JPH0753102B2

JPH0753102B2 - グルタチオン高含有酵母及びその製造法

Info

Publication number: JPH0753102B2
Application number: JP18732592A
Authority: JP
Inventors: 二郎清水; 康奥村; 隆哉大谷
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 1992-06-23
Filing date: 1992-06-23
Publication date: 1995-06-07
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: JPH0670752A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グルタチオン高含有サ
ッカロマイセス・セレビシエ、及びその製造法に関す
る。さらに詳しくは、遺伝子導入をしてグルタチオン生
産能を増強したサッカロマイセス・セレビシエに変異処
理を行い、菌体内にグルタチオンを著量生成して蓄積さ
せるサッカロマイセス・セレビシエ、及びその製造法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】グルタチオンは、グルタミン酸、システ
イン及びグリシンから成るペプチドであり、肝疾患の治
療薬、あるいは試薬として広く利用されている重要な化
合物である。従来、グルタチオンは、有機合成法や酵母
から抽出する方法によって製造されている。しかし、有
機合成法は反応工程の長さと工程の複雑さの点で、また
酵母からの抽出方法においては菌体から抽出されるグル
タチオンの量に限界があるという点で問題があった。

【０００３】これらの欠点を解決すべく、これまで数々
の改良がなされてきている。例えばグルタチオン生成に
関係するアミノ酸を添加することによるグルタチオン製
造法（特公昭47−26314、特開昭53−94089、特公昭54−
997、特開昭48−44487、特開昭51−36357）などがあ
る。しかしながら、これらの方法はグルタチオンの生産
量の点で満足のいくものではない。また、突然変異株取
得によるグルタチオン製造法（特公昭56−46826、特開
昭48−61689、特公昭53−31956、特開昭61−209583) な
どがある。さらに、遺伝子操作を利用した微生物による
グルタチオン製造法（特開昭58−20188、特開昭58−201
96、特開昭61−52299、特開昭62−275685、特開昭64−5
1098)がある。

【０００４】これらは、グルタチオン合成能を向上させ
てはいるが、グルタチオン合成に必要でかつ律速となる
Ｌ−システインの供給が十分に改良されておらず、グル
タチオン高生産には同アミノ酸添加が必要と考えられ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明では、
酵母サッカロマイセス・セレビシエに変異処理を行いア
ザセリン耐性株を造成することによって、律速となるＬ
−システインの菌体内合成系を強化し、従来の製法より
もグルタチオンの含有量の高い酵母サッカロマイセス・
セレビシエをアミノ酸（Ｌ−システイン）を添加するこ
となく取得することを目的とする。

【０００６】また、変異処理によって得られたアザセリ
ン耐性株を接合、さらには細胞融合処理することによっ
て高度にグルタチオンを含有する酵母サッカロマイセス
・セレビシエを取得することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、γ−グルタミ
ルシステイン合成酵素遺伝子を導入したグルタチオン高
生産サッカロマイセス・セレビシエに、変異処理を行っ
てアザセリン耐性株を造成し、得られたアザセリン耐性
株を好気的培養することによって、好ましくは流加培養
することによって、菌体内にグルタチオンを著量に生成
することを特徴とするグルタチオン高含有サッカロマイ
セス・セレビシエの製造法である。

【０００８】また、好ましくは、本発明はγ−グルタミ
ルシステイン合成酵素遺伝子を導入したグルタチオン高
生産サッカロマイセス・セレビシエに、変異処理を行っ
てアザセリン耐性株を造成し、得られたアザセリン耐性
株の１倍体を他のグルタチオン高生産株の１倍体と接合
して、多倍数体を造成し、得られた株を胞子形成させグ
ルタチオン生産能及び成育能の優れた株をスクリーニン
グして、得られた株を好気的培養することによって、好
ましくは流加培養することによって、菌体内にグルタチ
オンを著量に生成することを特徴とするグルタチオン高
含有サッカロマイセス・セレビシエの製造法である。

【０００９】さらに好ましくは、本発明はγ−グルタミ
ルシステイン合成酵素遺伝子を導入したグルタチオン高
生産サッカロマイセス・セレビシエに、変異処理を行っ
てアザセリン耐性株を造成し、得られたアザセリン耐性
株の１倍体を他のグルタチオン高生産株の１倍体と接合
して多倍数体を造成し、得られた株を胞子形成させ、ス
クリーニングして得られたグルタチオン生産能及び成育
能の優れた１倍体株の２株を細胞融合させて得られた株
を好気的培養することによって、好ましくは流加培養す
ることによって、菌体内にグルタチオンを著量に生成す
ることを特徴とするグルタチオン高含有サッカロマイセ
ス・セレビシエの製造法である。

【００１０】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明で用いる遺伝子導入グルタチオン高生産サッカロマ
イセス・セレビシエは、大竹らが確立した手法（1990年
度日本農芸化学会大会要旨集、145 頁、1990年) によっ
て得られるサッカロマイセス・セレビシエを用いること
ができる。すなわち、酵母由来のグルタチオン生合成系
酵素の一つであるγ−グルタミルシステイン合成酵素遺
伝子をサッカロマイセス・セレビシエの強発現プロモー
タ△Ｐ８に接続し、サッカロマイセス・セレビシエの染
色体ｔｒｐ１部位へ導入することによって遺伝子導入グ
ルタチオン高生産サッカロマイセス・セレビシエを造成
することができる。

【００１１】このような酵母としては、ブタペスト条約
に定める国際寄託当局に受託番号微工研条寄第13012号
によって寄託されたものが好ましい。アザセリン耐性株
を得るため変異源は、通常変異源として一般的に用いら
れる方法であればよく、紫外線、エチルメタンスルフォ
ン酸、ニトロソグアニジン、Ｘ線等を用いることができ
る。

【００１２】本発明でいうアザセリン耐性株とは、シス
テイン生合成に必要なセリン供給系が強化されることに
よりシステインの生合成が強化された変異株であり、本
発明においては、ＹＰＤ培地に対して25μg/ml濃度にな
るようにアザセリンを添加した培地で成育可能な株をい
う。本発明で得られるアザセリン耐性株は、通常システ
インを培地に添加して培養した場合と同じようにグルタ
チオン生産量が増加する特徴を示した。

【００１３】スクリーニングしたアザセリン耐性株の生
育能をさらに改良するための方法としては、アザセリン
耐性株との接合が可能な接合型の１倍体グルタチオン生
産優良株を得て、その１倍体とアザセリン耐性株を接合
して多倍数体を得ることができる。さらには、得られた
アザセリン耐性株の多倍数体を胞子形成させ、グルタチ
オン生産優良株をスクリーニングすることが可能であ
る。アザセリン耐性株との接合可能な１倍体優良株を得
るには、１倍体の優良株２株を接合させ、多倍数体株を
造成したのち胞子形成を行うという通常の方法をとるこ
とが出来る。

【００１４】また、さらに、得られたアザセリン耐性株
のグルタチオン生産性を高めるために多倍数体を造成す
ることができる。多倍数体造成の手法としては、接合、
あるいは細胞融合によって行うことができる。本発明の
菌株の培養条件としては、一般に行われているように、
培養温度20〜34℃、培養pH4.5 〜6.5 で好気的に培養す
れば特段の限定はされないが、特にグルタチオンの生産
性を高めるには流加培養を行うのが望ましい。流加培養
の条件は、ジャーファメンターを用い、グルコース、尿
素、酵母抽出物および無機塩からなる培地に植菌し、通
気量1vvm、温度30℃、ＤＯレベルを最少１〜５ppm とし
て、そこへグルコースと酵母抽出液の殺菌した混合液を
0.05 l/hの速度で植菌後12時間流加する。流加時間は約
12時間で初発液量の約１／40量を添加する。

【００１５】

【発明の効果】本発明によれば、従来の製法よりもグル
タチオンの含有量の高いサッカロマイセス・セレビシエ
をアミノ酸（Ｌ−システイン）を添加することなく取得
することができ、また、変異処理によって得られたアザ
セリン耐性株を接合、さらには細胞融合処理することに
よって高度にグルタチオンを含有するサッカロマイセス
・セレビシエを取得できる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例をもって本発明を詳しく説明す
るが、これに限定されるものではない。 (1) 遺伝子導入グルタチン高生産サッカロマイセス
・セレビシエの造成グルタチオン生合成系の遺伝子群を効率よく発現させる
ために、まず、サッカロマイセス・セレビシエの染色体
から強転写プロモーターのクローニングを行った。クロ
ーニングには、プロモーター検出ベクターpMC1585 を用
いて、β−ガラクトシダーゼ活性を指標に行った。その
結果、活性の高いＤＮＡ断片としてＰ８プロモーター断
片（約3.8kb)が得られた。このP8プロモーター断片か
ら、機能領域のみの△P8（約0.4kb)を作成した。

【００１７】次に、サッカロマイセス・セレビシエのγ
−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のクローニング
を行った。すなわち、S. cerevisiae YNN27 株 (α tr
p1 ura3) から、上記２種の酵素の欠損変異株を取得し
た。次にγ−グルタミルシステイン合成酵素欠損株（YH
1)を用いてγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の
クローニングを行った。YH1 株をYEp24 をベクターとす
る遺伝子ライブラリーで形質転換し、ニトロプルシッド
ソーダを用いてスクリーニングを行ったところ、目的の
遺伝子と思われる１種のプラスミド (pYOG1001) が得ら
れた。更に得られた遺伝子のサブクローニングを行った
ところ約4.4kb の断片上に目的の遺伝子（GSH1）が存在
した。そこでこの遺伝子断片の全塩基配列を決定したと
ころ、この断片は4.410 塩基からなっていた。

【００１８】このクローニングしたGSH1遺伝子の転写プ
ロモーターを△P8と交換し、強発現化した△P8−GSH1断
片をYNN27 株の染色体上のtrp1に挿入したＹＨＴ178 株
を作製した。ＹＨＴ178 株のGSH-1 活性とグルタチオン
含量を測定したところ、GSH-1 活性は、0.29ユニットで
あり、グルタチオン含量は約1.5 ％であった。

【００１９】(2) アザセリン耐性株の造成ＹＰＤ寒天培地（酵母エキス１％、ペプトン１％、グル
コース２％、寒天1.5％）上で30℃、３日間培養したサ
ッカロマイセス・セレビシエＹＨＴ178 株をＹＰＤ液体
培地（ＹＰＤ寒天培地から寒天を除いたもの）100ml の
入った500 ml容振盪フラスコに一白金耳接種し、30℃、
一晩振盪培養した。菌体を遠心分離(3000rpm、10分) で
集め、50mlの蒸留水で洗浄した。続いて20mlの燐酸バッ
ファー(pH7.5、0.1M）に懸濁し、エチルメタンスルフォ
ン酸 600μl を添加した。30℃で１時間振盪した後、20
mlの５％チオ硫酸ナトリウム溶液を加え５分間放置し
た。遠心分離で菌体を集め、20mlの蒸留水に再度懸濁し
た。この懸濁液をアザセリン25μg/mlを含むＳＤ寒天培
地（ディフコ社製イーストナイトロジェンベースＷ／Ｏ
アミノ酸0.67％、グルコース２％、ディフコ社製寒天
1.5％) に接種し、30℃で３日間培養した。生育してき
たコロニーを選択し、５mlのＹＰＤ培地の入った試験管
に接種し30℃、30時間振盪培養した。遠心分離で菌体を
集め、蒸留水で洗浄後１mlの蒸留水に懸濁した。この懸
濁液を100 ℃、５分間加熱した後、遠心分離にて上清を
得た。上清中の抽出されたグルタチオンを比色定量に供
した。

【００２０】0.7mM のＥＤＴＡを含む0.36M 、pH７の燐
酸バッファー2.5ml に、ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）４mg/ml 溶液100 μl 、ＮＡＤＰＨ 4mg/ml 溶液50
μl、グルタチオンリダクターゼ（オリエンタル酵母社
製) 0.5 ユニットを加え、光路長１cmのガラス製キュベ
ットへ入れ、25℃に加温した。そのキュベットへ適宜稀
釈しグルタチオンを測定レンジ濃度含むサンプルを10μ
l 添加して反応を開始した。日立自記分光光度計320 型
を用いて412nm の吸光度を連続的に１分間記録した。同
様にして濃度既知のグルタチオン標準溶液をサンプルと
して反応させ吸光度の増加を連続的に記録し、増加曲線
の勾配を用いて検量線を作り、サンプルの勾配からサン
プル中のグルタチオン含有を算出した。

【００２１】約1000株のコロニーを処理しグルタチオン
生産量が多かった60株を選択した。選択した株を100ml
のＹＰＤ培地の入った500ml 容振盪フラスコに接種し、
30℃で３日間振盪培地した。培地終了後、試験管を用い
て培養した場合と全く同様にして、各菌株のグルタチオ
ン生産量を比較した。その結果、菌体あたりのグルタチ
オン含量が最も高い ASR6-32株を選択した。表１にＹＨ
Ｔ178 と ASR6-32の比較を示す。

【００２２】

【表１】数値は、100ml ＹＰＤ培地を含む 500ml容坂口フラスコ
で30℃、３日間培養した時の値である。

【００２３】(3) アザセリン耐性株 ASR6-32の改良１
倍体株の造成次に、この変異株の生育能を改善するために接合によっ
て多倍体株とすることを試みた。まず、ＹＨＴ178 株と
サッカロマイセス・セレビシエの実験室株 AH22 株（AT
CC38626)を接合させた。前者はトリプトファン、ウラシ
ル要求性であり、後者はヒスチジン、ロイシン要求性を
有しているので、両者が接合した株は最少培地（ＳＤ培
地）で生育できるが、接合していない株は生育できない
ことを利用して接合株を選択した。得られた株を胞子形
成培地（酵母エキス 0.1％、グルコース0.05％、酢酸カ
リウム1.0 ％、寒天2.0 ％) に接種し、30℃で約10日間
培養した。胞子を形成している接合株を一白金耳取り、
0.1mg/mlのザイモリエース（生化学工業、10万ユニット
/g) 水溶液１mlに懸濁し、30℃で15分間静置した。この
懸濁液をナリシゲ株式会社製マイクロマニュピレータ、
MN-188/MD-188 型を用いて形成している胞子を分離し
た。分離した胞子の中から接合型がａでありかつグルコ
ース生産性がＹＨＴ178 同程度の株ＹＨＴ182 を選択し
た。ＹＨＴ182 とASR6-32 を同様にして接合、胞子形
成、胞子分離を行い、得られた株約100 株をＹＰＤ培地
で培養して、グルタチオン生産能及び生育を比較した。
しかして、生育とグルタチオン生産能の両方を満足する
株 62D株を習得した。両株を100ml のＹＰＤ培地の入っ
た 500ml容フラスコに接種し、30℃で３日間振盪培養
し、実施例１に示した方法と全く同様にしてグルタチオ
ン含量、菌体量等を比較した。結果を表２に示した。表
２は、ＹＨＴ178 株と62Ｄ株の比較を示す。62Ｄ株は微
工研条寄第13010号によって寄託された。

【００２４】

【表２】

【００２５】(4) アザセリン耐性株 62D株の多倍体株
の造成得られたグルタチオン高生産サッカロマイセス・セレビ
シエ62Ｄ株(ura３、 his３）をさらに改変した。まず、
プラスミド YEp24を制限酵素 HindIIIで、またプラスミ
ド YIo1 を制限酵素 BamHIで各々完全消化した。アガロ
ースゲル電気泳動に供し URA3 遺伝子断片を含むＤＮＡ
断片及び HIS3 遺伝子を除去した残りのYIp1 プラスミ
ド断片を分離した。マニアチス（Maniatis、T.) ら、
｛モレキュラー・クローニング(Molecular cloning) 、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold
Spring Harbor Laboratory) 、1982年｝の方法に準処し
て URA3 遺伝子を HIS3 遺伝子を除去した YIpベクター
へ連結してプラスミド pYI-U3 を作製した。

【００２６】62Ｄ株をＹＰＤ培地に接種し、30℃、16時
間振盪培養し、遠心分離にて菌体を集めた。洗浄後、菌
濃度約１×10¹⁰cells/mlになるように氷冷した１Ｍソル
ビトールに懸濁した。この懸濁液40μl に先に調製した
プラスミド pYI-U3 を約20μl/ml濃度含む溶液５μl を
加え、氷冷した。氷冷しておいたエレクトロポレーショ
ン用キュベット（バイオラッド社製165-2086) へ菌及び
プラスミドが混合している懸濁液を入れた。このキュベ
ットをジーンパルサー（バイオラッド社製）ヘセットし
た。装置を１kV、25μF に設定し、パルスコントローラ
ーを 200Ωとした。タイムコンスタントを４msecとして
エレクトロポレーションを行った。氷冷しておいた１Ｍ
ソルビトール溶液１mlをキュベットへ添加し、良く攪拌
した。その後、ヒスチジンを20μg/ml含むＳＤ寒天培地
に接種し、30℃で約３日間培養した。生育してきたコロ
ニーをＹＰＤ寒天培地へ移植した。同様にして、62Ｄ株
にYIp1を導入し、形質転換を行った。しかして、62Ｄ(h
is3)及び 62D (ura3）を得た。

【００２７】次に作成した上記２株の細胞融合を行っ
た。ＹＰＤ培地 100mlを含む 500ml容振盪フラスコに上
記の菌株を接種し、30℃で約16時間培養した。菌を遠心
分離で集め無菌水で洗浄後、ＳＴＥバッファー（１Ｍソ
ルビトール、20mMＥＤＴＡ、10mMトリス−塩酸（pH7.
4)) 100ml に懸濁した。そこへβ−メルカプトエタノー
ル39μl を加え30℃で10分間処理した。遠心分離で集菌
し、0.1mg/ml濃度のザイモリエース（生化学工業製、10
万ユニット/g) を含むＳＴバッファー（１Ｍソルビトー
ル、10mMトリス−塩酸（pH7.4)）10mlに懸濁し30℃で20
分間反応させてプロトプラストとした。遠心分離で集菌
し、ＳＴバッファーで１回洗浄した。その後、10mMのCa
Cl₂ を含むＳＴバッファー（ＳＴＣバッファー）10mlに
懸濁した。各々の懸濁液中の細胞数を血球計算盤で数
え、１×10⁷個を混合した。遠心分離で集菌した後、10
mM CaCl₂を含むＳＴバッファー１mlに懸濁し、30℃で15
分間加温した。再び、遠心分離で集菌し、１mlのＰＣＴ
バッファー（35％ＰＥＧ4000、10mMトリス−塩酸（pH7.
4)、10mM CaCl₂) に懸濁し30℃、10分間融合を行わせ
た。集菌し、ＳＴバッファーで洗浄し、１mlのＳＴＣバ
ッファーに懸濁した。１Ｍソルビトールを含むＳＤ寒天
培地へ、この懸濁液 100μl を接種、30℃で約５日間培
養した。生育してきたコロニーを約 100株、ＹＰＤ培地
へ移し、さらに７日間30℃で培養した。

【００２８】上記の約 100株を５mlのＹＰＤ培地を含む
試験管で30℃、３日間振盪培養し、グルタチオン含量及
び生育を選択指標として優良株を選択した。しかして、
62Ｄ／62Ｄ株を選んだ。62Ｄ／62Ｄ株は微工研条寄第13
011号で寄託された。表３に各菌株をＹＰＤ培地を用い3
0℃、３日間振盪培養した時の結果を示す。

【００２９】

【表３】 (5) グルタチオン高含有サッカロマイセス・セレビシ
エの培養、その１グルコース２％、イーストイクストラクト（ディフコ社
製）１％、バクトペプトン（ディフコ社製）１％よりな
る培地を調製し、500 ml振盪フラスコに100mlにて24時
間振盪培養し、種菌液とした。５Ｌジャーファメンター
（丸菱バイオエンジ社ＭＤＬ500 型) に、グルコース
２％、尿素0.6 ％、酵母抽出物（ミースト、アサヒビー
ル社製）0.4 ％、KH₂PO₄ 0.15％、MgSO₄・７H₂O 0.05
％、Na₂SO₄ 0.2％、CaCl₂・２H₂O 0.03 ％、ZnSO₄・７H
₂O 1.32ppm 、FeCl₃・６H₂O 1.45ppm 、CuSO₄・５H₂O
0.2ppmからなる培地2400mlを入れ、120 ℃、15分間殺菌
後、上記種菌液100mlを接種し、通気量1.0vvm、攪拌数4
00rpm、30℃、２％アンモニア水によりpH5.0 に制御
し、１％のシリコーン消泡剤（東芝シリコーン社、TSA7
37F)を使用し、48時間培養した。培養中、グルコース15
％、ミースト３％からなる培地600ml を接種後８時間よ
り0.05l/hの速度で12時間流加した。

【００３０】酵母菌体を含む培養液１mlを熱水抽出処理
し、遠心分離後、得られた菌体抽出液のグルタチオン生
産量は、Titze 法 (Anal. Biochem., 27, 502 (1969))
に従い412nm の吸収増加で測定した。凍結乾燥により乾
燥菌体重量を測定し、グルタチオン生産量からグルタチ
オン含有率を算出した。培養35時間のグルタチオン生産
量は、700mg/Ｌ、グルタチオン含有率は、4.22％、乾燥
菌体重量16.6mg/ml であった。同様な条件によるＹＨＴ
178 株との比較は表４に示す。表４は62Ｄ／62Ｄ株とＹ
ＨＴ178株の比較を示す。

【００３１】

【表４】 (6) グルタチオン高含有サッカロマイセス・セレビシ
エの培養、その２グルコース２％、イーストイクストラクト（ディフコ社
製）１％、バクトペプトン（ディフコ社製）１％よりな
る培地を調製し、2000ml振盪フラスコに500ml注入し
た。120 ℃、15分間殺菌後、62Ｄ／62Ｄ株を接種し、30
℃にて24時間振盪培養し、種菌液とした。

【００３２】３台の５Ｌジャーファメンター（丸菱バイ
オエンジ社ＭＤＬ500 型) に、グルコース２％、尿素
0.6 ％、酵母抽出物（ミースト、アサヒビール社製)0.4
％、KH₂PO₄ 0.15 ％、MgSO₄・７H₂O 0.05％、Na₂SO₄ 0.
2％、CaCl₂・２H₂O 0.03％、ZnSO₄・７H₂O 1.32ppm、Fe
Cl₃・６H₂O 1.45ppm、CuSO₄・５H₂O 0.2ppm からなる培
地2400mlを入れ、120 ℃、15分間殺菌した。上記種菌液
1750mlを3000rpm 、５分間遠心分離後、上清を捨て、殺
菌水500ml で洗浄し、再度同条件で遠心分離した。得ら
れた沈澱物に殺菌水を加え875ml とし、この２倍濃縮種
菌液を３台のジャーファメンターに各々125 ml、250 m
l、500 ml、接種した。接種時の生菌数は各々2.75×10⁷
cells／ml、6.25×10⁷cells／ml、9.00×10⁷cells／ml
であった。通気量1.0vvm、攪拌数600rpm、30℃、２％ア
ンモニア水によりpH5.0 に制御し、１％のシリコーン消
泡剤（東芝シリコーン社 TSA737F)を使用し、48時間培
養した。培養中、グルコース15％、ミースト３％からな
る培地 600mlを接種後12時間より0.05 l/hの速度で12時
間流加した。

【００３３】酵母菌体を含む培養液１mlを熱水抽出処理
し、遠心分離後得られた菌体抽出液のグルタチオン生産
量は、Titze 法 (Anal. Biochem., 27, 502 (1969)) に
従い412nm の吸収増加で測定した。凍結乾燥により乾燥
菌体重量を測定し、グルタチオン生産量からグルタチオ
ン含有率を算出した。培養48時間のグルタチオン生産
量、グルタチオン含有率、乾燥菌体重量は、表５に示
す。表５は62Ｄ／62Ｄ株のグルタチオン生産量を示す。

【００３４】

【表５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝
子を導入したグルタチオン高生産サッカロマイセス・セ
レビシエ（Saccaromyces cerevisiae）に変異処理を行
ってアザセリン耐性株を造成し、得られたアザセリン耐
性株を好気的培養することによって菌体内にグルタチオ
ンを著量に生成することを特徴とするグルタチオン高含
有サッカロマイセス・セレビシエの製造法。
【請求項２】遺伝子導入グルタチオン高生産サッカロ
マイセス・セレビシエが、ＹＨＴ178 株（微工研条寄第
13012号）であることを特徴とする請求項１に記載のグ
ルタチオン高含有サッカロマイセス・セレビシエの製造
法。
【請求項３】グルタチオン高含有サッカロマイセス・
セレビシエが、62Ｄ株（微工研条寄第13010号）である
ことを特徴とする請求項１のグルタチオン高含有サッカ
ロマイセス・セレビシエの製造法。
【請求項４】グルタチオン高含有サッカロマイセス・
セレビシエが、62Ｄ／62Ｄ株（微工研条寄第13011号）
であることを特徴とする請求項１のグルタチオン高含有
サッカロマイセス・セレビシエの製造法。