SU728720A3 - Способ получени вакцины против гепатита в - Google Patents
Способ получени вакцины против гепатита в Download PDFInfo
- Publication number
- SU728720A3 SU728720A3 SU762332953A SU2332953A SU728720A3 SU 728720 A3 SU728720 A3 SU 728720A3 SU 762332953 A SU762332953 A SU 762332953A SU 2332953 A SU2332953 A SU 2332953A SU 728720 A3 SU728720 A3 SU 728720A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- hepatitis
- hbsag
- particles
- vaccine
- antigen
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title claims description 6
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 33
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 33
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 33
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 16
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 claims description 4
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 abstract 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 11
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007560 sedimentation technique Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;prop-2-enamide Chemical compound [Na+].NC(=O)C=C.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1
Изобретение относитс к медицинской промышленности и касаетс производства бактерийных препаратов.
Известен способ получени вакцины против гепатита В путем выделени частиц HBsAg, содержащих е-антиген. на частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-антиген с последующей инактивацией целевого продукта l . Однако вакцина, полученна . известным способом, не обладает высокой специфичностью.
Целью изобретени вл етс повышение специфичности вакцины.
Эта цель достигаетс тем, что плазму кровиобрабатывают 3,04 ,5 вес.% полиэтиленгликол при рН 4,4-4,7, полученный осадок, содержащий HBsAg частицы размером 30-50 нм, раствор ют при рН 4,9-5,1, затем рН надосадочной жидкости довод т до 4,4-4,7, повторно обрабатывают полйэтиленгликолем и полученный осадок раствор ют в физиологическом растворе .
Кроме того, целевой продукт инактивируют обработкой формалином или 1 -пропиолактоном или облучением рентгеновскими лучами.
Предлагаемым способом получают вакцину против вирусного гепатита, котора включает в свой состав антигенные частицы, имеющие размер частиц 20-50 нм, причем эти антигенные частицы содержат неосажденные свободные необъединенные гепатит р -поверхностные антигены. Вакцина имеет менее ДО единиц антител гепатит (Ь-поверхностного антигена на 1000 ед. гепатит |Ь-поверхностного антигена. 5% частиц и размером, лежащим в интервале 3-50 нм, содержат неосажденные е-антигены или специфичные антигены, аналогичные частицы Дана. Антиген гепатита и е-антиген содержатс в вакцине в количестве, достаточном дл образовани антител при введении их в организм животного.
Дл получени , вакцины против гепатита В используют материал, состо сций из плазмы, полученной из хронического носител , который содержит антигены. Така плазма также содержит большое количество частиц Дана и волокон, не содержащих объединенного анти-е-антитела. Плазма может быть получена от клинически здоровых человеческих хронических носителей нВ, а также от шимпанзе, которых
естественно или искусственно инфицировали вирусом НВ и которые становились хроническими носител ми е-антиген положительного HBsAg.
Исходный материал должен быть бактериологически стерильным и должен быть свободным от присутстви , адвентициальных вирусов.
Очистку провод т обычным способом
Из антигенсодержащего вещества крови удал ют примеси путем подкислени до рН 4,4-4,7. Выпавший осадок вместе с клеточными остатками удал ют центрифугированием в течение 20 мин со скоростью 10000 об/мин. После этого материал смешивают с 2,5-4,5 вес.% полиэтиленгликол , предпочтительно с 3,0-4,5 вес.%. Более низкие концентрации, например 3:-4%, могут осаждать крупные фор1У1Ы ч;астиц и поэтому при определенных обсто тельствах вл ютс предпочтительными . Весовой процент полиэтиленгликол рассчитывают по. отношению к общему весу смеси. Таким образом, осаждают антигенный материал, содержащий гепатит В с более крупным размером частиц, например 30-50 нм, а также часть материала, содержащего оболочкоподобный гепатитный В поверхностный антиген. Осадок, содержа1дий HBsAg, регенерируют, и добавл ют некоторое количество воды при рН 4,95 ,1. Образуетс осадок, содержащий белковое вещество и полиэтиленгликоль , а жидка фаза - надосадочна жидкость, содержаща HBsAg, содержит частицы Дана или волокнистое веществ рН недостаточной Жидкости довод т до 4,4-4,7. Затем ее смешивают с 3,0-4,5 вес.% полиэтиленгдикол , счита на общий вес смеси, с образованием осадка, содержащего очищенные частицы, содержащие HBsAg поверхностный антиген, имеющие оболочкообразную конфигурацию с размером частиц 20-30 нм и волокнистые частицы, содержащие HBsAg и е-антиген, который не содержит какого-либо анти,-е-антитела , причем волокнистые частицы имеют диаметр 20-50 нм, а также частицы Дана со сферической конфигурацией , имеющие размер 40-50 нм и имеющие липопротеиновую внешнюю сферу , содержащую HBsAg и е-антигены, а также содержащие сердцевину, включающую ДНК, ДНК полимеразу и HBsAg.
В результате регенерируют очищенный антигенный материал. После этого его обрабатывают с целью инактивации вируса, а .полученный осадок раствор ют в физиологическом растворе .
Температура каждой из смеси после каждой стадии смешивани поддерживают в интервале 0-80 С в ходе образован-и осадков. Стади очистки облегчаетс , если регенерацию усиливают врезультате центрифугировани с
последующими стади ми осаждени . Полиэтиленгликоль используют в виде водного раствора, который содержит 30 вес.% полизтиленгликол . Такой Полиэтиленгликоль имеет мол. вес. 500-50000, предпочтительно около 60
Дальнейшую очистку осуществл ют путем адсорбции очищенных антигенов на гидроксилаппатите с использованием хроматографии. Частично очищенные антигены пропускают через хроматографическую колднку, содержащую гидроксилапатит, на котором они адсорбируютс . Дополнительно очищенные антигены затем регенерируют с использованием многоступенчатого элюировани . Частицы с размером 2550 нм регенерируютс отдельно от фракций с частицами более мелкого размера (16-22 нм) и от основной масы сывороточных протеинов. После очистки фракци более крупных части может быть инфекционной. Дл этого осуществл ют инактивацию. Целевой продукт инактивируют обработкой формалином в концентрации 1:2000 в течение 4 дней при З7с с использованием обычных методик или облучением рентгеновскими лучами. Вакцину осветл ют путем фильтрации через Millipore 0,22 /J фильтр или эквивалентный фильтр переддобавлением формалина или р -пропиолактона.
После инактивации конечный продукт подвергают диафильтрации с использованием Aroicon РПЗО фильтра или эквивалентного фильтра против 0,9% NaCI, содержащей 1:10000 Thiomerasal и любой стабилизатор, дл удалени низкомолекул рных соединеНИИ , исп.ользуемЫх дл инактивации, затем стерильно фильтруют и соответствующим образом разливают в стерильные ампулы дл модификации или jзaмopaживaни . Вакцину используют на отсутствие инфекциозности, иммунологическую активность.
Вакцину можно примен ть путем подкожной или внутримышечной инъекции . Примен ют обычно около двух до в мес ц с последующим введением вспомогательного вещества в период от 6 мес. до 1 года после первичной иммунизации. Первоначальна дозировка зависит от веса организма, а последующие дозировки - в зависимости от уровн антител в крови после первоначальной иммунизации.
Использование получаемой вакцины против гепатита В предотвращает хроническое заболевание печени.
Пример 1. Очистка и определение НВ ассоциированных частиц из 7,8 л плазмы от одного шимпанзе-носител HBsAq.
Вещества и методики. Источник HBsAg.
Антиген очищают из объединенной плазмы носител шимпанзе, предварительно инокулированного человеческой HBsAg - положительной, плазмой, относ щейс к adn подтипу. е-Антиген присутствует на поверхности способных к идентификации частиц Дана и используемой плазме.
Очистка HBsAg и е-антигена.
HBsAg и е-антиген выдел ют из плазмы путем осаждени с помощью полиэтиленгликол (PEG). Повторно суспендированный осадок HBsAg и е-антигена очищают хроматографированием на колонке с гидроксилапатитом. Конечные стадии очистки включает плотностное градиентное центрифугирование .
Осаждение HBsAg и е-антигена с помощью PEG.
На стадии, предшествующей очистке 7,800 МП HBsAg и на содержащей е-антигена плазмы, устанавливают рН 4,6 и добавл ют 30%-ный раст.вор PEG в дистиллированной, воде до приблизительно 2% концентрации. Раствор оставл ют на ночь при и осветл ют центрифугированием HBsAg во всплышем слое, осаждают увеличением концентрации PEG до 4%. Всплывший слой после сто ни в течение ночи при с декантируют и отбрасывают. Осадок HBsAg (содержащий е-антиген) ресуспендируют до 500 мл в дистиллированной воде. Основную часть PEG с некоторыми примес ми осаждают, устанавлива рН раствора равным 5,0 и осадок удал ют центрифугированием. Прозрачный верхний слой довод т до рН 4,6 и HBsAg и ассоциированный с частицей. е-А HBsAg (е) осаждают в результате добавлени 30% раствора PEG до конечной концентрации 4%. HBsAg/e удал ют центрифугированием после сто ни образца в течение ночи при 4°С. Наконец, осадок HBsAg/e ресуспендируют до 320 мл в дистиллированной воде.
Хроматографирование на колонке с гидроксилапатитом.
50 мл ресуспендированного .PEG осадка HBsAg/e пропускают через колонку 6,5Х 16,5 с гидроксилапатитом и элюируют прерывистым градиентом фосфатного буфера. В следующем эксперименте 200 мл образца под.вергают частичной очистке на колонке 6,5х 35 см с гидроксилапатитом. HBsAg, элюированный совместно с первым протеиновым пиком, пропускают через колонку с гидроксилапатитом во второй раз.
Плотностное градиентное центрифугирование .
Фракции HBsAg, выделенные хроматографированием на колонке, очищают скоростным зональным центрифугированием . Прерывистый градиент получают при использовании 3 мл 60% и 7 мл 40% сахарозы в 0,02 М натрийфосфатном буфере при рН 7,2 (содержащем 0,02% NaH) .
В каждую пробирку загружают по 20 мл образца и центрируют на Spinso SW 25,1 роторе при 18000 об/мин в течение 18 ч.Фракции объемом l мл собирают по капл м со дна пробирок и анализируют на содержание HBsAg.
O Фракции, содержащие максимальное количество антигенной активности, объедин ют , тщательно диализируют и концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны с 30000 MW
s от жимным рантом (Амикон РМ-30) .- Концентрированные фракции HBsAg подвергают конечным стади м очистки изопикническим св зыванием в линейном градиенте CsCI и скоростному зональ0 ному центрифугированию в прерывистом градиенте сахарозы при обычно используемых услови х.
Методы детектировани .
За содержанием HBsAg след т ме5 тодом встречного электрофореза (СЕР) или твердо-фазной радиоиммунопробой Ausria 1 или II, Abbott Laboratories. Концентрацию протеина устанавливают при 280 нм сиспользованием микроме- тодики Kjehldahl.
0
Критерий чистоты HBsAg.
Образцы после каждой стадии очистки анализируют методами целлюлозоацетатного электрофореза, иммуноэлектрофореза и испытани ми диффузии
5 в системе агарового гел по отношению к поливалентной антинормальной человеческой плазмапротеиновой антисыворотке .
Полиакриламидный гелевый элект6 рофорез.
Аликвоты образцов, содержащие 0,01 натрий фосфатный буфер прирН ,2, 1% натрий додецилсульфата, 1% 5-меркаптоэтанола и 10% глицерина, нагревают в течение 2 мин на кип щей вод ной бане, обрабатывают 7,510%i найтрийдодецилсульфатакриламидными гел ми.
Результаты очистки HBsAg/e поло0 жительных сывороток осаждением с помощью полиэтиленгликол представлены в таблице. Около 87% первоначального протеина плазмы удал ютс на первой стадии осаждени HBsAg (котора включает предочистку при концентрации
5 PEG 2%). Конечный выход после двух последовательных стадий осаждени с помощью PEG jipKa3HBaeT количественную регенерацию HBsAg в присутствии лишь 4% первоначальных протеинов.
Q
Очистка объединенного HBsAg шимпанзе осаждением с помощью PEG-6000. Первоначальна HBsAg-плазма 7,800 512 Первое осаждение 4% PEG Второе осаждение 10,QQO 4% PEG
50 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg фракционируют хроматографированием на гидроксилапатите. Элюат группируют на семь фракций, которые диализируют по сравнению с 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азиданатри ) и концентрируют ультрафиль/грацией . Концентрированные образцы авализирутот на. протеины при 280 нм и на присутствие HBsAg методом СЕР.
200 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg фракционируют на 1000 колонке с гидроксилапатитом. Фракции HBsAg из первого протеинового пика (группа 1: фракции 38-83) и оставшийс элюат (группа 11: фракци 84-110) объедин ют и концентрируют до 75 мл ультрафильтрацией.
Концентрированный образец из группы 1 повторно хроматографируют на колонК объемом 1000 мл с гидроксилапатитом .
Элюат объедин ют на росемь фракций . Объединенные образцы концентрируют ультрафильтрацией и промывают 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азида натри ) . Эти образцы анализируют на протеин и HBsAG.
Анализ образцов на содержание прмесей методом иммуноэлектрофореза обнаружил очень слабую линию преципитации во фракции I, более сильную линию во фракции ti-Vi и сильно вырс1женную широкую линию в объединенных фракци х Vlf-VIII , которые мигрируют между альфа2 и альбуминной област ми .
Электронна микроскопи образцов обнаружила в основном сферические частицы с диаметром 22-28 нм во фракци х 1-ш , сферические частиць и волокна, во фракци х W -Vl , главны образом небольшие сферические частицы и некоторое количество волокон .во фракци х ill М wКонцентрированные образцы из пре )зыдущих стадий подвергали полной очистке плотностным градиентным ценрифугированием .
Очищенные препараты HBsAg, состо щие главным образом из сферических частиц диаметром 20-22 нм, сферических частиц диаметром 22-28 м. 429 7,080
волокон, различного размера и частиц Дана, содержащих по 100 мг протеина, анализируют на полипептидный состав полиакриламид гелевым электрофорезом. Количественную разницу наблюдают в Протеиновых пиках индивидуальных образцов.
Пики карбогидратов низкого молекул рного веса представл ют собой гликолипйды, поскольку они не про вл ютс при голубом окрашивании по Coomassie.
Вакцину готов т из фракций крупных частиц, полученных в результате добавлени человеческого сывороточного альбумина с концентрацией 0,5 мг/мл с последующей инактивацией по сери м облучением от кобальтового источника (2,5 миллиона ращ) инактивацией формалином с использованием общеприн тых методик ( , 96 ч, концентраци 1:2,000), с последующим использованием р-пропиолактона по методикам, обычно используемым при производстве вакцин против бешенства.
Пример 2. Модифицированна .усовершенствованна PEG методика дл выделени HBsAg/e.
Модифицированную методику дл осаждени PEG используют на 2,6 л смешанной HBsAg, содержащей плазмы от одного шимпанзе-носител , содержащего е-антиген в необъединенном, неосажденном виде. рН плазмы устанавливают равным приблизительно 4,6 и немедленно добавл ют 30%-кый раствор PEG до конечной концентрации 2%. Раствор вымораживают на льду в течение 30 мин (вместо сто ни в течение ночи при 4°С, как в предыдущем примере ) и осадок удал ют центрифугированием .
Во Ъсплывшем слое, содержащем HBsAg, устанавливают концентрацию PEG, равную 4% (вместо 4,5% в предыдущем примере) в результате добавлени 6,6 ч на 100 30%-ного раствора PEG при комнатной температуре, Сус0 пенэию снова вымораживают на льду в течение 30 мин и осажденный HBsAg/e удал ют центрифугированием. Осадок ресуспендируют до 200 мл в дистиллированной воде. Основную часть 5 PEG и сопутствующих примесей удал ют 00
путем установлени рЫ, равным 5,0, вымораживанием раствора на льду в течение 30 MiK и удалением полученного в результате осадка центрифугированием . рН прозрачного всплывшего сло из предыдущей стадии вновь устанавливают равным 4,6 и добавл ют 30% PEG до конечной концентрации пор дка 3% (вместо 4,0-4,5%, как это делали ранее). Вещество вновь выморакивают на льду в течение 30 мин и осадок HBsAg/e удал ют центрифугированием .
Осадок из предыдущей стадии,- содержа ций HBsAg/e, суспендируют в 10 мл дистиллированной воды. Основную массу PEG осаждают в результате устаьовлени рН равным 5,0. После сто ни в течение ночи при 4С суспензию осветл ют центрифугированием. Прозрачный верхний слой, содержашд й HBsAg/e, дополн ют 0,5 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 до конечной концентрации пор дка 0,02 М и устанавливают конечный объем, равный 120 мл. с помощью дистиллированной воды.
Результаты такой очистки показывают более чем 33-кратную очистку HBsA
Пример 3. Фракционирование HBsAg/e периодической обработкой гидроксилапатитом.
Ресуспендированный PEG осадок HBsAg/e (пример 2) обрабатывают периодически гидроксилапатитом вместо процесса хроматографировани на колонке , .500 мл объем насадочного гидроксилапатита (Bio-Rad-Labs) суспендиру: .т в 800 мл 0,02 М натрий-фос фатном буфере при рН 7,2 и после добавлени препарата HBsAg/e перемешивают магнитной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Шлам дел т на две равные аликвоты и центрифугируют в чашах емкостью 1 л на центрифуге Sorvall RC-3 со скоростью 4,000 в течение 10 мин. Верхний слой декантируют и осадок последовательно промывают порци ми в 1 л с 0,02 М и 0,05% ,на|Трий-фосфатного буфера при рН 7,2, Элюаты объедин ют, концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны РМ-ЗО и диафильтруют 0,02 М фосфатным буфером с рИ 7,2, 0,02% МаН-з и довод т до объема 60 мл тем е буфером.
Концентрированный образец далее очищгиот скоростным зональным центрифугированием в прерывном градиенте сахарозы.
Отделенные частицы HBsAcj/e раздел ют на три фракции, диалиэируют и концентрируют ультрафильтрацией, Образцы,- исследованные методом электронной Г/икроскопии, обнаружили главным образом крупные волокна и частицы Дана во фракции 1; волокна, частицы Дана и сферические частицы дйс1метром 22-28 нм во фракции и и сферические частицы ДJ aмeтpoм 20-28 нм во фракции 1.
Пример 4 .-; Дисаггрегаци HBsAg/e частиц с помощью ионных и неионных детергентов.
HBsAg/e дастицы обрабатывают при комнатной температуре (в течение 5 1чмн - 2 ч) следующими детергентами: 0,5-2% Nohidett NP (детергент) (Shell Oil Co.), 0,5-2% Твина 80
0 ( поверхностно-активный агент), 5-10% Тритона Х-100 (органический поверхностно-активный агент), 0,1-1,0% додецилсульфата натри и т.д. Целью обработки вл етс усиление антиген5 ной активности в образцах, обработанных детергентом, и инактиваци инфекциозности этих образцов.
Оптимальные услови обработки определ ют путем анализа образцов
0 перед и после обработки детергентом с использованием тонкослойной и изоэлектрической фокусировки. Индивидуальные компоненты дисаггрегированных образцов могут быть выделены с использованием различных методик
5 разделени , например молекул рным исключением, адсорбцией, способами ионообменного хроматографического ультрацентрифугировани , различнымк методами электрофореза и т.д.
0 Одним из наиболее высокоэффективных способов вл етс метод зонного конвекционного изоэлектрического фокусировани , описанный ниже.
Изоэлектрическое фокусирование.
5
Тонкие слои получают на Sephadex75 гель целлюлозного носител в 1%ном растворе амфолина при рН 4,0-6,0 или рН 3f5-10,0. Пластины помещают в м льтипоровое устройство. Отпечатки делают на хроматографической -бумаге . Отпечатки раздел ют вдоль линии отделенных образцов и разрезают ка зоны 0,5-1 см. Индивидуальные зоны далее разрезают на более мелкие части, смачивают 0,2 мл буферного солевого раствора и элюируют 0,2 мл нормальной (не содержащей HBsAg и анти-КВ) человеческой сыворотки. Ллилсвоты в 200 мл из каждого элюата используют дл радиоиммуноанализа. Полоски между разделенными образцамг: также разрезают, элюируют 0,4 мл дегазированной дистиллированной воды и используют дл измерени рН. Если берут два отпечатка, то первый ис5 пользуют дл окрашивани на протеин а второй разрезают дл радиоиммуноанализа на HBsAg и измерений рН. АЛИквоту из каждого образца обрабатывают 5-10% неионного детергента
) (Тритон ) в течение 20 мин при комнатной температуре перед контактированием с гелем и выдерживают при описанных выше услови х при сравнении с образцом, который еще не обра5 батывали детергентами.
Claims (2)
- Предлагаемый способ позволяет по™ высить специфичность получаемой вакцины .,
Формул а инобро с ения 1.. Способ получения в а к щ-ι н ы тиб гепатита В путем выделения. час- тиц HBsAg, содержащих е-антиген на .;/) частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-аптиген, с последующей инактивацией целевого продукта, о тл и ч а ю щ и Я с я тем, что, с це,,, лью повышенья сп&шщячпости вакцины, плазму крови обрабатывают 3,04,5 вес.% полиэтилезгликоля при pH4.4- 4,7, полученный осадок, содержащий HBsAg частицы размером 30-50 нм» растворяют при рн 4,9-5,1, затем pH1 надосадочной жидкости доводят до4.4- 4,7, повторно обрабатывают полиэтиленгликолем и полученный осадок растворяют у фьзислогдчеоком растворе , - 2., Способ ; π., I, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что целевой продукт инактивируют обработкой формалином или β -пропиолактоном или облучением о <- е т га н о в с к и ми лу чамн ,
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/631,961 US4118479A (en) | 1975-03-14 | 1975-11-17 | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU728720A3 true SU728720A3 (ru) | 1980-04-15 |
Family
ID=24533494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU762332953A SU728720A3 (ru) | 1975-11-17 | 1976-03-12 | Способ получени вакцины против гепатита в |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2331354A2 (ru) |
| GB (1) | GB1518582A (ru) |
| SU (1) | SU728720A3 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4102996A (en) * | 1977-04-20 | 1978-07-25 | Merck & Co., Inc. | Method of preparing hepatitis B core antigen |
| ZA792485B (en) * | 1978-06-07 | 1980-06-25 | New York Blood Center Inc | Vaccine for active immunization containing hepatitis b surface and/or e-antigens |
-
1976
- 1976-03-09 GB GB9299/76A patent/GB1518582A/en not_active Expired
- 1976-03-12 SU SU762332953A patent/SU728720A3/ru active
- 1976-03-30 FR FR7609168A patent/FR2331354A2/fr active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB1518582A (en) | 1978-07-19 |
| FR2331354B2 (ru) | 1979-01-19 |
| FR2331354A2 (fr) | 1977-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3636191A (en) | Vaccine against viral hepatitis and process | |
| US4216205A (en) | Process of preparing a serum protein composition for intravenous application | |
| US4113712A (en) | HBsAG Particle composed of single polypeptide subunits and the preparation procedure | |
| CA1066191A (en) | Hepatitis b vaccine | |
| CA1069822A (en) | Preparation of a hepatitis b immune globulin and use thereof as a prophylactic material | |
| US4174388A (en) | Method for preparing hepatitis B immune globulin | |
| JPH0331691B2 (ru) | ||
| US4164565A (en) | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| KR900002651B1 (ko) | 면역성이 높은 신규한 형상의 간염 b 표면항원-함유 입자의 제조방법 | |
| US4118478A (en) | Vaccine manufacture for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| US4118479A (en) | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen | |
| EP0112506B1 (en) | A process for producing a hepatitis b infection preventing vaccine | |
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| US4639371A (en) | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom | |
| WO1981000050A1 (en) | Process for producing hepatitis b vaccine | |
| SU728720A3 (ru) | Способ получени вакцины против гепатита в | |
| RU2122430C1 (ru) | Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита b, содержащего пре s2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, вакцина для иммунизации против гепатита b | |
| EP0005864B1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| US5242812A (en) | Method for production and purification of hepatitis B vaccine | |
| US4118477A (en) | Hepatitis B antigen | |
| EP0179485B1 (en) | A process for the purification of hbsag | |
| US4558011A (en) | Method for preparation of pure hepatitis B surface antigen from human plasma | |
| US4129646A (en) | Isolating hepatitis B Dane particles | |
| EP0408742B1 (en) | Method for production and purification of hepatitis b vaccine | |
| CA1306689C (en) | Method of preparing a vaccine against hepatitis b and the vaccine thus obtained |