JP2018514794A - 安定なナノ磁性粒子分散 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年5月1日に出願された同一名称を有する米国特許仮出願第62/156,141号(弁理士整理番号BLD−0010−PV)の優先権を主張し、その内容がいずれかおよびすべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。
従来技術の当業者は、次の詳細な記載が本発明の特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、そのため代表的なだけであり、本発明の実際の範囲を示さないことを認識するであろう。本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明される特定の態様および実施形態に限定されず、これらは変わり得るということが理解される。また本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、添付の請求項によって定められる本発明の範囲を制限することは意図されていないことが理解されるべきである。
生物学的材料またはサンプルの成分を分離するために知られている技術の中でも、磁気分離技術を使用するものである。磁気分離法は、一般的には磁場に配置されたチャンバーまたはカラムに磁性材を選択的に保持する。このような方法は一般的に生物学的材料またはサンプルを1つ以上の分離カラムに通すことを含む。簡単に説明すると、生物学的材料またはサンプルは本発明の標的化ナノ磁性粒子に、この粒子と共役体化された標的化部分の使用を通して結合することによって磁気的に標識され、標的化部分はサンプルに存在することが分かっている、または疑われる、例えば同サンプルに存在することが分かっている、または疑われる特定細胞の表面上に提示された、所望(または「標的」)生体分子を標的にする。標識された標的サンプルの懸濁液は、つぎに分離チャンバーまたはカラムに加えられる。標識された生体分子種を反応混合物の残留物から分離するため、標的にされた生物学的材料は磁場の存在下でチャンバーに保持される。保持された標的化生物学的材料は、ついで磁場の強度を変える、または磁場を除くことによって溶出することができる。
磁性酸化物であるフェライトおよび非フェライトの2クラスを、本発明の標的化ナノ磁性粒子の作製に使用することができる。フェライト、または鉄含有遷移金属酸化物は、一般的にXO・Fe2O3として表すことができ、ここで「X」はFe、Ni、Cr、Co、Mn、Mg、Mo、Gd、Cu、V、Dy、Ey、Tm、またはYbである得る。従って、マグネタイトスーパークラスターを合成する過程では、Fe2+含有鉄塩を前述の二価金属イオン塩の1つで置換する。フェライトのこのクラスで最も好ましいものはFeO・Fe2O3であり、マグネタイトまたはFe3O4として良く知られている。磁性酸化物の非フェライトクラスは鉄原子を欠如しているが、代わりにCr、Co、Mn、Ni、Mo、Gd、Dy、Ey、TmおよびYbであるこれら遷移元素の2つ以上のイオンの組み合わせによって置換されている。このような非フェライトベースの磁性酸化物は、一般的には着色したナノ磁性粒子のスペクトルを生じるが、磁性酸化物のフェライトクラスよりも磁気的な反応性が低い。
本発明の標的化ナノ磁性粒子は多くのインビボ診断および治療での使用に適応することができ、イメージング、細胞療法、および治療剤の細胞への送達が含まれる。
現在、多くのヒト疾患が標準的な医薬品によって満足のいく治療がなされていない。これらの疾患のいくつかでは、細胞療法が魅力的な選択肢である。細胞ベース療法は一般的に細胞製品の重要な取り扱いおよび処理を必要とする。現在の細胞療法は医薬品適正製造基準(GMP)を含む、製造および規制要求事項に適合するかなりの規模の施設および装置を一般的に必要とし、それには適切に清浄な場所の使用ならびに部屋、装置、製品、品質管理、および品質保証手順を、サンプルの汚染がなく無菌を確実に維持する条件下で維持するための職員を含む。細胞ベース製品は一般的には別のデバイスおよび使い捨て品の組み合わせを用いて処理される。このような工程における製品および試薬の移し変えは手動および/または自動化であることができる。
本発明の標的化ナノ磁性粒子はまた、多くのインビトロ診断および治療利用に適応することができる。磁性粒子は従来から真核細胞、細菌種、核酸、およびタンパク質を単離するために使用されている。粒子単離または細胞分離に加え、磁性ナノ粒子は粒子表面に細胞活性化リガンドをコーティングすることによって細胞を刺激または活性化するためにも使用されており、生物学的な系でしばしば重要である標的結合の三次元全体の特徴が、溶液相活性化プロトコルと比べて正確に再現される。ここ数年で、磁性粒子はさらに新しいインビトロ試験での使用について研究されている。これらの例には、ナノ磁性粒子の健康への影響の可能性の評価(Kevinら,Biosensors and Bioelectronics,43,88(2013))およびsi−RNAの送達のためのナノテクノロジーをベースとしたシステム(Dim,ら,J.Nanobiotechnology,13,61(2015))の評価が含まれる。ナノ粒子はまた、癌の治療のために局所化磁気体温上昇状態を発生させることができる標的化加熱成分としての用途に関する試験が研究および開発されている(Makridis,ら,Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.,63,663(2016))。
次の例は本発明の特定の態様を説明してその実施において従来技術の当業者を補助するために提供される。これらの例はいずれの方式においても本発明の範囲を制限するものと決して考えられるべきではなく、適用可能な技術における基本的またはそれ以上の技術を有する当業者は、本明細書が全体を通して本発明を説明し、目的を実施して記載された目標および利点、ならびに本明細書における本来のこれらを得るように簡単に応用することができることを容易に認識するであろう。
この例は、本発明で使用するためのシラン化BSA/デキストランコーティングナノ磁性粒子を合成するための好ましい方法を説明する。この合成は3段階で実施され、最初に裸(未コーティング)のマグネタイトスーパークラスターの合成、続いてこれらのスーパークラスターのシラン化、最後にBSA/デキストランの混合物を用いたタンパク質/ポリマーコーティング段階を含む。
EDTA、EGTAのようなより一般的に知られているキレート剤ならびに弱塩基および弱酸のような電解質は、これらが沈殿物をコロイドゾルに分散させるのに役立つ場合に解膠剤と呼ばれる。この例では、強イオンキレート剤であるEGTA(シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)が上記例1によるマグネタイトスーパークラスターの形成後直ちに加えられる(0.25モルEGTA/1モル鉄)。このキレート化段階は、70℃で1時間進めてから上記例1のようにマグネタイトスーパークラスターを洗浄する。開始時のマグネタイトスーパークラスターの約2.5μmのサイズとは異なり、これらのEGTA解膠化マグネタイトスーパークラスターは、通常約1μmの流体力学的直径を有し、このようなサイズ低下はマグネタイトスーパークラスターの良好な分散の指標である。
上記例1で得られる最初の高磁場洗浄上清は、磁性粒子が約70nmの流体力学的サイズを有し、最初に市販のHGMS「XS」カラム(カタログNo.130−041−202、Miltenyi Biotec、サンディエゴ,カリフォルニア州)を用いてHGMS精製を実施し、過剰なコーティング試薬を取り除くために小さい強磁性ビーズとともにパッキングする。「XS」カラムを2インチ×1インチ×0.25インチ厚の「N極」面および同一サイズの「S極」面磁石を互いに対して配置することによって生じる均一な磁場に配置した。「XS」カラム/磁石アセンブリをペリスターポンプに接続してナノ磁性粒子の迅速な自動化処理を容易にした。
上記例1によって作製された直径115nmのBSA/デキストランコーティングナノ磁性粒子を上記例3で説明された方法に従ってストレプトアビジンに共有結合によって共役体化し、直径135nmのストレプトアビジン共役体化ナノ磁性粒子を作製した。このナノ粒子を室温で高イオン強度溶液(1MのNaCl)に再懸濁させて保存した後、粒子サイズ測定を様々な時点で実施した。コントロールサイズ測定を、BSAおよびアジ化ナトリウムを添加した低イオン強度緩衝液である通常の保存緩衝液において同一ナノ粒子で実施した。下記の表2は、この試験の結果を示す。この試験は、本発明のナノ磁性粒子の凝集に対する著しい耐性および増強されたコロイド安定性を実証する。
図2は本発明に従って作製された様々なナノ磁性粒子の磁気分離効率を示し、粒子には直径113nmのBSA/デキストランコーティング、127nmの抗体共役体化粒子、および130nmのストレプトアビジン共役体化粒子を含み、後者の2種は上記例3で説明された方法を用いて共役体化される。この試験は米国特許番号5,186,827号に記載されるように作製された4極子磁気分離装置を用いて実施し、等張リン酸緩衝化生理食塩水のような生理学的緩衝液に25μg/mL鉄を含む希釈ナノ磁性粒子懸濁液を加えた標準的な12mm×75mm使い捨て検査室試験チューブに適合するように設計された。試験チューブで使用する同様な強磁気分離装置は、StemCell Technologies(パーツ番号18000、Vancouver、ブリティッシュコロンビア、カナダ)から市販されている。図2はこれらすべての前述のナノ磁性粒子がわずか数分以内で素早く定量的に分離することを示す。
下記の表3は、上記の例1に従って6ヶ月間にわたって合成されたBSA/デキストランコーティングナノ磁性粒子の異なるロットの非特異的結合(NSB)を示す。この試験では、マウス脾臓細胞(全細胞1×107個/チューブ)を比較的多数のナノ磁性粒子(約2000粒子/細胞またはサンプルあたりの総粒子数2×1010)と4℃で20分間インキュベーションした。そして細胞/ナノ磁性粒子反応混合物を4極子磁気分離装置によって磁気を用いて正確に5分の磁気分離時間で2回洗浄した。
下記の表4は、直径127nmの抗マウスCD4ラット抗体(クローンRM4−5、カタログNo.100506、BioLegend Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州)共役体化ナノ磁性粒子(上記の例3で説明されたように調製)のマウス脾臓細胞による力価結果を示す。この力価は細胞に対する粒子の比500:1〜1500:1を用いて実施した。使用したプロトコルは上記の例6で前述されたものと基本的に同じであるが、ただし過剰なナノ磁性粒子の除去後、適切な蛍光色素共役体化抗体(表現型決定目的のため)による追加インキュベーションを実施し、細胞をフローサイトメトリー(CellQuestソフトウェアを用いたFACSCalibur、BD Biosciences,サンディエゴ、カリフォルニア州)で分析して、磁気によって選択された細胞の純度のパーセントを測定した。
この試験は、さらなる識別のために高い収率および純度で対象の標的細胞を単離することに関して、本発明のナノ磁性粒子の生物医学的有用性を明確に説明する。
この市販磁性粒子は信頼性および再現性のある結果を得ることができるような十分幅広い細胞に対する粒子の使用比を示さず、従って、このような従来の磁性粒子はHGMS型磁気分離法での使用には適さないことを示した。これらの磁性粒子による力価での収率の急速な低下は、HGMSカラムにおける金属(または強磁性)マトリックスでの比較的大きなサイズの磁性粒子の捕捉による可能性が最も高く、脱磁気化HGMSカラムに保持された磁気標識細胞の不十分な回収をもたらす。従来技術の当業者が認識しているように、このような従来の磁性粒子は前述の試験で使用されたような4極子型磁気分離装置などの強い外部磁場磁気分離装置でのみ実際に使用することができる。
本発明のナノ磁性粒子の長期安定性を評価するため、ストレプトアビジン−および抗マウスCD19ラット抗体−共役体化粒子を上記の例1および3に従って調製した。そして、これら粒子の複数の少量小分けを異なる3種の温度(4℃、25℃、および37℃)で保存し、磁気細胞分離試験を2ヶ月にわたって様々な時点で実施して、これらナノ磁性粒子の全体的な生物学的安定性をモニタリングした。BioLegendのMojoSortTMマウスCD4 T細胞分離キット(カタログNo.480005)は陰性選択検査であり、ビオチニル化抗体のカクテルで結合させたストレプトアビジンナノ磁性粒子を使用して、CD4陰性であるすべての細胞を磁気によって選択する。さらに、BioLegendのMojoSortTM緩衝液およびMojoSortTMマグネットを本例で説明された細胞選択プロトコルの実施で使用した。磁気分離段階から得られる「手つかず」細胞または上清は所望のCD4陽性細胞を含んだ。これらの「手つかず」細胞をつぎにフローサイトメトリー(CellQuestソフトウェアを用いたFACSCalibur、BD Biosciences,サンディエゴ、カリフォルニア州)で分析して、標的としたCD4陽性細胞の純度および収率を測定した。同様な分析をBioLegendのMojoSortTMマウスCD19ナノビーズ(BioLegend,カタログNo.480001)も用いて実施し、抗マウスCD19ラット抗体共役体化ナノ磁性粒子を使用してCD19陽性細胞を陽性処理によって選択した。
標的化細胞分離市場で利用率が高い様々な従来の市販磁性粒子の粒子サイズ分布を測定して、上記の例1を用いて作製したものと比較した。これらの測定は動的光散乱(Malvern Nano−S ZetaSizer、ウェストボロー、マサチューセッツ州)を用いて実施し、図8に示すように、様々な「サイズビン」における粒子の割合を実際の粒子サイズに対してプロットした。流体力学的直径を、「動的光散乱」の原理を使用するMalvern Nano−S ZetaSizer装置で測定し、これによって粒子はレーザーで照らされて散乱光が強度変動について分析される。本発明のナノ磁性粒子(図8で「BioLegend」と表示)は約130nmの流体力学的直径および直径が約300nmを超える比較的わずかな数の粒子を有した(磁性粒子を「外部磁場」および「内部磁場」に基づいた磁気分離装置の両方で十分同じように実施するために重要な基準)。図8で「従来粒子A」と表示された粒子は約82nmの流体力学的直径を有し、従って、「内部磁場」発生またはHGMSカラムでの使用にのみ適しているであろう(上記の図3も参照)。
本試験では、細胞を市販のHGMS適合性磁性粒子(図9、パネルA)および本発明の標的化ナノ磁性粒子(図9、パネルB)の両方を用いて、HGMSによって磁気的に選択した。図9に示す代表的な電子顕微鏡写真は、磁気によって選択された細胞の55nm凍結切片を用いて得、透過型電子顕微鏡で画像化した。C57BL/6マウス脾臓由来の単一細胞懸濁液を調製し、MojoSortTMマウスCD19ナノビーズ(BioLegend、カリフォルニア州)および市販のマウスCD19マイクロビーズ(Miltenyi、ドイツ)をBioLegendおよびMiltenyiの推奨プロトコルに従って用いてCD19+B細胞を単離した。単離したCD19細胞純度(BioLegendによる97%、Miltenyiによる94.9%)をCD45R/B220(クローンRA3−6B2)PEによって得られる細胞の染色およびフローサイトメトリーによる分析によって特定した。そして細胞を遠心分離して細胞ペレットを改良カルノフスキー固定液(0.15Mカコジル酸ナトリウム緩衝液にpH7.4で、2.5%グルタルアルデヒドおよび2%パラホルムアルデヒド)に4時間再懸濁させた。ついでこの調製物を0.15Mカコジル酸緩衝液中の1%四酸化オスミウムで1時間固定後処理し、一括して2%酢酸ウラニルで1時間染色した。ついでサンプルをエタノールで脱水し、Durcupanエポキシ樹脂(シグマ−アルドリッチ)で包理し、Leica UCTウルトラミクロトームで50〜60nmに切片化し、ホルムバールおよび炭素コーティングした銅グリッドに載せた。切片を2%酢酸ウラニルで5分間、サトウの鉛染色で1分間染色した。ついでグリッドをJEOL 1200EX II(JEOL,ピーボディ、マサチューセッツ州)透過型電子顕微鏡で検視して、Gatanデジタルカメラ(Gatan、プレザントン、カリフォルニア州)で撮影し、あるいはEagle 4k HSデジタルカメラ(FEI、ヒルズボロ、オレゴン州)を備えたTecnai G2Spirit BioTWIN透過型電子顕微鏡で検視した。
上記の例3および4に従って作製した抗マウスCD19共役体化ナノビーズ(全2×108粒子)およびSAv共役体化ナノビーズ(全2×108粒子)をそれぞれ様々な補充溶液に懸濁させ、Genesis Pilot凍結乾燥装置(SP Scientific)で3日間の凍結乾燥(Lyo)サイクルを実施した。具体的には、シラン処理したガラスバイアルに含まれる粒子懸濁液を−46℃に下げて凍結させ、ついで−80℃に3時間、そして−46℃に戻して密閉した真空チャンバーで3日間維持した。その後、温度を22℃まで上げた。凍結乾燥されたナノ磁性粒子をついでPBSで再構成して、MojoSorTMマウスCD19ナノビーズ(BioLegend Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、カタログNo.480001)およびMojoSortTMマウスCD4 T細胞単離キット(BioLegend Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、カタログNo.480005)の両方を用いて性能について試験した。結果を下記の表8および表9にそれぞれ示す。
磁気によって選択された細胞は、しばしば遺伝子/タンパク質/RNAプロファイリングのような下流処理で使用されるが、市販の磁性粒子は、ほとんどではないにしろ多くが細胞に対して毒性効果を有する。従って、生きたまたは生存可能な細胞をこれらの結合した磁性粒子によって得ることは、さらなる試験/探査のために極めて困難である。この試験では、マウスCD4抗原に対する抗体と共役体化された、本発明の標的化ナノ磁性粒子および幅広く使用されている市販の磁性粒子をともに、標的CD4+細胞が磁気分離された後に細胞機能性について並行して試験した。
マイクロサイズ浮揚バブルは、市販されている中空(または充満した空気)ミクロンサイズ球体であり、対象の標的部分に対する官能化表面またはコーティングリガンドを有する。細胞特異的リガンド(例えば、細胞抗原特異的抗体)と共役体することができて、特定の細胞集団を単離するのに使用される市販の例には、Targeson(サンディエゴ、カリフォルニア州)のガスカプセル化マイクロバブルおよびAkadeum Life Sciences(アナーバー、ミシガン州)の浮揚マイクロバブルが含まれる。研究論文に記載されている例には、Shi,ら,Methods,64,102(2013)のパーフルオロカーボンマイクロバブル、Hsu,ら,Technology(Singapore World Science),3,38(2014)のガラスマイクロバブル、Liou,ら,PLoS One,20,10(2015)のアルブミンマイクロバブル、およびShi,ら,PLoS One,8,1(2013)のガス充満イムノマイクロバブルが含まれる。分析物または細胞の単離のためにマイクロバブルをベースとしたシステムの使用を記載している特許文献の例には、米国特許および公開特許出願番号5116724号、5246829号、8835186号、US2003/010435A1号、US2007−0036722A1号、およびUS2011/0236884A1号が含まれる。これらの例は、標的細胞および分析物の特異的単離のために浮揚をベースとしたシステムを用いることの有用性を説明する。だが、浮揚をベースとしたシステムを磁性ナノ粒子と組み合わせて、所望の標的のより速く、より効率的でより効果的な分離を提供しているものは本発明の以前にはない。
希少細胞(すなわち、幹細胞、循環腫瘍細胞、胎児細胞、内皮細胞などの細胞)を単離するための市販の方法は、磁性粒子をベースとした2ステッププロトコルであり、陰性枯渇化段階が最初に実施されて不要な細胞を取り除き、洗浄段階および陽性選択段階が続いて希少細胞を捕捉する。希少細胞の直接的な陽性選択は、固相材料(すなわち、磁性および非磁性ビーズ)の非特異的結合、および一般的には百万個(またはそれ以上)の全細胞あたり標的細胞1個という非常に低い頻度でのみ存在するこれらの希少細胞を標的として結合することの著しい困難さのために、成功例は限定されている。さらに、希少細胞の直接的な陽性選択でしばしば使用される開始細胞懸濁液は、全血、バフィーコート、および/または溶血のような非常に困難な細胞調製物である。開始または天然細胞懸濁液のいかなる重要な操作も、細胞サンプル処理のすべての段階で生じる本来の細胞損失によって、サンプルに存在するいずれの希少細胞の回収/収率にも負の影響を有する。
上記の図13で示された理論的根拠は、ヒトCD4+リンパ球の単離にも適用でき、これは抗体が標的化するCD4抗原の受容体が単球で同時に発現されるためである。末梢血単核細胞から高純度でヒトCD4+を単離するための現在の方法は、混入している単球を磁性粒子の使用またはプラスチックプレートへの付着のいずれかで取り除く前豊富化段階を必要とする。その後、CD4+リンパ球は抗CD4コーティング磁性粒子を用いて単離される。
前述された本発明の文脈および後述される請求項において、次の用語は帰された意味を有すると理解されるものである。これらの用語に加え、必要に応じて、他の用語が本明細書における他の箇所で定められる。下記または本明細書の他の箇所で明確に定められていない場合、本明細書で使用される技術用語は、これらの技術で認識されている意味を有する。
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Claims (26)
- (a)磁性コア粒子、
(b)前記磁性コア粒子をカプセル化するガラス層、
(c)前記ガラス層と結合されたタンパク質/ポリマー複合層、および
(d)前記タンパク質/ポリマー複合層と結合された生物親和性リガンド対の1つのメンバーを含む標的化部分
を含む、標的化ナノ磁性粒子。 - 約5〜約500nm、好ましくは約30〜約300nmの範囲の直径を有する、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 前記磁性コア粒子がマグネタイト(Fe3O4)結晶を含み、任意に前記マグネタイト結晶が約5〜約300nmの範囲の直径を有する、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 前記ガラス層が有機官能性アルコキシシラン分子から形成されるシラン層であり、任意に有機官能性アルコキシシラン分子が結合可能な末端基を含み、任意に結合可能な末端基がアミノ、スルフィドリル、カルボキシル、およびヒドロキシル末端基からなる群から選択される、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 前記タンパク質/ポリマー複合層が前記ガラス層と共有結合され、ここで任意に前記タンパク質/ポリマー複合層は血清アルブミン、任意にウシまたはヒト血清アルブミン、デキストランまたはカゼインからなり、任意に前記タンパク質/ポリマー複合層が前記組成物を約45〜約85℃に加熱することによって永続的に結合される、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 前記標的化部分が抗体、抗原結合抗体フラグメント、細胞表面受容体、細胞表面受容体のリガンド結合細胞外領域、核酸、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンからなる群から選択される、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- さらに検出可能な標識を含む、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 前記磁性コア粒子が酸化第一鉄、任意にFe3O4もしくはFe2O3、酸化クロム、任意にCrO3、またはMn、Co、Ni、Zn、Gd、およびDyからなる群から選択される置換金属イオンを含む安定な金属酸化物からなる、請求項3に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 請求項1による複数の標的化ナノ磁性粒子を含む、組成物。
- 乾燥した容易に分散可能な組成物または液体組成物である、請求項9に記載の組成物。
- 前記複数の標的化ナノ磁性粒子が複数の標的化ナノ磁性粒子種を含み、ここで各標的化ナノ磁性粒子種が異なる標的化部分種を含む、請求項9に記載の組成物。
- 容器中に請求項9による組成物および任意に前記組成物の使用のための取扱説明書を含む、キット。
- 請求項1による標的化ナノ磁性粒子を作製する方法であって、
(a)約5〜約500nm、好ましくは約30〜約300nmの範囲の複数の直径を有する磁性コア粒子を得、
(b)前記磁性コア粒子をガラス層でカプセル化して第一カプセル化磁性コア粒子を形成させ、ここで前記ガラス層は任意に約1〜約50nmの範囲の厚さを有し、
(c)前記第一カプセル化磁性コア粒子をタンパク質/ポリマー複合層にカプセル化して第二カプセル化磁性コア粒子を形成させ、ここでタンパク質/ポリマー複合層は任意に約5〜約50nmの範囲の厚さを有し、
(d)標的化部分を前記第二カプセル化磁性コア粒子に、任意に共有結合によって、結合させ、ここで前記標的化部分は生物親和性リガンド対の1つのメンバーを含み、任意に前記標的化部分は抗体、抗原結合抗体フラグメント、細胞表面受容体、細胞表面受容体のリガンド結合細胞外領域、核酸、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、標的化薬剤送達の目的のための医薬化合物からなる群から独立して選択され、任意に
(e)医薬化合物または検出可能な標識を前記第二カプセル化磁性コア粒子と、任意に共有結合によって、結合すること
を含む、方法。 - 前記磁性コア粒子が解膠される、請求項13に記載の方法。
- 生体分子/粒子複合体を形成するための方法であって、請求項1による標的化ナノ磁性粒子を、前記標的化ナノ磁性粒子の前記標的化部分と直接的または間接的に特異的な反応性である対象の生体分子と結合させて生体分子/粒子複合体を形成することを含む、方法。
- 前記結合がインビトロまたはインビボで生じる、請求項15に記載の方法。
- 生体分子/粒子複合体を用いる方法であって、
(a)対象の生体分子を含むことが分かっている、または疑われる生物学的サンプルを、請求項1による標的化ナノ磁性粒子と接触させて生体分子/粒子複合体を形成させ、
(b)磁場を用いて前記生体分子/粒子複合体を単離すること
を含む、方法。 - 磁気カラム分離またはHGMS法を使用して、前記生体分子/粒子複合体を単離する、請求項17に記載の方法。
- 複合液体、任意に哺乳動物全血または哺乳動物全血の分画と混合されたとき、安定したコロイドとしての挙動を示す、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 前記タンパク質成分が任意にマレイミド誘導体化タンパク質である、請求項5に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 5年までの期間にわたって保存された際に、その磁性、生物親和性、および粒子サイズ、ならびに標的化特性に有意または有害な変化を示さない、請求項1に記載の標的化ナノ磁性粒子。
- 標的生体分子種を生物学的サンプルから分離するための方法であって、
(a)反応混合物において、対象の生体分子を含むことが分かっている、または疑われる生物学的サンプルを請求項1による標的化ナノ磁性粒子と接触させて生体分子/粒子複合体を形成させ、
(b)磁場を用いて前記生体分子/粒子複合体を前記反応混合物から単離すること
を含む、方法。 - 複数の標的生体分子種を生物学的サンプルから単離する方法であって、
(a)反応混合物において、対象の第一および第二生体分子種を含むことが分かっている、または疑われる生物学的サンプルを、対象の前記第一生体分子種を標的とする請求項1による標的化ナノ磁性粒子と接触させて第一標的生体分子/粒子複合体を形成させ、対象の前記第二生体分子種を標的とする標的化浮揚マイクロ粒子と接触させて第二標的生体分子/粒子複合体を形成させ、
(b)磁場を用いて前記第一生体分子/粒子複合体を前記反応混合物から単離し、
(c)前記第二生体分子/粒子複合体を前記反応混合物から分離すること
を含む、方法。 - 前記標的化ナノ磁性粒子が約5〜約500nm、好ましくは約30〜約300nmの範囲の直径を有する、請求項23に記載の方法。
- 前記標的化ナノ磁性粒子の前記磁性コア粒子がマグネタイト(Fe3O4)結晶を含み、任意にここで前記マグネタイト結晶が約5〜約300nmの範囲の直径を有する、請求項23に記載の方法。
- 容器中に請求項23による組成物および任意に前記組成物の使用のための取扱説明書を含む、キット。
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