SE445928B - Odling av aerococcus viridans ifo-12219 eller ifo-12317 och isolering av pyruvatoxidas derur - Google Patents

Odling av aerococcus viridans ifo-12219 eller ifo-12317 och isolering av pyruvatoxidas derur

Info

Publication number
SE445928B
SE445928B SE7902648A SE7902648A SE445928B SE 445928 B SE445928 B SE 445928B SE 7902648 A SE7902648 A SE 7902648A SE 7902648 A SE7902648 A SE 7902648A SE 445928 B SE445928 B SE 445928B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
pyruvate
ifo
solution
reagent
pyruvate oxidase
Prior art date
Application number
SE7902648A
Other languages
English (en)
Other versions
SE7902648L (sv
Inventor
H Misaki
Y Horiuchi
K Matsuura
S Harada
S Takenaka
Original Assignee
Toyo Jozo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP3468778A external-priority patent/JPS5840465B2/ja
Priority claimed from JP8635078A external-priority patent/JPS5915637B2/ja
Application filed by Toyo Jozo Kk filed Critical Toyo Jozo Kk
Publication of SE7902648L publication Critical patent/SE7902648L/sv
Publication of SE445928B publication Critical patent/SE445928B/sv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
    • C12Y102/03003—Pyruvate oxidase (1.2.3.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

7902648-0 Uppfinningen avser härutöver en sammansättning av olika substanser speciellt ägnade för diagnostisk analys av pyrodruv- syra, innefattande ett reaktionssystem med pyruvatoxidas.
'Vidare avser uppfinningen ett analytiskt sätt för att bestämma pyrodruvsyra i ett prov, innehållande pyrodruvsyra, eller ett pyrodruvsyra frigörande system, vilket sätt inne- fattar behandling av ett prov med ett reaktionssystem, inne- hållande pyrovatoxidas, och att mäta den förbrukade eller alstrade beståndsdelen. _ Slutligen avser uppfinningen ett förfarande för framställ- ning av pyruvatoxidas, innefattande odling av en pyruvatoxidas alstrande mikroorganism, tillhörande släkten Pediococcus, Streptococcus eller Aerococcus i ett närande odlingsmedium och att isolera det sålunda av de odlade cellerna framställda pyruvatoxidaset. 7 Uppfinningen förklaras närmare i samband med bifogade ritningar som visar följande. Pig. l ett optimalt pH-värde av pyruvatoxidas. Pig. 2 värmestabilitet av pyruvatoxidas. Pig. 3 pH-stabilitet av pyruvatoxidas. Pig. 3 resultatet av en analys av pyrodruvsyra medelst en syrelektrod och användning av pyruvatoxidas. Pig. 5 resultatet av en analys av serum medelst en syreelektrod och användning av pyruvatoxidas. Pig. 6 resul- tatet av en analys av pyrodruvsyra medelst kolometriskt sätt att använda pyruvatoxidas. Pig. 7 resultatet av en kvantitativ analys av serum-pyrodruvsyra och användning av pyruvatoxidas.
Pig. 8 resultatet av en analys av ADP och användning av pyruvat- oxidas. Pig. 9 resultatet av en analys av glycerol, triglycerid och serum-triglycerid med användning av pyruvatoxidas. Pig. lfi resultatet av en analys av GPT- och GOT-aktivitet med användning av pyruvatoxidas. Pig. ll ett diagram av en analys av GPT- aktivitet med användning av pyruvatoxidas. Pig. 12 ett diagram av en analys av GOT-aktivitet med användning av pyruvatoxidas.
Pyruvatoxidas enligt uppfinningen inverkar katalyserande på en oxiderande reaktion med pyrodruvsyra, oorganiskt fosfat LG 7902648-0 och syre för att bilda acetylfosfat, koldioxid och väteperoxid, och framställs företrädesvis genom att odla pyruvatoxidas- alstrande bakteríestammar tillhörande släkten Pediococcus, Streptococcus eller Aerococcus, exempelvis arterna Pediococcus sp B-0667, Streptococcus sp B-0668, Aerococcus viridans IPO 12219 eller IFO 12317.
Ovannämnda arter B-0667 och B-0668 har följande taxo- nomiska egenskaper: A. Iakttagelser vid olika medier, odlade vid BOOC under 2 dygn: Arten B-0667 Arten B-0668 Tryptosoja- buljong tryptosoja- agarskiva tryptosoja~ agarplatta gelatinskiva BCP-mjölk (lä dygn) svag växt, homogent grum- lig, senare ullig utfäll- ning svag växt, blekt gul-grå, ingen glans, ingenupp- komst av lösbart pigment kolonibildning; liten och Slät växt utefter hackad linje; ingen gelatinsmältning ingen ändring svag växt, homogent grum- lig, senare ullig ut- fällning svag växt, blekt gul-grå ingen glans, ingen upp- komst av lösbart pigment kolonibildning; liten och slät växt utefter hackad linje, ingen gelatinsmältning ingen ändring B. Mikroskopiska iakttagelser: Arten B-0667 Arten B~0868 Form Storlek Rörlighet sfärisk, äggliknande, parvis, tetraliknande ' eller korta kedjor 0,5-1,0 X 0,5-1,0 u sfärisk, äggliknande, parvis, tetraliknande eller korta kedjor 0,8-1,0 x 1,0-1,2 u 7902648-o u SPOÉPCI' _ färgning enligt Gram + + syrafast färg- ning - C. Fysiologiska egenskaper: Arten B-0667 Arten B~0668 Tillväxt- temperatur us°cl - e - s7°c so°c 2s°c 1o°c s°c Salttolerans: NaCl |++ + ++ l++ + ++ eller (+) eller (+) + + 4- + I , + 0% + - OF-test * fermentativ fermentatív beteende i 7 syre fakultatítvt anaerobískt fakultativt anaerobiskt nitratre- duktion - - indolfor- mation - - vätesulfat- bildning - - gelatin- hydrolys_ - - stärkelse- hydrolys - - cskulín- hydroïys acetoin~ bildning MR-test Katalas oxidas ureas (SSR) ureas (Christensen) utnyttjande citronsyra (Christensen) syrabildning av socker; adonitol L(+)-arabínos cellobios dulcitol meso-erytrítol fruktos fukos gelaktos glukos glycerol ínositol inulin laktos maltos mannitol mannos melisitos melibíos raffinos L(+)-ramnos salicin L-sorbos sorbitol 7902648-0 7902648-0 5 stärkelse - - sackaros + + trehalos + + xylos - - tolerans vid 60°C under 30 min - + Såsom framgår av "Bergey's Manual of Determinativaßac- teriology, Bth Edition, l97N" och "S T Cowan and K J Steel, Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge Press, l97U", är arterna B-0667 och B-0668 - som har ovannämnda taxonomiska egenskaper, särskilt Gram~positiva kocker, med avseende på katalas och oxidas negativ, fermentativt syrabildning av glukos och ingen gasbildning av socker (glukos) - omnämnda i denna litteratur som tillhörande släkten Pediococcus och Streptococcus.
En jämförelse av dessa stammar med identifikationshand- boken enligt ovanstående visar följande.
I tabellen betyder + = mer än 85% positiv, och - = mer än 85% negativ samt d = varierar bland stammar och arter.
Stam Stam Stam Släkt B-0667 B-0668 Pediococcus Streptococus Tillväxt vid u5°c - - + d tolerans vid BOOC under 30 min - + - d glycerol (sy- rabildning) ~ ~ - d arabinos (syrabild- ning) - - - + d salttolcrans (NaCl lO%) + - - + - 7902648-0 l det nedanstående kommer arten E-0657 sålunda att refe- reras till som släkt Pediococcus eller Streptococcus. Såsom framgår av ovannämnda “Manual for the Identification of Medical Bacteria" och "J Gen Microbiol, 26, 185 - l97, 1961" är de taxonomiska egenskaperna av stammarna B-0667 nästan identiska med dem av Pediococous urin-equi, men de i "Bergey's Manual of Detaminative Bacteriology, 8th Ed, l97H" beskrivna egenskaperna är något olika med dem. På grund härav kommer arten B-0667 att refereras till som släktet Pediococcus och att betecknas som Pediococcus sp B-0667. I Stammen B-0568 liknar släktet Streptoeoccus mer än släktet Podioooccus. Vidare framgår av "Manual for the Identi- fication of Medical Bacteria" att arten B-0668 liknar Strepto- coccus faecium variation durans, men inga taxonomiska egen- skaper har beskrivits i "Bergey's Manual", så att detaljerad jämförelse är omöjlig. Stammen B-C668 refereras emellertid till som Streptonorcus sp B-0668.
Stammarna B-0667 och B-0668 har deponerats för permanent samling i "Tnstitute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, M I T I, Japan" under depositions-nr FERM-P No UH38 och FERM-P No HU39.
Vid en utföringsform av uppfinningen odlas ovannämnda Pediococcus sp b-0667, Streptococcus sp B-0668, Aerococcus viri- dans IFO-l22l0 eller Aerococcus viridans IFO-l23l7 i ett bruk- ligt medium för enzymframställning. Odlingen kan genomföras medelst vanlig vätskeodling, varvid undervattenluftning är lämp- lig vid industriell framställning.
Ett brukligt medium för mikroorganismer kan lämpligen användas. Såsom kolkällor kan tjäna assimilerbara kolkällor såsom glukos, sackaros, laktos, maltos, fruktos, melass, pyro- druvsyra eller liknande. Assimilerbara kvävekällor såsom pepton, köttextrakt, jästextrakt, kaseinhydrolysat eller liknande kan komma till användning. Olika oorganiska salter såsom fosfat, karbonat, sulfat, salter av magnesium, kalcium, natrium, järn mangan eller zink kan nyttjas. 7902648-0.
Odlingstemperaturen kan väljas inom området för uppväxt av bakterieceller och framställning av pyruvatoxidas och är lämpligen 25-37°C. Odlingstiden kan varieras beroende på vill- koren och avslutas när framställningen av pyruvatoxidas i det väsentliga är slutförd och ligger vanligen mellan 18 och H8 h.
Pyruvatoxidas förekommer i celler hos mikroorganismer.
För att skilja pyruvatoxidas från de odlade cellerna, filtreras den odlade massan eller centrifugeras för att samla cellerna, och sprängs genom mekanisk behandling eller enzyma- tiskt som exempelvis med lysozym. Om nödvändigt, behandlas pyru- vatoxidas genom att tillsätta etylendíamintetraättika (EDTA) och ytbehandlingsmedel såsom TRITON X-l00R eller ADECATOL SO-l20R för att avskilja enzymet. Den sålunda erhållna lösningen av pyruvatoxidas kan koncentreras om så behövs, varefter en» zymet utfälls genom utsaltning medelst tillsats av lösbart salt såsom ammoniumsulfat eller natriumklorid. Föroreningar med låg molekylarvikt avlägsnas genom dialys. Ytterligare föroreningar undanröjs från pyruvatoxidaslösningen lämpligen genom kromato- grafisk absorption, jonbytarkromatografi eller gelfiltrering.
Den sålunda erhållna enzymlösningen behandlas med vakuumkon- centration och lyofilisering för att framställa pyruvatoxidas- pulver. Ytterligare rening kan åstadkommas genom brukliga re- ningsförfaranden för protein och enzym såsom absorptionskroma- tografi, jonbytarkromatografi eller gelfiltrering, Enligt uppfinningen framställd pyruvatoxidas har följande fysikaliskt kemiska egenskaper, varvid förkortningar används enligt följande.
Pediococcus sp B-0667 ~ B-0667 Streptococcus sp B-0668 - B-0668 Aerococcus viridans IFO-l22l9 ~ IFO~l22l9 Aerococcus viridans IFO-12317 - IFO-12317 (1) Enzymverkan: Enzymet katalyserar oxidativ reaktion genom pyrodruvsyra, oorganiskt fosfat och syre för att bilda acetylfosfat, kol- dioxid och väteperoxid.__ CH3C0COOH + HOP03 + O 3 + CO + H 0 -à CH3COQP0 2 2 2 2 7902648-Û (2) Optimalt pH-värde pH-vårdats verkan på pyruvatoxidasets aktivitet uppmäts.
Fosfatbuffertlösningar med pH 6-8 används för prövning. Resul- taten visas i fig. l där det optimala pH-värdet är följande.
B-0557 ps 5,3 - 1,5 B-osss ps 7,5 - 5,5 Iro-12219 ps 7,0 - s,o IFo-12317 ps 5,8 - 7,5 En ringa ändring iakttas genom fosfatkoncentrationen och typ av metalljon. (3) Värmestabilitet: Enzymets värmestabilitet bestäms genom inkubering i 10 mM fosfatbuffert (pH 6,5), innehållande 10 pM FAD vid 0, H0, 50, 60 och 7000 under 10 min enligt sättet av enzymprövníngen.
Såsom visas i fig. 2 aktiveras enzymet, erhållet av B-0667, IFO-12219 och IFO-12317, något vid HOOC och denatureras vid en temperatur högre än 6000. Det av B-0668 erhållna enzymet akti- veras icke vid HOOC och är nästan denaturerat över 60°C.
(H) pH-stabilitet Till varje enzymlösning (0,1 ml) sätts 0,2 M fosfat- buffert för pH 6 - 8 (0,9 ml) eller 0,2 M tris-HCl-buffert för pH 7 - 9 (0,9 ml), varvid varje lösning innehåller 10 pM FAD; lösningarna får stå kvar under 10 min vid UOOC. 20 pl av enzymlösningarna uttas, och enzymaktiviteten bestäms. Såsom visas i fig. 3 är enzymet från B-0667, IFO-12219 och IFO-12317 huvudsakligen stabilt vid ungefär pH 7 och det av B-0668 är stabilt vid ett värde för sur reaktion. (5) Verkan av olika substanser: 1) Inverkan av olika substanser på enzymaktiviteten prövas genom att istället för MgCl2 tillsätts 5 mM av nedan- stående substans till prövningssystemet.
Tillsatt relativ aktivitet (%) ~ substans 'B-0667 B-0668 IFO-12219 IFO-12317 Ingen tillsats 25,H 72,0 H2,0 50,3 7902648-0 10 n0TA 0 0 0_ 0 Mgc12 100 100 100 100 cac12 09,0 75,0 03,0 70,7 Mnc12 120,1 102,7 110,2 111,0 coclz 01,3 01,1 05,0 00,0 Baclz 20,0 50,0 23,9 20,0 znc12 10,0 00,2 10,0 22,0 Såsom framgår av ovanstående är enzymets inverkan upp- hävd genom EDTA och aktiverad genom Mg++, Ca++, Mn++ och Co++. 2) Inverkan av den följande substansens eliminering från prövningssystemet på enzymaktiviteten visas i det nedanstående. 0,1 M dimctylglutarat-Na0H~buffert används vid fosfat-elimineríng.
Eliminerad relativ aktivitet (%) substans B-0667 B-0668 IPD-12219 IFO-12317 Ingen eli- minering lÛO 100 100 100 tiaminpyro- fosfat 0 0 0 0 PAD 33,9 100 32,7 u1,7 tiaminpyro- fosfat och FAD 0 0 0 fosfat O 0 0 Det framgår av ovanstående att enzymet kräver tiamín- pyrofosfat och FAD som kofaktor och fosfat som substrat.
Vidare har uppmättssyrebrukning och enzymreaktion medelst en syreelektrod, varvid syre förbrukas alltefter enzymaktivi- teten (bildande av väteperoxid). Resultaten visas i det följande.
Syreförbruk- Reaktionsprodukt (p mol/min) ning Qu mol/ min) H20? acctylfosfat 0-0007 0,002 0,002 ' 0,030 7902648-0 1] B-0668 0,07? 0,0?l3 0,020 IFO-12219 0,0H0 0,038 0,037 IFO-12317 0,035 0,036 0,03N Undersökningarna genomförs medelst följande hjälpmedel.
Syreförbrukningen: mätinstrument för upplöst syre (YSI-syre- mätare modell 531) acetylfosfat: "F Lipmann et al, J Biol Chem, 134, H63- HSU, l9U0 väteperoxid: metod som tillämpar N,N-dimetylanilin, U-aminoantipyrin och hästrädis-peroxid Såsom förklaras i det ovanstående betecknas det av ovan- nämnda fyra stammar utvunna enzymet som pyruvatoxidas och flavinprotein.
Undersökningsmetoden för pyruvatoxidas enligt föreliggande uppfinning är följande. 0,5 M kaliumpyruvat 0,1 ml 0,5 M fosfatbuffert (pH 7,0) 0,2 ml 0,2 % U-aminoantipyrin 0,l ml 0,2 % N,N-dimetylanilin 0,2 ml 0,2 M MgCl2 50 pl 10 mM tiamínpyrofosfat 20 pl peroxidas (H5 U/ml) 0,1 ml lmM FAD 10 pl destillerat vatten 0,22 ml Ovanstående reaktionsblandning förinkuberas vid 37°C under 3 min. ' Till denna lösning sätts enzymlösningen (20 pl) och för- inkuberas vid 37°C under 10 min. 0,1 M citratbuffert (pH 6,0, 2ml), innehållande 0,1 m EDTA tillsätts för att avbryta reaktionen. Den bildade violetta färgen uppmäts genom kolori- metri vid 565 nm. " En enhet (1 U) av enzymaktivitet definieras som den akti- vitet som alstrar l ßmol väteperoxid/min.
För att aktivera pyruvatoxidas-reaktionssystemet, till- sätts FAD, tiamínpyrofosfat och fosfat. Vidare tillsätts för aktivering av enzymet lämpligen jonfrigörande salt som frigör 79026480-0 12 kalciumjoner, koboltjoner, magnesiumjoner eller manganjoner, i form av klorid. En indikator som färgíndíkator eller fluore- sensindikator för väteperoxid kan väljas alltefter lämplighet.
. Mängden och förhållandet av beståndsdelarna i enzym- reaktionen kan väljas för väsentlig enzymreaktion och kan varie- ras alltefter mängden pyruvat, temperaturen ochtidslängden för enzymreaktíonen. Exempelvis mellan 1 och 20 U pyruvat- oxidas¿ 0,1 - 20 n mol FAD, 0,05 - 0,5 p mol tiaminpyrofosfat, 1 -~l0,p mol oorganisk fosfat och 0,05 - 10 p mol jonfrigörande salt per test kan användas med fördel. Pyruvatoxidas kan mikrokapslas eller vara i form av orörliga likvärda länkar med organiska eller oorganiska bärare eller absorberade av bärare.
Mol-förhållandet av indikatorer för väteperoxid är åtminstone ekvimclar eller en överskottsmängd av alstrad väteperoxid. I fall av peroxidas används lämpligen 0,5 - 20 U per test. Dessa beståndsdelar av den enàymatiska reaktionsblandningen används företrädesvis i lösning med passande justerat pH-värde av bufferten.
Det sålunda förberedda enzymatiska reaktionssystemet tillämpas för analys av pyrodruvsyra. Alla sådana prov som innehåller pyruvat, kan analyseras. Exempelvis pyrodruvsyra själv, pyrodruvsyra i serum eller urin och pyrodruvsyra som bildar enzymreaktionssystem såsom mjölksyra och laktatdehydro- genas (LDG), ADP och pyruvatkinas, glycerol, glycerolkinas och pyruvatkinas kan omnämnas. Ytterligare detaljerade exempel på enzymatiska reaktioner som bildar pyrodruvsyra, och undersök- ningsobjekt är följande. '(1) Undersökning av mjölksyra- eller LGDfaktívitet, laktat -%%%--7-pyruvat + NADH2 (23 Undersökning av ADP- eller pyruvatkinas (PK)-aktivitet: ADP + fosñenolpyruvat --gå-9 ATP + pyruvat (3) Undersökning av glutamat-pyruvat-transaminas (GPT)-aktivitet eller -ketoglutaratz alanin + °&-ketoglutarat -EEE-9 pyruvat + glutamat (H) Undersökning av glutamat-oxaloacetat-transaminas (GOT)- aktivítet: aspartat + 0<~ketoglutarat --§9I- oxaloacetat + glutamat oxaloacetat oxaloacetatdekarbooxilaspyruvat + C02 7902648-Û 13 (5) Undersökning av glycerol eller glycerofosfokínas (GK)- aktivitet: glycerol + ATP --Eg-+ glycerol-3-fosfat + ADP ADP + fosfoenolpyruvat --EK-f> pyruvat + ATP (6) Undersökning av triglyceridz tríglycerid lipas eller 1ipoprotein1ipasglycerOl_3_ fosfat + ADP ADP + fosfoenolpyruvat -~2š-w> pyruvat + ATP (7) Undersökning av kreatinin eller kreatininfosfokinas (CPK): kreatinas kreatin + ATP --Egg-> kreatinfosfat + ADP PK kreatin kreatin ADP + fosfoenolpyruvat pyruvat + ATP (8) Undersökning av myokinas: ATP + AMF -9ï95i5ɧ+>2 ADP ADP + fosfoenolpyruvat --EK-f> pyruvat + ATP (9) Undersökning av fettsyra eller tiokinas-aktivitet: fafryacid + COA + ATP~Éí95É9Éí> acy1¥coA + AMP + PPi AMP + ATP-9¥95i9Éí> 2 ADP ADP + fosfoenolpyruvat --25-> pyruvat + ATP Dessa enzymreaktioner är endast nämnda som exempel; de pyruvatbildande reaktionerna kan genomföras med hjälp av olika kombinationer av enzymer och dessas substrat, exempelvis biologiska prov. Såsom exemplifierat i det ovanstående kan undersökningen tillämpas icke endast på undersökningar av pyruvat, utan även på undersökning av enzym, enzymaktívitet eller substrat.
Undersökningen genomförs genom inkubering av provet med reagensblandningen. Denna är lämpligen en sammansättning av nödvändiga reagenser. Att mäta den förbrukade syremängden med hjälp av en mätare för upplöst syre lämpar sig för under- sökningsmetoden. I detta fall är någon indikator för väteperoxid ej nödvändig. För att undersöka den framställda komponenten är det lämpligt att mäta väteperoxidmängden, exempelvis medelst en väteperoxid-elektrodmätare såsom YST-oxidasmätare eller kolorimetriskt eller fluorometriskt med en indikator för väte- peroxid. Undersökningen kan lämpligen genomföras under 10 - so min vid 20 - un°c. 7902648-0 in En indikator för väteperoxid är en kombination av en eller flera kromogena eller fluorescenta ämnen som åstadkoms genom koppling med väteperoxidkällan. Ett exempel på sådana indika- torer är en kombination av fyrvärda titanföreníngar och xylenol-orange-som kopplas med väteperoxid för att bilda stabil röd färg, eller en kombination av fenol eller N,N-dimetyl- anilin eller homovanillinsyra, H-aminoantipyrin och peroxidas för mätning av färg eller fluorescens. U-aminoantipyrin kan ersättas med H-aminofenazon. En kombination av 2,6-dik1o- rofenol, indofenol pch peroxidas och av guaíacol och peroxidas kan likaledes komma till användning. Indikatorn kan i förväg beredas som lösning. Kolori- eller fluorometriska undersök- ningar kan genomföras genom att mäta absorptionen vid en våg- längd såsom 565 nm.
Mängden av pyrodruvsyran kan mätas genom uträkning från motsvarande standardkurvor för förbrukad syre eller alstrad väteperoxid.
Fosfat som förbrukad komponent eller acetylfosfat som alstrad komponent kan likaledes undersökas medelst någon lämpligometod.
Såsom förklaras i det ovanstående kan en sammansättning av reagenser användas för analysering, speciellt diagnostisk analysering, innefattande pyruvatoxidas och dettas tillämpning på olika undersökningsmetoder. Närmare bestämt och såsom be- skrivs i det ovanstående: diagnostisk analyseríng såsom analys av pyruvat i detta innehållande reagens eller i serum eller urin, undersökning av enzymaktivitet av LDH, pyruvatkinas, GPT, GOT, glycerolkinas, lipas, lipoproteinlipas, kreatininfosfo- kínas, myokinas eller tiokinas, och analys av biologiska komponenter såsom laktat, ADP, glycerol, triglycerid, kreatinin eller fettsyra kan med fördel utföras medelst sammansättningen och metoden enligt uppfinningen.
Följande exempel förklarar utföringsformerna av upp- finningen. 7902648-0 Exemgel l Ett medium (varje medium 100 ml, pH 7) innefattar glukos (1 %); jästextrakt (0,5%), NaCl (0,2%) KH2POu (0,1%), KQHPOH (0,l%), MgS0u (0,05%) och CaCO3 (0,3%) och sterili- seras i en Erlenmeyer-flaska vid l20°C under 20 min. I varje medium okuleras bakterier av stammarna Pediococcus sp B-0667 FERM-P nr UH38, Streptococcus sp B-0668 PERM-P nr MRBS. Aero- coccus viridans IFO-12219 eller Aeroccccus viridans IFO-123 17 och odlas under skakning vid 3000 under 20 h vid 300 vpm.
Därefter samlas de odlade cellerna genom centrifugering och tvättas med 10 mM fosfatbuffert (pH 6,5) och centrifugeras på nytt för att uppsamla bakterínellerna. De sålunda erhållna cellerna suspenderas 1 den 10 mM buffert (10 ml, ph 7,0), innehållande 0,02% iysozyn och o,1% TRITON x-1ooRa1ky1-ary1- polyetenalkohol, ett nonjonaktivt medel från Rohm and Haas Co, USA och inkuberas vid 3700 under 60 min. Den genom centrifu- gering erhållna produkten samlas. Den innehåller pyruvat- oxidas. Den förefintliga enzymaktiviteten av produkten visas i den följande tabellen Släkt enzymaktiviteten B-0667 0,50 B-0668 0,38 IFO-12219 0,52 IFO-12317 0,06 Exemgel 2 Ett medium (20 1) bestående av samma komponenter som beskrivs i exempel l steriliseras medelst ånga i en 30 l odlingstank. Odlad buljong (200 ml) Pediococcus sp B-0667 FERM-P nr HH38, som odlades på samma sätt som i exempel 1, tillsätts och det hela odlas nu vid 30°C under 20 h. Genom centri- fugering samlade bakterieceller (ungefär 100 g) suspenderas i lysozymlösningen (0,2 mg/ml, H l), dessutom tillsätts TRITON X~l00R (H g), EDTA (3 g) och l M fosfatbuffert (pH 6,5, H0 ml). Det hela omrörs vid 3700 under 80 min. Till den därefter genom centrifugering erhållna produkten sätts ammoniumsulfat, 7902648-0 16 och utfällningen samlas genom centrifugering vid 0,50 - 0,73 mättnadsgrad. Fällningen upplöstes i 10 mM fosfatbuffert (pH-värde 6,5, 1000 ml) (5160 U, utbyte 86 %), därefter till- sättes kall aceton (0,65 volymer) och oren fällning fråncepare- rades. Ytterligare aceton (0,3 volymer) tillsattes och utfäll- ningen, som samlats genom centrifugering upplöses i 10 mM fosfatbuffert (pH 6,5, 70 ml) (H750 U, utvinning 79,2 %).
Till lösningen sattes ammoniumsulfat och utfällningen upp- samlades vid 0,50 - 0,70 mättnadsgrad genom centrifugering.
Efter upplösning av utfällningen i l0 mM fosfatbuffert (pH 6,5) överfördes lösningen till en kolonn av SEPHADEXR tvärbunden dextrinmolekyisikt från Pharmaoia (6 x 70 cm), och den fraktion som visar absorbering vid 280 nm, samlas upp.
De aktiva fraktionerna sammanslås och frystorkas för att erhålla pyruvatoxidas i pulverform (39N0 U, 758 mg, utbyte 55,7 %).
Exempel 3 Efter upplösning av utfällningen i 10 mM fosfatbuffert (pH 6,5) fylls lösningen i en kolonn av SEPHADEXR (6 x 70 cm), och den fraktion som visar absorbering vid 280 nM uppsamlas.
De aktiva fraktionerna sammanslås och frystorkas för att erhålla pyruvatoxidas i pulverform (39H0 U, 758 mg, utvinning 65,7%).
Exempel 3 En sammansättning för pyruvatanalys (vid användning av syreelektrod): pyruvatoxidas framställt enligt exempel 2 (samma som i de följande exemplen). 300 U FAD 0,5 pmol tiaminpyrofosfat 10 pmol Mnclq 25 nmol « 0,2 É fosfatbuffert (pH 7,5) 1,0 ml sackaros 0,5 g 0,2 M dimetylglutarat-NaOH-buffert (ph 7,5) 5 ml 7902648-0 17 Ovanstående blandning lyofiliseras för att förbereda sammansättningen för undersökning av pyrodruvsyra (för syre- elektrodmätning, 50 tester).
Exemgel H En sammansättning för pyruvatanalys (för kolorimetrisk undersökning): Reagens'(I) pyruvat oxidas 200 U FAD 0,5 pmol tiaminpyrofosfat 10 pmol 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) 1,0 ml sackaros 0,5 g 0,2 M dimetylglutarat-NaOH-buffert (ph 7,5) 0,5 ml peroxidas (100 U9mg, hästrädisperox- idas) 2,5 mg 0,3 % H-aminoantipyrin 5 ml Ovanstående blandning lyofiliseras för att förbereda rea- gensen (I) för sammansättningen för pyruvatanalys (för kolori- imetri, 50 tester).
Ett ytterligare reagens (II9)består av 0,2% vattenlösning av N,N-dimetylanilin, innehållande 25 pmol MnCl2 (50 ml) och brytreagens (III) bestående av 0,1 M citratbuffert (pH 5,0, 100 ml), innehållande 0,1 M EDTA tillfogas.
Exemgel 5 En sammansättning enligt exempel 3 upplöses i destillerat vatten (50 ml) och en provmängd lösning (1,0 ml) därav införs i ett reaktionskärl. Härtill sätts 5,0 mM pyruvatlösning (var och en 0-100 pl), eller mänskligt serum 50 pl och 5,0 mM pyruvatlösning (var och en ytterligare 0-100 ul) och lösningen inkuberas vid 37°C, varefter syreförbrukningen uppmäts medelst en galvanisk syreelektrod. Resultaten redovisas i fig. H.
Vidare upplöstes en sammansättning enligt exempel 3 i destillerat vatten (25 ml) och en provmängd lösning (0,5 ml) 7902648-og 18 därav infördes 5 ett reaktionskärl, varefter inkuberades med tillsättning av vattenlösning (0,5 ml) innehållande mänsk- ligt serum (0-0,5 ml) vid 37°C. I fig. 5 visas resultatet av undersökningen av syreförbrukningen, uppmätt medelst galvanisk syrelektrod.
Såsom visas i fig. H och 5 förefinns goda linjära för- hållanden.
Exempel 6 7 Det lyofiliserade reagenset (I) enligt exempel H upplöses genom tillsättning av reagens (II) (50 ml) och varje provmängd lösning (1 ml) i små teströr inkuberas vid 37°C. Härtill sätts 5 ml kaliumpyruvatlösning (var och en 0 - 50 pl), och mänskligt serum (50 pl) tillsätts med 5 mM kaliumpyruvatlösning (var och en 0 - 50 pl) och inkuberas vid 37°C under 10 min. Brytlösning (2 ml) tillsätts, varefter absorberingen mäts vid 565 nm.
Såsom visas i fig. 6 förefinns goda linjära förhållanden, kvan- titativa resultat vid de ovan visade undersökningarna och även när detta resultat sammanfaller med kalibreringskurvan för väteperoxid (2,5 mM'H2O2, 0 - 50 pl).
Ytterligare alikvota prov av mänskligt serum (0 - 0,5 ml) införs i små teströr och justeras till 0,5 ml genom att till- sätta destillerat vatten. Varje lösning (1,0 ml) av reagens (I) med tillsats av reagens (II) enligt exempel H sätts till och inkuberas vid 37°C under 10 min. Reaktionen avbryts genom att tillsätta brytreagens (III) (1,5 ml) och undersöks kolori- metriskt vid 565 nm. Såsom visas i fig. 7, erhålls ett gott kvantitativt resultat.
Exempel 7 Reaktionsblandning: 0,2 M dímetylglutarat-NaOH-buffert (pH 7,5) 0,2 ml 10 mM_MnCl2 50 pl 0,2% N,N-dimetylanilin 0,2 ml 0,3% H-aminoantipyrin 0,1 ml -peroxidas (45 U/ml) 0,1 ml 10 mM~tiaminpyrofosfat 20 pl 0,2 M fosfafbufferr (pH 7,5) 25 ,u1 20 mM fosfoenolpyruvat 0,1 ml 7902648-0 19 pyruvatkinas (HOOU U/ml) 5 ml 5 mM ADP 0 - 50 pl Ovanstående reaktionsblandning justeras till 1,0 ml genom tillsats av destillerat vatten, förínkuberas vid 37°C, varefter lösningen av pyruvatoxidas (200 U/ml, 20 pl) till- sätts, och inkubenas vid 37°C under 10 min. Efter avbrytning av reaktionen genom tillsats av 0,1 M citratbuffert (pH 6,0, 2,0 ml) mäts absorberlngen vid 565 nm. Såsom visas i fíg. 8, erhålls goda kvantitativa resultat vid ADP-undersökningen genom att bestämma väteperoxíd som uppstår i reaktionsblandningen' av ADP, pyruvatkinas, fosfoenolpyruvat och annat.
Enligt fig. 8 föreligger god linearitet om 2,5 mM väte- paoxid används istället för 5 mM ADP.
Exempel 8 Triglycerid-undersökningssammansättning: Reagens (I): 0,2 M dimetylglutarat-NaOH-buffert (pH 7,5) 10 ml 0,3% H-amínoantipyrin 5 ml peroxidas (100 U/mg) 2,5 mg tiaminpyrofosfat 10 pmol 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) l,25 ml fosfoenolpyruvat l00 umol pyruvatkinas (0000 U/ml) -0,1 ml pyruvatoxidas (200 U/ml) 2 ml lipoproteinlipas (3000 U/ml) 0,5 ml glyeerolfosfokinas (300 U/ml) 1,0 ml ATP 100 pmol Ovanstående reagens lyofiliseras.
Reagens (II): 25 pmol MnCl2 i 0,25 dimetylanilin 50 ml Reagens (III) (brytlösning): 0,1 M EDTA i 0,1 M citratbuffert (pH 6,0) 100 ml 790264841, 20 Reagens (I) enligt exempel 8 upplöses i reagens (II) och varje alikvot lösning (1,0 ml) därav fylls i teströren.
Varje alikvot prov (0 - 50 pl) av mänskligt serum, inne- hållande 1,02 pmol/nl triglycerid, 5 mM glycerollösning, H,2 mM trioleín i 0,l% TRITON X-l00R-lösning eller 2,5 mM väte- 'peroxid~lösning tillsätts och inkuberas vid 37°C under l0 min.
Såsom framgår av fig. 9 förefínns god linearítet. Éxemnel 9 iReagens (I) enligt exempel 8 upplöses i reagens (II) och varje alíkvot lösning (1,0 ml) därav fylls i teströren.
Varje provmängd (0- 50 pl) av mänskligt serum, innehållande 1,02 pmol/ml triglycerid, 5 mM glycerollösning, H2 mM triolein i 0,1 % TRITON X~l00R-lösning eller 2,5 mM väteperoxid- lösning, tillsätts och inkuberas vid 37°C under 10 min. Såsom framgår av fíg. 9 förefínns god linearitet.
Exemgel 10 Sammansättning för undersökning av serum-transaminas för 100 tester: (1) sammansättning för GTP-undersökning (för 100 tester): Reagens (I): lyofiliserat reagens, bestående av följande: pyruvatoxidas H00 U FAD 500 nmol tiaminpyrofosfat 150 mmol L-alanin 20 mmol m~ketoglutarat 1 mmol sackaros l g U-aminoantipyrin 150 mmol peroxidas H50 U 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) “ 2,5 ml 0,2 dimetylglutarat-NaOH (pH 7,5) 30 ml Reagens (II) (100 ml används för reagens (I): 42 pmol MnCl2 i 0,2% dimetylanilin-lösning 210 ml Reagens (III) (brytlösning) 200 ml för rea- gens (I) ' 2,0 ml 7902648-0 för l test: 0,1 M EDTA i 0,2 M citratfubbert (ph 5,0) H20 ml (2) sammansättning för GOT-undersökning(för 100 tester): Reagens (1) lyofílíserat reagens, bestående av följande: pyruvatoxidas H00 U FAD 500 nmol tíaminpyrofosfat 150 mmol L-asparaginsyra 20 mmol m -ketoglutarat _ l mmol oxaloacetatdekarboxylas 200 U sackaros 1 g U-aminoantipyrin 150 mmol peroxidas H50 U 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,5) 2,5 ml 'o,2 aimefylglufaraf-Naon-buffert (ph 7,5) so mi Reagens (II) och reagens (III): samma som ovanstående (l).
Exempel ll Reagenserna (I) enligt exempel 10, (I) (för GPT-aktivi- tetsundersökning) och (2)(för GOT-aktivítetsundersökning) upplöses vart och ett genom att tillsätta reagens (II) (100 ml).
Varje provmängd (1,0 ml) av lösningen införs i små teströr och förinkuberas vid 370C under 5 min (förinkuberad lösning av reagens (I). Standardserumlösníngen (20 pl) (MAXITOLR, Calbi- chem Co, innehållande GPT 700 K U/ml och GOT 1000 K U/ml), utspädd i ett konstant förhållande, tillsättes och inkuberas vid 37oC under 10 min. Reaktionen avbryts genom tillsats av brytreagens (III) (2,0 ml) och absorptíonen mäts vid 565 nM.
Såsom visas i fig. 10 företer de båda enzymaktiviteterna wlinearitet ända upptill den optiska tätheten av ungefär 1,0 (enzymaktivitet: ungefär 750 K/ml). ÉÄÉEBEÄIÄÄ a Till varje förinkubcrad lösning av reagens (I), erhållen ~ i exempel ll, sätts 20 pl mänskligt serum (H5 prov) och in- 2? 7902648-0 kuberas vid 37°C under 20 min. Brytreagens (III) (0,2 ml) tillsätts och absorptionen mäts vid 565 nm.
Samma prov av mänskligt serum undersöks medelst LKB- metoden (UV-absorberingsmetoden, GOT-undersökníngssammansätt- ning och GPT-undersökningssammansättning, framställda av LKB Corp) och korreleras med GPT- och GOT-aktiviteten.
AV fig. ll framgår korrelationskoefficienten: r = 0,968 och regressíonsekvatíonen: y = 0,00295 x + 0,Û032 för GPT- undersökningen.
Av fig. 12 framgår korrelàtionskpefficienten: r = 0,966 och regressionsekvationen: y = 0,00287 x + 0,0l80.

Claims (1)

1. 7902648-0 23 P A T E N T K R A V Förfarande för framställning och isolering av pyru- vatoxidas, k ä n n e t e c k n a t av att de pyruvatoxidas~ producerande mikroorganísmerna Aerococcus víridans IFO~l22l9 eller Aerococcus viridans IFO-12317 odlas i ett näringsmedium och att bildat pyvuvatoxidas isoleras från de från närings- medlet framställda cellerna genom att cellerna sönderdelas på mekanisk eller enzymatisk väg och att pyruvatoxidaset ut- vinnes ur cellmassan.
SE7902648A 1978-03-25 1979-03-23 Odling av aerococcus viridans ifo-12219 eller ifo-12317 och isolering av pyruvatoxidas derur SE445928B (sv)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3468778A JPS5840465B2 (ja) 1978-03-25 1978-03-25 ピルビン酸オキシダ−ゼの製造法
JP8635078A JPS5915637B2 (ja) 1978-07-14 1978-07-14 ピルビン酸オキシダ−ゼを用いる分析用キツトおよび分析法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE7902648L SE7902648L (sv) 1979-09-26
SE445928B true SE445928B (sv) 1986-07-28

Family

ID=26373526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE7902648A SE445928B (sv) 1978-03-25 1979-03-23 Odling av aerococcus viridans ifo-12219 eller ifo-12317 och isolering av pyruvatoxidas derur

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4246342A (sv)
CA (1) CA1143640A (sv)
DE (2) DE2954385C2 (sv)
DK (1) DK156253C (sv)
FR (2) FR2420760B1 (sv)
GB (2) GB2043650B (sv)
IT (1) IT1165650B (sv)
SE (1) SE445928B (sv)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4246342A (en) * 1978-03-25 1981-01-20 Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Process for the manufacture of pyruvate oxidase, and analytical method and kit for the use of the same
DE2950381A1 (de) * 1979-12-14 1981-06-19 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zur bestimmulng von triglyceriden
US4316954A (en) 1980-04-18 1982-02-23 Eastman Kodak Company Assay for neuraminic acids
JPS57144996A (en) * 1981-02-27 1982-09-07 Fuji Photo Film Co Ltd Film for quantitative analysis
JPS57208998A (en) * 1981-06-17 1982-12-22 Fuji Photo Film Co Ltd Multi-layered analytical film for determination of transaminase
DE3221730A1 (de) * 1982-06-09 1983-12-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und analytische mittel zur aktivitaetsbestimmung von glutamat-oxalacetat-transaminase
DE3306719A1 (de) * 1983-02-25 1984-08-30 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Pyruvatoxidase
JPS6034181A (ja) * 1983-08-04 1985-02-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ノイラミニダ−ゼの製造法
IT1205338B (it) * 1983-08-09 1989-03-15 Miles Italiana Composizione e metodo per la determinazione enzimatica di urea in liquidi organici
US4812400A (en) * 1986-07-14 1989-03-14 Steinman Gary D Process for measuring sodium levels in biological fluids
US4965194A (en) * 1986-08-21 1990-10-23 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Pyruvate oxidase and an analytical method using the same
JPS63137699A (ja) * 1986-11-28 1988-06-09 Fuji Photo Film Co Ltd 酵素活性測定用分析要素
EP0274425B1 (en) * 1987-01-06 1993-12-15 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Pyruvate oxidase, its preparation and use
JP3034969B2 (ja) * 1991-03-01 2000-04-17 旭化成工業株式会社 アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物
US5462858A (en) * 1993-12-29 1995-10-31 Eastman Kodak Company Dry multilayer analytical elements for assaying transaminases
JP4707237B2 (ja) 1999-03-17 2011-06-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 外因性アミノ酸および新規ａｔｐ再生システムを用いたインビトロ高分子生合成の方法
US7410755B2 (en) * 2005-02-22 2008-08-12 Discoverx ADP detection using an enzyme-coupled reaction
CN101177686B (zh) * 2006-11-10 2011-05-18 中国科学院上海生命科学研究院 一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK678474A (sv) 1974-02-15 1975-10-13 Hoffmann La Roche
US4246342A (en) 1978-03-25 1981-01-20 Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Process for the manufacture of pyruvate oxidase, and analytical method and kit for the use of the same

Also Published As

Publication number Publication date
GB2043650A (en) 1980-10-08
GB2020018B (en) 1982-11-10
DE2954385C2 (sv) 1989-10-26
DK119679A (da) 1979-09-26
SE7902648L (sv) 1979-09-26
DK156253C (da) 1989-12-11
FR2420760A1 (fr) 1979-10-19
DE2911481A1 (de) 1979-10-04
FR2420760B1 (fr) 1985-04-19
CA1143640A (en) 1983-03-29
FR2436182B1 (sv) 1983-09-09
DE2911481C2 (de) 1985-01-24
IT7967627A0 (it) 1979-03-26
GB2043650B (en) 1982-10-20
US4246342A (en) 1981-01-20
IT1165650B (it) 1987-04-22
GB2020018A (en) 1979-11-07
FR2436182A1 (fr) 1980-04-11
DK156253B (da) 1989-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE445928B (sv) Odling av aerococcus viridans ifo-12219 eller ifo-12317 och isolering av pyruvatoxidas derur
EP0204283A2 (en) Uricase and a method for the preparation thereof
US4135980A (en) Choline oxidase
CA1215903A (en) Assay method for component relating to lipids, composition for assay and process for production of enzyme used therefor
AU722636B2 (en) Method for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol
US4740465A (en) Heat-resistant sarcosine oxidase N and process for producing the same
US4816393A (en) Nucleoside triphosphate-dependent 1-methylhydantoinase, a process for obtaining it and the use thereof
CA1130739A (en) Lactate oxidase, process for manufacture thereof and analytical method and kit for the use of the same
JPH0284178A (ja) Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット
Rock et al. Isolation and characterization of two methanol-utilizing bacteria
US4965194A (en) Pyruvate oxidase and an analytical method using the same
US4960701A (en) N-acetylmannosamine dehydrogenase, process for its production, method for quantitatively analyzing N-acetylmannosamine or sialic acid, and kit for the quantitative analysis
EP0089210A2 (en) Reagent for assaying cholinsterase
US4276377A (en) Creatinine iminohydrolase free from urease activity
CA1125205A (en) PROCESS FOR PRODUCTION OF L-.alpha.-GLYCEROPHOSPHATE OXIDASE
SE441931B (sv) Forfarande och medel for bestemning av pyrodruvsyra eller pyruvat
JPH0284177A (ja) Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ
JPH01265899A (ja) トリグリセリドの分析用試薬および分析方法
JPS6368099A (ja) ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬
DK158681B (da) Udstyr til pyrodruesyreanalyse.
JPH066075B2 (ja) Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法
JPS5915637B2 (ja) ピルビン酸オキシダ−ゼを用いる分析用キツトおよび分析法
JPS63148998A (ja) Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量方法及びその定量用キツト
JP2000093196A (ja) カイロイノシトールの定量方法
JPH0833482A (ja) 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 7902648-0

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed

Ref document number: 7902648-0

Format of ref document f/p: F