstehenden Arten.
Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen und der Zeichnung weiter veranschaulicht, wobei:
1 und 2 die sehr bedeutsame, positive Korrelation zwischen der β-N-Acetylhexosamidase-Aktivität und Schätzungen der Menge des aktuell verwendeten pilzlichen Indikators PLFA in ausgewählten Bodenproben veranschaulichen. Die β-N-Acetylhexosamidase-Aktivität wird gemessen als die Freisetzung von 4-Methylumbelliferon (4-MU) von 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, gemessen in Nanomol 4-MU, die pro Stunde und pro g Boden (Trockengewicht) freigesetzt werden;
3 veranschaulicht das Fehlen einer bedeutsamen Korrelation zwischen β-N-Acetylhexosamidase-Aktivität, wie durch den Umsatz von 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (4-MU-GlcNAc) bestimmt und als die Freisetzung von nMol 4-Methylumbelliferon (4-MU) Stunde^–1 g^–1 Trockengewicht (TG) Boden angegeben, und dem Indikator von bakterieller Biomasse, i15:0 PLFA (Frostegård and Bååth, 1996);
4 zeigt die starke Korrelation zwischen der Anwesenheit und Aktivität von pilzlicher β-N-Acetylhexosamidase-Aktivität, wie durch den Umsatz von 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid bestimmt und als die Freisetzung von 4-Methylumbelliferon (4-MU) Stunde^–1 mg^–1 Trockengewicht (TG) angegeben;
5 veranschaulicht die Korrelation zwischen Aureobasidium pullulans-Biomasse, wie in mg Trockengewicht gemessen, und der Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon ausgestrahlt wird (FE pro Minute). Es wurden Proben zu den angezeigten Zeitpunkten genommen und gemäß dem in "Materialien und Verfahren" beschriebenen Test getestet;
6 veranschaulicht die Korrelation zwischen Penicillium commune-Biomasse (mg Trockengewicht) und der Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon ausgestrahlt wird (FE pro Minute). Es wurden Proben zu den angezeigten Zeitpunkten genommen und gemäß dem in "Materialien und Verfahren" beschriebenen Test getestet;
7 zeigt die Korrelation zwischen Aureobasidium pullulans-Biomasse (mg Trockengewicht) und der Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon ausgestrahlt wird (FE). Alle Proben wurden 6 Minuten mit 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (4-MU-GlcNAc) in Kontakt gebracht. A. pullulans wurde in einer Chemostat-Kultur mit einer Verdünnungsrate von 0,08 Stunden^–1 gezogen. Es wurden Proben genommen und die Biomasse wurde verdünnt, um minimale nachweisbare Mengen an pilzlicher Biomasse zu testen,
8 veranschaulicht die Beziehung zwischen Aureobasidium pullulans-Biomasse und der Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon ausgestrahlt wird (FE pro mg Trockengewicht pro Minute). Kulturen von A. pullulans wurden in einem Chemostat mit den in der Figur angezeigten Verdünnungsraten gezogen. Es wurden Proben genommen und mit 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (4-MU-GlcNAc) in Kontakt gebracht, wie in "Materialien und Verfahren" beschrieben;
9 zeigt den quantitativen Nachweis von lebendigen, nicht wachsenden pilzlichen Propagationseinheiten in Form von Konidien (Sporen) von Penicillium commune. Das Ergebnis zeigt eine Korrelation von Verdünnungen von Biomasse, die P. commune-Konidien umfasst (Millionen pro ml), mit der Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon ausgestrahlt wird (FE pro Minute). Es wurden Proben gemäß dem in "Materialien und Verfahren" beschriebenen Test getestet;
10 veranschaulicht den Zeitverlauf von Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon in pasteurisiertem Gemüsesaft ausgestrahlt wird, der 4-Methylumbelliferyl-Glcnac enthält, beimpft mit Blastokonidien von Aureobasidium pullulans mit einer Konzentration von 3,000 oder 30,000 pro ml;
11 zeigt den Zeitverlauf von Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon in pasteurisiertem Apfelsaft ausgestrahlt wird, der 4-Methylumbelliferyl-Glcnac enthält, beimpft mit Blastokonidien von Aureobasidium pullulans mit einer Konzentration von 3,000 oder 30,000 pro ml; und
12 zeigt den Zeitverlauf von Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon in pasteurisiertem Orangensaft ausgestrahlt wird, der 4-Methylumbelliferyl-Glcnac enthält, beimpft mit Blastokonidien von Aureobasidium pullulans mit einer Konzentration von 3,000 oder 30,000 pro ml.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
Verwendete Organismen. Die Pilze und Bakterien wurden von der Kultursammlung des Institute of Biotechnology, Technische Universität Dänemark (IBT); der Universität Massachusetts, Amherst, Mass. (QM); des Department of General Microbiology, Universität Kopenhagen, Dänemark (AGM); und des Department of Mycology und Pycology, Universität Kopenhagen, Dänemark (AAS) erhalten.
Verwendete Medien. Das Gemüsesaftmedium (V8) enthielt: 250 ml Granini-Gemüsesaft, (NH₄)₂SO₄, 0,5 g; KH₂PO₄, 0,5 g; Agar (Bactoagar, Difco Laboratories), 15,0 g. Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf 1 l eingestellt. Der anfängliche pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt.
Das CYA-Agarmedium enthielt (g l^–1 destilliertes Wasser): Saccharose, 30,0; Hefeextrakt (Difco, Bacto-Hefeextrakt), 5,0; NaNO₃.0; K₂HPO₄, 1,0; KCl, 0,5; MgSO₄·7H₂0 und die folgenden Komponenten (mg/l destilliertes Wasser): SO₄·7H₂O, 10,0; ZnCl₂, 1,0; CaCl₂·2H₂O, 18,6; MnCl₂·2H₂O, 1,1; CuCl₂·2H₂O, 0,27; NaMoO₄·2H₂O, 0,22; CoCl₂·6H₂O, 0,28; H₃BO₃, 0,4; KI, 0,06. Agar (Bactoagar, Difco Laboratories) wurde bis zu einer Endkonzentration von 15 g l^–1 zugegeben.
Das Mineralmedium, das Glucose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt (15 g l^–1), war, wie in Reeslev et al. (1993) beschrieben, außer dass Agar bis zu einer Konzentration von 15 g l^–1 zugegeben wurde.
Das BEA-Medium enthielt (g l^–1 destilliertes Wasser): Bodenextrakt, 400 ml; Glucose, 1; Pepton, 1; Hefeextrakt, 1; K₂PO₄, 1; Agar, 15.
Das Chitin-Agarmedium enthielt (g l^–1 destilliertes Wasser): hydrolysierten Chitinniederschlag, 10; K₂HPO₄, 1; MgSO₄·7H₂O, 0,5; NaCl, 0,5; CaCl₂, 0,1; Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O, 0,05; NH₄Cl, 0,1; Agar, 15.
Der hydrolysierte Chitinniederschlag wurde hergestellt durch Zugabe von: 10 g Chitin (Fluka Bio-Chemika) zu 200 ml destilliertem Wasser und Halten über Nacht bei 4°C. 400 ml 75%iges H₂SO₄ wurden zugegeben und die resultierende Lösung wurde bei 4°C für 24 Stunden stehen gelassen. Das Chitin wurde durch Mischen der Lösung mit 9 l 4°C kalten destillierten Wassers ausgefällt. Nach 48 Stunden wurde der Überstand dekantiert und der Niederschlag filtriert, um große Stücke von nicht aufgelöstem Chitin zu entfernen. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, mit 0,2% K₂HPO₄ gewaschen, und der Überstand wurde in 5-6 wiederholten Zyklen entfernt. Der resultierende hydrolysierte Chitinniederschlag wurde dann zur Herstellung des Chitinagars verwendet. Nach dem Autoklavieren wurden den Agarmedien 2 ml (200 μM) von durch ein Filter sterilisiertem (0,2 μm) 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosaminid zugegeben. Die Medien wurden in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen gegeben und jeweils gut mit einer reinen pilzlichen oder bakteriellen Kultur beimpft.
Nachweis von β-N-Acetylglucosaminidase-Aktivität in ausgewählten pilzlichen und bakteriellen Spezies. Eine gemischte Auswahl an Pilzen und Bakterien wurde auf Bodenextraktagar (BEA) und Chitinagar, die 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid enthielten, durchmustert. Die Mikroorganismen wurden in Mikrotiterplatten gezüchtet, die bei Raumtemperatur (21-23°C) inkubiert wurden, und sie wurden über acht Tage täglich visuell unter UV-Licht (366 nm) untersucht. Aktivität gegen 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid wurde durch Fluoreszenz angezeigt. Alle Durchmusterungen erfolgten dreimal.
Durchmusterung von ausgewählten Pilzen auf mehrere Enzymaktivitäten. Eine Anzahl von Pilzen, die verschiedene taxonomische Gruppierungen darstellen, wurde auf Enzymaktivität durchmustert. Die Pilze wurden in Platten mit 24 Vertiefungen (Nunclon Multidish, Life Technologies A/S) (Volumen der Vertiefungen 3,4 ml), die 1,5 ml mit Agar versetztes Wachstumsmedium enthielten, gezogen. Nach einer Wachstumsperiode von 10 Tagen bei 25°C wurden 1,5 ml Citrat-Phosphat-Puffer (pH-Wert 5) in die Vertiefungen gegeben und dann wurde jeder Vertiefung eines von 11 Enzymsubstraten zugegeben und 5 Stunden bei 25°C inkubiert, wonach die Fluoreszenz in jeder Vertiefung gemessen wurde. Für jeden Pilz wurden zwei Vertiefungen mit jedem Enzymsubstrat inkubiert. Alle Substrate wurden mit einer Endkonzentration von 10 μM verwendet. Das Substrat allein und der Organismus plus das mit Agar versetzte Medium wurden als Kontrollen eingeschlossen.
Mikrokosmos-Experimente. 100 mg Grob(„bulk")boden wurden in 10 ml fassende Kunststoffrohre abgewogen. Alle Tests wurden bei 25°C in 2 ml 0,05 M Tris-Maleat-Puffer mit vier Wiederholungen durchgeführt. 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid wurde zu einer Endkonzentration von 20 μM zugegeben. Kontrollen für den Extrakt, die Substratfluoreszenz und das Löschen wurden parallel verarbeitet. Der Test wurde durch Zugabe von 2 ml eiskaltem 96%igem Ethanol beendet. Nach Zentrifugieren wurden 2,7 ml Überstand in UV-Kunststoffküvetten überführt, die 300 μl 2,5 M Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 10 enthielten. Die Fluoreszenz, die von dem Umsatz von 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (freigesetztes 4-Methylumbelliferon, 4-MU) hergeleitet wurde, wurde mit einem Lumineszenzspektrometer (Perkin-Elmer LS50, Buckinghamshire, UK) bei 446 nm Emission und 377 nm Anregung bestimmt.
Bestimmung des Biomasse-Trockengewichts und der N-Acetylglucosaminidase-Aktivität. Die Pilze wurden auf CYA-Agar-Medium gezogen, das mit Cellophanmembranen bedeckt war, und das Wachstum wurde als radiale Koloniewachstumsrate, Biomasse-Trockengewicht und als die Rate des Abbaus von 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid bestimmt. Bei allen Pilzen war die radiale Koloniewachstumsrate während des Zeitverlaufs der Experimente gleich. Die Probennahme wurde initiiert, als die Kolonien einen Durchmesser von 2-35 mm, je nach Spezies, aufwiesen. Die Pilze wurden bei 25°C gezogen. Die Cellophanmembran, die die Pilzkolonie enthielt, wurde sanft von der Agarplatte abgehoben und in 3 ml Citrat-Phosphat-Puffer gegeben (pH-Wert 5). Das Substrat für β-N-Acetylglucosaminidase (4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid) wurde zu einer Endkonzentration von 20 μM zugegeben. Es wurde sichergestellt, dass die Abbaurate während der Inkubationszeit konstant war. Als die Kolonien wuchsen, wurde die Inkubationszeit allmählich verringert (von 30 min auf 2,5 min.), um zu belegen, dass weniger als 10% des anfänglichen Substrats hydrolysiert waren. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 3 ml 70% (Vol./Vol.) Ethanol gestoppt.
Vor Überwachung der Fluoreszenz wurden die Proben 5 Minuten bei 4000 U/min zentrifugiert. 1,7 ml Überstand wurden in eine Küvette gegeben, die 300 μl Tris-Puffer (2,5 M) enthielt. Die Funktion des Tris-Puffers (pH-Wert 10) bestand darin, den pH-Wert der Probe auf einen pH-Wert über 9 zu erhöhen, da die Fluoreszenz von 4-Methylumbelliferon vom pH-Wert abhängt, und zwar mit einer maximalen Emission oberhalb eines pH-Wertes von 8 (Fink & Koehler, 1972). Die Fluoreszenz (Anregung 377 nm Emission 446 nm) wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Lumineszenzspektrometers LS 50 B überwacht, das mit einem IBM-kompatiblen PC verbunden war, wobei Software verwendet wurde, die vom Hersteller bereitgestellt wurde. Die Fluoreszenz bei jeder Biomassenkonzentration erfolgte durch dreifache Bestimmungen. Um das Biomasse-Trockengewicht der Kolonie zu erhalten, wurde das Pellet aus der Zentrifugation resuspendiert und durch ein vorgewogenes Membranfilter filtriert (1,2 μm Porengröße) und bei 80°C bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet.
Chemostat-Experiment. Chemostat-Kultivierungen unter Verwendung des Mineralmediums wurden mit verschiedenen Verdünnungsraten durchgeführt. Der Chemostat wurde mit einer Verdünnungsrate von 0,08 h^–1 durchgeführt, und der pH-Wert und die Temperatur wurden konstant auf 5 bzw. 27°C gehalten (Reeslev et al., 1993). Von dem Chemostat genommene Proben wurden durch ein Nylonnetz (Porengröße 41 μm) filtriert, wobei das Myzel aufgefangen wurde. Das Myzel wurde dann sofort in frischem Medium resuspendiert, das 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid enthielt.
BEISPIEL 1
Nachweis von β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität und anderen Enzymaktivitäten in ausgewählten pilzlichen und bakteriellen Spezies
Eine gemischte Auswahl von Pilzen wurde auf einem Mineralmedium und einem Gemüsesaftmedium auf ihre Fähigkeit durchmustert, 11 mit 4-Methylumbelliferon markierte Substrate abzubauen (Tabellen 1.1 und 1.2) Die Durchmusterung zeigte, dass die Fähigkeit, 4-Methylumbelliferyl-GLcNAc (Substrat 3 und 4 in Tabellen 1.1 und 1.2) in allen getesteten Pilzen gezeigt werden konnte. Das gleiche verbreitete Abbaupotenzial hinsichtlich anderer Modellsubstrate konnte nicht gezeigt werden. Die Pilze, die dem Testverfahren unterworfen wurden, wurden alle von der Kultursammlung des Department of General Microbiology an der Universität Kopenhagen, Dänemark, erhalten.
In einem anderen Experiment wurde eine gemischte Auswahl an Pilzen und Bakterien auf ihre Fähigkeit durchmustert, 4-Methylumbelliferyl-GLcNAc abzubauen, wenn sie auf Bodenextraktagar (BEA) oder einem mit Chitin ergänzten Medium (Chitin-Medium) geimpft waren (Tabellen 1.3 und 1.4). Dieses Experiment zeigte, dass mit Ausnahme von 3 Spezies alle Pilze in der Lage waren, β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität auf BEA zu produzieren. Des Weiteren konnten zwei von drei pilzlichen Spezies, die zuvor keine β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität auf BEA zeigten, auf dem gleichen Medium induziert werden, das mit Chitin ergänzt war. Im Gegensatz dazu waren nur 7 bakterielle Spezies in der Lage, β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität zu produzieren, und zwar nur auf mit Chitin ergänztem Medium. Tabelle 1.3 Pilzspezies, die β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität auf BEA und Chitinagar produzieren

^aBEA: Bodenextraktagar

^aBEA: Bodenextraktagar

BEISPIEL 2
Bestimmung von pilzlicher Biomasse in einer komplexen Umgebung
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Bestimmen einer pilzlichen Biomasse, die in einer Probe vorhanden ist, durch Nachweis einer pilzlichen enzymatischen Aktivität, die in der Biomasse vorhanden ist. Der Nachweis der pilzlichen enzymatischen Aktivität beinhaltet das Inkontaktbringen der Probe mit einem Substratmolekül, das eine von dem Substrat freigesetzte nachweisbare Einheit umfasst, in Gegenwart der pilzlichen enzymatischen Aktivität. Die Demonstration der sehr bedeutsamen, positiven Korrelation zwischen der nachgewiesenen, durch die pilzliche enzymatische Aktivität vermittelten Spaltung von 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (4-MU-GlcNAc) zur Freisetzung von 4-Methylumbelliferon, gemessen in Nanomol von gespaltenem 4-MU-GlcNAc pro Stunde pro cm³, und Schätzungen der Menge der aktuell verwendeten Pilzindikatoren des Stands der Technik, Ergosterol und PLFA, in ausgewählten Bodenproben sind in den 1 bzw. 2 gezeigt.
Die Tatsache, dass diese sehr bedeutsame Korrelation in einer derartigen komplexen Umgebung erhalten wurde, zeigt die Allround-Anwendung des Verfahrens, das in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt ist.
Des Weiteren zeigt 3 das gleichzeitige Fehlen einer bedeutsamen Korrelation zwischen dem Gehalt des bakteriellen Biomasse-Indexmoleküls i15:0 PLFA und der β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität in den Bodenproben, was bestätigt, dass β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität ein spezifischer Indikator für pilzliche Biomasse in komplexen Proben ist, die auch β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität produzierende nicht-pilzliche Spezies enthalten.
Ein Mikrokosmosexperiment wurde durchgeführt, um die β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität als einen spezifischen Indikator für die Anwesenheit von Pilzen in einer komplexen Probe zu bewerten. Buchenstreumikrokosmen wurden mit mikrobiellen Populationen beimpft, die von einem Buchenwaldboden isoliert worden waren, bestehend aus (i) Bakterien von dem Buchenwaldboden, die durch Zentrifugieren/Homogenisieren isoliert worden waren und frei von pilzlichen Propagationseinheiten waren, (ii) einer Suspension aus Bakterien und Pilzen, die für eine natürliche mikrobielle Population in einem Buchenwaldboden repräsentativ sind, und (iii) einer Monokultur von cellulolytischen Pilzen (Humicola sp.), die von Buchenblättern isoliert worden waren. Experimente mit Mikrokosmen zeigten, dass β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivitäten in Mikrokosmen, die ein Gemisch aus Bakterien und Pilzen enthielten, zehnmal höher und in Mikrokosmen, die nur Pilze enthielten, 60-mal höher waren im Vergleich zu Mikrokosmen, die mit einer gemischten bakteriellen Population, die frei von Pilzen war, beimpft worden waren (4). Das Experiment zeigte eine starke Korrelation zwischen der Anwesenheit und Aktivität von Pilzen. Des Weiteren zeigte das Experiment, dass eine gemischte bakterielle Population mit einer hohen funktionellen Diversität, wie durch die Community Level Physiological Profiles (BIOLOG) gezeigt, nur geringfügig zur β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität beitrug.
BEISPIEL 3
Korrelation von β-N-Acetylhexosaminidase mit pilzlicher Biomasse
Die Korrelation zwischen der nachgewiesenen Substrateinheit und der Menge an pilzlicher Biomasse wurde für Kulturen von Aureobasidium pullulans (5) und Penicillium commune (6) gezeigt, welche in ein Standardmedium geimpft und unter Standardbedingungen gezogen wurden. Die Biomasse jeder Kultur wurde in mg Trockengewicht gemessen und mit der gemessenen, quantitativ nachgewiesenen durch 4-Methylumbelliferon herbeigeführten Fluoreszenz korreliert (FE pro Minute). Proben zur Bestimmung von Biomasse und zum Nachweis von 4-Methylumbelliferon wurden zu den angezeigten Zeitpunkten genommen und, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, getestet. Die Ergebnisse zeigen eine unmittelbare, positive Korrelation von pilzlicher Biomasse mit nachgewiesener Fluoreszenz.
BEISPIEL 4
Bestimmung der minimalen nachweisbaren Menge an pilzlicher Biomasse
Nachdem eine Korrelation zwischen pilzlicher Biomasse und der freigesetzten Substrateinheit erstellt wurde, wurde eine Bestimmung der minimalen nachweisbaren Menge an pilzlicher Biomasse vorgenommen.
Aureobasidium pullulans-Biomasse wurde in einer Chemostat-Kultur mit einer Verdünnungsrate von 0,08 Stunden^–1 gezüchtet. Eine Probe von 20 ml wurde von dem Chemostat entnommen und durch ein Nylonnetz (41 μm Porengröße) filtriert, um das Myzel zurückzubehalten und einzelne Zellen zu entfernen. Das zurückbehaltene Myzel wurde mit drei Volumina Inkubationsmedium gewaschen. Eine entsprechende Probe zum Bestimmen der Menge an pilzlicher Biomasse wurde durch ein Membranfilter (1,2 μm Porengröße) filtriert und bei 80°C getrocknet.
Das zu testende Myzel wurde in 200 ml Medium resuspendiert und Proben und Verdünnungen davon wurden dem Testmedium zugegeben, das auf einen pH-Wert von 5 kalibriert war. Bei T₀ wurden 0,2 ml 4-MU-GlcNAc bis zu einer Endkonzentration von 40 μM in einem Gesamtvolumen von 2 ml zugegeben. Das Inkontaktbringen der Probe mit 4-MU-GlcNAc erfolgte 6 Minuten bei 25°C. Bei T = 6 min, etwa 12 Minuten nach Entnahme der Probe von dem Chemostat, wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml eiskaltem 96%igen (Vol./Vol.) Ethanol gestoppt.
Die Korrelation der quantitativ nachgewiesenen Fluoreszenz mit der getesteten pilzlichen Biomasse, gemessen als Trockengewicht, ist in 7 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass pilzliche Biomasse in einer Menge von weniger als 2 mg Trockengewicht pro Liter mit einer Inkubationszeit von 6 Minuten nachgewiesen wird. Die tatsächliche Menge an pilzlicher Biomasse, die in der Probe vorhanden ist, betrug weniger als 4 μg. Durch Verlängern der Zeit des Inkontaktbringens der Probe mit dem Substratmolekül ist es möglich, eine Menge an pilzlicher Biomasse von weniger als 0,1 μg nachzuweisen.
Korrelation zwischen β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität pro pilzlicher Biomasse
Wie in 8 veranschaulicht, kann eine Korrelation zwischen Aureobasidium pullulans-Biomasse (mg Trockengewicht) und der quantitativ nachgewiesenen Fluoreszenz, die durch 4-Methylumbelliferon ausgestrahlt wird (FE pro mg Trockengewicht pro Minute), für einen Satz verschiedener Chemostat-Verdünnungsraten erstellt werden, während alle anderen Parameter konstant gehalten werden.
Die Kulturen waren kohlenstoffbegrenzt (um einen möglichst hohen Anteil an Myzelzellen gegenüber Hefe zu erhalten) (Reeslev et al. 1993). Des Weiteren wurden Vorkehrungen getroffen, um jegliche Abnahme der Biomasse im konstanten Zustand zu vermeiden, was oft bei höheren Verdünnungsraten vorkommt und eine Verschiebung des begrenzenden Nährstoffs und dadurch des Zellstoffwechsels anzeigen kann.
Kulturen von A. pullulans wurden in SYN-Medium in einem Chemostat mit den in 8 gezeigten Verdünnungsraten gezüchtet. Es wurden Proben von dem Chemostat entnommen und durch ein Nylonnetz (41 μm Porengröße) filtriert, um einzelne Zellen zu entfernen und das Myzel zurückzubehalten. Proben wurden resuspendiert, wie vorstehend beschrieben, und mit 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (4-MU-GlcNAc) in Kontakt gebracht, wie in Materialien und Verfahren beschrieben.
BEISPIEL 6
Bestimmung von pilzlicher Biomasse, die Konidien umfasst
Der quantitative Nachweis von nicht wachsenden Propagationseinheiten wie Konidien (Sporen) von Penicillium commune wurde auch unter Verwendung des Testverfahrens, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, erhalten. Die in 9 gezeigten Ergebnisse zeigen eine unmittelbare Korrelation zwischen Verdünnungen von Biomasse, die P. commune-Konidien umfasst (Millionen pro ml) und der quantitativ nachgewiesenen Fluoreszenz, die von 4-Methylumbelliferon ausgestrahlt wird (FE pro Minute). Es wurden Proben gemäß dem in Materialien und Verfahren beschriebenen Test getestet.
BEISPIEL 7
Nachweis von pilzlicher Biomasse in Lebensmittelprodukten
Pasteurisierter Apfelsaft, Orangensaft und Gemüsesaft wurden mit Blastokonidien von A. pullulans mit einer Endkonzentration von 3.000 und 30.000 pro ml beimpft und 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid als das Substrat wurde bis zu einer Endkonzentration von 110 μM zugegeben. Proben wurden unter sterilen Bedingungen entnommen und die Fluoreszenz wurde bestimmt. Die 10, 11 und 12 zeigen, dass die Nachweiszeiten, wie sie durch den Abbau des Substrats bestimmt werden, zwischen 22 und 25 Stunden bei 30.000 Konidien pro ml und etwa 29 bis 32 Stunden bei 3.000 Konidien pro ml lagen.
Eine Hemmung der Keimung von Blastokonidien von A. pullulans auf Grund eines Crowdingeffekts tritt bei Konzentrationen von weniger als etwa 1 × 10⁶ pro ml nicht auf, und daher sollte die Zeit, die für die Keimung erforderlich ist, nicht beeinflusst werden, wenn geringere Impfmaterialkonzentrationen verwendet werden. Auch sollte der Unterschied der Impfdichte nicht die spezifische Wachstumsrate in den Experimenten beeinträchtigen. Folglich steht der Unterschied der Nachweiszeit von etwa 7 Stunden mit dem Unterschied der anfänglichen Konzentration von Blastokonidien in Zusammenhang. Basierend auf diesen Annahmen kann die Nachweiszeit für Saft, der 1 Konidium pro ml enthält, durch Extrapolation auf etwa 53 Stunden geschätzt werden.
BEISPIEL 8
Nachweis von pilzlicher Biomasse in Zusammenhang mit Baumaterialien
Es wurden Proben von den Deckenbrettern eines Schulgebäudes mit Pilzproblemen (Schimmelproblemen) vor und nach der Reinigung entnommen. Durch visuelle Untersuchung wurden drei Bereiche für das Experiment ausgewählt: ein Bereich mit keinem sichtbaren Pilzwachstum, ein Bereich, der leicht kontaminiert erschien, und ein Bereich mit offensichtlichem Pilzwachstum.

Bereich 1: starke schwarze Verfärbung der Deckenbretter
Bereich 2: die Deckenbretter sind leicht schmutzig
Bereich 3: keine sichtbare Verfärbung

Es wurden von jedem Bereich drei Proben entnommen. Die Proben wurden entnommen, indem ein 5 cm² großer Bereich der Decke mit sterilen Lappen leicht gerieben wurde. Die Lappen wurden eine Stunde oder weniger in einem Puffer inkubiert, der als ein Substrat 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid enthielt, wonach der Lappen entfernt wurde, gefolgt von der Zugabe von 2,5 M Tris, und die Fluoreszenz wurde bestimmt. Die Ergebnisse (Tabelle 8.1) zeigten eine gute Übereinstimmung mit den visuellen Beobachtungen und einer Agarplattenprägung. Die Agarplattenprägungen wurden während eines Zeitraums von 7 Tagen bewertet.
Tabelle 8.1 Gebildete Fluoreszenzeinheiten (- Kontrolle) von Proben, die von Deckenbrettern vor und nach der Reinigung entnommen wurden. Die Proben wurden 1 Stunde inkubiert
Das Verfahren der Agarprägung ergab die folgenden Ergebnisse:

vor der Reinigung Bereich 1: > 50 Kolonien Bereich 2: < 10 Kolonien Bereich 3: kein Wachstum
nach der Reinigung Bereich 1: kein Wachstum Bereich 2: kein Wachstum Bereich 3: kein Wachstum

BEISPIEL 9
Bestimmung von pilzlicher Biomasse in einer Probe von Holz
Das Verfahren zum Nachweis einer pilzlichen Biomasse wurde verwendet, um "in situ" eine Probe von Holz zu testen, von dem bekannt war, dass es mit Propagationseinheiten von Serpula lacrymans kontaminiert war. Eine Probe wurde, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, getestet, und nach einer Kontaktzeit von 20 Minuten wurde eine Fluoreszenz entsprechend 840 Fluoreszenzeinheiten (FE) gemessen.
In einem Kontrollexperiment wurde ein ähnlicher Block von Holz, von dem auch bekannt war, dass es S. lacrymans umfasste, vor dem Testen autoklaviert, und es war keine Fluoreszenz nachweisbar, als die Probe dem Testen unterworfen wurde (ein Wert von 0 FE wurde erhalten).
Das Verfahren kann somit verwendet werden, um die Wirkung einer gegebenen Fungizidbehandlung von Holz oder die Wirkung irgendeiner Behandlung zu bewerten, die das Ziel der Eliminierung des Wachstums einer pilzlichen Biomasse in Holz hat. Insbesondere kann das Verfahren zum Nachweisen von pilzlichen Infektionen von Bäumen und Pflanzen, z. B. Infektionen durch Ophiostoma novo ulmi, was die Holländische Ulmenkrankheit verursacht, verwendet werden.
BEISPIEL 10
Diagnoseverfahren zum Nachweis von pilzlichen Infektionen in Menschen
Das Diagnoseverfahren weist pilzliche β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität in menschlichem Plasma nach. Es wurde herausgefunden, dass 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid auch durch menschliche Hexosaminidase gespalten wird, die normalerweise in Blut- und Plasmaproben vorhanden ist. Es wurde jedoch entdeckt, dass diese menschliche Hexosaminidase-Aktivität durch einen Vorbehandlungsschritt eliminiert werden kann, der das Ausfällen z. B. durch Zugabe von Ammoniumsulfat (70% Sättigung) zu den menschlichen Plasmaproben umfasst. Dies wurde in Plasmaproben gezeigt, die Candida albicans- oder Aspergillus fumigatus-Kulturflüssigkeiten enthielten, wobei in C. albicans oder A. fumigatus β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität vorhanden war. In den Proben, die C. albicans-Kulturflüssigkeit enthielten, verblieben mehr als 75% der pilzlichen β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität nach dem Ausfällschritt, um störende menschliche Enzymaktivität zu eliminieren.
Das Testgemisch umfasst normalerweise 100 μl des vorbehandelten Plasmas, das mit Kulturflüssigkeit, 100 μl Phosphat/Citrat-Puffer, pH-Wert 5, und 50 μl (1,2 mM) Substrat (4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid) ergänzt ist. Nach der Inkubation wurden 300 μl Tris-Puffer (2,5 M) dem Gemisch zugegeben, um den pH-Wert auf über 9 anzuheben, und die Fluoreszenz wurde gemessen. Dieses Verfahren wurde auf Plasma von verschiedenen Kontrollpersonen ohne vorherige bekannte pilzliche Infektionen getestet. Kulturflüssigkeiten von der Züchtung von C. albicans oder von A. fumigatus, enthaltend β-N-Acetylhexosaminidase- Aktivität, wurden den Plasmaproben zugegeben. Nach einer Vorbehandlung, wie vorstehend beschrieben, wurden 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid und Puffer zugegeben und das Plasma wurde inkubiert. Nach der Inkubation wurde Tris-Puffer zugegeben, und die gebildete Fluoreszenz wurde im Vergleich zu den Kontrollproben gemessen. Die Anwesenheit von pilzlicher β-N-Acetylhexosaminidase-Aktivität wurde nachgewiesen und die Fluoreszenz war proportional zu der Menge an zugegebener pilzlicher β-N-Acetylhexosaminidase.
REFERENZEN

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Claims

Verfahren zum selektiven Nachweis pilzlicher Biomasse in einer Probe, umfassend die Schritte: (i) Nachweis der Menge, Anwesenheit oder Aktivität von β-N-Acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) in der Probe, (ii) Korrelieren der Menge, Anwesenheit oder Aktivität der β-N-Acetylhexosaminidase mit mindestens einem pilzlichen Biomasse-Parameter, welcher in der Probe vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge, Anwesenheit oder Aktivität von β-N-Acetylhexosaminidase nachgewiesen wird durch (i) Inkontaktbringen der Probe mit einem Substratmolekül, welches eine nachweisbare Einheit umfaßt, die von dem Substratmolekül in Anwesenheit der β-N-Acetylhexosaminidase freisetzbar ist, und (ii) Nachweis der freigesetzten Einheit.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge, Anwesenheit oder Aktivität der β-N-Acetylhexosaminidase immunologisch nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pilzliche Biomasse-Parameter ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Menge der pilzlichen Biomasse in der Probe, welche direkt bestimmt wird durch die Messung des Gewichts der pilzlichen Biomasse, einem Stoffwechselprodukt, einer zusätzlichen enzymatischen Aktivität und einem Indikator des physiologischen Zustandes der pilzlichen Biomasse.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der pilzliche Biomasse-Parameter ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ergosterol und Phospholipidfettsäuren (PLFA).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die pilzliche Biomasse Pilze umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina und Deuteromycotina.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Substratmolekül eine fluorogene und/oder chromogene Einheit umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die freigesetzte Einheit 4-Methylumbelliferon oder ein durch Fluoreszenz nachweisbares Derivat davon ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Substratmolekül 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Substratmolekül 4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N',N''-triacetylchitotriosid ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei eine Menge von weniger als 1 Picomol der freigesetzten Einheit nachgewiesen werden kann.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die freigesetzte Einheit im Zeitablauf zu vorbestimmten Zeitabständen oder kontinuierlich nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die freigesetzte Einheit durch eine online-Analyse nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, umfassend den Nachweis von mindestens einem zusätzlichen Substratmolekül, welches eine nachweisbare Einheit umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zeit des Inkontaktbringens der Probe mit dem Substratmolekül höchstens 30 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis einer Menge an pilzlicher Biomasse von höchstens 1 μg, vorzugsweise von höchstens 0,1 μg, weiter bevorzugt von höchstens 0,01 μg und am meisten bevorzugt von höchstens 0,001 μg möglich ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Umweltprobe, einem Lebensmittelprodukt, Pflanzenmaterial, Baumaterial und einer industriellen Pilzkultur.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe menschlichen oder tierischen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Probe vor dem Nachweis durch Fällung mit Ammoniumsulfat vorbehandelt wird, um nicht-pilzliche β-N-Acetylhexasominidase-Aktivität, welche inhärent in solch einer Probe anwesend ist, zu reduzieren oder zu eliminieren.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Probe vor dem Nachweis unter Verwendung von Mitteln, welche selektiv das Wachstum von nicht-pilzlichen biologischen Aktivitäten hemmen, vorinkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Vorinkubation die Verwendung von Züchtungsmethoden umfaßt, bei denen die nicht-pilzliche β-N-Acetylhexosaminidase nicht exprimiert werden kann.
Verwendung eines Produktes umfassend (i) einen Wirkstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Substratmolekül umfassend eine nachweisbare Einheit, welche von dem Substratmolekül in Anwesenheit von β-N-Acetylhexosaminidase freisetzbar ist, eine immunologisch aktive Verbindung, welche in der Lage ist, an β-N-Acetylhexosaminidase zu binden, und eine Nucleotidsequenz, welche in der Lage ist, mit einer DNA- oder RNA-Sequenz, die für β-N-Acetylhexosaminidase codiert, zu hybridisieren, und (ii) ein Mittel zum Nachweis eines Signals, welches aus der Reaktion zwischen dem Wirkstoff und der β-N-Acetylhexosaminidase resultiert, zum Nachweis von pilzlicher Biomasse in einer Probe.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Substratmolekül eine 4-Methylumbelliferon-Einheit oder ein Derivat davon umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Substratmolekül 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid ist.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Substratmolekül 4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N',N''-triacetylchitotriosid ist.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Mittel zum Nachweis des Signals ein Spektrometer ist.