JPH0761935A

JPH0761935A - 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法

Info

Publication number: JPH0761935A
Application number: JP21049493A
Authority: JP
Inventors: Naoto Furuhata; 直人古畑; Yutaka Hirao; 豊平尾; Kazuo Takechi; 和男武智
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1993-08-25
Filing date: 1993-08-25
Publication date: 1995-03-07

Abstract

(57)【要約】【構成】免疫グロブリンを含む画分を出発原料とし
て、夾雑するウィルスが不活化するのに充分な条件下、
ｐＨ４．５〜６．５でしかも安定化剤の存在下に液状で
加熱処理し、ｐＨ５．１〜５．４、イオン強度０．００
０１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０
００〜１０，０００のポリエチレングリコール６〜１０
ｗ／ｖ％で処理して上清を回収し、この上清をｐＨ７〜
１０、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ、温度０〜４
℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０００のポリエ
チレングリコール１０〜１５ｗ／ｖ％で処理して沈殿を
回収する工程からなる静注用免疫グロブリン製剤の製造
方法。【効果】免疫グロブリンが殆ど不活化されておらず、
夾雑ウィルスが不活化され、グロブリン二量体の含有量
が極めて少なく、溶解性がよく、抗補体活性が充分に低
く、安全性と有効性の高い静注用免疫グロブリン製剤が
効率よく得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、静注用免疫グロブリン
製剤の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血漿蛋白成分である免疫グロブリンのう
ち、特にＩｇＧを主成分とする免疫グロブリン製剤は、
これまで広く感染症の予防および治療に用いられてき
た。

【０００３】この免疫グロブリン製剤中の、肝炎ウィル
ス等の夾雑ウィルスの混在は必ずしも否認されていな
い。そこで、夾雑ウィルスの不活化法として液状加熱処
理法（特開昭６１−１９１６２２号等）或いは乾熱処理
法（特開昭６１−７８７３０号、特開昭６０−２７０１
９５号等）が提案されている。

【０００４】この加熱処理法を発展させて、ポリエチレ
ングリコール（以下、ＰＥＧという）分画処理、陰イオ
ン交換体処理等と組み合わせることにより、臨床上適用
できる製剤、すなわち、安全性と有効性の高い静注用免
疫グロブリン製剤を製造できる方法を確立した（特開昭
６３−１８３５３９号）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の静注
用免疫グロブリン製剤の製造方法についてさらに改良検
討を行い、収率改善・生産性の向上・夾雑蛋白のさらな
る除去等を課題とするものである。従って、本発明の目
的は、夾雑ウィルスを不活性化し、夾雑蛋白が極めて少
なく、臨床上適用できる製剤、すなわち、安全性と有効
性がさらに高い静注用免疫グロブリン製剤の効率的な製
造方法を提供することにある。

【０００６】本発明者らは、この目的に沿って静注用免
疫グロブリン製剤の工業的な製法について検討し、ポリ
エチレングリコール（以下、ＰＥＧという）分画処理、
加熱処理等を組み合わせ、各工程の処理条件を設定して
本発明を完成した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、その特
許請求の範囲に記載した通りであり、特に免疫グロブリ
ンを含む画分を出発原料とする、以下の処理からなる静
注用免疫グロブリン製剤の製造方法に関する。

【０００８】（ａ）夾雑するウィルスが不活化するの
に充分な条件下、ｐＨ４．５〜６．５でしかも安定化剤
の存在下に液状で加熱処理する。（ｂ）ｐＨ５．１〜５．４、イオン強度０．０００１
〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００
〜１０，０００のＰＥＧ６〜１０ｗ／ｖ％で処理して上
清を回収する。（ｃ） (b) の上清をｐＨ７〜１０、イオン強度０．０
００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，
０００〜１０，０００のＰＥＧ１０〜１５ｗ／ｖ％で処
理して沈殿を回収する。

【０００９】（出発原料）本発明の出発原料としては、
免疫グロブリンを含む画分が使用され、これはヒト血漿
由来であって、免疫グロブリン画分を含むものであれば
特に限定されない。具体的には、コーンのエタノール分
画により得られる画分II＋III 、画分II、および免疫グ
ロブリンを含むこれらと同等の画分のペースト等が挙げ
られる。また、この出発原料は、ヒト血液型抗体、カリ
クレイン、プレカリクレイン、ＩｇＭ、ＩｇＧ重合体な
どを含んでいてもよい。

【００１０】（製法）本発明による製造方法は、好まし
くは以下の処理よりなる。低濃度ＰＥＧ処理工程本工程は出発原料を低濃度ＰＥＧで処理し、上清を回収
する工程である。出発原料を適当な水性溶媒に懸濁す
る。水性溶媒の溶質として、たとえば塩化ナトリウム、
リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸、酢酸ナトリ
ウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム等を含ませてもよ
い。

【００１１】この懸濁液を分子量１，０００〜１０，０
００（好適には約２，０００〜６，０００）のＰＥＧで
処理する（例えば、両者を混合する）。処理条件は、Ｐ
ＥＧ濃度６〜１０ｗ／ｖ％（特に８ｗ／ｖ％）、ｐＨ
５．１〜５．４（特に５．２〜５．３）、イオン強度
０．０００１〜０．１Ｍ（特に、０．０００１〜０．０
１Ｍ）とする。この際、蛋白濃度１〜２０ｗ／ｖ％（特
に、１〜５ｗ／ｖ％）であることが好ましい。当該処理
は、０〜４℃程度で通常３０分〜６時間程度攪拌するこ
とによって行われる。その後、例えば遠心分離（６００
０〜８０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）して上清を回収
する。

【００１２】高濃度ＰＥＧ処理工程本工程はの工程で得られた上清を高濃度ＰＥＧで処理
し、沈殿を回収する工程である。上記上清を分子量１，
０００〜１０，０００（好適には２，０００〜６，００
０）のＰＥＧにてさらに処理する（例えば、両者を混合
する）。処理条件は、ＰＥＧ濃度１０〜１５ｗ／ｖ％
（特に、１１〜１３ｗ／ｖ％）、ｐＨ７〜１０（特に８
〜９）、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ（特に、
０．０００１〜０．０１Ｍ）とする。この際、蛋白濃度
１〜２０ｗ／ｖ％（特に、１〜５ｗ／ｖ％）であること
が好ましい。当該処理は、０〜４℃程度で通常３０分〜
６時間程度攪拌することによって行われる。その後、例
えば遠心分離（６０００〜８０００ｒｐｍ、１０〜３０
分間）して沈殿を回収する。

【００１３】陰イオン交換体処理工程本工程はの工程で得られた沈殿画分を水性溶媒に溶解
後、または後記の工程の処理後陰イオン交換体で接触
処理して非吸着画分を回収する工程である。本工程は、
ＩｇＭ、ＩｇＧ重合体を除くために行われる。

【００１４】（ｉ）陰イオン交換体の調製陰イオン交換体は、陰イオン交換基を不溶性担体に結合
したものであるが、陰イオン交換基としてはジエチルア
ミノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アミノエチル（ＱＡ
Ｅ）基等を、不溶性担体としてはアガロース、セルロー
ス、デキストラン、ポリアクリルアミド等を用いること
が出来る。その結合は公知の方法で行われる。

【００１５】（ii）処理方法の工程で得られた沈殿画分を適当な水性溶媒に溶解す
る。水性溶媒はｐＨ５．８〜６．２（好ましくはｐＨ
６．０）、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍの水溶液
とする。の工程と同様の溶質を含んでいてもよい。蛋
白質濃度としては、１〜１５ｗ／ｖ％（特に、３〜１０
ｗ／ｖ％）が好ましい。さらに、上記水性溶媒で平衡化
した陰イオン交換体と接触処理する。その処理に際して
はバッチ法、カラム法のどちらを用いてもよい。

【００１６】たとえば、バッチ法では、陰イオン交換体
１ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍｌ程度と混
合させ、０〜４℃で３０分〜２時間程度攪拌した後、遠
心分離（６０００〜８０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）
して上清を回収する。カラム法でも、陰イオン交換体１
ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍｌ程度を接触
させ、非吸着画分を回収する。なお、本の工程は所望
により省略することもできる。また、液状加熱処理を行
う場合にはの固定化ヒト血液型物質処理後に当該陰イ
オン交換体処理を実施することが好ましい。

【００１７】固定化ジアミノ化合物による処理本工程は、の工程で得られた沈殿画分またはの工程
で得られた非吸着画分を固定化ジアミノ化合物で接触処
理して、非吸着画分を回収する工程である。本工程はプ
レカリクレインまたはカリクレインを除くために行われ
る。

【００１８】（ｉ）固定化ジアミノ化合物の調製固定化ジアミノ化合物は、ジアミノ化合物を不溶性担体
に固定化したものである。ジアミノ化合物としては、ア
ミノベンズアミジン、アミノベンズグアニジン、リジ
ン、アルギニン等を用いることができる。不溶性担体と
してはアガロース、セルロース、デキストラン、シリカ
ゲル、ガラス等が用いられる。固定化は公知の方法に準
じればよい。例えば、アガロース、セルロース等は、例
えばＣＮＢｒ活性化法により、またシリカゲル、ガラス
等はオキシラン法により、ジアミノ化合物を固定化する
ことができる。

【００１９】（ii）処理方法処理対象物、例えばの工程の非吸着画分をｐＨ５〜８
（特に、ｐＨ６〜７）、イオン強度０．０００１〜０．
１Ｍ（特に０．０００１〜０．０１Ｍ）の条件下で固定
化ジアミノ化合物と接触処理する。その際、蛋白濃度１
〜１５ｗ／ｖ％（特に、３〜１０ｗ／ｖ％）であること
が好ましく、またバッチ法、カラム法のいずれもが好適
に使用される。

【００２０】例えばバッチ法では、固定化ジアミノ化合
物１ｍｌに対して上記画分１０〜１００ｍｌ程度を混合
させ、０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で３０分〜４時
間、好ましくは３０分〜２時間程度攪拌した後、遠心分
離（６，０００〜８，０００ｒｐｍ、１０〜３０分間）
して上清を回収する。カラム法でも、固定化ジアミノ化
合物１ｍｌに対して上記画分１０〜１００ｍｌ程度を接
触させ、非吸着画分を回収する。本の工程は所望によ
り省略することも可能である。

【００２１】固定化ヒト血液型物質処理工程本工程はの工程の沈殿画分またはの非吸着画分また
はの非吸着画分を固定化ヒト血液型物質で接触処理し
て、非吸着画分を回収する工程である。本工程はヒト血
液型抗体を除くために行われる。

【００２２】（ｉ）固定化ヒト血液型物質の調製固定化ヒト血液型物質は、ヒト血液型物質を不溶性担体
に固定化したものである。ヒト血液型物質の調製は、公
知の方法を用いればよい。例えば、ヒトＡ、Ｂ、ＡＢま
たはＯ型の赤血球を低張溶液中で溶血、または超音波処
理した後、硫安分画法またはＰＥＧ分画法により精製す
ること等により得られる。ヒト血液型物質としては合成
抗原（糖鎖）を用いることもできる〔Human Blood Grou
ps and Carbohydrate Chemistry(1978) Chem.Soc.Rev.
p423〜452 を参照〕。

【００２３】さらにこのヒト血液型物質は生理的食塩液
に溶解後、夾雑するウィルスの不活性化に有効とされて
いる、例えば、約５０〜７０℃、好ましくは約６０℃
で、７〜１３時間、好ましくは約１０時間、または約８
０〜１３０℃、好ましくは９５〜１２１℃で約１〜４０
分、好ましくは約２〜３０分間加熱処理する。その後、
遠心分離して不溶物を除去し、蒸留水に対して透析し
て、各ヒト血液型物質を得る。不溶性担体としてはアガ
ロース、セルロース、デキストラン、シリカゲル、ガラ
ス等が用いられる。固定化は公知の方法に準じればよ
い。例えば、アガロース、セルロース、等はＣＮＢｒ活
性化法により、シリカゲル、ガラス等はオキシラン法に
よりヒト血液型物質を固定化できる。

【００２４】（ii）処理方法処理対象物、例えばの工程の非吸着画分をｐＨ５〜８
（特にｐＨ６〜７）、イオン強度０．０００１〜０．１
Ｍ（特に０．０００１〜０．０１Ｍ）の条件下で、上記
水性溶媒で平衡化した固定化ヒト血液型物質と接触処理
する。その際、蛋白濃度１〜１５ｗ／ｖ％（特に、３〜
１０ｗ／ｖ％）であることが好ましく、またバッチ法、
カラム法のどちらを用いてもよい。

【００２５】例えば、バッチ法では、固定化ヒト血液型
物質１ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１００ｍｌ程度
と混合させ、０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で、３０
分〜４時間、好ましくは３０分〜２時間程度攪拌した
後、遠心分離（６，０００〜８，０００ｒｐｍ、１０〜
３０分間）して上清を回収する。カラム法でも、固定化
ヒト血液型物質１ｍｌに対して処理対象溶液１０〜１０
０ｍｌ程度を接触させ、非吸着画分を回収する。

【００２６】加熱処理工程本工程は、所望の段階で安定化剤の存在下に免疫グロブ
リンの抗体活性の減少は最小限にとどめるが、夾雑する
ウィルス、例えばＨＢウィルス、ＡＩＤＳウィルス等は
完全に不活性化する条件下で加熱処理する工程である。
加熱処理は溶液状態、即ち免疫グロブリンの水溶液状態
（即ち、液状加熱処理）で行う。安定化剤としては、二
糖類（例、サッカロース、マルトース）、糖アルコール
（例、ソルビトール、マンニトール）、より好ましくは
ソルビトールが好適に例示される。安定化剤の添加量
は、二糖類、糖アルコール等を１０ｗ／ｖ％以上（好ま
しくは１０〜５０ｗ／ｖ％）を用いることが好適に例示
される。

【００２７】加熱の対象となる免疫グロブリンの量は、
蛋白質として０．１〜３０ｗ／ｖ％（好ましくは５〜２
０ｗ／ｖ％）に調整することが好ましい。液状加熱処理
は水溶液のｐＨを４．５〜６．５、好ましくはｐＨ５〜
６に調整し、例えば５０〜７０℃（好ましくは６０℃程
度）で１０分〜２０時間（好ましくは１０時間程度）処
理される。また、水溶液のイオン強度としては、０．０
００１〜０．１Ｍ（特に好ましくは０．０００１〜０．
０１Ｍ）が例示される。液状加熱処理の工程は、出発原
料に対して、またはの工程の後に行うのが好適であ
る。なお、の工程の後に行う場合は、及びの処理
を再度行うことが夾雑物除去の点でより好ましい。

【００２８】（液状製剤の調製）得られた免疫グロブリ
ン組成物を常套手段によって１〜１０ｗ／ｖ％（好まし
くは３〜７ｗ／ｖ％）になるように水溶液に調整しさら
に安定化剤、例えば、二糖類（ショ糖、マルトース
等）、糖アルコール（ソルビトール、マンニトール
等）、さらに好ましくはソルビトール１〜２０ｗ／ｖ％
（好ましくは、２〜１０ｗ／ｖ％）、ｐＨ５〜６（好ま
しくはｐＨ５．３〜５．７、特に好ましくは約５．
５）、低電導度、好ましくは電導度１ｍｍｈｏ以下（特
に、０．６ｍｍｈｏ以下、共に８℃換算）になるよう
に、自体既知の手段にて調整したのち、通常の製剤化技
術に基づいて、除菌濾過、分注等を行う。かくして、静
脈内投与可能な免疫グロブリン製剤が調製される。

【００２９】

【作用・効果】本発明においては、上記のような方法に
より静注用グロブリン製剤を製造したため、得られた製
剤中に、ＩｇＧ重合体が検出されなくなり、また、製造
工程中におけるＩｇＧの収率が向上した。

【００３０】本発明により得られた製剤は免疫グロブリ
ンが殆ど不活化されておらず、しかも、抗ヒト血液型物
質抗体等の夾雑物は含まれず、加熱処理を施しているの
で夾雑ウィルスも不活化され、溶解性もよく、抗補体活
性も充分に低い等の性質を有し、昭和６０年度発行の日
本国生物学的製剤基準（以下、生基準）をパスできる安
全な製剤である。

【００３１】また、本発明により得られた製剤は、用
時、適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水）に溶解して、
静脈内投与、点滴等により、感染症等の予防または治療
に用いられる。即ち、本発明は静注用免疫グロブリン製
剤の工業的製法として有益である。

【００３２】

【実施例・実験例】本発明をより詳細に説明するために
実施例及び実験例を挙げるが、本発明は、これらによっ
て何ら限定されるものではない。

【００３３】（実験例１）各ｐＨでの低濃度ＰＥＧ分
画処理実施例１において、８％ＰＥＧ分画処理による上清回収
工程を各ｐＨで行い、ＩｇＧ収率、ＩｇＧ重合体の有
無、上清濁度を測定した。ＩｇＧ収率は抗ＩｇＧ抗血清
を用いた免疫比濁法（ディナクアントａＩｇＧ、ベーリ
ンガーマンハイム社製）によるＩｇＧ量を測定後に収率
を算出した。ＩｇＧ重合体はＨＰＬＣによるゲル濾過法
（担体はＴＳＫgel Ｇ3000ＳＷ_XL、東ソー社製、溶離液
は0.3 ％塩化ナトリウムを含む50mM酢酸緩衝液、ｐＨ
６．７）を用いて測定した。上清濁度は目視によった。
結果を表１に示した。

【００３４】

【表１】

【００３５】低値にｐＨを設定したものは（ｐＨ５．１
〜５．３、サンプル２〜４）、従来法（ｐＨ５．０、サ
ンプル５）に比べてＩｇＧの収率が増加し、しかも、遠
心上清は澄明であり、ＩｇＧ重合体はＨＰＬＣ分析によ
り検出されなかった。ｐＨを５．０に調整したサンプル
１では、遠心上清が白濁して、ＩｇＧ重合体がＨＰＬＣ
分析により検出された。

【００３６】（実験例２）各ｐＨでのＤＥＡＥ処理実施例１において、ＤＥＡＥ処理時のｐＨを５．５（従
来法）と６．０（本発明）で行って比較し、ＩｇＧ収
率、免疫電気泳動法による沈降線を測定した。また、免
疫電気泳動法では、異常沈降線の濃淡によりＩｇＧ以外
の夾雑蛋白の存在を確認できる。免疫電気泳動法は以下
の手順によった。

【００３７】寒天板の作製ベロナール緩衝液にアガロースを１％となるように溶解
し、溶解液を５．５mlずつ試験管に分注し、水平台の上
でガラス板(50 ×75mm) に注いだ。室温で放置してゲル
が固化後に、予め作製した平面図上で寒天板に抗血清を
注ぐ溝と試料を入れる穴を作った。試料および抗血清の調製試料を５％濃度（７０Ａ₂₈₀）に調製した。泳動距離の
指標とするため血漿にはブロムフェノールブルー（以
下、ＢＰＢ）を添加した。電気泳動ベロナール緩衝液を両側に満たした泳動槽に寒天板を設
置し、試料穴に試料を５μｌ添加後に２号濾紙を用いて
寒天板と緩衝液のブリッジを作った。寒天板１cm当たり
１〜２mAの割合で通電し、ＢＰＢで着色したアルブミン
の位置が陽極側より１．５cmの所にきた時( 約１時間）
に泳動を終了した。抗血清の添加電気泳動後に予め作製しておいた上記の溝に抗血清６０
μｌを添加した。翌日、沈降線の観察を行った。結果を表２に示した。
ＩｇＧ収率は、ＤＥＡＥ処理前のＩｇＧ量を１００％と
して表した。

【００３８】

【表２】

【００３９】ＤＥＡＥ処理時にｐＨ５．５で処理したサ
ンプル６は、異常沈降線物質が検出されたが、ＤＥＡＥ
処理時にｐＨ６．０で処理したサンプル７及び８は、電
気泳動法による確認の結果、異常沈降線物質及びトラン
スフェリンが検出限界以下まで除去されていることが分
かった。また、ｐＨ６．０で処理したサンプル７及び８
のＩｇＧ収率は、サンプル９（従来法）に比べて改善さ
れていた。

【００４０】（実施例１）コーン画分II＋III ペースト
１kgを蒸留水１０ｌにて懸濁し、ｐＨを５．５に調整し
た後、遠心分離を行い、上清を回収し、上清１００ml当
たりソルビトールを５０ｇ（終濃度３３ｗ／ｖ％）添加
し、６０℃で１０時間加熱処理した。加熱終了後、ｐＨ
を５．３に調整した後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が８
％になるように添加し、２℃で遠心分離を行った。得ら
れた上清を１Ｎ−水酸化ナトリウムを用いｐＨ８．８と
した後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が１２％になるよう
に加え、２℃で遠心分離を行い、沈殿画分にＩｇＧ画分
を得た。この溶液をｐＨ６に調整した上で、ＤＥＡＥ−
セファデックスを添加（５０ml溶液当たり１ml）し、０
〜４℃の条件下、約１時間接触処理し、処理後遠心分離
（７０００rpm 、約２０分間）して上清（ＩｇＧ溶液）
を回収した。このＩｇＧ溶液を蒸留水で５％ＩｇＧ溶液
に調整し、酢酸ナトリウムで溶液のpHを約５．５にし、
さらにソルビトールを終濃度５％まで添加した。この水
溶液（電導度約１mmho）を除菌濾過し静注用免疫グロブ
リン液状製剤を得た。

【００４１】本製剤は実質的にＩｇＧ単量体のみを含
み、抗補体価も１０〜１５ＣＨ₅₀程度であり、静注用グ
ロブリンとしての生基準にも合格した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫グロブリンを含む画分を出発原料と
する、以下の工程を含む処理からなることを特徴とする
静注用免疫グロブリン製剤の製造方法：（ａ）夾雑するウィルスが不活化するのに充分な条件
下、ｐＨ４．５〜６．５でしかも安定化剤の存在下に液
状で加熱処理する。（ｂ）ｐＨ５．１〜５．４、イオン強度０．０００１
〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００
〜１０，０００のポリエチレングリコール６〜１０ｗ／
ｖ％で処理して上清を回収する。（ｃ） (b) の上清をｐＨ７〜１０、イオン強度０．０
００１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，
０００〜１０，０００のポリエチレングリコール１０〜
１５ｗ／ｖ％で処理して沈殿を回収する。
【請求項２】工程(c) で得られた沈殿を水性溶媒に溶
解し、ｐＨ５．８〜６．２、イオン強度０．０００１〜
０．１Ｍの条件下、陰イオン交換体で処理して非吸着画
分を回収する工程を含んでなる請求項１に記載の静注用
免疫グロブリン製剤の製造方法。